ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ КАБАРДИНО-БАЛКАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. Х.М. БЕРБЕКОВА ЧАСТНАЯ МЕДИЦИНСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ Лабораторный практикум Для специальностей: 060101 – Лечебное дело, 060105 – Стоматология НАЛЬЧИК 2008 УДК 576.9 (075) ББК 28.4 я 73 Г 35 Рецензент: доктор медицинских наук, профессор, зав. отделом молекулярной биологии ЦНИЛ Российского государственного медицинского университета Л.Г. Коркина Авторы: Габрилович И.М., Хараева З.Ф., Блиева Л.З., Хакешева Т.А. Г 35 Частная медицинская микробиология: Лабораторный практикум. – Нальчик: Каб.-Балк. ун-т, 2008. – 89 с. Практикум содержит краткие теоретические сведения по частной медицинской микробиологии. Особое внимание обращено на современные методы диагностики. К каждой теме даются задания, контрольные вопросы, тесты и ситуационные задачи. Издание рассчитано на самостоятельную подготовку студентов, обучающихся по специальностям «Лечебное дело» и «Стоматология». Рекомендовано РИС университета УДК 576.9 (075) ББК 28.4 я 73 Кабардино-Балкарский государственный университет, 2008 2 ВВЕДЕНИЕ Современная микробиология представляет собой комплекс наук, изучающих морфологию, физиологию, генетику, экологию микроорганизмов. Частная медицинская микробиология является одним из разделов микробиологии и изучает свойства патогенных микроорганизмов, особенности патогенеза заболеваний, вызываемых ими, основы лабораторной диагностики и меры специфической профилактики и терапии. При подготовке к лабораторным занятиям студенту необходимо систематизировать учебный материал и представить его в виде ответов на следующие вопросы: систематика возбудителя (семейство, род, виды, и при необходимости – биовары, серовары, хемовары, фаговары); морфология (форма, взаимное расположение, окраска по Граму, подвижность, наличие спор и капсул); особенности физиологии (способ дыхания, тип питания, набор элективных питательных сред для данного возбудителя, особенности роста на искусственных питательных средах); антигенное строение; факторы вирулентности (адгезины, инвазины, токсины, факторы персистенции); патогенез заболевания (источник инфекции, пути передачи, входные ворота, стадии патогенеза); особенности лабораторной диагностики (материал для исследования, применяемые методы исследования, схема диагностики); методы специфической профилактики и терапии. В связи с этим планом разбора свойств патогенного микроорганизма в данном лабораторном практикуме систематизирован специфический научный материал. Особое внимание обращено на современные методы диагностики, помимо контрольных вопросов к каждому занятию имеются тесты и ситуационные задачи, необходимые студентам для самоконтроля. 3 ТЕМА 1. Микробиологическая диагностика холеры Возбудителями холеры являются Vibrio cholerae (классический холерный вибрион) и Vibrio eltor (вибрион Эль-Тор). Систематика. Семейство – Vibrionaceae, род – Vibrio, вид – cholerae. Существует 4 биовара – cholerae, eltor, proteus, albensis. Патогенными для человека являются биовары – cholerae и eltor (истинные холерные вибрионы). Биовары – proteus и albensis – не вызывают у человека холерную инфекцию и называются холероподобными. Морфология. Грамотрицательные, подвижные (монотрих) вибрионы, спор и капсул не образуют. По морфологическим признакам представители биоваров не отличаются. Особенности физиологии. Хемоорганотроф, строгий аэроб, хорошо растет на простых средах щелочной реакции (рН 8,2-9,0). При лабораторной диагностике холеры необходимо решить три задачи: 1) определение принадлежности выделенного микроорганизма к роду Vibrio и виду cholerae; 2) определение принадлежности к истинным или холероподобным холерным вибрионам (табл. 1); 3) определение биовара (табл. 2). Таблица 1 Отличительные особенности холерных и холероподобных вибрионов Признак Ферментация сахарозы Ферментация маннозы Ферментация арабинозы Расщепление крахмала Нитрозоиндоловая проба Разжижение желатины Агглютинация холерной О-сывороткой Холерные вибрионы + + + + + Холероподобные вибрионы -/+ -/+ -/+ - + Таблица 2 Отличительные особенности биоваров eltor и cholerae Признак Гемолиз эритроцитов Лизис холерным фагом Лизис фагом Эль-Тор Рост в присутствии полимиксина (40 ед\мл) Реакция Фогес-Проскауера Подавление содой агглютинации холерной О-сыворотки 4 V. cholerae + + V. eltor + + + + - Схема микробиологической диагностики холеры Материал для исследования Для ускоренной диагностики холерной инфекции используют методы микроагглютинации в фазовом контрасте, реакцию нарастания титра фага, иммунофлюоресцентный и люминесцентный методы. Диагностика в методе Полева – Ермольевой основана на постановке трех тестов: 1. Посев в пробирку с 1 % пептонной водой, с последующим приготовлением мазка из пленки (через 4-6 часов) и морфологическим анализом. 2. Постановка реакции агглютинации с О-холерной сывороткой. 3. Тест на расщепление крахмала. Результаты ускоренного метода Полева – Ермольевой дают информацию о принадлежности выделенного штамма к истинным или холероподобным вибрионам. Лабораторный практикум 1. Изучить морфологию холерных вибрионов в готовых препаратах, зарисовать. 5 2. Просмотреть посевы на 1 % пептонной воде, приготовить мазки из пленки, окрасить их фуксином, микроскопировать, зарисовать. 3. Разобрать метод ускоренной диагностики холеры Полева – Ермольевой. 4. Ознакомиться с диагностическими и лечебно-профилактическими холерными препаратами (О-холерной сывороткой, холерной вакциной, холерным бактериофагом). Контрольные вопросы 1. Систематика возбудителей холеры. 2. Морфологические особенности V. cholerae. 3. Факторы вирулентности V. cholerae. 4. Механизм действия холерогена. 5. Биохимические особенности холерных вибрионов. 6. Триада Хейберга – значение в дифференцировке холерных вибрионов. 7. Устойчивость холерных вибрионов в окружающей среде. 8. Антигенное строение холерного вибриона. 9. Неагглютинирующиеся холерные вибрионы (НАГи) – особенности и эпидемиологическое значение. 10. Особенности вибриона Эль-Тор, эпидемиологическое значение. 11. Принципы дифференцировки истинных и холероподобных вибрионов. 12. Принципы дифференцировки биоваров cholerae и eltor. 13. Источники заражения при холере. 14. Патогенез холеры. 15. Особенности постинфекционного иммунитета при холере. 16. Особенности взятия и доставки материала при диагностике холеры. 17. Сущность реакции Фогес – Проскауера (реакция холерарот). 18. Сущность феномена Исаева – Пфейффера. 19. Принцип лабораторной диагностики холеры. 20. Ускоренный метод диагностики холеры. 21. Принципы специфической и неспецифической профилактики и терапии при холере. Тесты для самоконтроля 1. Возбудитель холерного вибриона относится к семейству: Enterobacteriaceae Vibrionaceae Micrococcaceae Brucellaceae 2. Морфология возбудителя холеры: грамотрицательная палочка подвижен 6 неподвижен вибрион образует капсулу 3. Элективной средой для холерного вибриона является: среда Эндо 1 % пептонная вода желточно-солевой агар щелочной агар среда Сабуро 4. На 1 % пептонной воде V.cholerae (биовар cholerae) растет, образуя: голубоватую пленку мелкозернистый осадок крупнозернистый осадок равномерную муть с небольшим осадком 5. Материалом для исследования при холере является: моча испражнения рвотные массы ликвор кровь промывные воды желудка 6. Среда для накопления культуры холерного вибриона: сахарный бульон пептонная вода МПБ селенитовая среда желточный бульон 7. Основным методом при диагностике на холеру является: серологический бактериологический биологический аллергический микроскопический 8. Пути заражения при холере: через воду через пищу транмиссивно 7 половым путем от носителя 9. Поставьте в нужной последовательности стадии патогенеза холеры: инкубационный период холерная кома холерный энтерит холерный энтероколит холерный алгид 10. Для холерного вибриона характерно: неподвижность активная ферментация сахаров подвижность аэробный тип дыхания продукция экзотоксина образование индола 11. Холероген вызывает: спазм гладкой мускулатуры нарушение всасывания воды в кишечнике гемолиз эритроцитов расплавление тканей поражение ЦНС 12. Антигены холерного вибриона: О-аг Vi-аг К-аг Н –аг R-аг 13. В диагностике холеры применяют методы: бактериофаготипирование серотипирование аллергический метод биологический метод бактериологический 14. Сопоставьте название возбудителя холеры и свойства: 1. V. cholerae а) лизис бактериофагом «В» 2. V. eltor б) бактериофагом «С» 8 в) лизис бактриофагом «Эльтор» г) чувствительность в полимиксину д) устойчивость к полимиксину е) положительная реакция с О-холерной сывороткой 15. Составьте правильную последовательность этапов бактериологической диагностики холерного возбудителя: 1) реакция агглютинации с О-холерной сывороткой 2) определение биохимической активности в триаде Хейберга 3) взятие материала 4) посев на среды 5) определение чувствительности к полимиксину Тестовые ситуационные задачи 1. Из поступившего материала для исследования (испражнения) от больного с диагнозом гастроэнтерит с профузным поносом приготовили первичный мазок. При микроскопии окрашенного по Граму мазка обнаружены полиморфные клетки: кокки, спиралевидные клетки, тонкие изогнутые палочки. При микроскопии препарата методом «висячая капля» обнаружена подвижность микроорганизма. Из исследуемого материала произвели высев на 1 % пептонную воду. Спустя 6-8 ч сделали высев на щелочной агар и вторую пептонную воду. Спустя 18-24 часа на пептонной воде образовалась голубоватая пленка. На щелочном агаре выросли колонии 1-2 мм, с гладкой поверхностью, прозрачные, с голубоватым оттенком. Данные дальнейшего исследования: лактоза-, арабиноза-, сахароза+ (К), манноза+ (К), разжижают желатин. Положительная реакция агглютинации с О-холерной сывороткой, агглютинация с куриными эритроцитами не отмечается. Культура чувствительна к диагностическому бактериофагу «С», полимиксину. Определите возбудитель: Vibrio cholerae биовар cholerae, Vibrio cholerae биовар eltor. 2. Поступил материал для исследования (испражнения) от больного с диагнозом гастроэнтерит с профузным поносом. При микроскопии окрашенного по Граму мазка обнаружены полиморфные клетки: кокки, тонкие изогнутые палочки. При микроскопии препарата «висячая капля» обнаружена подвижность микроорганизма. Из исследуемого материала производят высев на 1 % пептонную воду. Спустя 18-24 часа на пептонной воде образовалась пленка беловатого цвета. На щелочном агаре выросли колонии 1-2 мм, с гладкой поверхностью, прозрачные, бесцветные. Данные дальнейшего исследования: лактоза-, арабиноза-, сахароза + (К), манноза + (К), крахмал+, разжижает желатину. Положительная реакция агглютинации с О-холерной сывороткой и куриными эритроцитами. Культура чувствительна к диагностическому бактериофагу «Эльтор-2», не чувствительна к полимиксину. Реакция Фогес-Проскауера +. Определите возбудитель: Vibrio cholerae биовар cholerae, Vibrio cholerae биовар eltor. 9 ТЕМА 2. Микробиологическая диагностика эшерихиозов Термином «эшерихиозы» обозначают группу инфекционных заболеваний, вызываемых микроорганизмами рода Escherichia. Более чем в 99 % случаев возбудители эшерихиозов относятся к виду coli, в 1 % инфекции вызываются E. hermanii, E. ferqusonii, E. vulneris. Первоначально кишечную палочку относили к комменсалам, однако впоследствии у многих штаммов были обнаружены вирулентные свойства. Систематика. Семейство – Enterobacteriaceae, род – Escherichia, вид – coli. Морфология. Грамотрицательная палочка, спор не образует, подвижность и капсулообразование – признаки вариабельные. По морфологическим признакам представители условно-патогенных и непатогенных штаммов не отличаются. Особенности физиологии. Хемоорганотроф, факультативный анаэроб, растет на универсальных средах, образуя S-формы колоний. Элективными средами являются среда Эндо, Левина и Плоскирева. При лабораторной диагностике первичное разделение патогенных и непатогенных штаммов проводится в реакции агглютинации с ОКА-смесью сывороток (таб. 3). Известно, что определенные серотипы вызывают инфекции мочевыводящих путей, менингиты новорожденных, сепсис и кишечные инфекции. Кишечные инфекции, занимающие ведущее место в структуре эшерихиозов, связаны с 5 основными группами E. coli: ЕТЕС – энтеротоксигенные кишечные палочки; ЕPЕС – энетропатогенные кишечные палочки; ЕIEC-энтероинвазивные кишечные палочки; EHEC – энтерогеморрагические кишечные палочки; EАEC – энтероадгезивные (энтероадгеррентные) кишечные палочки. Таблица 3 Серовары E.coli и их патогенное значение ЕТЕС 06 08 015 020 025 027 063 078 080 085 0114 0115 0123 0148 0153 0159 0167 10 Кишечные инфекции ЕPЕС ЕIЕС ЕHЕС 018 026 044 055 086 0111 0114 0119 0125 0126 0127 0128 0142 0153 028 029 0112 0124 0136 0143 0144 0152 0164 0167 0157 Инфекции мочевыводящих путей Сепсис Менингит 01 02 04 06 07 08 09 011 018 022 025 062 075 01 02 04 06 07 08 011 018 022 025 075 01 06 07 016 018 083 Лабораторный практикум 1. Изучить морфологию кишечных палочек в готовых препаратах, зарисовать. 2. Просмотреть посевы на среде Эндо, описать колонии, приготовить мазки, окрасить их по Граму, микроскопировать, зарисовать. 3. Разобрать этапы бактериологического метода при диагностике эшерихиозов. 4. Разобрать дифференциальные признаки ETEC и вибрионов холеры. Контрольные вопросы 1. Систематика возбудителей E.coli. 2. Морфологические особенности E.coli. 3. Антигенное строение E.coli. Значение антигенной формулы. 4. Факторы вирулентности ETEC. 5. Факторы вирулентности EPEC. 6. Факторы вирулентности EIEC. 7. Факторы вирулентности EHEC. 8. Санитарное значение E.coli. 9. Роль E. coli. как представителя нормальной микрофлоры. 10. Принцип лабораторной диагностики кишечных эшерихиозов. Тесты для самоконтроля 1. E. coli принадлежит к семеству: Micrococcaceae Enterobacteriaceae Vibrionaceae Neisseriacae 2. Морфологические свойства эшерихий: крупные, толстые палочки длиной 5-7 мкм мелкие, слегка изогнутые палочки длиной 1-2 мкм грамположительные бактерии не образуют спор могут образовывать капсулу грамотрицательные бактерии 3. Антигены эшерихий: капсульный протективный О-антиген Н-антиген 11 4. Непатогенные кишечные палочки отличаются по ферментации: лактозы глюкозы маннита мальтозы пептона 5. Кишечные палочки характеризуются: нетребовательностью к питательным средам анаэробным способом дыхания грамотрицательной окраской подвижностью не образуют спор 6. Поверхностный антиген кишечных палочек характеризуется: термостабильностью связью с образованием капсулы чувствительностью к формалину способностью разрушаться при длительном кипячении 7. Для выделения энтеропатогенных кишечных палочек применяют: мясо-пептонный агар солевой агар среду Эндо среду Сабуро кровяной агар 8. Материал для диагностики колиэнтеритов: рвотные массы испражнения больного моча материнское молоко спинно-мозговая жидкость 9. Для микробиологического исследования при эшерихиозах используют: реакцию нейтрализации реакцию агглютинации реакцию преципитации метод иммунофлуоресценции посев материала на среду Эндо 12 10. Основными методами при диагностике колиэнтеритов являются: бактериологический микроскопический серологический биологический аллергический 11. Передача колиэнтеритов происходит: алиментарным путем аспирационным путем контактным путем половым путем транмиссивным путем 12. Источником инфекции при колиэнтеритах служат: почва грызуны человек крупный рогатый скот собаки 13. Токсины, продуцируемые кишечной палочкой: эндотоксин гемотоксин некротоксин нейротоксин энтеротоксин 14. Специфическая профилактика колиэнтеритов включает: применение живых вакцин применение химических вакцин использование убитых вакцин отсутствует применение анатоксина 15. Токсины, не продуцируемые кишечной палочкой: эндотоксин гемотоксин нейротоксин энтеротоксин тетанолизин 13 16. Требованиями для питьевой воды являются: колититр не меньше 300 колииндекс более 10 колииндекс не более 3 коли более 500 микробное число не более 100 17. ЭПКП могут вызывать: дизентерию колиэнтерит пищевые отравления холеру сальмонеллез дизентериеподобное заболевание Тестовые ситуационные задачи 1. Поступивший материал для исследования (испражнения) от больного ребенка с диагнозом колиэнтерит засевают на среды Эндо и Левина. Через 24 часа на чашке со средой Эндо выросли колонии круглой формы, с ровным четко очерченным краем, матовой поверхностью, не принимающие цвет среды. Ориентировочная реакция агглютинации на стекле с ОКА-смесью сывороток дала положительный результат. Какие дальнейшие действия следует предпринять: 1) пересев на скошенный агар, 2) на среду Ресселя, 3) на столбик с мочевиной, 4) постановка реакции агглютинации с монорецепторными сыворотками. 2. Поступивший материал для исследования (испражнения) от больного ребенка 1,5 лет с диагнозом колиэнтерит засевают на среды Эндо и Левина. Через 24 часа на чашке со средой Эндо выросли колонии круглой формы, с ровным четко очерченным краем, матовой поверхностью, не принимающие цвет среды. Ориентировочная реакция агглютинации на стекле со смесью ОКА-сывороток дала положительный результат. Данные биохимической активности: лактоза -, сахароза +, глюкоза +, сероводород -, мочевина -. Микроорганизм подвижен. Определите возбудителя заболевания. 3. Поступивший материал для исследования (испражнения) от больного с диагнозом колиэнтерит засевают на среды Эндо и Левина. Через 24 часа на чашке со средой Эндо выросли колонии круглой формы, с ровным краем, матовой поверхностью, принимающие цвет среды. Ориентировочная реакция агглютинации на стекле с ОКА-смесью сывороток дала положительный результат. Данные биохимической активности: лактоза +, сахароза +, глюкоза +, сероводород -, мочевина -. Микроорганизм подвижен. Патогенный или непатогенный микроорганизм выделен из материала? 14 ТЕМА 3. Микробиологическая диагностика заболеваний, вызванных сальмонеллами (1). Возбудители брюшного тифа и паратифов А, В, С Систематика. Семейство Enterobacteriaceae, род Salmonella, виды S. typhi (возбудитель брюшного тифа), S.paratyphi A,B,C (возбудители паратифов А, В, С). Морфология. Грамотрицательные, неспорообразующие палочки, подвижные, имеют микрокапсулу, в мазках располагаются беспорядочно. Особенности физиологии. Факультативные анаэробы, хемоорганотрофы, мезофилы. Элективные питательные среды – висмут-сульфитный агар, среда Рапоппорта (желчный бульон), Эндо, Левина, Плоскирева. Видовую идентификацию производят исходя из ферментативных свойств и антигенного строения. Основными биохимическими показателями при дифференциации видов сальмонелл являются ферментация лактозы, глюкозы, маннита, мальтозы, маннита, выделение сероводорода и индола (табл. 4). Таблица 4 Биохимическая активность сальмонелл Вид Сахаролитическая активность Л С S.typhi - - S.paratyphi A,B,C - - S.enteritidis - - S.typhimurium - - Г + (К) + (КГ) + (КГ) + (КГ) Мл + (К) + (КГ) + (КГ) + (КГ) Мн + (К) + (КГ) + (КГ) + (КГ) Протеолитическая активность H 2S индол + - + - + - + - Антигенное строение: сальмонеллы имеют О-антиген (соматический) и Нантиген (жгутиковый). Н-аг может существовать в двух фазах – специфической (1 фаза или α) и неспецифической (2 фаза или β). Так как сальмонеллы имеют микрокапсулу, то обнаруживается и К-аг (Vi-аг). Для серологической диагностики сальмонелл применяется классификация по Кауфману – Уайту (табл. 5). Серологическая диагностика тифо-паратифозных заболеваний В связи с тем, что высеять возбудителя болезни не всегда удается, значительную помощь в лабораторной диагностике кишечных заболеваний оказывают серологические исследования. 15 Таблица 5 Классификация сальмонелл по антигенным свойствам (схема Кауфмана – Уайта) Группа Вид О-аг А S. paratyphi A S. paratyphi B S. typhimurium S. derbi S. heidelberg S. paratyphi C S. cholerae suis S. newport S. typhi S. enteritidis S. dublin S. london S. anatum S. senftenberg 1,2,12 1,4,5,12 1,4,5,12 1,4,12 4,5,12 6,7,Vi 6,7 6,8 9,12, Vi 1,9,12 1,9,12 3,10 3,10 1,3,19 В С D E Н-аг 1 фаза 2 фаза а b 1,2 i 1,2 f,g r 1,2 c 1,5 c 1,5 e,h 1,2 d g,m g,p l,v 1,6 e,h 1,6 g,s,t - В крови больного брюшным тифом или паратифами А,В,С с 8-10 дня заболевания (с момента проявления симптомов болезни) появляются антитела к О- и Н-антигенам. Образующиеся антитела обнаруживаются в крови с помощью реакции агглютинации Видаля. Реакцию Видаля нельзя считать основным диагностическим методом, так как существуют следующие случаи ложноположительных результатов: 1. В случае ранее перенесенного заболевания (анамнестический Видаль). 2. В случае ранее проведенной вакцинации (прививочный Видаль). 3. В случае проживания пациента в эндемичном по брюшному тифу и паратифам регионе (эндемичный Видаль). 4. При лихорадочных состояниях, беременности (неспецифичный Видаль). Подтверждением истинной реакции Видаля является возрастание титра Оантител (проба спустя 7-8 дней после первичного анализа) или превалирование Н-антител над титром О-антител. При иммунизации брюшно-тифозной вакциной О-антитела к брюшному тифу обнаруживаются в крови вакцинированных недолго, Н-агглютинины сохраняются продолжительное время, опосредуя поствакцинальный иммунитет. Задание 1. Изучить морфологию сальмонелл в готовых препаратах, зарисовать. 16 2. Познакомиться с принципами работы со средой Ресселя. Произвести посев на среду Ресселя бактериальных культур. 3. Произвести ориентировочную реакцию агглютинации с АВСДЕсальмонеллезной сывороткой. Оценить результаты. Контрольные вопросы 1. Каково систематическое положение сальмонелл? 2. Каковы общие морфологические свойства сальмонелл и других представителей семейства Enterobacteriaceae и какие у сальмонелл морфологические особенности? 3. Каково антигенное строение сальмонелл? 4. Какие биохимические свойства сальмонелл являются основными в дифференциальной диагностике? 5. Перечислите источники инфекции при тифе и паратифах. 6. Охарактеризуйте стадии патогенеза брюшного тифа. Перечислите особенности клинического течения паратифов А, В, С. 7. Каковы особенности патогенеза пищевых токсикоинфекций? 8. В чем состоят особенности сальмонеллеза, вызванного S. typhimurium? 9. Какие микробиологические методы используются в диагностике сальмонеллезов? Какие материалы и в какой срок необходимо брать при диагностике брюшного тифа и паратифов? Какой материал берется при диагностике носительства? 10. Как получают монорецепторные сыворотки и для чего они применяются? 11. В чем состоит диагностическая значимость реакции Видаля? Тесты для самоконтроля 1. Систематическое положение возбудителей сальмонелл: род Escherichia род Salmonella семейство Enterobacteriaceae род Shigella семейство Vibrionaceae 2. Морфологические особенности сальмонелл: палочки с закругленными концами перитрихи образуют споры красятся грамотрицательно имеют макрокапсулу 17 3. Характеристика сальмонелл: подвижны неприхотливы к питательным средам имеют Vi- и Н-антигены в организме образуют капсулу образуют споры 4. Основные методы диагностики сальмонеллезов: аллергический серологический микроскопический биологический бактериологический 5. Среда для посева крови больного при подозрении на брюшной тиф: сахарный бульон пептонная вода МПБ казеиновый бульон желчный бульон 6. Среда обогащения для копрокультуры при подозрении на сальмонеллез: сахарный бульон пептонная вода МПБ селенитовая среда казеиновый бульон 7. Основной углевод, входящий в состав дифференциально-диагностических сред для выделения возбудителей кишечных инфекций: лактоза мальтоза сахароза глюкоза маннит 8. Для серодиагностики брюшного тифа применяется реакция: Видаля Хеддельсона Райта Вассермана Преципитации 18 9. Элективная среда для выделения чистой культуры сальмонелл: Леффлера висмут-сульфитный агар желчно-солевой агар Бучина Эндо 10. Из нижеперечисленных родов микроорганизмов к семейству Enterobacteriaceae не принадлежит род: Klebsiella Morganella Staphylococcus Salmonella Shigella Тестовые ситуационные задачи 1. Поступила гемокультура для исследования на присутствие тифознопаратифозных бактерий. Произвели посев на среду Рапопорта. Спустя сутки обнаружены изменения: питательная среда, совершенно прозрачная до посева, становится мутной. На дне флакона обнаруживается грязновато-белый осадок. Из среды с первичным посевом крови сделали высев на чашки с висмутсульфитным агаром и на среду Плоскирева. Спустя сутки на висмут-сульфитном агаре выросли колонии черные с металлическим блеском, окруженные светлым ореолом. На среде Плоскирева колонии прозрачные и бесцветные. При микроскопии мазков, приготовленных из этих колоний видны грамотрицательные палочки. Данные биохимической активности: лактоза-, глюкоза +(К), сероводород+, мочевина-. Микроорганизм подвижен. Определить видовую и родовую принадлежность выделенного микроорганизма: (N. meningitidis, E. coli, S. aureus, N. gonorhoeae, S. typhy, S. paratyphi, Sh. dysenteriae, S. enteritidis). 2. Поступивший материал для исследования (испражнения) от больного с диагнозом колиэнтерит засевают на среды Эндо и Левина и висмутсульфитный агар. Через 24 часа на чашке со средой Эндо обнаружены колонии круглой формы, прозрачные и бесцветные. На висмут-сульфитном агаре колонии черные с металлическим блеском, окруженные светлым ореолом. При микроскопии мазков, приготовленных из этих колоний, видны грамотрицательные палочки. Данные биохимического активности: лактоза -, глюкоза +(К), сероводород+, мочевина-. Микроорганизм подвижен. На основе имеющихся данных предположите, какой выделен микроорганизм? Какие методы необходимо применить для более точной идентификации микроорганизма. (E. coli, S. aureus, Salmonella typhy, Salmonella paratyphi А/В , Shigella dysenteriae, Salmonella enteritidis)? 19 ТЕМА 4. Микробиологическая диагностика заболеваний, обусловленных сальмонеллами (II) Сальмонеллезами, как правило, называют острые кишечные заболевания, вызванные сальмонеллами, кроме антропонозов – брюшного тифа и паратифов А, В, С. Наиболее часто сальмонеллезы протекают в виде гастроэнтерита и токсико-септического заболевания детей первых лет жизни. Сальмонеллезный гастроэнтерит может быть обусловлен сотнями сероваров, относящихся к разным подродам и сероварам групп В, С, D, E: S. enteritidis, S. cholerae-suis, S. typhimurium, S. anatum и др. Токсико-септическая форма у детей чаще вызывается штаммами S. typhimurium, обладающими высокой инвазивностью, множественной антибиотикоустойчивостью, резистентностью к дезинфектантам, способностью выделять энтеротоксин. Заболевание протекает в тяжелой форме, дает высокую летальность, в палатах новорожденных и др. детских учреждениях возможны вспышки внутригоспитальных инфекций, вызванных S. typhimurium. Основными источниками заражения у человека при гастроэнтерите являются мясо и яйца домашних птиц (50 %), крупный рогатый скот, свиньи, овцы, лошади. Инфицированные животные выделяют возбудителей с молоком, мочой, калом, слюной. Возбудитель передается с мясом и мясными продуктами. Реже выявляются поражения, вызванные употреблением рыбы, овощей и фруктов. Заболевание регистрируется повсеместно и характеризуется сезонным пиком – май-сентябрь. Основным методом диагностики является бактериологический метод (см. схему). Схема бактериологического исследования при диагностике сальмонеллеза 20 Задание 1. Оценить результаты биохимической активности исследуемых культур при посеве на среду Ресселя. Рассмотреть возможные варианты результатов в случае идентификации сальмонелл разных видов, эшерихий (условнопатогенных и непатогенных). 2. Агглютинировать культуры, не ферментирующие лактозу с типовыми Осыворотками сальмонелл. 3. Поставить реакции Видаля, для чего сделать 2 ряда разведений исследуемой сыворотки (1:100, 1:200, 1:400, 1:800). В пробирки 1 ряда внести 2-3 капли О-диагностикума, в пробирки 2 ряда – Н-диагностикума, встряхнуть и инкубировать в термостате. Контрольные вопросы 1. Сальмонеллы – возбудители пищевых токсикоинфекций: систематика, морфология, культивирование. 2. Особенности S. typhimurium. 3. Принципы лабораторной диагностики сальмонеллеза: взятие материала, посев на элективные среды, вид колоний, оценка биохимической активности, реакции агглютинации. 4. Среда Ресселя: значение и особенности применения при лабораторной диагностике. 5. Реакция Видаля – принцип постановки и значение. 6. Ложноположительная реакция Видаля и ее отличие от истинной положительной серологической реакции. Тесты для самоконтроля 1. Систематическое положение возбудителей сальмонеллеза: род Escherichia род Salmonella семейство Enterobacteriaceae род Shigella семейство Vibrionaceae 2. Характеристика сальмонелл-возбудителей пищевых токсикоинфекций: подвижны неприхотливы к питательным средам имеют Vi- и н-антигены в организме образуют капсулу образуют споры 21 3. Основные методы диагностики сальмонеллезов: аллергический серологический микроскопический биологический бактериологический 4. Возбудителем сальмонеллеза пищевой токсикоинфекции является: S. paratyphi S. enterocolitica S. derbi S. typhi S. enteritidis 5. Материалом при диагностике сальмонеллеза является: кровь желчь испражнения ликвор моча 6. Среда для посева при подозрении на сальмонеллез: сахарный бульон пептонная вода МПБ висмут-сульфитный агар желточный бульон 7. Среда обогащения для копрокультуры при подозрении на сальмонеллез: сахарный бульон пептонная вода МПБ селенитовая среда казеиновый бульон Тестовые ситуационные задачи 1. Поступивший материал для исследования (испражнения) от больного с диагнозом острое кишечное заболевание засевают на среды Эндо и Левина и висмут-сульфитный агар. Через 24 часа на чашке со средой Эндо обнаружены колонии круглой формы, прозрачные и бесцветные, а также колонии, принимающие цвет среды. На висмут-сульфитном агаре колонии черные с металлическим бле22 ском, окруженные светлым ореолом. При микроскопии мазков, приготовленных из обоих типов колоний, видны грамотрицательные палочки. Данные биохимической активности микроорганизмов из 1 типа колоний: лактоза+, глюкоза+КГ, сероводород-. Данные биохимии бактерий из 2 типа колоний: лактоза-, глюкоза+ (КГ), сероводород+, мочевина–. Оба микроорганизма подвижны. Определите родовую принадлежность выделенных микроорганизмов. 2. Поступивший материал для исследования (испражнения) от больного с диагнозом острое кишечное заболевание засевают на среды Эндо и Левина и висмут-сульфитный агар. Через 24 часа на чашке со средой Эндо обнаружены колонии круглой формы, прозрачные и бесцветные. На висмутсульфитном агаре колонии черные с металлическим блеском, окруженные светлым ореолом. При микроскопии мазков, приготовленных из этих колоний видны грамотрицательные палочки. Данные биохимической активности: лактоза-, глюкоза + (КГ), сероводород +, мочевина –. Микроорганизм подвижен. 1. Определите родовую принадлежность микроорганизма (Escherichia, Salmonella, Shigella) 2. Что следует предпринять для дальнейшей идентификации возбудителя заболевания (пересев на скошенный агар, на среду Ресселя, на столбик с мочевиной, серологическую диагностику)? ТЕМА 5. Микробиологическая диагностика дизентерии Термином дизентерия (шигеллез) обозначают инфекционное заболевание, протекающее с поражением слизистой толстого кишечника, вызванное бактериями рода Shigella. Дизентериеподобное заболевание вызывают EIEC и дизентерийная амеба. Систематика. Возбудители бактериальной дизентерии относятся к роду Shigella (семейство Enterobacteriaceae) (табл. 6). Морфология. Грамотрицательные, споронеобразующие, неподвижные, капсулонеобразующие палочки. Особенности физиологии. Хемоорганотрофы, мезофилы, факультативные анаэробы. Элективными средами являются: Эндо, Левина, Плоскирева, средой обогащения – селенитовый бульон. Человек – единственный природный резервуар шигелл, основной путь передачи – фекально-оральный, контактно-бытовой. Материалом для исследования являются испражнения, продукты и вода. При хранении взятого материала более 24 ч даже в консервирующих растворах вероятность выделения шигелл чрезвычайно низка. Для бактериологической диагностики шигеллезов достаточно провести биохимическое и серологическое исследования. Серологическое исследование при дизентерии состоит в постановке реакции агглютинации или РПГА. Этот метод дает возможность ретроспективно поставить диагноз при стертых формах, а также может способствовать установлению вида возбудителя. Аллергическая проба ставится редко. Для постановки внутрикожной пробы применяют препарат «дизентерин» – комплекс белков Sh. flexneri и Sh. sonnei. 23 Таблица 6 Классификация шигелл Подгруппа Подгруппа А Sh. dysentheriae Подгруппа В Sh. flexneri Серотип и подтип 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1a 1b 2a 2b 3a 3b 3c 4a 4b 5a 5b 6 Подгруппа С Sh. boydii Подгруппа D Sh. sonnei 24 Антиген Типовой Групповой I I II II III III III IV IV V V VI 1-15 3,4 3,4,6 3,4 7,8 6,7,8 3,4,6 7,8 3,4,6 3,4 3,4,6 7,8 3,4 3,4 Вид Григорьева – Шига Штуцера – Шмитца Ларджа – Сакса Провизорный newcasle Ферментация маннита Не ферментируют маннит Ферментируют маннит Ферментируют маннит Ферментируют маннит, на 48 ч лактозу и сахарозу Схема бактериологической диагностики дизентерии Лабораторный практикум 1. Бактериологическая диагностика дизентерии: а) просмотреть посевы на среде Эндо, описать колонии; б) агглютинировать на стекле с поливалентной сывороткой – АВСD; в) отсеять часть колонии на среду Ресселя; г) оценить ферментацию по раннее засеянной среде Ресселя. 2. Диагностические и лечебно-профилактические препараты Ознакомиться с основными препаратами, применяемыми при диагностике, лечении и профилактике заболеваний, вызванных энтеробактериями. Контрольные вопроcы 1. Систематика шигелл. Серологическая классификация. Значение серологических групп А, В, С, Д. 25 2. Морфологические особенности шигелл. 3. Культуральные особенности шигелл. 4. Антигенное строение шигелл. 5. Факторы вирулентности шигелл. 6. Источники и пути передачи дизентерии. 7. Патогенез дизентерии. 8. Какие методы диагностики применяются при дизентерии? 9. Особенности взятия и транспортировки материала при диагностике дизентерии. 10. Сущность и значение кератоконъюктивальной пробы. 11. Каково значение серологического метода диагностики дизентерии? 12. Значение аллергического метода диагностики. 13. Особенности Sh. dysenteriae. 14. Особенности Sh. flexneri. 15. Особенности Sh. flexneri (newcasle). 16. Особенности Sh. boydii. 17. Особенности Sh. sonnei. Тесты для самоконтроля 1. Систематическое положение возбудителей дизентерии: род Escherichia род Salmonella семейство Enterobacteriaceae род Shigella семейство Vibrionaceae 2. Возбудители дизентерии были изучены: Шига Пастером Кохом Мечниковым Григорьевым Флекснером 3. Морфологические особенности шигелл: мелкие полиморфные палочки палочки с закругленными концами перитрихи образуют споры красятся грамотрицательно 4. Характеристика шигелл: подвижны 26 неприхотливы к питательным средам имеют Vi- и н-антигены в организме образуют капсулу имеют о- и к-антигены 5. Классификация рода шигелл основана на: тинкторальных свойствах токсинообразовании морфологии антигенном строении расщеплении сахаров 6. Для Sh. dysentheriae характерна: ферментация маннита отсутствие ферментации маннита образование экзотоксина образование газа при ферментации глюкозы ферментация лактозы 7. Основные свойства шигелл: высокая патогенность для животных действие эндотоксина образование ферментов агрессии отсутствие подвижности 8. Дизентерия: сопровождается поражением тонкого кишечника передается через предметы обихода, игрушки преобладает в зимнее время года чаще вызывается возбудителями вида Шига после себя оставляет нестойкий иммунитет 9. Заражение дизентерией происходит: воздушно-капельным путем алиментарным путем трансмиссивно через кожу половым путем 10. Иммунитет при дизентерии: прочный нестойкий типоспецифичный видоспецифичный 27 11. При диагностике дизентерии применяют методы: аллергический серологический микроскопический биологический бактериологический 12. Shigella Sh. flexneri характеризуется: ферментацией маннита отсутствием ферментации маннита ферментацией лактозы отсутствием ферментации лактозы образованием экзотоксина Шига 13. Sh. newcasle отличаются от других шигелл: по ферментации маннита по антигеному строению по образованию газа при ферментации лактозы антигенной однородностью ферментацией лактозы 14. Sh. sonnei отличаются от других шигелл: сбраживают лактозу на 2 сутки антигенной структурой устойчивостью во внешней среде легкостью диссоциации на s- и r-формы разжижжением желатины Тестовая ситуационная задача Поступивший материал для исследования (испражнения) от больного с диагнозом острое кишечное заболевание засевают на среды Левина и Плоскирева и селенитовую среду. Через 24 часа на чашках со средами Левина и Плоскирева обнаружены колонии круглой формы, прозрачные и бесцветные, приподнятые над поверхнотью питательной среды. При микроскопии мазков, приготовленных из этих колоний, видны грамотрицательные палочки. Данные биохимической активности: лактоза-, глюкоза +(К), сероводород–, мочевина-. Микроорганизм неподвижен. 1. Определите родовую принадлежность микроорганизма (Escherichia, Salmonella, Shigella) 2. Что следует предпринять для дальнейшей идентификации возбудителя заболевания (пересев на скошенный агар, на среду Ресселя, на столбик с мочевиной, серологическую диагностику)? 28 ТЕМА 6. Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных условно-патогенными энтеробактериями В семейство Enterоbacteriaceae входит ряд представителей условнопатогенных бактерий, этиологическая роль которых при различных заболеваниях в последние годы резко возросла. Среди них представители родов Klebsiella, Proteus, cемейства Pseudomonadaceae род Pseudomonas. Морфология. Основной морфологической особенностью клебсиелл является наличие макрокапсулы, превышающей по своему диаметру величину самой бактериальной клетки (палочковидной формы) в несколько раз. Клебсиеллы грамотрицательны, неподвижны, спор не образуют, в мазках располагаются беспорядочно. Бактерии рода Proteus также являются грамотрицательными палочками, спор и капсул не образуют, подвижны. Синегнойная палочка в качестве защитной структуры имеет слизистый чехол, неподвижна, спор не образует грамотрицательные. Особенности физиологии. Клебсиеллы и протей являются факультативными анаэробами по типу дыхания, хемоорганотрофы, мезофиллы. Не требовательны к питательным средам. Особенностью роста клебсиелл на искусственных плотных средах является слизистый характер роста. Для протея характерно образование феномена «роения» при росте на плотных питательных средах, для P. vulgaris видовым культуральным признаком является «ползучий рост» при посеве в конденсационную каплю по методу Шукевича. Синегнойная палочка является строгим аэробом, хорошо растет в универсальных средах. Большинство штаммов продуцируют пигмент, который имеет цвет от серого до ярко-синего. Так как пигмент P. aeruginosa является водорастворимым, при росте на плотных питательных средах окрашивается прилегающая часть среды, у пациентов с синегнойной раневой инфекцией повязки также окрашиваются в сине-зеленый цвет. Особенности патогенеза заболеваний, вызванных условно-патогенными энтеробактериями. Протеи нередко обнаруживают при хронических инфекциях мочевыводящих путей, а также при сепсисе, пневмониях (воспалении лёгких) и очаговых поражениях у ослабленных больных. Первое место по частоте обнаружения занимает Proteus mirabilis, затем следует Proteus morganii и Proteus rettgeri. Реже выделяют Proteus vulgaris. Протеи способны образовывать фермент уреазу, которая разлагает мочевину до аммиака, что способствует образованию фосфатных камней в почках. Аммиак токсичен для почек, вызывает некроз почечной ткани. K. pneumoniae часто встречаются в качестве возбудителей воспалительных процессов различной локализации. K. ozaenae является возбудителем хронического атрофического заболевания респираторного тракта (озена). K. rhinoscleromatis вызывает хронический гранулематозный патологический процесс в носоглотке, гортани, глотке, трахее, бронхах. 29 Синегнойная палочка, наряду с клебсиеллами и протеем, часто является возбудителем внутрибольничных инфекций, очень чувствительны к синегнойной инфекции дети младшего возраста. P. aeruginosa вызывает локальные и системные инфекционные заболевания: отиты, кератиты, циститы, раневые инфекции (в том числе ожоговые) и др. В лабораторной диагностике основным методом является бактериологический, при эпидемиологическом исследовании применяют методы фаготипирования. Задание 1. Изучить рост клебсиелл на плотных питательных средах. Заполнить таблицу с параметрами колониеобразования. 2. Приготовить мазки по Бурри – Гинсу из жидкой бактериальной культуры клебсиелл. 3. Разобрать метод Шукевича на примере обнаружения протея в пищевых продуктах. Для этого приготовить разведения молока 1:100 и 1:1000 (дистилированной водой). По 0,1мл разведенных проб внести в конденсационную каплю скошенного агара. Разобрать возможные варианты полученных результатов. 4. Изучить особенности культуральных свойств синегнойной палочки. Контрольные вопросы 1. Систематика возбудителей клебсиеллезов. 2. Морфологические особенности K.pneumoniae. 3. Факторы вирулентности клебсиелл. 4. Культуральные особенности представителей разных видов клебсиелл. 5. Особенности патогенеза клебсиеллезных инфекций. 6. Систематика и особенности морфологии бактерий рода Proteus. 7. Факторы вирулентности P. vulgaris и P. mirabilis. 8. Дифференциальная диагностика бактерий рода Proteus. 9. Систематика синегнойной палочки. 10. Морфологические и культуральные особенности синегнойной палочки. 11. Патогенез инфекционных заболеваний, вызванных синегнойной палочкой. Тесты для самоконтроля 1. Из нижеперечисленных родов микроорганизмов к семейству Enterobacteriaceae не принадлежит род: Klebsiella 30 Morganella Pseudomonas Salmonella Shigella 2. При микроскопии мазка мокроты обнаружены грамнегативные палочки с закруглёнными концами, окруженные капсулой. Можно предположить, что это: Klebsiella S. pneumoniae Legionella pneumophilia S. aureus S. epidermidis 3. Сопоставьте название возбудителя и элективную среду для его выделения: 1. Salmonella typhi а) среда Сабуро 2. E. coli б) Среда Эндо 3. Sh. zonnei в) висмут-сульфитный агар 4. Klebsiella pneumoniae г) среды Левина и Плоскирева д) желточно-солевой агар е) Среда Кларка ж) желчный бульон 4. Особенности клебсиелл: наличие капсулы выраженная подвижность дают ползучий рост дают слизистый рост грамположительная окраска 5. Клебсиеллы имеют антигены: жгутиковый капсульный О-антиген Vi-аг 6. Клебсиеллы вызывают: дизентерию пневмонию пищевые отравления озену риноскперому колиэнтерит 31 7. Морфологической особенностью синегнойной палочки является: капсула слизистый чехол подвижность спорообразование 8. Культуральными особенностями синегнойной палочки являются: пигментообразование слизистый рост образование R-колоний образование пиоцианина 9. Культуральной особенностью P. vulgaris является: слизистый рост образование R-колоний «ползучий рост» пигментообразование 10. К представителям какого семейства относятся клебсиеллы? Enterobacteriaceae Campylobacter Pseudomonas 11. В настоящее время существуют следующие виды клебсиелл: K. pneumoniae K. еnterocolitica K. rhinoscletromatis K. ozaenae 12. К путям передачи клебсиеллезной инфекции относят: Внутриутробный Контактно-бытовой Воздушно-капельный Фекально-оральный 13. Для клебсиеллезной инфекции характерны следующие утверждения: Наибольшая частота регистрации в раннем возрасте; Недоношенные дети и дети с отягощенным преморбидным фоном наиболее подвержены заболеванию; В клинической картине преобладают проявления септического процесса; Редко являются причиной возникновения ОКИ у детей. 32 14. Для желудочно-кишечной формы клебсиеллеза у детей первого года жизни характерны: острое начало заболевания; развитие заболевания у недоношенных и детей с отягощенным преморбидным фоном; тяжесть состояния обусловлена развитием токсикоза с эксикозом. Тестовая ситуационная задача При исследовании материала (раневое отделяемое) произведен посев на кровяной агар и среду Эндо. На вторые сутки на кровяном агаре нет признаков роста, на среде Эндо обнаружены колонии, принимающие цвет среды, слизистой консистенции. При микроскопическом методе обнаружены грамотрицательные палочки, расположенные в мазках беспорядочно. При окраске по Бурри – Гинсу выявлена капсула. Определите возбудителя. ТЕМА 7. Микробиологическая диагностика дифтерии и коклюша Дифтерия – острое инфекционное заболевание преимущественно детского возраста, проявляющееся глубокой интоксикацией и характерным фибринозным воспалением в месте локализации возбудителя. Систематика. Возбудителем являются токсигенные штаммы C. diphtheriae, имеющие 3 биовара: gravis, intermedius, mitis, отличающиеся по культурально-биохимическим характеристикам и вызывающие разное по степени тяжести течение заболевания (см. табл. 7). Нетоксигенные штаммы вызывают фарингит, артрит, эндокардит. Морфология. Дифтерийный возбудитель имеет форму тонкой и слегка изогнутой палочки с утолщениями на концах, булавовидной формы (coryne – булава), Г+, спор и капсул (микрокапсула иногда определяется) не образует, неподвижен. В старых культурах выражен полиморфизм, и наряду с типичными формами можно обнаружить кокковидные, нитевидные и ветвящиеся бактерии. Содержат метахроматические включения – зерна волютина, тельца Бабеша – Эрнста (по химической природе – полиметафосфаты). Для их обнаружения применяют метод Нейссера. В отличие от дифтероидов, C. diphtheriae в мазках располагаются под углом друг к другу, напоминая римские цифры. Морфологические отличия биоваров: Gravis – короткие неправильной формы палочки с малым количеством метахроматических гранул (волютиновых зерен, или тельцев Бабеша – Эрнста) 33 Mitis – длинные полиморфные палочки, содержащие большое количество волютиновых зерен. Физиология. Факультативный анаэроб с признаками аэрофильности, мезофил, хемоорганотроф. Растет в средах с добавлением сыворотки крови, АМК, витаминов. Элективными средами являются свернутые сывороточные среды Ру и Леффлера. Наибольшее распространение получили среды с добавлением теллурита – кровяно-теллуритовый агар, на котором разные биовары (табл. 7) образуют разные типы колоний. Gravis – серые с радиальной исчерченностью, неровными краями, среднего размера (2-4 мм), ломкие при прикосновении. На бульоне растут в виде пленки, бульон прозрачен, на дне может быть осадок. Mitis – темно-серые или черные, гладкие, блестящие, с ровными краями, мелкого размера, вязкой консистенции. На бульоне растут в виде диффузного помутнения с образованием осадка. Intermedius – чаще серого цвета, мелкого размера, с гладкой поверхностью. На бульоне образуют незначительное помутнение. При лабораторной диагностике необходимо решить три основные задачи: 1) установление рода и вида (отличия от дифтериоидов); 2) определение биовара; 3) определение токсигенности (заражают куриный эмбрион – дифтерийный токсин вызывает гибель культуры клеток или определяют продукцию токсина методом преципитации в геле). Материалом является слизь из носа и зева, пленки с миндалин или других слизистых оболочек в месте входных ворот возбудителя. Лечение и профилактика. Для специфической терапии применяют антитоксическую противодифтерийную сыворотку в дозах от 5000 до 50000 МЕ в зависимости от степени тяжести. Для плановой специфической профилактики применяют вакцины – АКДС, АДС, АДС-М, АКДС – вводят с 3-месячного возраста, троекратно с перерывом в 1,5 месяца. АДС-М – применяется в случае необходимости прививания ослабленного контингента при эпидемических вспышках, содержит уменьшенное количество антигена. АДС – применяется для детей, переболевших коклюшем, и детей старше 3 лет. 34 Таблица 7 Сравнительная характеристика биоваров Corynebacterium diphtheriae Свойства Морфологическая характеристика 1. Форма и размер клетки Биовар gravis intermedius mitis Короткие, толстые палочки Малое Среднее Культуральные особенности 1. Рост на плотных средах с теллуритом Крупные, серочерные колонии, R-формы Мелкие, серочерные колонии S-формы 2. Рост в жидкой питательной среде Поверхностная пленка, бульон прозрачный, на дне осадок Небольшое помутнение с постепенным появлением осадка Диффузное помутнение с образованием осадка +\- - + + + +\- + - + - 2. Количество зерен волютина (полиметафосфаты, тельца Бабеша – Эрнста) Биохимические свойства 1. Гемолиз на кровяном агаре 2. Ферментация крахмала 3. Цистиназа 4. Сахароза Длинные, изогнутые палочки Значительное (расположены по полюсам бактериальной палочки) Мелкие, черные колонии S-формы Коклюш – острое инфекционное заболевание, основным симптомом которого являются приступы судорожного кашля, преимущественно болеют дети. В 1900 г. бельгийскими учеными Борде и Жангу обнаружен возбудитель коклюша – Bordetella pertussis. Возбудителем сходного заболевания, но 35 протекающего в более легкой форме, является Bordetella parapertussis (открыт в 1937 г.). Bordetella bronchiseptica вызывает коклюшеподобное заболевание. Морфология. Грамотрицательные, овоидные палочки, окрашиваются биполярно, спор не образуют, иногда обнаруживается капсула. Bordetella pertussis, parapertussis – неподвижны. Bordetella bronchiseptica – перитрих. Физиология. Строгие аэробы, хемоорганотрофы, при культивированиии необходимо добавлять 3 АМК (ауксотрофы): пролин, цистеин, глутаминовая кислота. Элективной средой является картофельно-глицериновый агар с добавлением крови – среда Борде – Жангу и казеиново-угольный агар. Основной фактор патогенности – экзотоксин, под действием которого происходит некроз слизистой оболочки задней стенки глотки, создается постоянный поток сигналов в головной мозг (продолговатый мозг), в котором формируется стойкий очаг возбуждения, следствием чего являются спазматические приступы кашля. Лечение и профилактика. Специфическая терапия отсутствует. Для плановой специфической профилактики применяют вакцину АКДС. Задание 1. Изучить морфологию возбудителей дифтерии в готовых препаратах, зарисовать. 2. Изучить морфологию возбудителя коклюша в готовых препаратах, зарисовать. 3. Разобрать метод определения токсигенности C. diphtheriae. 4. Разобрать пробу Шика и ее значение. 5. Ознакомиться с диагностическими и лечебно-профилактическими препаратами (антитоксической сывороткой, вакцинами). Контрольные вопросы 1. Систематика, морфология и особенности физиологии C. diphtheriae. 2. Методы дифференциации биоваров и значение определения биоваров при диагностике дифтерии. 3. Механизм действия дифтерийного токсина. 4. Метод определения токсигенности выделенной культуры при подозрении на дифтерию. 5. Особенности клинических проявлений дифтерии при нетипичном расположении входных ворот. 6. Специфическая терапия и профилактика дифтерии. 7. Реакция Шика и ее значение. 8. Морфологические и культуральные особенности возбудителя коклюша. 9. Патогенез коклюша. 10. Принципы микробиологической диагностики коклюша. 11. Что представляет собой вакцина АКДС? 36 Тесты для самоконтроля знаний 1. Типичная морфология дифтерийной палочки: барабанная палочка с булавовидными утолщениями на концах веретенообразная форма в виде ракетки овоидной формы 2. Характерные колонии возбудителя коклюша при росте на среде КУА: в виде головы медузы (локона, львиной головы) мелкие с плотным центром сухие, морщинистые в виде капелек ртути крупные, плоские 3. Сопоставьте название возбудителя и заболевание, которое он вызывает: Bordetella pertussis а) паракоклюш Bordetella parapertussis б)коклюшеподобное заболевание Bordetella bronchiseptica в) коклюш г) пневмония д) туберкулез 4. Сопоставьте название возбудителя и вид колоний на питательной среде (казеиново-угольный агар), которые он образует: 1. Bordetella pertussis а) колонии мелкого размера («капельки ртути», выпуклые, гладкие, вокруг колоний светлый ободок, появляются через 48 часов 2. Bordetella parapertussis б) колонии большого размера («ромашки»), с неровными краями и исчерченной поверхностью, появляются через 12 часов в) колонии среднего размера («капельки ртути», выпуклые, гладкие, появляются через 24 часа 5. Элективной средой для возбудителя коклюша является: среда Эндо среда Сабуро казеино-угольный агар желточной-солевой агар кровяной агар 6. Характерными чертами Bordetella pertussis являются: грамотрицательная окраска 37 палочковидная форма кокковидная форма грамположительная окраска рост колоний через 24 часа рост колоний через 48 часов 7. Методы взятия материала при коклюше: мазок из зева метод «кашлевых пластинок» взятие слизи из задней стенки глотки мазок из носоглотки кровь 8. Возбудителем дифтерии являются токсигенные: Corynebacterium ulcerans Corynebacterium diphtheriae вариант gravis Corynebacterium diphtheriae вариант intermedius Corynebacterium pseudotuberculosis Corynebacterium diphtheriae вариант mitis 9. Элективной средой для возбудителя дифтерии является: среда Эндо кровяно-теллуритовый агар казеино-угольный агар желточной-солевой агар кровяной агар 10. Характерными чертами Corynebacterium diphtheriae вариант mitis являются: взаиморасположение бактерий в мазке под углом друг к другу палочковидная форма кокковидная форма вызывает более легкое течение заболевания рост колоний через 48 часов вызывает более тяжелое течение заболевания 11. Методы взятия материала при дифтерии: мазок из пораженных участков ротоглотки метод «кашлевых пластинок» взятие слизи из задней стенки глотки мазок из носоглотки кровь 12. Типичная морфология дифтерийной палочки 38 барабанная палочка с булавовидными утолщениями на концах веретенообразная форма в виде ракетки овоидной формы Тестовые ситуационные задачи 1. Патологический материал (собирают стерильным тампоном с пораженных участков ротоглотки) засевают на кровяно-теллуритовую среду. Через 24 часа выросли колонии серого цвета, выпуклые, с ровными краями; еще через сутки колонии приобрели металлический оттенок, стали крошащимися. При микроскопии (окраска по Нейссеру) обнаружены палочки с утолщенными концами и выраженной внутриклеточной исчерченностью, взаиморасположение которых напоминает римские цифры X, V. Данные биохимической активности: цистиназа+, глюкоза+, сахароза-, крахмал+, мочевина-, редукция нитратов +. Выделенный микроорганизм обладал токсигенностью (реакция преципитации в геле). Определите возбудителя: Corynebacterium diphtheriae вариант gravis, Corynebacterium diphtheriae вариант mitis, Corynebacterium pseudodiphtheriae. 2. Патологический материал (собирают стерильным тампоном с пораженных участков ротоглотки) засевают на кровяно-теллуритовую среду. Через 24 ч выросли колонии черного цвета, выпуклые, с ровными краями; еще через сутки колонии приобрели металлический оттенок, стали крошащимися. При микроскопировании (окраска по Нейссеру) обнаружены палочки с утолщенными концами, взаиморасположение которых напоминает римские цифры X, V. Данные биохимической активности: цистиназа+, глюкоза+, сахароза-, крахмал-, мочевина-, редукция нитратов+. Выделенный микроорганизм обладал токсигенностью (реакция преципитации в геле). Определите возбудителя: Corynebacterium diphtheriae вариант gravis, Corynebacterium diphtheriae вариант mitis, Corynebacterium pseudodiphtheriae. 3. Поступил материал (слизь с задней стенки глотки) от больного ребенка 1,5 лет со спастическим кашлем. Произвели посев на казеиново-угольный агар. Спустя 48 ч выросли колонии мелкого размера, напоминающие капельки ртути, выпуклые, четко очерченные, с гладкой поверхностью. Вокруг колоний наблюдается светлый ободок. При микроскопии обнаружены грамотрицательные, короткие палочки, некоторые бактерии овоидной формы. Ориентировочная реакция агглютинации с иммунной противококлюшной сывороткой положительная. Произвели высев выделенной культуры на скошенный МП-агар. Через сутки признаков роста микроорганизма нет. Мочевину не разлагает. Отмечалась положительная реакция агглютинации с монорецепторной сывороткой (фактор 1). Определите возбудителя: Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchseptica. 39 4. Материал для исследования, взятый методом «кашлевых пластинок» от больного ребенка 3 лет с диагнозом острый бронхит и спастическим кашлем, засеяли на казеиново-угольный агар. Спустя 24 ч выросли колонии среднего размера, темного цвета, выпуклые, четко очерченные, с гладкой поверхностью. При микроскопии обнаружены грамотрицательные, короткие палочки. Ориентировочная реакция агглютинации с иммунной противококлюшной сывороткой положительная. Произвели высев выделенной культуры на скошенный МП-агар. Через сутки обнаружен видимый рост микроорганизмов. Мочевину не разлагает. Отмечалась положительная реакция агглютинации с монорецепторной сывороткой (фактор 12). Определите возбудителя: Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchseptica. ТЕМА 8. Микробиологическая диагностика чумы, туляремии, бруцеллеза Чума, туляремия, бруцеллез являются особо опасными зооантропонозными инфекционными заболеваниями. Чума – острое инфекционное заболевание, протекающее по типу геморрагической септицемии. Возбудитель чумы – Yersinia pestis – относится к семейству Enterobacteriaceae. Представляют собой грамотрицательные овоидные палочки, красящиеся биполярно и образующие в макроорганизме капсулу белковой природы. Спор не образует, жгутиков нет. По типу дыхания – строгий аэроб, по типу питания – хемоорганотроф, при оптимальной температуре – психрофил. Палочка чумы дает характерный рост на жидких и плотных питательных средах: на жидких средах Yersinia pestis растет, образуя рыхлую пленку со спускающимися нитями («сталактиты»), на дне образуется осадок, бульон при росте остается прозрачным; на плотных средах Yersinia pestis растет, проходя 3 фазы – 10-12 ч – стадия «битого стекла», 18-24 ч – стадия «кружевных платочков», 40-48 ч – стадия «ромашки». Другие представители рода Yersinia стадии «битого стекла» не имеют. Для дифференциации используют и другие признаки (см. табл. 8) Таблица 8 Дифференциация иерсиний Свойства Подвижность Ферментация рамнозы Ферментация адонита Агглютинация с противочумной сывороткой Лизис чумным фагом Y. pestis - Y. pseudotuberculosis + Y. enterocolitica + +++ + + + - + - - Лабораторное исследование при чуме имеет большое значение, так как своевременно поставленный диагноз позволяет не только эффективно провести ран40 нее лечение больного, но и быстро развернуть комплекс противоэпидемических мероприятий. Микробиологический диагноз чумы включает микроскопический, бактериологический и биологический методы, фаготипирование. Дополнительными методами являются серологические реакции (РПГА, РН). Бруцеллы выделены в род с неопределенной семейственной принадлежностью. Их подразделяют на множество видов, наибольшее значение имеют 3 вида: Br. melitensis, Br. abortus, Br. suis (табл. 9). Таблица 9 Дифференциация видов бруцелл Вид Br. melitensis Br. abortus Br. suis Рост в присутствии красителей тионина РА с сывороткой ВМ РА с сывороткой ВА + + + – + – – + – – + – Потребность в СО2 Образование Н 2S фуксина – – + – + ++ Бруцеллы имеют вид коккобактерий или коротких палочек, располагаются отдельно или парами (реже небольшими группами), грамотрицательны, не образуют спор и капсул. Бруцеллы – строгие аэробы, растут медленно, 3-10 суток. Требовательны к составу питательных сред, растут на печеночном агаре, печеночном бульоне, сывороточно-декстрозном агаре, агаре из картофельного настоя с сывороткой крови и др. Клиническое течение бруцеллеза весьма разнообразно, поэтому микробиологическая диагностика имеет большое значение. В начальном периоде наиболее вероятно выделение гемокультуры. Для определения видов бруцелл используют их основные дифференциальные признаки (см. таб. 9). Наиболее распространенным методом является серологический метод: ускоренная реакция на стекле – реакция Хеддльсона и развернутая РА – реакции Райта. Кроме того, проводится аллергическая проба Бюрне с бруцеллином. Положительная реакция появляется через 1-2 недели после контакта в бруцеллами и сохраняется годами. Возбудитель туляремии (F. tularensis) представляет собой очень мелкие кокковидные или палочковидные бактерии. Грамотрицательны, спор не образуют, в организме образуют небольших размеров капсулу. Строгий аэроб, требователен к питательным средам, непосредственно из первичного посева материала, полученного от больного, выделить возбудителя не удается. Для диагностики туляремии используют микроскопический, биологический, серологический и аллергический методы. Аллергическая проба ста- 41 вится с тулярином. Кожная проба высоко специфична и проявляется у больных с 3-5 дня заболевания. Задание 1. Изучить морфологию бактерий рода Yersinia в готовых препаратах, зарисовать. 2. Изучить морфологию F. tularensis в готовых препаратах, зарисовать. 3. Ознакомиться с постановкой реакции Хеддльсона и реакции Райта. 4. Ознакомиться с постановкой кровяно-капельной реакции с туляремийным диагностикумом. Контрольные вопросы 1. Общая характеристика особо опасных инфекций: признаки, классификация. 2. Систематика, морфология и особенности физиологии Y. pestis. 3. Антигенное строение Y. pestis. 4. Факторы вирулентности Y. pestis. 5. Эпидемиология и патогенез чумы. 6. Принципы лабораторной диагностики чумы. 7. Специфическая профилактика чумы. 8. Систематика, морфология и особенности физиологии бруцелл. 9. Антигенное строение и факторы вирулентности бруцелл. 10. Эпидемиология и патогенез бруцеллеза. Специфическая профилактика. 11. Принципы видовой идентификации бруцелл, серологические методы, значение определения видов. 12. Систематика, морфология и особенности физиологии возбудителя туляремии. 13. Факторы вирулентности возбудителя туляремии. 14. Эпидемиология и патогенез туляремии. Специфическая профилактика. 15. Принципы лабораторной диагностики туляремии. Значение биологического метода. Тестовые задания для самоконтроля 1. Возбудитель чумы имеет форму: ракетки палочки с центральной спорой стрептобациллы веретена палочки 2. Возбудитель чумы относится к роду 42 эшерихий коринебактерий клостридий йерсиний сальмонелл 3. Возбудитель чумы: образует капсулу в организме грамположительные палочки грамотрицательные палочки подвижен образует споры 4 . Культивирование возбудителя чумы: оптимальмая температура роста 42 0С строгий анаэроб вызывает почернение среды Вильсона – Блера растет на мясо-пептонном агаре 5. Патогенез бруцеллеза связан с: распространением заболевания через укусы диких животных способностью возбудителя продуировать экзотоксин попаданием спор из почвы заражением с пищей 6. Для микробиологической диагностики бруцеллеза используют: аллергическую пробу микроскопию заражение белых мышей реакцию нейтрализации токсина в опыте на животных реакцию связывания комплемента 7. Для аллергической пробы при диагностике бруцеллеза используют: бактериофаг аутовакцину антитоксическую сыворотку антраксин бруцеллин 8. Специфическая профилактика туляремии проводится с помощью: вакцины Солка анатоксина антитоксической сыворотки 43 антибиотиков вакцины Варлофоломеевой – Ковальского 9. Для возбудителей туляремии характерно: мелкие грамотрицательные палочки образование экзотоксина аэробный тип дыхания анаэробный тип дыхания грамположительные кокки 10. Патогенез туляремии связан с: действием эндотоксина действием экзотоксина поражением продолговатого мозга приемом испорченной пищи аллергизацией организма 11. Для микробиологического исследования при туляремии используют: реакцию агглютинации реакцию нейтрализации биологический метод аллергическую пробу вирусологические методы 12. Для диагностики туляремии не используют: биологический метод аллергический метод серологические реакции заражение курных эмбрионов микроскопический метод Тестовые ситуационные задачи 1. Материал для исследования (пунктат из периферического бубона) засевают в МПБ и МП-агар. На плотной питательной среде спустя 24 часа выросли колонии круглой формы, выпуклые, вокруг колоний прозрачная фестончатая кайма беловатого цвета. В пробирках с МПБ рост отмечается в виде нежной пленки с отростками, отходящими вглубь среды. При микроскопии окрашенного метиленовой синькой мазка обнаружены биполярно окрашенные палочки. Микроорганизм неподвижен при 37 о. Проба с чумным бактериофагом положительная. Данные биохимической активности: глюкоза+, лактоза-, cахароза-, рамноза-, маннит+, сорбит-, арабиноза+, мочевина+, ино44 зит-, индол-. На основе приведенных данных: 1) определите, какой микроорганизм выделен; 2) какой метод исследования следует еще применить. 2. Материал для исследования (мокрота) засевают в МПБ и МП-агар. На плотной питательной среде спустя 24 часа выросли колонии круглой формы, выпуклые, вокруг колоний прозрачная фестончатая кайма беловатого цвета. В пробирках с МПБ рост отмечается в виде нежной пленки с отростками, отходящими в глубь среды. При микроскопии окрашенного метиленовой синькой мазка обнаружены биполярно окрашенные палочки. Микроорганизм неподвижен. Проба с чумным бактериофагом отрицательная. Данные биохимической активности: глюкоза+, лактоза-, cахароза-, рамноза+, маннит+, сорбит-, арабиноза+, мочевина+, инозит-, индол-. На основе приведенных данных определите, какой микроорганизм выделен. ТЕМА 9. Микробиологическая диагностика сибирской язвы Возбудитель сибирской язвы относится к семейству Bacillaceae, к роду Bacillus, виду anthracis. Заболевание сибирская язва является типичным зооантропонозом. Морфология. Грамположительные палочки с обрубленными концами, располагающиеся в цепочку (стрептобациллы). Образуют центрально расположенную спору, не превышающую размер самой бактериальной клетки. При попадании в микроорганизм образуют капсулу, окружающую всю цепочку. Возбудители сибирской язвы неподвижны. Особенности физиологии. Хемоорганотрофы, мезофилы, факультативные анаэробы. Хорошо растут в универсальных питательных средах – мясопептонном бульоне и мясо-пептонном агаре. На агаре образуют типичные Rколонии, в столбике агара растут в виде «перевернутой елочки», в бульоне образуют придонный рост в виде «комочка ваты». В бактериологической диагностике необходимо проводить дифференциацию с антракоидами, непатогенными для человека (см. табл. 10). Отсутствие подвижности, капсулообразования, гемолиза на кровяном агаре, лизис специальным сибиреязвенным бактериофагом, вирулентность для кроликов, тест «жемчужного ожерелья» – признаки, позволяющие отличить возбудителя сибирской язвы от непатогенных для человека антракоидов. Аллергическая проба сибирской язвы состоит в постановке внутрикожной пробы с антраксином – гидролизатом вегетативных форм возбудителя (белково-полисахаридный комплекс). Для санитарного контроля сырья (мех, кожа, шерсть) используется реакция термопреципитации по Асколи. Для специфической профилактики используют сибиреязвенную вакцину СТИ. 45 Таблица 10 Признаки Bacillus anthracis, ложносибиреязвенных микробов и антракоидов Подвижность _ + B. pseudoanthracis слабая _ B. antracoides слабая B. subtilis + Название микроба B. anthraxcis Капсула Рост в бульоне Гемолиз ЛС* Патогенность ** В виде комочка ваты на дне, бульон прозрачен Крошковидный осадок, пленка на поверхности, бульон мутнеет _ К патогенна + С _ Крошковидный осадок, пленка на поверхности, бульон мутнеет + С _ Пленка на поверхности, среда мутная _ С Патогенна только в больших дозах для мышей Патогенна только в больших дозах для мышей непатогенна * – лакмусовая сыворотка (к – краснеет, с – синеет) ** – патогенность для животных в биологическом эксперименте Задание 1. Изучить морфологию возбудителя в готовых препаратах. 2. Разобрать реакцию кольцепреципитации по Асколи: в 2 преципитационные пробирки внести по 0,3 мл преципитирующей сибиреязвенной сыворотки; в опытную пробирку осторожно наслоить 0,3 мл фильтрата термоэкстракта кусочков шерсти, а в контрольную – 0,3 мл 0,9 % NaCl. При наличии комплементраного антигена в пробирке на границе обеих жидкостей появляется мутно-белое кольцо преципитата (не позднее, чем через 15 минут). 46 Схема бактериологической диагностики сибирской язвы Контрольные вопроcы 1. Систематика возбудителя сибирской язвы. 2. Морфологические и культуральные особенности возбудителя сибирской язвы. 3. Патогенез сибирской язвы. 4. Факторы вирулентности B.anthracis. 5. Дифференциальная диагностика возбудителя сибирской язвы от антракоидов. 6. Основные методы микробиологической диагностики сибирской язвы. 7. Значение аллергического метода диагностики. 8. Специфическая профилактика. Тесты для самоконтроля 1. B. antracis принадлежит к семейству: Micrococcaceae Enterobacteriaceae Vibrionaceae Neisseriacae Bacillaceae 47 2. Морфологические свойства возбудителя сибирской язвы: крупные, толстые палочки мелкие, слегка изогнутые палочки длиной 1-2 мм грамположительные микробы не образуют спор могут образовывать капсулу грамотрицательные 3. Антигены возбудителя сибирской язвы капсульный протективный о-антиген н-антиген 4. B. anthracis характеризуются: нетребовательностью к питательным средам анаэробным способом дыхания грамотрицательной окраской подвижностью образуют споры 5. Поверхностный антиген B. anthracis характеризуется: термостабильностью связью с образованием капсулы подразделением на в-, а- и I-антигены чувствительностью к формалину способностью разрушаться при длительном кипячении 6. Материалом для диагностики сибирской язвы являются: рвотные массы испражнения больного моча материнское молоко спинно-мозговая жидкость 7. Для микробиологического исследования при сибирской язве используют: реакцию нейтрализации реакцию агглютинации реакцию термопреципитации метод иммунофлуоресценции посев материала на среду Эндо 48 ТЕМА 10. Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных грамположительными кокками Систематика. Возбудители стафилококковых инфекций относятся к семейству Micrococcaceae, роду Staphyloсoссus. Наибольшее значение в инфекционной патологии человека играют золотистый стафилококк (S. aureus), эпидермальный стафилококк (S. epidermidis). Морфология. Стафилококки – клетки правильной шаровидной формы, грамположительны. В мазах располагаются беспорядочно, неподвижны, не образуют спор и капсул. Особенности физиологии. Стафилококки являются факультативными анаэробами, хемоорганотрофами. Нетребовательны к условиям культивирования, хорошо растут на обычных питательных средах. На плотных питательных средах стафилококки образуют колонии среднего размера, S-формы. Цвет колоний может быть различным у разных штаммов одного и того же вида, в связи с чем не является основным дифференциальным признаком. Антигенное строение. Стафилококки имеют полисахаридные и белковые антигены. К белковым антигенам относится, в частности, поверхностный белок А. Полисахаридные антигены специфичны, что позволяет подразделить стафилококки на серовары. Факторы вирулентности. Стафилококки продуцируют более 30 различных токсичных продуктов и ферментов. Среди токсинов наибольшее значение имеют: гемолизины, лейкоцидин, энтеротоксины, эксфолиатин. К группе ферментов патогенности относятся: плазмокоагулаза, лецитиназа, фосфатазы, протеиназа, ДНКаза и др. Особые патогенные свойства стафилококкам придает поверхностный белок А, обладающий прямой иммунодепрессивной активностью. Стафилококки широко распространены в природе и встречаются практически везде. Источниками инфекции могут быть как больные, так и бактерионосители. Пути передачи – контактный, воздушно-капельный, алиментарный. Особенностью стафилококков является их политропность, то есть потенциальная способность к повреждению любой ткани. В лабораторной диагностике основными методами являются бактериологический и микроскопический. Диагностику проводят на основе признаков колониеобразования и биохимической активности (см. табл. 11). При эпидемиологическом исследовании применяют методы фаготипирования. Таблица 11 Дифференциальные признаки стафилококков Бактериальная культура S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus Пигментообразование +\- Лецитиназа Гемолиз Плазмокоагулаза +\+\- +\+\- + - 49 Систематика. Стрептококки относятся к семейству Streptococcaceae, роду Streptococcus. По строению полисахаридного антигена стрептококки делятся на 21 серогруппу, обозначаемую латинскими буквами (от А до V). Большинство возбудителей стерептококковой инфекции относятся к группе А (S. pyogenes, S. pneumoniae). Морфология. Шаровидные или овальной формы клетки, располагаются, как правило, в цепочку или попарно (S. pneumoniae), грамположительны. Неподвижны, не образуют спор, иногда образуют капсулу. Особенности физиологии. Стрептококки являются факультативными анаэробами, хемоорганотрофами. Лучше растут на питательных средах с кровью и сывороткой. На плотных питательных средах стрептококки образуют колонии мелкого размера, S-формы, сероватого цвета. По характеру роста на кровяном агаре различают α-, β-, γ-гемолитические стрептококки. Факторы вирулентности. Патогенность стрептококков связана с токсинообразованием, ферментами агрессии, поверхностным белком М, капсулой (у пневмококков). Для диагностики стрептококковых инфекций используются микроскопический, бактериологический и серологический методы. Задание 1. Приготовить мазки и окрасить по Граму. Изучить морфологию стафилококков и стрептококков. 2. Изучить лецитиназную активность стафилококков при посеве на агар Чистовича. 3. Поставить тест на плазмокоагулазу. Оценить результаты. Ознакомиться с возможностью определения фибринолизирующей активности. Контрольные вопросы 1. Каково систематические положение стафилококков и стрептококков? 2. Морфология грамположительных кокков. Каковы морфологические особенности пневмококков? 3. Антигенное строение грамположительных кокков. 4. Факторы вирулентности грамположительных кокков. 5. Особенности патогенеза стафилококковых инфекций. 6. Особенности стрептококковых инфекций. 7. Для чего производится фаготипирование стафилококков? 8. Специфическая профилактика и терапия стафилококковых и стрептококковых инфекций. 50 Тесты для самоконтроля 1. При микроскопии мазка мокроты обнаружены мелкие ланцетовидные грамположительные диплококки, окружённые капсулой. Можно предположить, что это: S. pneumoniae Klebsiella Legionella pneumophilia S. aureus S. epidermidis 2. Наиболее частыми возбудителями неспецифических инфекций в ожоговых отделениях являются: стафилококки псевдомонады стрептококки энтеробактерии анаэробы 3. Коагулазоположительным видом стафилококков являются: S. aureus S. epidermidis S. hominis S. saprophyticus 4. Элективной средой для стафилококков является: желточно-солевой агар мясо-пептонный агар среда Борде – Жангу казеиновый агар мясо-пептонный бульон 5. Ферментами, необходимыми при идентификации стафилококка, являются: плазмокоагулаза ДНК-аза фосфатаза лецитиназа каталаза 6. Методы, используемые для выявления источника при стафилококковой инфекции: фаготипирование 51 определение антибиотикограммы колицинотипирование определение серовара определение биохимических свойств выделенной культуры 7. Признаками, характерными для метициллинрезистентных штаммов стафилококков, являются: множественная резистентность к антибиотикам чувствительность к различным антибиотикам коагулазоположительные резистентность к фагам атипичные по культуральным свойствам высоковирулентные 8. Признаками, характерными для госпитальных штаммов S. aureus, являются: вирулентность множественная резистентность к антибиотикам чувствительность к различным антибиотикам резистентность к фагам атипичные по культуральным свойствам высоковирулентные 9. Роль антибиотиков в формировании госпитальных штаммов: вызывают мутации способствуют передаче R-плазмид селекция антибиотикорезистентных антибиотиков бактерицидная 10. Методами диагностики при стафилококковой инфекции являются: бактериологический биологический иммунологический аллергический микроскопический 11. Основными доказательствами стрептококковой этиологии скарлатины являются: скарлатинозный токсин при подкожном введении восприимчивым людям вызывает характерную сыпь на коже при внутрикожном введении токсина появляется реакция в виде покраснения и припухлости в зеве больных скарлатиной в 100 % случаев обнаруживается S. pyogenes 52 из крови больных выделяется стрептококк при введении больному внутрикожно в участок, покрытый сыпью, антитоксической сыворотки наблюдается феномен «гашения» сыпи 12. Все указанные факторы могут обусловливать патогенность S. pyogenes, кроме: перекрёстнореагирующих антигенов О- и S- стрептолизинов эритрогенного токсина энтеротоксина М-протеина эксфолиатина 13. Штаммы стрептококка, вызывающие скарлатину, отличаются от других стрептококков тем, что продуцируют: S-стрептолизин эритрогенный токсин 0-стрептолизин лецитиназу ДНК-азу Тестовые ситуационные задачи 1. Поступила кровь на стерильность от больного с длительной лихорадкой неясного генеза. Материал был засеян на среду 6 «Б». Через 24 ч обнаружен видимый рост и произведен высев на кровяной агар. Спустя сутки выросли колонии: средних размеров, золотистого цвета, на кровяном агаре видны вокруг колоний зоны гемолиза. При посеве на среду Чистовича обнаружена лецитиназная активность. Предполагаемый возбудитель: S. aureus, S. epidermidis, Str. pyogenes, E. coli. 2. Поступила кровь на стерильность от больного с вялотекущей пневмонией. Материал был засеян на среду 6 «Б». Через 24 ч произведен высев на кровяной агар. Спустя сутки выросли колонии: средних размеров, бесцветные, слизистые, с ровными краями, на кровяном агаре нет зон гемолиза. При микроскопии обнаружены беспорядочно расположенные грамположительные кокки. Данные биохимического анализа: плазмокоагулаза –, нитратная среда +. Предполагаемый возбудитель: S. aureus, S. epidermidis, Str. mutans, Str. pyogenes, E. coli. 3. Материал для исследования (испражнения) взят от больного с диагнозом гастроэнтероколит. Произведены посевы на среды Эндо, Левина и кровяной агар. Спустя сутки выросли колонии: средних размеров, принимающие цвет среды (среда Эндо) и бесцветные на кровяном агаре с зонами гемолиза, слизистые, с ровными краями. При микроскопии обнаружены беспорядочно распо53 ложенные грамположительные кокки. Данные биохимического анализа: плазмокоагулаза +, нитратная среда +, мальтоза +, маннит +. Предполагаемый возбудитель: S. typhy, S. aureus, S. epidermidis, Str. pyogenes, E. coli. 4. Поступил материал для исследования (мокрота) от больного с острым бронхитом. При посеве на кровяной агар через сутки выросли колонии мелкого размера, бесцветные, вокруг колоний отчетливые зоны гемолиза. При микроскопии обнаружены расположенные в цепочку грамположительные кокки. Какие из перечисленных микрооорганизмов могут быть возбудителями патологического процесса: S. aureus, S. epidermidis, Str. salivarius, Str. pyogenes, E. coli? ТЕМА 11. Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных грамотрицательными кокками Патогенные грамотрицательные кокки относятся к семейству Neisseriaceae, роду Neisseriae. Возбудитель гонореи – N. gonorhoeae, возбудитель менингита – N. meningitidis. Менингококки – грамотрицательные диплококки, имеющие характерную форму, напоминающую кофейное или бобовидное зерно, неподвижные, споронеобразующие, не образуют капсулу. Гонококк морфологически сходен с менингококком. В первичном материале исследования (гной из очага поражения) располагается внутри лейкоцитов (незавершенный фагоцитоз). Менингококк является облигатным аэробом, хемоорганотрофом, требователен к составу питательных сред. На жидких средах образует равномерное помутнение с пленкой на поверхности, на плотных средах – прозрачные колонии S-формы. Гонококк также чрезвычайно требователен к составу питательных сред. Материалом для исследования при менингококковой инфекции служат: слизь из носоглотки (при менингококковом назофарингите), спинно-мозговая жидкость (для установления диагноза менингит) и кровь (при менингококкцемии). При исследовании любого материала необходимо помнить о соблюдении специальных режимов доставки в лабораторию из-за высокой лабильности бактерий. Материал должен быть обязательно защищен от холода и доставлен в кратчайшие сроки. Основными методами диагностики при менингококковой инфекции являются: микроскопический, бактериологический и серологический. При диагностике гонореи достаточным является применение микроскопического анализа. Так, при обнаружении грамотрицательных диплококков, расположенных преимущественно внутри лейкоцитов, подтверждается диагноз гонореи. 54 Задание 1. Микроскопировать готовые препараты менингококков и гонококков, зарисовать. 2. Оценить реакцию плазмокоагуляции и лецитиназную активность стафилококковых культур (продолжение). 3. Приготовить мазок, окрасить по Граму. 4. Ознакомиться с применяемыми лечебно-профилактическими препаратами (гонококковая лечебная вакцина). Контрольные вопросы 1. 2. 3. 4. 5. 6. Морфологические особенности грамотрицательных кокков. Факторы вирулентности менингококков. Особенности патогенеза менингококковой инфекции. Принципы лабораторной диагностики менингококковой инфекции. Особенности патогенеза гонококковой инфекции. Лабораторная диагностика гонореи. Тесты для самоконтроля 1. Входными воротами при менингококковой инфекции является слизистая: тонкой кишки толстой кишки носоглотки конъюнктива глаза половых органов 2. Менингококки: кокки ланцетовидной формы грамотрицательные кокки образуют споры обладают подвижностью имеют зерна волютина 3. Гонококки характеризуются: неоднородностью антигенного строения образованием капсулы малой устойчивостью во внешней среде образованием экзотоксина чувствительностью к низким температурам 55 4. Культуральные свойства менингококков: нетребовательны к питательным средам растут в анаэробных условиях растут в присутствии нативного белка растут на обычных питательных средах являются анаэробами 5. Менингококковые заболевания характеризуются: воздушно-капельным путем распространения алиментарным путем распространения действием экзотоксина явлениями бактериемии проникновением возбудителя в мозговые оболочки 6. Источниками менингококков являются: грызуны больные люди больные животные вода носители 7. Для микробиологической диагностики менингококковых заболеваний используют: слизь из зева и носа кровь мочу испражнения спинно-мозговую жидкость 8. Микробиологические методы исследования при менингококковых заболеваниях: микроскопия патологического материала посев на мясо-пептонный агар посев на щелочной агар постановка реакции гемолиза 9. Гонококки были открыты: Кохом Нейссером Вейксальбаумом Френкелем 56 10. Гонококки образуют споры грамотрицательные кокки располагаются внутриклеточно Тестовые ситуационные задачи 1. Поступил материал для исследования (ликвор) от больного с диагнозом цереброспинальный менингит. Произведены высевы на кровяной агар, сывороточный агар, среду 199, полужидкий агар, ТГС. Спустя сутки выросли колонии: на плотных средах мелкого размера, бесцветные, с ровными краями, на кровяном агаре нет зон гемолиза. Жидкая питательная среда помутнела и образовалась пленка. При микроскопии обнаружены грамотрицательные кокки, расположенные попарно. Данные биохимического анализа: лактоза –, мальтоза +, сахароза –, глюкоза +. Предполагаемый возбудитель: V. cholerae, S. aureus, N. meningitidis, Str. faecalis, S. epidermidis, Str mutans, Str. pyogenes, E. coli. 2. Поступил материал для исследования (слизь из носоглотки) от больного с диагнозом ринофарингит. Произведены высевы на кровяной агар, сывороточный агар, среду199 , полужидкий агар, ТГС. Спустя сутки выросли колонии: на плотных средах мелкого размера, бесцветные, с ровными краями, на кровяном агаре нет зон гемолиза. Жидкая питательная среда помутнела и образовалась пленка. При микроскопии обнаружены грамотрицательные кокки, расположенные попарно. Данные биохимического анализа: лактоза – , мальтоза +, сахароза –, глюкоза +. Предполагаемый возбудитель: V. cholerae, N. meningitidis, S. aureus, S. epidermidis, Str. faecаlis. 3. Поступил материал для исследования (мазок из шейки матки) от больной с диагнозом кольпит. При микроскопии обнаружены грамотрицательные кокки, расположенные попарно. Предполагаемый возбудитель: S. aureus, N. meningitidis, S. epidermidis, N. gonorrhoae, Str. salivarius, Str. pyogenes, Str. pneumonia, E. coli. ТЕМА 12. Микробиологическая диагностика анаэробных инфекций Патогенные анаэробы – это большая группа микроорганизмов, основной особенностью которой является анаэробный тип дыхания. Несмотря на токсичное действие кислорода воздуха, строгие анаэробы широко распространены как в природе (почва, сточные воды, глубокие слои различных водоемов), так и в кишечнике животных и человека, являясь представителями нормальной микрофлоры и обеспечивая поддержание нормальной жизнедеятельности макроорганизма. Строгих анаэробов можно подразделить на 2 группы по спорообразованию: 1 группа – спорообразующие – семейство Bacilllaceae, род Clostridium; 57 2 группа – споронеобразующие – рода Bacteroides, Fusobacterium (грамотрицательные), рода Bifidobacterium и Lactobacterium (грамположительные). Пептострептококки и пептококки относятся также к строгим неспорообразующим грамположительным коккам. Вейлонеллы – к грамотрицательным коккам с таким же типом дыхания. Основную роль в патологии человека играют бактерии, принадлежащие к роду Clostridium. Это анаэробные крупные грамположительные палочки цилиндрической формы. Диаметр спор превышает диаметр палочки (см. табл. 12.). Таблица 12 Морфология патогенных анаэробов, принадлежащих к роду Clostridium Название C. perfringens C. septicum C. hystoliticum C. tetani C. botulinum Окраска по Граму + + + + + Спорообразование/ расположение спор +/центральное +/субтерминальное +/субтерминальное +/терминальное +/субтерминальное Подвижность Капсула + + + + + - Анаэробная раневая инфекция является типичной смешанной (микст) инфекцией и вызывается несколькими представителями рода Clostridium. Всегда при газовой анаэробной инфекции обнаруживаются бактерии C. perfringens, имеющие морфологические особенности (см. табл. 12). Другие представители (C. septicum, C. hystoliticum, C. sordelii, C. novyi, C. sporogenes, C. difficile) обнаруживаются в ранах в стойких ассоциациях не только друг с другом, но и с аэробными и анаэробными гноеродными и гнилостными бактериями. Материалом для исследования служат кусочки пораженных тканей, отечная жидкость, перевязочный материал, образцы почвы. Исследование проводят в несколько этапов. 1. Бактериоскопия первичного материала. 2. Выделение возбудителя и его идентификация бактериологическим методом. 3. Биологический эксперимент – заражение белых мышей исследуемым материалом. 4. Идентификация токсина клостридий в реакции нейтрализации. Столбняк (возбудитель C. tetani) – типичная токсическая раневая инфекция, характеризующаяся поражением нейротоксином двигательных клеток спинного и головного мозга, которое проявляется в виде судорог поперечно-полосатой мускулатуры. По жгутиковому антигену различают 10 сероваров, продуцирующих идентичный экзотоксин. Как правило, диагностика 58 столбняка по причине яркой клинической картины не требует лабораторных методов исследования. Необходимость в ней возникает в спорных и неясных случаях и проводится с помощью микроскопии, бактериологического метода, биологической пробы, постановки РПГА. Ботулизм – пищевая токсикоинфекция (возбудитель C.botulinum), характеризующаяся специфическим поражением ЦНС. C.botulinum образует 8 типов токсинов: А, В, С1, С2, D, E, F, G. Токсины различаются по своей антигенной структуре, но вызывают одинаковую симптоматику при отравлении. Материалом для исследования служат продукты, промывные воды желудка, рвотные массы, кровь, моча, испражнения. Основными методами диагностики являются: бактериологический, биологическая проба, РПГА с антительным диагностикумом. Задание 1. Изучить морфологию возбудителей анаэробных инфекций в готовых препаратах. 2. Изучить колонии клостридий на кровяном агаре, приготовить мазок по Граму и Ожешко. Зарисовать. 3. Ознакомиться со схемой постановки биологической пробы при определении типа ботулинического токсина. 4. Провести сравнительную характеристику свойств патогенных анаэробов. Контрольные вопросы 1. Характерные особенности и систематическое положение анаэробных бацилл. 2. Морфологические и культуральные особенности возбудителя столбняка. 3. Особенности столбнячного токсина. 4. Патогенез столбняка. 5. Методы диагностики столбняка. 6. Особенности возбудителя ботулизма. 7. Ботулинический токсин, его особенности. 8. Патогенез ботулизма. 9. Специфическая терапия ботулизма. 10. Возбудители анаэробной газовой инфекции, их особенности. 11. Патогенез анаэробной раневой инфекции. 12. Методы диагностики газовой гангрены. Тесты для самоконтроля 1. Столбнячная палочка имеет форму: ракетки 59 палочки с центральной спорой стрептобациллы веретена барабанной палочки 2. Возбудители газовой гангрены относятся к роду: эшерихий коринебактерий клостридий бордетелл сальмонелл 3. Клостридии столбняка: образуют капсулу в организме тонкие грамположительные палочки активно ферментируют углеводы подвижны образуют эндотоксин экзотоксин 4. Культивирование клостридий столбняка: оптимальмая температура роста 42 0С строгий анаэроб почернение среды Вильсона – Блера растут на мясо-пептонном агаре в щелочном бульоне образуют нежную пленку 5. Возбудитель столбняка продуцирует: энтеротоксин тетанолизин некротоксин тетаноспазмин эритрогенный токсин 6. Патогенез столбняка связан с: распространением заболевания через укусы диких животных внедрением возбудителя через неповрежденную кожу способностъю возбудителя продуцировать экзотоксин распространением токсина гематогенно попаданием спор из почвы 7. Для микробиологической диагностики столбняка используют: аллергическую пробу микроскопию заражение белых мышей 60 реакцию нейтрализации токсина в опыте на животных реакцию связывания комплемента 8. Для специфической терапии столбняка используют: бактериофаг аутовакцину антитоксическую сыворотку анатоксин убитую вакцину 9. Специфическая профилактика столбняка проводится с помощью: живой вакцины анатоксина антимикробной сыворотки антитоксической сыворотки антибиотиков 10. Для клостридий ботулизма характерно: образование экзотоксина отсутствие серотипов аэробный тип дыхания анаэробный тип дыхания 11. Патогенез ботулизма связан с: действием эндотоксина действием экзотоксина всасыванием токсина в слизистую кишечника поражением продолговатого мозга приемом испорченной пищи 12. Для микробиологического исследования при ботулизме используют: реакцию агглютинации реакцию нейтрализации культивирование в условиях повышенной аэрации биологический метод аллергическую пробу 13. Исследуемый материал при микробиологической диагностике ботулизма: вода пищевые продукты почва трупный материал рвотные массы 61 14. Для лечения ботулизма используют: антимикробную сыворотку поливалентную антитоксическую сыворотку аутовакцину антибиотики бактериофаг 15. Для специфической профилактики ботулизма применяют: комбинированную вакцину поливалентную противоботулиническую сыворотку гамма-глобулин анатоксин специфическая профилактика отсутствует ТЕМА 13. Микробиология туберкулеза и лепры Туберкулез – первично-хроническое инфекционное заболевание с преимущественной локализацией патологического процесса в легких. При туберкулезе также поражаются лимфатические узлы, пищеварительный тракт, кожа, кости. Систематика. Порядок Actinomycetales, семейство Mycobacteriaceae, род Mycobacterium. Основными патогенными для человека видами, вызывающими туберкулез, являются: M. tuberculosis, M. bovis, M. avium. Морфология. Грамположительные тонкие, слегка изогнутые палочки. Неподвижные, спор и капсул не образуют. Имеют специфический химический состав клеточной стенки с высокой концентрацией жирных кислот (жировая, восковая и фосфатидная фракции). Особенности физиологии. Строгие аэробы, мезофилы, хемоорганотрофы. Элективными средами являются среды Петрова, Петраньяни и Левенштейна – Йенсена. Особенности культуральных свойств позволяют провести первоначальную внутриродовую диагностику (см. табл. 13). Таблица 13 Культуральные свойства основных возбудителей туберкулеза Название M. tuberculosis M. bovis M. avium 62 Срок появления колоний (сутки) 16-28 Характер колоний R 24-40 10-14 Глицеринофильность Потребность при росте в 5 % СО2 + + S - -- S - Пигмент От кремового до оранжевого Нет пигмента Розовый Лабораторная диагностика. Особенностью лабораторной диагностики туберкулеза является применение методов обогащения материала. Причиной обязательного применения обработки исследуемого материала является присутствие в нем посторонней микрофлоры (стафилококки, стрептококки, клебсиеллы и др.), а также преимущественное расположение микобактерий в слизисто-гнойных комочках. В практику микробиологических лабораторий вошли методы гомогенизации и флотации. Метод гомогенизации. Суточное количество мокроты (или другого материала) смешивают с равным объемом 1 % NaOH и встряхивают на шюттель-аппарате (вортекс) до полного разжижения мокроты. Гомогенизированный материал центрифугируют при 3000 об/мин 15 минут и к осадку добавляют 1мл 10 % HCl. Затем кислоту отмывают центрифугированием осадка и используют для диагностики. Метод флотации. Суточное количество мокроты (или другого материала) смешивают с равным объемом 1 % NaOH и встряхивают на шюттельаппарате (вортекс) до полного разжижения мокроты. Колбу с материалом нагревают до 50 0С, затем добавляют 1-2 капли ксилола или бензина, встряхивают 10 минут и оставляют при комнатной температуре до появления поверхностной пленки, которая в дальнейшем и используется для диагностики. В микробиологической диагностике применяют 3 основных метода – бактериоскопический, бактериологический и биологический – и дополнительные методы исследования. Возбудителем лепры (проказы) является Mycobacterium leprae (палочка Хансена). Систематика. Порядок Actinomycetales, семейство Mycobacteriaceae, род Mycobacterium, вид leprae. Морфология. Грамположительные тонкие, слегка изогнутые палочки, для которых характерен полиморфизм. Неподвижные, спор и капсул не образуют. Пространственное расположение является одним из основных особенностей микобактерий лепры – палочки располагаются параллельными рядами, напоминая «пачку сигарет». Особенности физиологии. Являются облигатными внутриклеточными паразитами. На искусственных питательных средах не растут. Основными биологическими моделями, применяемыми в культивировании, являются введение заразного материала в лапку мышей и инфицирование броненосцев, у которых отсутствует видовой иммунитет к микобактериям лепры. Задание 1. Изучить морфологию возбудителей туберкулеза в готовых препаратах, зарисовать. 2. Разобрать методы специфической профилактики туберкулеза и значение аллергических проб (пробы Манту и Пирке). 63 Контрольные вопросы 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Систематика возбудителей туберкулеза. Морфологические особенности M. tuberculosis, M. bovis, M. avium. Факторы вирулентности возбудителей микобактерий. Особенности патогенеза туберкулеза. Особенности взятия материала (мокроты) при диагностике туберкулеза. Значение методов обогащения материала при диагностике туберкулеза. Принципы дифференцировки M. tuberculosis, M. bovis, M. avium. Особенности постинфекционного иммунитета при туберкулезе. Аллергические пробы при туберкулезе. Ускоренный метод диагностики туберкулеза. Принципы специфической профилактики туберкулеза. Систематика и морфология возбудителей лепры. Особенности возбудителей лепры. Патогенез проказы. Принципы диагностики лепры. Проба Мицуды. Тесты для самоконтроля 1. Возбудитель туберкулеза относится к роду: шигелл сальмонелл микобактерий клостридий коринебактерий 2. Сопоставьте название возбудителя и заболевание, которое он вызывает: M. tuberculosis а) лепра M. bovis б) цистит M. leprae в) энтероколит г) туберкулез 3. Палочки туберкулеза кислотоустойчивы за счет: капсулы присутствия в клеточной стенке белков спорообразования присутствия в клеточной стенке жирных кислот присутствия в клеточной стенке гликопептидов 64 4. Методы обработки мокроты при диагностике туберкулеза: метод Коха метод флотации метод центрифугирования метод Творта отсутствие предварительной обработки 5. Основным материалом при диагностике легочного туберкулеза является: моча кровь мокрота ликвор мазок из зева Тестовые ситуационные задачи 1. Поступивший материал для исследования (мокрота) от больного с длительно существующими жалобами на кашель и субфебрильную температуру обработали методом гомогенизации. При окраске по методу Циля – Нильсена обнаружены тонкие, слегка изогнутые палочки. Рост при посеве на среду Левенштейна – Йенсена появился на 24 сутки в виде R-колоний, крошащихся при прикосновении. Тест на ниацин – «+». При заражении кролика в/м низкой дозой (0,01 млг) сформировался долго незаживающий свищ. Определите возбудителя. 2. Поступивший материал для исследования (мокрота) от больного с длительно существующими жалобами на кашель и субфебрильную температуру обработали методом флотации. При окраске по методу Циля – Нильсена обнаружены тонкие слегка изогнутые палочки. Рост при посеве на среду Левенштейна – Йенсена появился на 35 сутки в виде S-колоний, вязких при прикосновении. Тест на ниацин «–». При заражении кролика в/м низкой дозой (0,01 млг) развился сепсис. Определите возбудителя. ТЕМА 14. Микробиологическая диагностика спирохетозов К патогенным спирохетам (семейство Spirochetaceae), относятся 3 рода: Treponema, Borrelia, Leptospira (табл. 14). В род Treponema входят возбудители сифилиса и невенерических трепанематозов: фрамбезии (Tr. pertenuae), пинты (Tr. carateum), беджела (Tr. bejel). 65 Таблица 14 Сравнительная характеристика патогенных спирохет Род Treponema Вызываемое заболевание сифилис, невенерические трепанематозы Leptospira лептоспироз Borrelia возвратные тифы, болезь Лайма Особенности морфологии 8-12 равномерных завитков, бледно-розовая окраска (метод Романовского – Гимза) 12-18 равномерных завитков, розовый цвет при окраске по Романовскому – Гимза Особенности физиологии Строгий анаэроб ПС \ Рост на ПС* Не растет Строгий аэроб Неравномерные завитки (3-10), темно-фиолетовый цвет при окраске по Романовскому – Гимза Строгий анаэроб Сывороточные среды, фосфатно-буферный раствор (среда Терских) Не вызывают помутнения при росте на жидких ПС Сывороточные, кровяные среды, куриные эмбрионы * – искусственные питательные среды Возбудитель сифилиса имеет вид спирально извитого микроорганизма с 8-12 равномерными завитками. Для Treponema pallidum характерны плавные движения и плохая окрашиваемость по Романовскому – Гимза. Тип дыхания – строгий анаэроб, не поддается искусственному культивированию (при выращивании на питательных средах теряет вирулентность). Методы диагностики сифилиса и вид материала зависят от периода заболевания (табл. 15). Таблица 15 Принципы диагностики сифилиса Период заболевания 1 Материал Отделяемое шанкра, кровь 2 Материал с сифилид, кровь Кровь 3 66 Методы Микроскопический Серологические реакции (серонегативный и серопозитивный периоды) Микроскопический Серологические реакции Серологические реакции Лептоспиры – микроорганизмы с 12-18 плотными завитками, напоминающими плотную пружину. Подвижны, при окраске по Романовскому – Гимза принимают розовый цвет. По типу дыхания являются строгими аэробами. Растут на средах с добавлением сыворотки крови, рост обнаруживается на 5-7-й день при просмотре капли в темном поле (помутнения среды при росте не возникает). На плотных питательных средах рост появляется в виде S-колоний на 4-8-й день. Лептоспироз является сапронозом, то есть заражение происходит через объекты внешней среды (воду), а не непосредственно от больных животных или человека. Основными методами диагностики являются микроскопический, бактериологический, серологический, а также постановка биопроб (табл. 16). Таблица 16 Принципы диагностики лептоспироза Срок взятия материала 1-7-й день 8-й день далее С 14-го дня и Материал Диагностические методы кровь Микроскопический Бактериологический Биопроба (в\бр заражение кровью больного морских свинок) РАЛ Микроскопический Бактериологический Биопроба (в\бр заражение мочой больного морских свинок) РАЛ Серологические реакции (РАЛ, РСК, РПГА, РП) моча кровь Боррелии отличаются от других спирохет неравномерностью завитков (от 3 до 10), хорошей окрашиваемостью по Романовскому – Гимза (приобретают темно-фиолетовый цвет). Боррелии являются строгими анаэробами, растут на сложных средах с добавлением крови, сыворотки, кусочков тканей, в куриных эмбрионах. Патогенез и особенности эпидемиологии зависят от вида (табл. 17). 67 Таблица 17 Классификация боррелий Заболевание Возбудитель Переносчик Эпидемический возвратный вшивый тиф Эндемический возвратный клещевой тиф B.recurrentis Платяная вошь B. persica B. caucasica B. duttoni B. hispanica B. burgdorferi Клещи Болезнь Лайма Иксодовые клещи Географическое распространение повсеместно Центральная и Средняя Азия Кавказ, Закавказье, Украина Центральная и Южная Африка Средиземноморье Северная Америка, Евразия Для диагностики боррелиозов используют микроскопический и серологический методы (материал: во время приступа – кровь), для дифференциальной диагностики используют биопробу. Задание 1. Изучить особенности морфологии и физиологии патогенных спирохет. Составить сравнительную характеристику. 2. Разобрать постановку реакции Вассермана, реакции иммобилизации трепонем. 3. Разобрать принципы диагностики лептоспироза и боррелиозов с учетом динамики заболевания. 4. Ознакомиться с диагностическими и лечебно-профилактическими препаратами: лептоспирозная сухая вакцина, кардиолипиновый комплекс мышц сердца быка для реакции Вассермана, липоидный антиген для осадочных реакций. Контрольные вопросы 1. Систематическое положение патогенных спирохет. 2. Особенности возбудителя сифилиса. 3. Особенности лабораторной диагностики сифилиса в зависимости от периода заболевания. 4. Сущность реакции иммобилизации трепонем. 5. Механизм реакции Вассермана. 6. Особенности возбудителей невенерических трепонематозов. 7. Особенности лептоспир. 8. Лабораторная диагностика лептоспирозов. 68 9. Сущность реакции агллютинации-лизиса. 10. Особенности возбудителей возвратного тифа (критерии дифференцировки). 11. Отличия возбудителей эпидемического и клещевого возвратного тифа. 12. Лабораторная диагностика возвратного тифа. Тесты для самоконтроля 1. Возбудитель сифилиса относится к роду: шигелл сальмонелл трепонем клостридий коринебактерий 2. Сопоставьте название возбудителя и заболевание, которое он вызывает: T. pallidum а) лептоспироз B. recurrentis б) эндемический возвратный тиф L.interrogans в) сифилис г) эпидемический возвратный тиф 3. Тип дыхания возбудителя сифилиса: строгий аэроб капнический микроб строгий анаэроб факультативный анаэроб присутствие в клеточной стенке гликопептидов 4. Методы диагностики в 1 периоде сифилиса: серологические реакции биопроба микроскопия метод Творта 5. Основными материалами при диагностике лептоспироза являются: моча кровь мокрота ликвор мазок из зева 69 6. Типичная морфология лептоспир: барабанная палочка с булавовидными утолщениями на концах веретенообразная форма плотно закрученная пружина овоидной формы 7. Характерные колонии лептоспир при росте на сывороточном агаре: в виде головы медузы (локона, львиной головы) мелкие с плотным центром сухие, морщинистые классические колонии S-формы 8. Сопоставьте название возбудителя и заболевание, которое он вызывает: B. recurrentis а) болезнь Лайма B. persica б) эпидемический тиф B. burgdorferi в) эндемический тиф г) сыпной тиф д) туберкулез 9. Возбудитель эндемического тифа: патогенен только для человека патогенен и для человека, и для животных передается через платяную вошь передается через укусы клещей 10. Основным материалом при бактериологическом исследовании на лептоспироз на 10 день от начала заболевания является: кровь ликвор испражнения моча желчь ТЕМА 15. Микробиологическая диагностика риккетсиозов и хламидиозов Особенностью риккетсий и хламидий является их облигатный паразитизм, обусловленный ферментной дефектностью (риккетсии не способны синтезировать НАДФ, хламидии не способны синтезировать АТФ). 70 В семейство Rickettsiaceae входят 3 рода патогенных риккетсий: Rickettsia, Rochalimeae, Coxiella. Морфология риккетсий зависит от стадии жизненного цикла: кокковидная форма при внеклеточном расположении и палочковидная или нитевидная при внутриклеточном расположении микроорганизмов. Риккетсии не образуют спор и капсул, неподвижны, грамотрицательны. Большая часть риккетсий не вызывает заболевания, однако около 50 различных видов поражают как животных, так и людей и отличаются как переносчиками заболевания, так и тяжестью клинических проявлений (табл. 18). Таблица 18 Классификация патогенных риккетсий Название Rickettsia prowazekii Переносчик Платяная вошь Rickettsia typhi Rickettsia tsutsugamushi (orientales) Rochalimae Coxiella burnetii Крысиные блохи и вши Trambicula akamushi Заболевание у человека Эндемический сыпной тиф Болезнь Брила – Ценссера Эндемический сыпной тиф Лихорадка цуцугамуши Платяная вошь Иксодовые клещи Траншейная лихорадка Ку-лихорадка Диагностика риккетсиозов производится путем выделения риккетсий из крови больного или переносчиков и грызунов. Культивирование риккетсий проводят в желточном мешке куриного эмбриона, в организме лабораторных животных (морских свинок, белых мышей), в тканевых культурах. Но основным методом является серологический: РА, РПГА, реакция нейтрализации (табл. 19). Таблица 19 Схема микробиологической диагностики риккетсиозов Материал для исследования Кровь Кровь Методы Микроскопический метод, биопроба Серологические реакции с аналогами риккетсиозного антигена (штаммы P. vulgaris), рекции Вейля – Феликса Биопроба, микроскопия Переносчики грызуны Патогенные хламидии относятся к порядку Chlamydiales, семейству Chlamydiaceae, роду Chlamydia. В настоящее время выделяют 3 вида хламидий: С. trachоmatis, C. psitaci, C. pneumoniae. Жизненный цикл хламидий состоит из 3 стадий: 71 1 стадия – элементарного тельца – хламидии находятся вне клетки в покоящемся состоянии, поверхностные структуры более плотные, представлены трехслойной клеточной стенкой, имеют овоидную форму, при окраске по Романовскому – Гимза принимают розовый цвет, метаболизм резко снижен. Это стадия покоя, в эту стадию хдамидии переходят от одного хозяина к другому; 2 стадия – ретикулярного тельца – хламидии поступают в клетки путем фагоцитоза, имеют сферическую форму, при окраске по Романовскому – Гимза принимают голубой цвет, обладают тонкой оболочкой, быстро делятся внутри клетки. Ретикулярные тельца превращаются в элементарные, скапливающиеся в виде микроколоний и окруженные общей мембраной – хламидой. Инфицированная клетка погибает, элементарные тельца выходят наружу. 3 стадия – промежуточная стадия, как правило, проходит внутри клетки. У человека хламидии вызывают различные заболевания (см. табл. 20), для диагностики которых используют вирусологические методы, а также иммуноферментный анализ и серологические реакции (РПГА, РА, РСК). Таблица 20 Патогенные хламидии Название возбудителя С.trachоmatis C.psittaci C.pneumoniae Заболевание Трахома («болезнь семьи») Венерический хламидиоз Болезнь Никола – Фавра (венерический лимфагранулематоз) Орнитоз\пситтакоз Респираторные заболевания Источник Больной человек Больной человек/носитель Больной человек Птицы (водоплавающие птицы, голуби и др.) Больной человек Пути передачи Контактно-бытовой путь Половой путь Половой путь Воздушно-пылевой Контактно-бытовой Алиментарный Воздушно-капельный Воздушно-пылевой Задание 1. Изучить морфологию риккетсий в готовых препаратах. 2. Ознакомиться с принципами постановки ИФА диагностики хламидиоза. 3. Ознакомиться с диагностическими и профилактическими риккетсиозными препаратами (антиген Провачека, антиген Музера, вакцина против Кулихорадки). 72 Контрольные вопросы 1. Систематическое положение и основные свойства риккетсий. 2. Классификация риккетсиозов. 3. Особенности хламидий. 4. Заболевания, вызываемые хламидиями. 5. Основные отличия возбудителей риккетсиозов 6. Методы культивирования риккетсий. 7. Лабораторная диагностика эпидемического сыпного тифа. 8. Серологическая диагностика риккетсиозов. 9. Методы диагностики хламидиозов. Тесты для самоконтроля 1. Систематическое положение возбудителей сыпного тифа: род Escherichia род Salmonella семейство Rickettsiaceae род Rickettsia семейство Vibrionaceae 2. Морфологические особенности риккетсий: палочки с закругленными концами перитрихи образуют споры красятся грамотрицательно имеют макрокапсулу полиморфны 3. Характеристика риккетсий: культивируются в куриных эмбрионах неприхотливы к питательным средам имеют Vi- и Н-антигены в организме образуют капсулу не образуют НАДФ 4. Основные методы диагностики риккетсиозов: аллергический серологический микроскопический биологический бактериологический 73 5. Для серодиагностики сыпного тифа применяется реакция: Видаля Хеддельсона Райта Вассермана Вейля – Феликса 6. Хламидии не способны образовывать: НАДФ НАД АТФ СОД 7. Сопоставьте заболевание и его возбудителя: венерический хламидиоз C. psittaci болезнь Никола-Фавра С. trachomatis орнитоз С. pneimoniae пневмония… 8. Основными методами диагностики хламидиозов являются: бактериологический серологический иммуноферментный биологический ТЕМА 16. Микробиологическая диагностика вирусных инфекций (РНК-вирусы) РНК-содержащие вирусы 1. Пикорнавирусы – семейство Picornaviridae (исп. Pico – малый, rna – рибонуклеиновая кислота) – безоболочечные вирусы, содержащие однонитевую плюс РНК. 1.1. 1.1.1. Энтеровирусы – род Enterovirus Вирусы полиомиелита Полиомиелит – острое лихорадочное заболевание, иногда сопровождается поражением серого вещества (от греч. polios – серый) спинного мозга и ствола головного мозга, в результате развиваются вялые параличи и парезы мышц ног, туловища, рук. Микробиологическая диагностика. Материал для исследования – испражнения, отделяемое носоглотки, при летальных исходах – кусочки головного и спинного мозга, лимфатические узлы. Диагностика с помощью ИФА, реак74 ции нейтрализации цитопатического действия вируса в культуре клеток со штаммоспецифической иммунной сывороткой, а также в ПЦР. Серодиагностика основана на использовании парных сывороток больных с применением эталонных штаммов вируса в качестве диагностикума. Содержание сывороточных IgG, IgA, IgM определяют методом радиальной иммунодиффузии по Манчини. 1.1.2. Вирусы Коксаки А и В Вирусы Коксаки А вызывают у человека герпангину (герпетиформные высыпания на задней стенке глотки, дисфагия, лихорадка), пузырчатку в полости рта и конечностей, полиомиелитоподобные заболевания, диарею у детей; возможна сыпь. Вирусы Коксаки В вызывают полиомиелитоподобные заболевания, энцефалит, миокардит, плевродинию (болезненные приступы в области груди, лихорадка, плеврит). Микробиологическая диагностика. Вирус выделяют из испражнений, отделяемого носоглотки, заражают культуры клеток HeLa или почек обезьян или мышей-сосунков. Учитывают характер патологических изменений у зараженных мышей. Вирусы идентифицируют в РТГА, РСК, РН, ИФА. 1.1.3. Вирусы группы ЕСНО Вирусы ЕСНО (от англ. Enteric cytopathogenic human orphans viruses – кишечные цитопатогенные человеческие вирусы-сироты) вызывают ОРВИ, асептический менингит, полиомиелитоподобные заболевания, возможна сыпь. Микробиологическая диагностика. Вирус выделяют из церебральной спинной жидкости, испражнений, отделяемого носоглотки, заражают культуры клеток почек обезьян. Вирусы идентифицируют в РТГА, РСК, РН, ИФА. Серодиагностика основана на выявлении в сыворотке крови нарастания титра антител, используются РТГА, РСК, РН, ИФА 1.2. 1.2.1. Род Hepatovirus Вирус гепатита А Вирус гепатита А вызывает острую инфекционную болезнь, характеризующуюся лихорадкой, преимущественным поражением печени, интоксикацией, иногда желтухой и отличающуюся склонностью к эпидемическому распространению. Микробиологическая диагностика. Материалом для исследования служат сыворотка, испражнения. В крови определяют IgM, в испражнениях – вирусный Аг с помощью ИФА, РИА и иммунной электронной микроскопии. 75 2. Тогавирусы 2.1. Семейство Togaviridae (лат. Toga – плащ, накидка) – сложные вирусы, содержащие однонитевую плюс РНК 2.1.1. Вирус краснухи Краснуха – острое инфекционное заболевание, характеризующееся пятнистыми высыпаниями на коже, катаральным воспалением верхних дыхательных путей и конъюнктивы, увеличением лимфатических узлов и признаками незначительной общей интоксикации. Микробиологическая диагностика. Вирус выделяют из смывов со слизистой оболочки носа и зева, крови, мочи, реже – испражнений, выявляют Ат в парных сыворотках и цереброспинальной жидкости при врожденной краснухе и прогрессирующем краснушном панэнцефалите. Индикацию вируса осуществляют на основании интерференции с цитопатогенными вирусами или по РТГА, РИФ и ИФА. Для обнаружения Ат применяют РН, РСК, РТГА, ИФА. Определение специфических IgM свидетельствует о недавно перенесенном заболевании или болезни в момент обследования. 3. Ортомиксовирусы – семейство Orthomyxoviridae (греч. orthos – прямой, myxa – слизь) – сложные вирусы, содержащие однонитевую минус РНК. 3.1. 3.1.1. Род Influenzavirus Вирусы гриппа А, В и С Грипп – (франц. Grippe, grippen – схватывать, царапать) – острое инфекционное вирусное заболевание человека, характеризующееся поражением респираторного тракта, лихорадкой, общей интоксикацией, нарушением деятельности сердечно-сосудистой системы. Микробиологическая диагностика. Материал для исследования – носоглоточное отделяемое (табл. 21). Обнаруживают вирусные Аг с помощью РИФ и ИФА; геном вирусов при помощи ПЦР. Используют вирусологический метод, идентифицируют вирусы по антигенной структуре с помощью РСК, РТГА, ИФА, РБН. Эти реакции используют и для серодиагностики. Таблица 21 Схема микробиологической диагностики гриппа Исследуемый материал Смыв из носоглотки, слизь из зева и др. Сутки 1 3-4 5-6 Сыворотка 76 1-2 Методы Заражение 10-11-дневных куриных эмбрионов Вскрытие зараженных эмбрионов, определение наличия вирусов Идентификация вирусов в серологических реакциях Серологические реакции: РСК, РТГА 4. Парамиксовирусы – семейство Paramyxoviridae – сложные вирусы, содержащие однонитевую минус РНК. 4.1. 4.1.1. 4.2. 4.2.1. Род Respirovirus Вирусы парагриппа человека 1, 3 Род Rubulavirus Вирусы парагриппа человека 2, 4а, 4в Парагрипп – острая инфекционная болезнь, характеризующаяся преимущественным поражением верхних дыхательных путей, в основном гортани, и умеренной интоксикацией. Микробиологическая диагностика. Вирус выделяют из слизи, смывов с дыхательных путей, мокроты. Применяют вирусологический метод на культуре клеток. Индикацию проводят по цитопатическому действию вирусов, РГА, феномены гемадсорбции. Идентификацию осуществляют с помощью РТГА, РСК, РН. Серологическим методом выявляют Аг вирусов и обнаруживают Ат в парных сыворотках крови больного в РТГА, РСК, РН и др. 4.2.2. Вирус эпидемического паротита Эпидемический паротит («свинка») – острая детская инфекция, характеризующаяся поражением околоушных слюнных желез, реже – других органов. Микробиологическая диагностика. Материал для исследования – слюна, цереброспинальная жидкость, моча, сыворотка крови. Применяют вирусологический метод, вирус идентифицируют с помощью РТГА, РИФ, РН, РСК. При серологическом методе в парных сыворотках крови больного определяют Ат с помощью ИФА, РСК, РТГА. 4.3. 4.3.1. Род Мorbillivirus Вирус кори Корь – острая инфекционная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, катаральным воспалением слизистых оболочек верхних дыхательных путей и глаз, а также пятнисто-папулезной сыпью на коже. Микробиологическая диагностика. Исследуют смыв с носоглотки, соскобы с элементов сыпи, кровь, мочу. Вирус можно обнаружить в патологическом материале и в зараженных культурах клеток с помощью РИФ, РТГА и РН. Для серологической диагностики применяют РСК, РТГА и РН. 5. Рабдовирусы – семейство Rhabdoviridae – сложные вирусы, содержащие однонитевую минус РНК. 77 5.1. 5.1.1. Род Lyssavirus Вирус бешенства Бешенство (Rhabies, синонимы: водобоязнь, гидрофобия) – вирусная инфекционная болезнь, развивающаяся после укуса или ослюнения раны инфицированным животным. Поражаются нейроны ЦНС с развитием симптомов возбуждения, параличом дыхательной и глотательной мускулатуры. Микробиологическая диагностика. Выделяют вирус из патологического материала путем биопробы на белых мышах: мышей-сосунков заражают интрацеребрально. Идентификацию вирусов проводят с помощью ИФА, а также в РН на мышах. Прижизненная диагностика основана на использовании отпечатков роговицы, биоптатов кожи с помощью РИФ, выделении вируса из слюны, цереброспинальной и слезной жидкости путем интерцеребрального инфицирования мышей-сосунков. Ат у больных определяют с помощью РСК, ИФА. 6. Ретровирусы – семейство Retroviridae 6.1. 6.1.1. Род Lentivirus Вирус иммунодефицита человека ВИЧ-инфекция заканчивается развитием синдрома приобретенного иммунодефицита. СПИД характеризуется преимущественным поражением иммунной системы, длительным течением, полиморфностью клинических проявлений, высокой летальностью, передачей в естественных условиях от больного человека здоровому, склонностью к быстрому эпидемическому распространению. Микробиологическая диагностика. Для проведения Аг и Ат ВИЧ используют ИФА, ИБ и ПЦР. Метод выявления вируса в крови, лимфоцитах превосходит по информативности другие тесты, однако он трудоемок и дорог. Для определения ВИЧ-Ат разработано множество тест-систем, позволяющих выявлять до 99,9 % всех положительных проб. Однако при любой положительной пробе для подтверждения результатов ставится реакция ИБ. Задание 1. Микробиологическая диагностика гриппа. Заразить куриные эмбрионы смывом из носоглотки больного. Смыв обработать антибиотиками (стрептомицином и пенициллином по 100 ед/мл) в течение 30 минут, после чего 0,2-0,5 мл ввести в полость амниона 10-11 дневного куриного эмбриона. Для этого рассмотреть эмбрион с помощью овоскопа, отметить место расположения зародыша и воздушной полости. Обработать скорлупу спиртовым раствором и раствором йода, обжечь. Проколоть скорлупу над воздушной полостью, расширить отверстие. Осторожно (не повреждая кровеносные сосуды) вскрыть хорионаллантоидную оболочку, вывести ее и внести в амнио78 тическую полость смыв. После заражения закрыть отверстие в скорлупу стерильным стеклянным колпачком и залить парафином. Второй способ заражения: проколоть скорлупу над воздушной полостью, под контролем овоскопа направить иглу шприца со смывом в направлении эмбриона и ввести исследуемый материал, после чего залить отверстие в скорлупу парафином. Зараженные эмбрионы инкубировать при 39 0С 1-2 суток. 2. Микробиологическая диагностика бешенства. Изучить препараты срезов аммонова рога с включениями Бабеша – Негри. Зарисовать. 3. Ознакомление с диагностикой и лечебно-профилактическими препаратами: живая гриппозная вакцина («Гриппол»), антирабическая вакцина, противогриппозная сыворотка, лейкоцитарный интерферон, антирабический иммунолобулин и др. Контрольные вопросы 1. Семейство Orthomyxoviridae: систематика, строение, антигенное строение, виды антигенной изменчивости, патогенез заболевания, спец. профилактика. 2. Принцип диагностики гриппозной инфекции. 3. Особенности семейства Paramyxoviridae. 4. Возбудитель парагриппа, систематика, строение, особенности патогенеза. 5. Возбудитель кори. 6. Возбудитель паротита. 7. Вирус бешенства: систематика, строение, антигенное строение, патогенез заболевания, спец. профилактика. 8. Пикорнавирусы: общие свойства вирусов. 9. Возбудитель полиомиелита: систематика, строение, антигенное строение, патогенез заболевания, спец. профилактика. 10. Вирус краснухи. Тесты для самоконтроля 1. Миксовирусы характеризуются следующими признаками: устойчивы к эфиру имеют суперкапсид обладают тропизмом к мукополисахаридам имеют фермент нейраминидазу имеют общий комплементсвязывающий антиген 2. В группу миксовирусов входят возбудители: гриппа паротита оспы 79 полиомиелита бешенства 3. К ортомиксовирусам относятся: вирус кори вирус гриппа вирус паротита вирус СПИДа вирус оспы 4. Вирус гриппа: устойчив к низким температурам содержит ДНК характеризуется изменчивой антигенной структурой относится к пикорновирусам культивируется в курином бульоне 5. Вирусы гриппа имеют: гемагглютинирующий антиген спиральный тип симметрии липоуглеводную оболочку жировые включения рибосомы 6. Для гриппа характерны: воздушно-капельный путь передачи трансмиссивный путь передачи спорадические заболевания возникновение эпидемий и пандемий водный путь распространения 7. Грипп характеризуется: малой частотой заболевания детей до 10 лет высокой контагиозностью частыми осложнениями переходом в хроническую форму скрытым течением 8. Для выделения вируса гриппа используют: морских свинок куриные эмбрионы культуру ткани почек среду 199 белых мышей 80 9. Материалом для исследования при гриппе служат: промывные воды желудка смыв из зева отпечатки со слизистой носа содержимое пустул смывы с рук детей 10. Для диагностики гриппа используют: биологический метод метод флуоресцирующих антител цветную пробу серологическую диагностику аллергические пробы 11. Для специфической профилактики гриппа применяют: анатоксин убитую вакцину живую вакцину интерферон гамма-глобулин 12. Специфическая терапия гриппа проводится с помощью: гамма-глобулина живой вакцины антитоксической сыворотки убитой вакцины лейкоцитарного интерферона 13. Парамиксовирусы включают: вирус гриппа вирус кори вирус бешенства вирус сендай 14. Возбудитель парагриппа: обладает гемолитической активностыо имеет четыре серотипа содержит нейраминидазу дает островковую гемадсорбцию дает диффузную гемадсорбцио 15. Вирусы эпидемического паротита имеют антигены: гемагглютинин 81 общие для всех миксовирусов антигены глюцидо-липидо-протеидный комплекс растворимый антиген полисахаридный антиген 16. При лабораторной диагностике паротита используют: серологические реакции аллергические пробы выделение вируса на культуре ткани электронную микроскопию выявление включений 17. Для специфической профилактики паротита применяют: гамма-глобулин живую вакцину убитую вакцину антибиотики химическую вакцину 18. Вирус кори: передается алиментарным путем идентифицируется в реакции задержки гемадсорбции имеет несколько серотипов чаще поражает детей после 4-5 лет относится к ДНК-содержащим вирусам 19. Вирус кори: в культурах клеток образует цитоплазматические включения культивируется в клетках амниотической полости человеческого эмбриона имеет гемагглютинин высокоустойчив во внешней среде обладает нейраминидазой ТЕМА 17. Микробиологическая диагностика вирусных инфекций (ДНК-вирусы) 1. Гепаднавирусы – семейство Hepadnaviridae – сложные обратно транскрибирующие вирусы. 1.1. 82 Род Orthohepadnavirus 1.1.1. Вирус гепатита В Гепатит В – антропонозная инфекция, преимущественно с парентеральным механизмом заражения, которая может протекать в форме вирусного носительства, острой и хронической форм и характеризуется поражением печени с возможным развитием острой печеночной недостаточности, хронического гепатита, цирроза печени и первичного рака печени. Микробиологическая диагностика. Методами ИФА и РНГА в крови определяют маркеры гепатита В: Аг (HBs и HBe) и Ат (анти-HBs – IgM, антиHBs-IgG, анти-HBs, анти-HBe-IgM). ПЦР определяют наличие вирусной ДНК в крови и биоптатах печени. 2. Герпесвирусы – семейство Herpesviridae (греч. Herpes – ползучий) – сложные ДНК-содержащие вирусы. Семейство включает 3 подсемейства: А – подсемейство Alphaherpesvirinae 2А.1. Род Simplexvirus 2А.1.1. Вирус простого герпеса Герпетическая инфекция, или простой герпес, характеризуется везикулярными высыпаниями на коже, слизистых оболочках, поражением ЦНС и внутренних органов, а также пожизненным носительством и рецидивами болезни. Микробиологическая диагностика. Материал для исследования – содержимое герпетических везикул, слюна, соскобы с роговой оболочки глаз, кровь, спинномозговая жидкость. При культивировании в культуре клеток через 24 часа становится видимым ЦПЭ. Выделенный вирус идентифицируют в РИФ и ИФА с использованием моноклональных Ат. Серодиагностику проводят с помощью РСК, РИФ, ИФА и РН по нарастанию титра Ат больного. При экспресс-диагностике в мазках-отпечатках из высыпаний, окрашенных по Романовскому – Гимза, выявляются гигантские многоядерные клетки с внутриядерными включениями. 2А.2. Род Varicellovirus 2А.2.1. Вирус ветряной оспы и опоясывающего герпеса Ветряная оспа встречается главным образом у детей, протекает с лихорадкой, интоксикацией, сыпью в виде везикул с прозрачным содержимым. Опоясывающий герпес, или опоясывающий лишай, – эндогенная инфекция взрослых, перенесших в детстве ветряную оспу. Болезнь проявляется в виде везикулярной сыпи по ходу нервов. Микробиологическая диагностика. Материал для исследования – содержимое высыпаний, отделяемое носоглотки и кровь культивируют в человеческих диплоидных фибробластах. Вирус идентифицируют в РИФ, РСК, ИФА и РН. При серодиагностике применяют ИФА, РСК и РН. Вирус можно вы83 явить в мазках-отпечатках, окрашенных по Романовскому – Гимза, по образованию синцития и внутриядерных включений. В – подсемейство Betaherpesvirinae 2В.3. Род Cytomegalovirus 2В.3.1. Вирус цитомегалии Цитомегаловирус вызывает инфекцию человека, характеризующуюся поражением многих органов и тканей и протекающую разнообразно – от пожизненной латентной инфекции до тяжелой острой генерализованной формы с летальным исходом. Микробиологическая диагностика. Исследуют кровь, грудное молоко, мочу, слюну, отделяемое цервикального канала и спинно-мозговую жидкость. Вирус выделяют в культуре клеток. Идентификацию проводят с помощью ПЦР, а также в РИФ и ИФА с использованием моноклональных Ат. Ат в сыворотке крови больных определяют в ИФА, РСК и РН. Идентифицированные клетки в организме человека характеризуются увеличенными размерами и внутриядерными включениями в виде «глаза совы» (окраска гематоксин-эозин). С – подсемейство Gammaherpesvirinae 2С.4. Род Lymphocryptovirus 2С.4.1. Вирус Эпштейна – Барр ВЭБ вызывает лимфопролиферативные болезни, а также инфекционный мононуклеоз, характеризующийся интоксикацией, поражением небных и глоточных миндалин, увеличением лимфатических узлов, печени, селезенки, изменениями в крови. Микробиологическая диагностика. Инфекционный мононуклеоз документируется обнаружением атипичных лимфоцитов, лимфоцитозом. Применяют РА эритроцитов барана сывороткой крови больного, выявляют IgM к вирусному капсидному антигену (VCA). 3. Поксвирусы – семейство Poxviridae (англ. Pox – оспа, язва) – самые крупные сложные вирусы. 3.1. 3.1.1. Род Orthopoxvirus Вирус натуральной оспы Натуральная оспа – особо опасная высококонтагиозная инфекция, характеризующаяся тяжелым течением, лихорадкой и обильной пустулезнопапуллезной сыпью на коже и слизистых оболочках. Болезнь до ликвидации на земном шаре (в 1977 г.) относилась к карантинным инфекциям. 84 Микробиологическая диагностика. Исследуют содержимое элементов сыпи, отделяемое носоглотки, кровь, пораженные органы и ткани (табл. 22). Вирус выявляют при электронной микроскопии, в РИФ, РП. Выделяют вирус путем заражения крупных эмбрионов и культур клеток с последующей идентификацией в РН, РСК, РТГА. Серологическую диагностику проводят в РТГА, РСК, РПГА, РН. Таблица 22 Схема микробиологической диагностики натуральной оспы Исследуемый материал Кровь, жидкость везикул, пустул, кожные чешуйки и др. Сутки 1 3-4 5-6 Сыворотка 1-2 Методы Вирусоскопия, ИФ исследование Заражение 10-11-дневных куриных эмбрионов Вскрытие зараженных эмбрионов, определение наличия вирусов Идентификация вирусов в серологических реакциях Серологические реакции: РСК, РП, РТГА Задание 1. Микробиологическая диагностика гриппа (продолжение). Вскрыть куриные эмбрионы, для чего снять стеклянный колпачок и пастеровской пипеткой отсосать амниотическую жидкость. Поставить реакцию гемагглютинации: приготовить разведения вирусосодержащей жидкости в физиологическом растворе 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 (в объеме 0,5 мл). Добавить ко всем пробам по 0,5 мл 1 % взвеси куриных эритроцитов. Встряхнуть и поставить в термостат на 30 минут, после чего зафиксировать результаты. 2. Ознакомление с диагностическими препаратами: полиомиелитная живая вакцина, вакцина против клещевого энцефалита, сухая оспенная вакцина, противооспенный иммуноглобулин. Контрольные вопросы 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Классификация герпесвирусов. Каковы особенности герпесвирусов. Патогенез герпетических инфекций Методы лабораторной диагностики вирусов герпеса (ВПГ-1, 2, ЦМВ). Классификация аденовирусов. Методы культивирования аденовирусов. Лабораторная диагностика аденовирусов. 85 8. 9. 10. 11. Особенности вируса натуральной оспы. Патогенез натуральной оспы. Методы лабораторной диагностики натуральной оспы. Специфическая профилактика и терапия натуральной оспы. Тестовые задания для самоконтроля 1. Для аденовирусов характерно: наличие белковой оболочки крупные размеры кубический тип симметрии содержание РНК невосприимчивость к ним лабораторных животных 2. Вирусы группы герпеса: содержат РНК в естественных условиях непатогенны для животных наиболее просто устроены относятся к ДНК-содержащим паразитируют в ядрах нервных клеток 3. Вирус натуральной оспы: имеет мелкие размеры устойчив к эфиру не имеет суперкапсида патогенен для животных имеет кубоидальную форму 4. Присутствие вируса натуральной оспы в клетках выявляется с помощью: темнопольной микроскопии окраски по Морозову окраски по Романовскому – Гимза люминесцентной микроскопии метода Пашена 5. При лабораторной диагностике натуральной оспы выявляют: тельца Негри цитопатическое действие вируса симптомы заболевания у чувствительных животных тельца Пашена нарастание титра антител 86 6. Серологическую диагностику натуральной оспы проводят: с помощью цветной пробы реакцией гемагглютинации реакцией нетрализации РСК реакцией торможения гемагглютинации реакцией гемадсорбции 7. Для профилактики натуральной оспы применяют: ововакцину Морозова вакцину Ферми гамма-глобулин оспенный детрит убитую вакцину 8. Сопоставьте название вируса и особенности его генома: РНК-содержащий а) вирус гриппа ДНК-содержащий б) вирус СПИДа в) вирус полиомиелита г) цитомегаловирус д) вирус Эпштейна – Барр 9. Вирусы, содержащие ДНК: пикорнавирусы поксвирусы парамиксвирусы аденовирусы 87 СОДЕРЖАНИЕ Введение…………………………………………………………………….. Тема 1. Микробиологическая диагностика холеры ……………………… Тема 2. Микробиологическая диагностика эшерихиозов ..……………… Тема 3. Микробиологическая диагностика заболеваний, вызванных сальмонеллами (1). Возбудители брюшного тифа и паратифов А, В, С.. Тема 4. Микробиологическая диагностика заболеваний, обусловленных сальмонеллами (II)……………………………………………………. Тема 5. Микробиологическая диагностика дизентерии………………… Тема 6. Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных условно-патогенными энтеробактериями…………………………………… Тема 7. Микробиологическая диагностика дифтерии и коклюша……… Тема 8. Микробиологическая диагностика чумы, туляремии, бруцеллеза Тема 9. Микробиологическая диагностика сибирской язвы …….……… Тема 10. Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных грамположительными кокками ……………………….…………………. Тема 11. Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных грамотрицательными кокками…………………………………………… Тема12. Микробиологическая диагностика анаэробных инфекций……. Тема 13. Микробиология туберкулеза и лепры………………………… Тема 14. Микробиологическая диагностика спирохетозов……………… Тема 15. Микробиологическая диагностика риккетсиозов и хламидиозов Тема 16. Микробиологическая диагностика вирусных инфекций (РНКвирусы)……………………………………………………………….……… Тема 17. Микробиологическая диагностика вирусных инфекций (ДНКвирусы)…………………………………………………………………… 88 3 4 10 15 20 23 29 33 40 45 49 54 57 62 65 70 74 82 УЧЕБНОЕ ИЗДАНИЕ Габрилович Исаак Моисеевич Хараева Заира Феликсовна Хакешева Тамара Алисовна Блиева Лариса Заурбековна ЧАСТНАЯ МЕДИЦИНСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ Лабораторный практикум Для специальностей: 060101 – Лечебное дело, 060105 – Стоматология Редактор Ю.Ю. Бекузарова Компьютерная верстка Е.Л. Шериевой Корректор В.В. Вакулина В печать 29.09.2008. Формат 60х84 1/16. Печать трафаретная. Бумага офсетная. 5.35 усл.п.л. 5.0 уч.-изд.л. Тираж 300 экз. Заказ № Кабардино-Балкарский государственный университет. 360004, г. Нальчик, ул. Чернышевского, 173 Полиграфический участок ИПЦ КБГУ 360004, г. Нальчик, ул. Чернышевского, 173. 89
