ПРИНЦИПЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД 1. Обеспечение питательных потребностей микроорганизмов II. Выбор сырьевых источников для конструирования ПС ШП. Оптимизация ПС IV. Стандартизация Питательных Сред ПОТРЕБНОСТЬ ПРОДУЦЕНТОВ В АЗОТЕ В расчете на сухое вещество содержание азота в клетке составляет в среднем у бактерий 12%, у грибов10%. В зависимости от типов используемых азотистых соединений микроорганизмы разделяют на 4 грушны: •Азотфиксирующие микроорганизмы - обладающие свойством усваивать атмосферный азот; • Протеолитические - расщепляющие высокомолекулярные белковые вещества и пептиды; • Дезаминирующие - требующие присутствия в среде готовых аминокислот, расщепление которых сопровождается выделением аммиака. •Нитритно-нитратные микроорганизмы - усваивающие окисленные формы азота. ШИРОКО ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ИСТОЧНИКИ АЗОТА • пептоны • субстраты, полученные кислотном гидролизе белка при (чаше всего казеина). Гидролизат казеина содержит полный набор аминокислот (за исключением триптофана, разрушающегося при кислотном гидролизе) и является универсальным источником азота. Важную грушу представляют микроорганизмы, способные фиксировать молекулярный азот воздуха. НАЧЕНИЕ ДЛЯ ПРОДУЦЕНТОВ АКТИВНОСТИ ВОДЫ (микроорганизмы способны развиваться на питательных средах, в которых активность воды (aw) находится в пределах от 0,63 до 0,93, причем для бактерий этот диапазон значительно уже (от 0,93 до 0,99), чем для дрожжей микроскопических грибов. ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕДЬЯВЛЯЕМЫЕ К «ИДЕАЛЬНОМУ» СЫРЬЮ 1. Доступность 2. Дешевизна 3. Иметь стандартный состав 4. Быть стабильным при хранении 5. Хорошо растворяться воде 6. Легко усваиваться микроорганизмами 7. Не должно относиться к пищевым продуктам. РАЗНОВИДНОСТИ СЫРЬЕВЫХ ИСТОЧНИКОВ • синтезированные химическим путем • минерального происхождения • животного происхождения • растительного происхождения • из отходов производства ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕДЬЯВЛЯЕМЫЕ K ПИТАТЕЛЬНЫМ СРЕДАМ 1. Наличие все необходимых веществ для роста и развития продуцента. 2. Компоненты, находящиеся в питательной среде, должны быть в таких количествах, форме и соотношениях, которые клетки способны усваивать. 3. Наличие достаточной влажности (для грибов не менее 12 %, для бактерий - не менсе 20 %). 4. Изотоничность среды. Для продуцента, т. с. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри продуцента. ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕДЬЯВЛЯЕМЫЕ К ПИТАТЕЛЬНЫМ СРЕДАМ 5. рН среды: - ацидофильные - алкалофильные - нейтрофильные Для поддержания рН используют буферные системы. Большинство бактерий хорошо развиваются при рН, близком к нейтральному (6,5-7,5). У грибов и дрожжей оптимум рН находится в кислой зоне (4,0-6,0). 6. Стерильность питательной среды. ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД • тепловаябстерилизация (периодическая или непрерывная) - пастеризация - кипячение - автоклавирование - стерилизации текучим паром -стерилизации «перегретым» паром • УФ и гамма облучение • ультрафильтрация КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД • на соответствии физико-химическим и биологическим характеристикам • способность основного тестового штамма - продуцента расти на данной среде. Контроль выполняется лабораторией для каждой произведенной серии (партии) питательной среды. ПОВЕРХНОСТНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Поверхностный способ культивирования применим ТОЛЬКО ДЛЯ аэробных микроорганизмов на поверхности: - жидкой среды - жидкофазная ферментация - плотной или сыпучей среды - твердофазная ферментация ПОВЕРХНОСТНОЕ КУЛЬГИВИРОВАНИЯ НА ПЛОТНЫХ ИЛИ СЫПУЧИХ СРЕДАХ Поверхностные твердофазное культивирование осуществляется, как правило, на основе растительного сырья, где продуцентом являются чаще всего мицелиальные грибы или дрожжи. Слой субстрата обычно не превышает 3-7 см. В качестве "биореакторов" используют большие (до нескольких квадратных метров) подносы. ПОВЕРХНОСТНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ЖИДКИХ СРЕДАХ При жидкофазном поверхностном культивировании микроорганизмы растут на поверхности жидкой питательной среды, потребляя содержащиеся в ней субстраты и выделяя в эту среду продукты метаболизма. ГЛУБИННОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ В ПЛОТНЫХ ИЛИ СЫПУЧИХ СРЕДАХ Различают два типа глубинного твердофазного культивирования: • Глубинное культивирование в не перемешиваемом слое. В качестве "биореакторов" используют глубокие открытые емкости. Для аэробных твердофазных процессов разработаны приспособления, обеспечивающие необходимый газообмен; • Твердофазные процессы с перемешиванием и аэрацией. Используют биореакторы с низкоскоростным перемешиванием. ИСХОДНАЯ ФАЗА (ЛАГ-ФАЗА) ИЛИ ИНДУКЦИОННЫЙ ПЕРИОД Размножение микробных клеток не происходит ОНИ приспосабливаются к изменившимся условиям и вырабатывают ферменты, необходимые для роста данной питательной среде. Ha продолжительность лаг-фазы зависит от следующих факторов: • от состава питательной среды • от качества посевного материала • от посевной дозы СТАДИИ СИНТЕЗА ПЕЛЕВОГО ПРОДУКТА Целевые продукты синтезируются в: • экспоненциальной фазе (нуклеотиды, многие ферменты, витамины - так называемые первичные метаболиты) • стационарной фазе роста (антибиотики, пигменты и т.п. - так называемые вторичные метаболиты) Температура и время ферментации - грибов - до 7 суток при 24°С - актиномицетов - до 5 дней при 26-28°С - бактерий - 1-3 суток при 37,0°С ГЛУБИННОЕ ПЕРИОДИЧЕСКОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ В подготовленный ферментер загружают сразу весь объем питательной среды и вносят посевной материал. Выращивание м/о проводят в оптимальных условиях (t, рН, аэрация) от нескольких часов до нескольких дней, после чего процесс останавливают и выделяют целевой продукт. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ В РЕЖИМЕ ПОЛНОГО ВЫТЕСНЕНИЯ Этот способ характеризуется тем, что культура в ферментёре не перемешивается представляет собой поток жидкости через трубку. Ферментер имеет трубчатую форму (может иметь прямую, S-образную или спиральную) и устанавливается горизонтально или вертикально. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ В РЕЖИМЕ ПОЛНОГО ВЫТЕСНЕНИЯ Засев осуществляется непрерывно на входе в ферментер одновременно с подачей среды. Затем биомасса за время от посева до выгрузки проходит через все стадии периодической культуры, т. е. фазы роста распределены не во времени, а в пространстве, причем каждой ферментера в части установившемся режиме соответствует определенный отрезок кривой роста. СПОСОБЫ НЕПРЕРЫВНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ В РЕЖИМЕ ПОЛНОГО СМЕШИВАНИЯ • Хемостатный – рост регулируется лимитирующих веществ субстрата (C, азота, микроорганизмов концентрацией питательного витаминами, микроэлементами и т.п.) • Турбидостатный - процесс контролируется по изменению концентрации микроорганизмов путем измерения оптической плотности, мутности в прозрачных питательных средах ХЕМОСТАТНЫЙ СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Основан на использовании биореактора, в который определенной скоростью подаётся питательная среда и одновременно с той же скоростью отбирается клеточная суспензия. При этом концентрация микроорганизмов остаётся постоянной благодаря строгому контролю в биомассе количества лимитирующего вещества в следствии регулирования скорости подачи субстрата. ТУРБИДОСТАТНЫЙ СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Основан на использовании биореактора, в который с определенной скоростью подаётся питательная среда и одновременно с той же скоростью отбирается клеточная суспензия. При этом концентрация микроорганизмов в биореакторе остаётся на нужном уровне благодаря тому, что субстрат подается с заданной скоростью, а при снижении концентрации клеток подача питательной среды прекращается. Поступление субстрата регулируется автоматически, чаще всего по измерению оптической мутности биомассы, которая коррелирует с концентрации микроорганизмов. КЛАССИФИКАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ПО МАСШТАБУ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ • диагностические среды • производственные (технологические) - для культивирования бактерий, дрожжей, грибов - для культивирования культур клеток.
