Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр «Всероссийский научно-исследовательский институт масличных культур имени В.С. Пустовойта» ОТЧЁТ О ВЫПОЛНЕНИИ НАУЧНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ аспиранта очной формы обучения Усатенко Лолиты Олеговны отдела биологических исследований за 1 семестр 2022/2023 учебного года Специальность: 4.1.2 Селекция, семеноводство и биотехнология растений Тема диссертационной работы: «Исходный материал с оптимальным составом глюкозинолатов в семенах рапса (Brassica napus L.)» Научный руководитель _______________ Ефименко С. Г. Аспирант ________________ Усатенко Л. О. Краснодар 2023 Введение Актуальность темы. Содержание глюкозинолатов является показателем безопасности использования семян рапса, которое не должно превышать 25 мкмоль/г семян. Селекция на снижение общего содержания глюкозинолатов во ВНИИМК идет эффективно. С другой стороны, необходимо оптимизировать состав, повысить долю индольных и ароматических глюкозинолатов, являющихся естественной защитой растения и снизить долю алифатических глюкозинолатов глюконапина, глюкобрассиканапина, прогоитрина, наполеиферина, которые имеют антипитательное и зобогенное действие. Отсутствие достаточной информации о различиях между содержанием глюкозинолатов в семенах рапса озимого и ярового и о наследуемости глюкозинолатов позволяют обосновать необходимость проведения исследований и углубленного контроля и мониторинга за содержанием и составом глюкозинолатов в семенах рапса. Патентная проработка. Тема актуальна. Необходимо ежегодное проведение патентных исследований. Цель и задачи исследований. Целью исследования является выделение исходного материала с оптимальным составом глюкозинолатов в семенах рапса. Задачи исследования на 1 семестр обучения: 1. Провести обзор литературных источников по проблеме исследования. 2. Провести поиск образцов семян рапса озимого и ярового с максимальным диапазоном изменчивости по общему содержанию глюкозинолатов с помощью ИК-спектрометрии. 3. Определить общее содержание глюкозинолатов в семенах рапса фотоколориметрическим методом. 2 Научная новизна и практическая значимость ожидаемых результатов. Состоит в уточнении различий состава глюкозинолатов в семенах рапса озимого и ярового методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и тонкослойной хроматографии (ТСХ), в разработке градуировочных моделей для ИК-спектрометрии отдельных форм глюкозинолатов и проведении с их помощью массовой оценки семян рапса по составу глюкозинолатов, в проведении отбора образцов семян с определенным сочетанием отдельных форм глюкозинолатов, в определении наследуемости отдельных форм глюкозинолатов в семенах рапса и выделении исходного материала с оптимальным составом глюкозинолатов в семенах рапса. 3 Основная часть Степень изученности вопроса. Первые сведения о глюкозинолатах были приведены в трудах Челленджера в 1950 г. (Challenger, 1950), а уже в 1956 г. Эттлингером и Лундином была представлена первая правильная структура этих соединений (Ettlinger, 1956). В те же годы было обнаружено, что высокая концентрация глюкозинолатов токсична для людей и животных, а низкая концентрация их некоторых гидролитических продуктов имеет полезный эффект. С химической точки зрения глюкозинолаты представляют собой замещенные сложные эфиры тиоаминокислот со следующей химической структурой (рис.1): Рис. 1 Химическая структура глюкозинолатов (Ettlinger, 1956). Биосинтез глюкозинолатов основан на соответствующих аминокислотах, как показано в следующей схеме: аминокислота → Nгидроксиаминокислота → альдоксим → тиогидроксикислота → десульфоглюкозинолат → глюкозинолат (Halkier, 1997). Во время первой фазы происходит модификация исходной аминокислоты, которая отличается боковой цепью глюкозинолатов (R). Исходными являются метионин аминокислотами и цистеин, алифатических ароматических – фенилаланин и тирозин, биосинтез глюкозинолатов с индольной группой начинается с L-триптофана (Kutáček, 1962). Токсичные соединения образуются в результате гидролитического разрушения алифатических глюкозинолатов (рис. 2). Этот гидролиз происходит благодаря действию фермента мирозиназы, и он происходит отдельно в клетках идиобласта, в то время как глюкозинолаты локализуются в паренхиматозных тканях (Guignard, 4 1980). Продукты гидролиза глюкозинолатов ответственны за характерный вкус и запах многих овощей Brassica. Рис. 2 Схема гидролиза глюкозинолатов (Guignard, 1980). В 1961 г. в Канаде были выведены формы рапса Canola (Canadian oil low acid) с содержанием эруковой кислоты не более 2 % от общего содержания жирных кислот и максимальным содержанием глюкозинолатов 30 мкмоль/г семян. Рапс «0»-го типа содержит не более 2 % эруковой кислоты, «00»-го типа содержит не более 2 % эруковой кислоты и 25 мкмоль/г семян глюкозинолатов, «000»-го типа – низкоэруковый, низкоглюкозинолатный, желтосемянный (Buchner, 1987). По своим физиологическим свойствам глюкозинолаты в зависимости от характера продуктов разложения делят на три группы: алифатические, индольные, ароматические (Fieldsend, 1994). Вегетативные органы и семена рапса содержат глюкозинолаты из всех трех групп, причем выявлены различия между рапсом озимым и яровым по компонентному составу глюкозинолатов (Daun, 1986). Наиболее представлены распространены следующим алифатические составом: глюкозинолаты, глюкоиберин, они прогойтрин, глюкорафанин, синигрин, глюкоаллисин, глюконаполеиферин, глюконапин, глюкобрассиканапин, глюкотропеолин. Глюконапин, глюкобрассиканапин, прогоитрин, наполеиферин – эти основные алифатические глюкозинолаты, которые представляют серьезную проблему в комбикормовой промышленности, поскольку они снижают пригодность рапсовой муки и шрота при кормлении сельскохозяйственных животных (Halkier, 2006). Глюконапин и глюкобрассиканапин избирательно связывают йод и препятствуют его поступлению в щитовидную железу, но этот эффект может 5 быть компенсирован добавлением солей йода в пищу или кормовые смеси. Прогоитрин и наполеиферин – это алифатические гидроксиглюкозинолаты. Эта группа соединений с точки зрения антипитательного эффекта является наиболее значительной. Продукты разложения гидроксиглюкозинолатов – нестабильные изотиоцианаты. Они циклизуются с образованием замещенного 5-винил-2-оксазолидинтиона (гоитрин). Он подавляет синтез гормонов щитовидной железы – тироксина и трийодтиронина, и этот отрицательный эффект не может быть устранен повышенным потреблением йода. Содержание прогоитрина в семенах рапса составляет около 71% от общего количества глюкозинолатов (Halkier, 2006). Индольные глюкозинолаты гидроксиглюкобрассицин, имеют глюкобрассицин, следующий состав: 4- 4-метоксиглюкобрассицин, неоглюкобрассицин (Fenwick, 1983). Из ароматических глюкозинолатов присутствует синальбин. Глюкозинолаты, содержащие индольную группу или бензольное кольцо, участвуют в активной защите растения и выполняют роль фитоалексинов (Takasugi, 1986), поскольку Griffiths et al. (1994) доказали тот факт, что повышенный биосинтез этих глюкозинолатов запускается после нападения некоторых видов вредителей. Индолглюкозинолаты способны выделять ауксин при воздействии на растение внешних факторов (мороз, болезни). Изучение индолглюкозинолатов и их метаболизма требует независимых глубоких исследований из-за низкой освещенности в научной литературе. Химическая структура глюкозинолата является важным детерминантом образующегося продукта, который в свою очередь определяет его биологическую активность (Zhou, 2005). По этой причине важно правильно идентифицировать и количественно оценить различные глюкозинолаты, присутствующие в семенах рапса. Методы анализа общего содержания глюкозинолатов основаны на химических или биохимических реакциях, таких как палладиевый тест (Thies, 1978), метод высвобождения глюкозы (Smith, 1987), метод 6 высвобождения сульфатов. Из-за времени, необходимого для экстракции глюкозинолатов и других реакций, эти методы не очень быстры, но могут быть оптимизированы для обеспечения высокого потока и низкой стоимости. Другие методы, использующие физические принципы, являются более простыми. Они основаны на использовании прямой спектроскопии без экстракции глюкозинолатов. Спектроскопия отражения в ближнем инфракрасном диапазоне позволяет работать с целыми семенами, не уничтожая анализируемый образец. Рентгеновская флуоресцентная спектроскопия требует размола образца, но является более точным. Этот метод основан на тесной взаимосвязи между общим содержанием серы и общим содержанием глюкозинолатов в семенах рапса и способности рентгеновской флуоресцентной спектроскопии определять общее содержание серы в органическом веществе (Daun, 1986). В настоящее время общее содержание глюкозинолатов оценивается фотоколориметрическим методом анализа (Осик, и 1996) ИК- спектроскопическим методом анализа. Методы анализа состава глюкозинолатов разнообразны и делятся на хроматографические и нехроматографические. Для выделения глюкозинолатов используются бумажная хроматография, тонкослойная хроматография, газовая хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, жидкостная хроматография гидрофильного взаимодействия и некоторые из самых современных методов, таких как сильноионообменная центробежно-распределительная хроматография, метод микрочипов и т. д. (Smith, 1987). У всех методов есть свои преимущества и недостатки. Для проверки используемого метода определения отдельных форм глюкозинолатов необходимы сертифицированные справочные материалы (CRM). Три вида образцов семян рапса (с высоким, средним и низким содержанием), названные соответственно CRM 366, CRM 190 и CRM 367, были сертифицированы Бюро Communautaire de Référence в 1989-1991 годах. 7 Газовая хроматография (ГХ) показывала замечательные результаты даже при низкой эффективности и успешно применялась для разделения и количественного и качественного анализа глюкозинолатов (Jart, 1961). Летучесть глюкозинолатов решалась триметилсилилированием. По мере возрастания интереса производилось множество модификаций метода, в основном в типах используемых колонок. Для повышения эффективности и точности метода его чаще всего комбинировали с масс-спектрометрией (Cole, 1975; Gil, 1980; Hasapis, 1981). ГХ имеет несколько недостатков: она занимает много времени и из-за высокой температуры хроматографии глюкозинолаты денатурируются, и трудно получить чистые образцы (Mullin, 1978). ГХ занимает много времени для анализа, а мощность хроматографа низка по сравнению с ВЭЖХ, но тем не менее этот метод всегда представлял интерес. Эта простая процедура и точные результаты побудили исследователей применять этот метод для анализа глюкозинолатов (Kjaer, 1956; Jart, 1961; Elliott, 1971; Underhill, 1971; Bjorkman, 1972; VanEtten, 1974; Mullin, 1978; Thies, 1978; Olsen, 1979; McGregor, 1983; Kamel, 2008; Chaundhary, 2012). Бумажная хроматография (БХ) – очень простой и быстрый метод определения глюкозинолатов. БХ применяли для разделения тиомочевины, образующейся при взаимодействии изотиоцианатов с аммиаком (Josefsson, 1967). Обычно использовались две разные подвижные фазы: насыщенный водой хлороформ для гидрофобных тиомочевин и смесь бутанол: толуол: вода для гидрофильных тиомочевин. БХ применялся многими исследователями (Kjaer, 1953; Ettlinger, 1956; Kjaer, 1956; Josefsson, 1967; Elliott, 1971; Bjorkman, 1972; Smith, 2006). Недостаток этого метода заключался в том, что значения глюкозинолатов зависели от температуры растворителя, количества хроматографической вещества. Это бумаги, привело следовательно, применения этого метода. 8 к чистоты снижению растворителя и популярности и, Тонкослойная хроматография (ТСХ) – быстрый и надежный метод. Он имеет более низкий предел обнаружения, чем БХ, как утверждает Josefsson (1967). Он был использован для обнаружения тиомочевины, образующейся в реакции между изотиоцианатами и аммиаком. ТСХ использовали для оценки как неповрежденных глюкозинолатов, так и продуктов их гидролиза (Gadamer, 1897). По неизвестным причинам ТСХ не получила широкого распространения по сравнению с БХ. Существует лишь несколько значительных применений ТСХ для оценки глюкозинолатов (Bjorkman, 1972; Barron, 1988; Emam, 2009; Devi, 2010; Russo, 2012). У этого метода множество преимуществ: быстрые результаты, большое количество образцов, оцениваемых одновременно, воспроизводимость и очень низкая стоимость, этот метод может стать успешной альтернативой ВЭЖХ. Исходя из анализа зарубежной научной литературы, самым часто применяемым методом анализа отдельных глюкозинолатов является ВЭЖХ анализ ферментативно десульфатированных глюкозинолатов (Betz, 1994). Важным этапом анализа является ингибирование активности мирозиназы. По этой причине растительные материалы перед исследованиями должны быть полностью высушены сушкой замораживанием, а для экстракции необходимо использовать водный метанол в сочетании с высокими температурами. Еще одним важным этапом анализа является получение десульфоглюкозинолатов путем гидролиза глюкозинолатов ферментами сульфатазами (арилсульфогидролазами, EC 3.1.6.1). Десульфоглюкозинолаты обеспечивают лучшее разделение с помощью ВЭЖХ, но часто возникают трудности при интерпретации результатов отдельных глюкозинолатов из-за времени и концентрации ферментов в продуктах десульфатирования (Mullin, 1978). Стандартная процедура ВЭЖХ-анализа описывает экстракцию глюкозинолатов с использованием метанола с добавлением внутреннего стандарта перед экстракцией. Следующим этапом является очистка экстракта на ионообменных колонках, заполненных ионообменной смолой DEAE 9 Сефадекс А и натрий-ацетатным буфером перед ферментативной десульфатацией глюкозинолатов. Десульфоглюкозинолаты элюируют из колонки водой и затем разделяют с помощью ВЭЖХ с ультрафиолетовым детектированием при 229 нм (ГОСТ ISO 9167-1-2015). Блок-схема определения десульфатированных глюкозинолатов: 1. Повреждение тканей растений. 2. Экстракция глюкозинолатов. 3. Десульфатация глюкозинолатов. 4. Определение глюкозинолатов. «Ключом» лучшего разделения глюкозинолатов является ферментативная десульфатация сульфатазой из Helix pomatia. Некоторые исследования также демонстрируют, что время гидролиза зависит от природы глюкозинолатов (Quinsac, 1987). Хроматографические методы являются высокоэффективными для определения, идентификации и количественной оценки отдельных глюкозинолатов с использованием внутреннего стандарта, но в тоже время являются дорогостоящими и трудоемкими. Регулирование биосинтеза глюкозинолатов необходимо понимать, чтобы контролировать и оптимизировать их содержание. Высокая концентрация глюкозинолатов наблюдается в основном в быстрорастущих частях растений, например, в ростках и корнях, и может быть связана с защитой от повреждений, вызванных вредителями, паразитами и болезнями (Giamoustaris, 1995). Содержание глюкозинолатов так же может зависеть от способа внесения удобрений и состава почвы. Увеличение концентрации сульфатов в почве приводит к повышению уровня глюкозинолатов как в листьях, так и в семенах, в то время как повышение концентрации азотистых удобрений оказывает противоположный эффект. Некоторые авторы утверждают, что содержание глюкозинолатов в семенах не контролируется генотипом зародыша семени, и что их уровень зависит только от возраста растений, стадии развития, может повышаться в ответ на механическое 10 повреждение или поражение насекомыми (Mithen, 1992). Однако показано, что генетический контроль содержания глюкозинолатов очень сложен и для того, чтобы прояснить действие генов требуются более глубокие исследования. В конце 70-х гг. ВНИИМК стал первым учреждением в России, где началась селекционная работа на качество масла и шрота рапса озимого и ярового. На тот момент общее содержание глюкозинолатов в обезжиренных семенах рапса составляло от 90 до 140 мкмоль/г семян. На сегодняшний день сорта рапса селекции ВНИИМК содержат от 14 до 17 мкмоль/г семян глюкозинолатов (Бочкарева, 2021). РАЗДЕЛ 1. Определение общего содержания и состава глюкозинолатов в семенах рапса Опыт 1.1. Провести широкомасштабный поиск образцов семян рапса озимого и ярового с максимальным диапазоном изменчивости по общему содержанию глюкозинолатов с помощью ИК-спектрометрии. Схема и методика опыта. Широкомасштабный поиск проводится на всех поступающих образцах рапса озимого и ярового в лабораторию биохимии для отбора образцов с минимальным, средним и максимальным содержанием глюкозинолатов. С помощью разработанной градуировочной модели содержания глюкозинолатов для ИК-анализатора MATRIX-I проводится определение общего содержания глюкозинолатов и выделение искомых образцов из селекционного материала отдела селекции рапса и горчицы. Объем работы: 12056 образцов рапса озимого и ярового. Место проведения: Лаборатория биохимии, отдел селекции рапса и горчицы ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, г. Краснодар. Сроки выполнения: 2022 г. В результате было выделено 195 и 59 образцов семян рапса озимого и ярового соответственно с максимальным диапазоном изменчивости по общему содержанию глюкозинолатов. 11 Опыт 1.2. Определить общее содержание глюкозинолатов в семенах рапса фотоколориметрическим методом с использованием реактива хлористого палладия. Схема и методика опыта. Предварительно снимаются спектральные данные образцов семян рапса, выделенных в опыте 1.1, на ИК-анализаторе для уточнения разработанной градуировочной модели по определению содержания глюкозинолатов с помощью ИК-спектрометрии. Снятие спектров проводится с массой пробы от 9 г до 20 г в трехкратной повторности с пересыпанием образца. Затем в двукратной повторности определяется общее содержание глюкозинолатов в водных экстрактах семян фотоколориметрическим методом с использованием хлористого палладия. Навеску семян 1,8 г предварительно измельчают, затем экстрагируют дистиллированной водой в водяной бане при температуре не ниже 90 оС. К растворам добавляют реактив хлористый палладат натрия и через 30 минут при длине волны 440 нм снимают экстинцию на спектрофотометре В-1200. Спектральные данные и данные химических анализов вносятся в таблицу спектров в программу QUANT. Объем работы: 195 образцов рапса озимого, 59 образцов рапса ярового, 508 химических анализов, 762 спектральных данных. Место проведения: Лаборатория биохимии, отдел селекции рапса и горчицы ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, г. Краснодар. Сроки выполнения: 2022-2023 гг. На основании химического анализа образцов, полученные значения общего содержания глюкозинолатов были распределены на 4 класса от низкого содержания до высокого (табл. 1). Исходя из данных, представленные в таблице 1, минимальное содержание глюкозинолатов было выявлено в образце рапса озимого № 1104 и составило 7,4 мкмоль/г семян, а максимальное – 81,9 мкмоль/г семян в образце № 6886. Диапазон изменчивости признака составил 74,5 мкмоль/г семян. Минимальное содержание глюкозинолатов было выявлено в образце 12 рапса ярового № 8182 и составило 11,1 мкмоль/г семян, а максимальное – 83,8 мкмоль/г семян в образце № 7741. Диапазон изменчивости признака составил 72,7 мкмоль/г семян. Таблица 1. Распределение общего содержания глюкозинолатов в семенах рапса озимого и ярового ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, Краснодар, 2023 г. Количество Количество Содержание Содержание Класс образцов образцов глюкозинолатов глюкозинолатов рапса озимого рапса ярового 7-22 мкмоль/г 11-22 мкмоль/г 1 142 45 семян семян 22-40 мкмоль/г 22-40 мкмоль/г 2 22 5 семян семян 40-60 мкмоль/г 40-60 мкмоль/г 3 24 3 семян семян 60-82 мкмоль/г 60-84 мкмоль/г 4 6 6 семян семян Всего: 195 Всего: 59 Определение состава отдельных форм глюкозинолатов будет проведено в дальнейших исследованиях на отобранных в опыте 1.2 образцах рапса озимого и ярового. Выполнение индивидуального плана. За 1 семестр обучения в аспирантуре был проведён обзор литературы по теме НИР: проработано 45 литературных источника как отечественных, так и зарубежных авторов. Сданы зачёты по дисциплинам учебного плана за 1 семестр: - английский язык; - история и философия науки. В соответствии с тематическим планом были проведены опытноэкспериментальные исследования по разделу 1 (опыт 1.1, опыт 1.2). 13 Публикации и участие в научных мероприятиях. Таблица 2. Список опубликованных научных работ № п/п Наименование работы 1 2 1 Вид работы Выходные данные Объём работы (в стр. или п.л.) 3 4 5 за отчётный период (1 семестр обучения) Оценка Статья Сборник материалов 4 погрешности 12-й Международной определения конференции общего молодых ученых и содержания специалистов глюкозинолатов «Актуальные вопросы в семенах рапса биологии, селекции, озимого технологии (Brassica napus возделывания и L.) переработки сельскохозяйственных культур», с. 317-321 Соавторы 6 Ефименко С. Г. Таблица 3. Перечень научных мероприятий № п/п 1 1 Статус Название мероприятия (междунар., всерос., регион.) Место и дата проведения 4 2 3 за отчётный период (1 семестр обучения) 12-ая Международная конференция молодых ученых и г. Краснодар специалистов «Актуальные ФГБНУ ВНЦ вопросы биологии, селекции, международная ВНИИМК технологии возделывания и 1-3 марта 2023 г. переработки сельскохозяйственных культур» 14 Заключение В результате проведенных опытно-экспериментальных исследований по разделу 1 (опыт 1.1, опыт 1.2) было выделено 195 образцов рапса озимого с максимальным диапазоном изменчивости общего содержания глюкозинолатов от 7,4 до 81,9 мкмоль/г и 59 образцов рапса ярового с содержанием глюкозинолатовот 11,1 до 83,8 мкмоль/г. Был освоен фотоколориметрический метод определения общего содержания палладия. глюкозинолатов Были получены с использованием уточненные данные реактива хлористого общего содержания глюкозинолатов в семенах рапса озимого и ярового. На основе полученных данных была усовершенствована градуировочная модель по определению общего содержания глюкозинолатов для ИК-спектрометрии в семенах рапса. Определение состава отдельных форм глюкозинолатов будет проведено в дальнейших исследованиях на отобранных в опыте 1.2 образцах рапса озимого и ярового. 15 Список использованных источников 1) Challenger F. The Natural Mustard Oil Glucosides and the Related Isothiocyanates and Nitriles / F. Challenger // In: Aspects of the Organic Chemistry of Sulphur Butterworths London. – 1950. – pp. 115-161. 2) Ettlinger M.G. The structure of sinigrin and sinalbin: an enzymatic rearrangement / M.G. Ettlinger, A.J. Lundeen // J. Amer. Chem. Soc. – 1956. – № 78. – pp. 4172-4173. 3) Halkier B.A. The biosynthesis of glucosinolates / B.A. Halkier, Du L. // Trends. Plant. Sci. – 1997. – № 11. – pp. 425-431. 4) Kutáček M. Biogenesis of glucobrassicin the in vitro precursor of ascorbigen / M. Kutáček, Prochaska, K. Vereš // Nature. – 1962. – № 194. – pp. 393-394. 5) Guignard L. Sur la localisation des principes qui fournissent les essences sulfurées des Cruciféres / L. Guignard // C.R. Hebd. Séanc. Acad. Sci. – 1980. – № 111. – pp. 249-252. 6) Buchner R. Glucosinolates in rapeseed / R. Buchner // Martinus Nijhoff Publishers. – 1987. – pp. 50-58. 7) Fieldsend J. Changes in glucosinolates during crop development in single and double-low genotypes of winter oilseed rape (Brassica napus). Production and distribution in vegetative tissues and developing pods during development and potential role in the recycling of sulphur within crop / J. Fieldsend, G.F.J. Milford // Ann. Appl. Biol. – 1994. – № 124. – pp. 531-542. 8) Halkier B. Biology and biochemistry of glucosinolates / B. Halkier, J. Gershenzon // Ann Rev Plant Biol. – 2006. – № 57. – pp. 303-333. 9) Daun J. K. Glucosinolate Analysis in Rapeseed and Canola / J. K. Daun // Update. J. Jpn. Oil Chem. Soc. (Yakagaku). – 1986. – № 35. – pp. 426-434. 10) Fenwick G.R. Glucosinolates and their breakdown products in food and food and food plants / G.R. Fenwick, R.K. Heaney, W.J. Mullin // CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr. – 1983. – № 18. – pp. 123-202. 16 11) Takasugi M. Isolation of three novel sulphur-containing phytoalexins from the Chinese cabbage Brassica campestris L. spp. Pekinensis / M. Takasugi, N. Katsui, A. Shirata // J. Chem. Soc., Chem Commun. – 1986. – pp.1077-1078. 12) Griffiths D.W. Induced changes in the indole glucosinolate content of oil-seed and forage rape (Brassica napus) plant in response to either turnip root fly (Delia floralis) larval feeding or artificial root damage / D.W. Griffiths, W.H. Mac Farlane-Smith // J. Sci. Food Agric. – 1994. – № 65. – pp.171-178. 13) Zhou J. Separation and purification of the main glucosinolate from rapeseeds / J. Zhou, J. Hu, A. Qiu // Se. Pu. – 2005. – № 23. – pp. 411-414. 14) Thies W. Quantitative Analysis of Glucosinolates after Their Enzymatic Desulfation on Ion Exchange Columns / W. Thies // In: Preceedings of the Fifth International Rapeseed Congress. – 1978. – Vol. 1. – pp. 136-139. 15) Smith D. B. Simple and Rapid Method of Quantitatively Measuring the Glucosinolate Concentration of Rapeseed / D. B. Smith, D. G. Parsons, C.A. Starr // J. Agric. Sci. – 1985. – Vol. 105. – pp. 597-603. 16) Осик Н.С. Метод быстрой оценки общего содержания глюкозинолатов в семенах капустных для целей селекции / Н.С. Осик, В.П. Швецова // Науч.- тех. бюл. ВНИИМК. – 1996. – Вып. 113. – С. 98-99. 17) Jart A. Gas-Liquid Chromatographic Retention Data for Some isoThiocyanates / A. Jart // Acta Chem. Scand., Vol. 15. – 1961. – № 18. – pp. 1223-1230. 18) Cole R.A. 1-Cyanoepithioalkanes: Major Alkenylglucosinolate Hydrolysis in Certain Cruciferae Products of / R.A. Cole // Phytochemistry. – 1975. – Vol. 14. – pp. 2293-2294. 19) Gil V., MacLeod A. J. Some Glucosinolates of Farsetia aegyptia and Farsetia Ramosissima / V. Gil, A. J. MacLeod // Phytochemistry. – 1980. – Vol. 19. – pp. 227-231. 20) Hasapis X. Glucosinolates of Nine Cruciferae and Two Capparaceae Species / X. Hasapis, A. J. MacLeod, M. Moreau // Phytochemistry. – 1981. – Vol. 20. – pp. 2355-2358. 17 21) Mullin W.J. High-Performance Liquid Chromatography and Gas Chromatography of organic Isothiocyanates and their Methanol-Isothiocyanate Addition Compounds / W.J. Mullin // J. Chromatogr. – 1978. – Vol. 155. – pp. 198-202. 22) Kjaer A. IsoThiocyanates XXIX* Separation of Volatile isoThiocyanates by Gas Chromatography / A. Kjaer, A. Jart // Acta Chem. Scand. – 1956. – Vol. 11. – pp. 1423. 23) Elliott M.C. Indole Compounds Related to Auxins and Goitrogens of Woad (Isatis tinctoria L.) / M.C. Elliott, B.B. Stowe // Plant Physiol. – 1971. – Vol. 47. – pp. 366-372. 24) Underhill E.W. Gas Chromatography of Trimethylsilyl Derivatives of Glucosinolates / E.W. Underhill, D.F. Kirkland // J. Chromatogr. – 1971. – Vol. 57. – pp. 47-54. 25) Bjorkman R. Preparative Isolation and 35S-Labelling of Glucosinolates from Rapeseed (Brassica napus L.) / R. Bjorkman // Acta Chem. Scand. – 1972. – Vol. 26. – pp. 1111-1116. 26) VanEtten C. Glucosinolates and derived products in cruciferous vegetables: total glucosinolates by retention on anion exchange resin and enzymatic hydrolysis to measure released glucose / C. VanEtten, M. Daxenbichler // J. Assoc. offic. Anal. Chem. № 60. – 1974. – № 18. – pp. 933-946. 27) Olsen O. Recent Advances in the Analysis of Glucosinolates / O. Olsen, H. Sorensen // J. Am Oil Chem. Soc. – 1979. – Vol. 58. – pp. 857-865. 28) McGregor D.I. A rapid and simple assay for identifying low glucosinolates rapeseed / D.I. McGregor, R.K. Downey // Can. J. Plant. Sci. – 1983. – № 55. – pp. 191-196. 29) Kamel A.M. Secondary and Primary Plant Metabolites as Chemical Markers for Resistance of Bitter Candytuft (Iberis amara) Plant against Insect Attack / A.M. Kamel, S.E. El-Gengaihi // Not. Bot. Hort. Agrobot. Cluj. – 2008. – Vol. 36.– pp. 80-87. 18 30) Chaudhary A. Anticancer Antioxidant Activities and GC-MS Analysis of Glucosinolates in Two Cultivars of Broccoli / A. Chaudhary, G. Rampal, U. Sharma, T. S. Thind, B.Singh, A.P. Vig, S. Arora // Med. Chem. Drug Disc. – 2012. – Vol. 2. – pp. 30-37. 31) Josefsson E. Distribution of Thioglucosides in Different Parts of Brassica Plants / E. Josefsson // Phytochemistry. – 1967. – Vol. 6. – pp. 16171627. 32) Kjaer A. Paper Chromatography of Thioureas / A. Kjaer, K. Rubinstein // Acta Chem. Scand. – 1953. – Vol. 7. – pp. 528-536. 33) Kjaer A. IsoThiocyanates XIX. L (-)-5-Methyl-sulphinylpentyl isoThiocyanate the Aglucone of a New Naturally Ocurring Glucoside (Glucoalyssin) / A. Kjaer, R. Gmelin // Acta Chem. Scand. – 1956. – Vol. 10. – pp. 1100-1110. 34) Smith C. A. Rapid Method for Determining Total Glucosinolates in Rapeseed by Measurement of Enzymatically Released Glucose / C. A. Smith, C. Dacombe // J. Sci. Food Agric. – 2006. – Vol. 38. – pp.141-150. 35) Gadamer J. UÈ ber das Sinigrin / J. Gadamer // Ber. Dtsch. Chem. Ges. – 1897. – Vol. 30. – pp. 2322-2327. 36) Barron D. Sulphated Flavonoids / D. Barron, L. Varin, R.K. Ibrahim, J.B. Harborne, C.A. Williams // Phytochemistry. – 1988. – Vol. 27. – pp. 23752395. 37) Emam S.S. Glucosinolates Phenolic Acids and Anthraquinones of Isatis microcarpa Boiss and Pseuderucaria clavate (Boiss&Reut.) Family: Cruciferae / S.S. Emam, H.I.A. El-Moaty // J. Appl. Sci. Res. – 2009. – Vol. 5. – pp. 2315-2322. 38) Devi J.R. Extraction and Separation of Glucosinolates from Brassica oleraceae var Rubra / J.R. Devi, E.B. Thangam // Adv. Biol. Res. – 2010. – Vol. 4. – pp. 309-313. 19 39) Russo. Rapid Separation of Seed Glucosinolates from Camelina sativa by Thin Layer Chromatography / Russo, Reggiani // Int. J. Plant Biol. – 2012. – № 18. – pp. 22-23. 40) ГОСТ ISO 9167-1-2015. Определение содержания глюкозинолатов. – Москва: Стандартинформ. – 2016. 41) Quinsac A. Analyse quantitative rapide des glucosinolates du colza par chromatographie en phase liquide isocratique / A. Quinsac, D. Ribaillier // Bull. GCIRC. – 1994. – № 10. – pp.167-177. 42) Betz J. M. High Performance Liquid Chromatographic Determination of Glucosinolates in Brassica vegetables / J. M. Betz, W. D. Fox // Food Phytochemicals 1: Fruits and Vegetables. ACS Symposium Series American Chemical Society Washington DC. – 1994. – pp. 181-196. 43) Giamoustaris A. The effect of modifying the glucosinolate content of leaves of oilseed rape on its interactions with specialist and generalist pests / A. Giamoustaris, R. Mithen // Ann. Appl. Biol. – 1995. – № 126. – pp. 347-363. 44) Mithen R. Leaf glucosinolate profiles and their relationship to pest and disease resistance in oilseed rape / R. Mithen // Euphytica. – 1992. – № 63. – pp. 71-83. 45) Бочкарева Э.Б. Селекция рапса озимого во ВНИИМК: история и новые результаты (обзор) / Э.Б. Бочкарева, Л.А. Горлова, Е.А. Стрельников, В.В. Сердюк // Масличные культуры. – 2021. – Вып. 188. – С. 87-95. 20
