Определение рН питательной среды

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1
Тема: Принципы составления питательных сред в биотехнологическом
производстве. Особенности роста микроорганизмов на питательных средах
различного состава
Цель работы: Ознакомиться с основными принципами составления питательных
сред для культивирования микроорганизмов. Изучить потребности
микроорганизмов в источниках питания.
Посуда, материалы, оборудование, реактивы: колбы с ватными пробками на 250
мл – 6; стеклянные палочки – 6; пипетки градуированные на 5 мл – 3, на 1мл – 6;
цилиндры мерные на 250 мл – 1, на 100 мл – 1; воронки 6; стеклянные стаканчики на 50
мл – 6; фильтры бумажные складчатые; фильтровальная бумага. Весы электронные;
рефрактометр; иономер; термостат; реактивы для приготовления питательных сред.
Культура гриба Aspergillus niger, спиртовка, бактериологическая петля, карандаш по
стеклу.
Краткие теоретические положения
Питательная среда обеспечивает жизнедеятельность, рост и развитие
микроорганизмов, эффективный синтез целевого продукта. Неотъемлемой частью
питательной среды служит вода, все процессы жизнедеятельности протекают только в
водной среде.
Питательные среды могут иметь неопределенный состав, то есть включать
биогенные добавки - мясной экстракт, кукурузную муку, морские водоросли и т.д.
Подобные среды обычно готовят на водопроводной воде. Применяют также среды,
приготовленные из чистых химических соединений в заранее определенных
соотношениях - синтетические среды. Смесь веществ, как правило, вносят в
дистиллированную воду. С экономической точки зрения выгодно употребление
природного, более дешевого сырья. Однако применение синтетических сред позволяет
изучить физиолого-биохимические свойства микроорганизмов и оптимизировать состав
среды. Компромиссным вариантом является использование полусинтетических сред, в
состав которых вместе с химически чистыми соединениями входят биогенные добавки.
Состав среды определяется потребностями микроорганизмов в соединениях,
необходимых для биосинтеза и получения энергии. Конструктивные и метаболические
процессы у микроорганизмов крайне разнообразны, поэтому столь же разнообразны их
потребности в питательных веществах.
Питательные среды для культивирования микроорганизмов содержат большое
количество необходимых компонентов, основным из которых считают тот, который
служит микроорганизмам источником углерода и энергии. Это вещество или смесь
веществ называется субстратом, а все остальные - вспомогательными веществами.
Так как микроорганизмы способны ассимилировать любое органическое
соединение, потенциальными ресурсами для биотехнологии могут служить все мировые
запасы органических веществ. При выборе сырья необходимо учитывать его влияние на
себестоимость готового продукта, доступность, методы получения, свойства и
качественные характеристики.
Потребность микроорганизма в тех или иных соединениях определяется
особенностями данного вида. В самом приближенном виде физиологические потребности
микроорганизмов в питательных веществах можно выявить, определив химический состав
микробной клетки: обычно содержание углерода находится в пределах 45-55%, азота – 614, К – 0,5-2, Р – 1-3, Mg – 0,1-1, S – 0,02-1, Ca – 1%.
1
Источники углерода
Легкодоступными считаются сахара: глюкоза, сахароза, лактоза. За ними следуют
многоатомные спирты: глицерин, маннит и др. Далее следуют полисахариды: целлюлоза,
гемицеллюлоза, крахмал, которые могут быть источниками углерода либо после
превращения их в усвояемые микроорганизмами моно- и низкомолекулярные
олигосахариды, либо микроорганизмы должны иметь набор ферментов, гидролизующих
эти вещества (Aspergillus, Bacillus, Penicillium и др.).
На практике встречается большое количество микроорганизмов, которые успешно
утилизируют органические кислоты, особенно в анаэробных условиях.
Низкомолекулярные спирты: метанол и этанол - относятся к числу перспективных
видов сырья. Многие дрожжи родов Candida, Hansenula и др. способны ассимилировать
этанол. Дрожжи родов Pichia, Candida и др. и бактерии рода Flavobacterium используют в
качестве единственного источника углерода метанол.
Некоторые виды микроорганизмов используют в качестве источника углерода и
энергии н-алканы и некоторые фракции нефти. Особенностью углеводородов является их
низкая растворимость в воде, поэтому только незначительная часть микроорганизмов
способна ассимилировать углеводороды.
Источники азота
Азот может содержаться в форме неорганических солей или кислот. Большинство
дрожжей хорошо усваивает аммиачные соли, а также аммиак из водного раствора,
потребность в нитратах испытывают только некоторые виды дрожжей. Источником азота
могут служить и органические соединения: аминокислоты, мочевина и т.д., которые легко
усваиваются микроорганизмами.
Известно, что бактерии более требовательны к источникам азота, чем грибы,
актиномицеты и дрожжи.
Источники фосфора
Фосфор является важнейшим компонентом клетки, он входит в состав АТФ, АДФ,
АМФ и обеспечивает нормальное течение энергетического обмена в клетке, а также
синтез белков и нуклеиновых кислот и др. биохимических превращений. Фосфор вносится
в среду в виде солей фосфорной кислоты.
Вода
Вода должна отвечать требованиям ГОСТ (чистая, бесцветная, без привкуса, запаха
и осадка).
Источники витаминов и микроэлементов
Потребность у микроорганизмов в этих соединениях различна, тем не менее,
практически все микроорганизмы лучше растут в присутствии витаминов. Эффективной
добавкой к питательным средам оказался кукурузный экстракт благодаря наличию в нем
витаминов, аминокислот и минеральных элементов в легко ассимилируемых формах. В
рецептуры сред включают также дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт, сок
картофеля, молочную сыворотку, экстракт солодовых ростков и др. продукты.
Микроэлементы в состав питательных сред вводят в микродозах, в противном
случае они оказывают ингибирующее действие на микроорганизмы.
Итак, состав питательной среды для каждого микроорганизма устанавливают
экспериментально.
Задача специалиста, оптимизирующего состав среды для конкретного вида
микроорганизма, - выбрать такие источники углерода, азота, фосфора и др. веществ,
которые наиболее оправданы в экономическом и экологическом отношениях.
2
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ
Первое занятие
1. Подготовка питательной среды.
2. Определение содержания сухих веществ в питательной среде.
3. Определение рН питательной среды.
4. Подготовка посевной суспензии и засев питательной среды.
5. Установка колб в термостат.
Подготовка питательной среды
Среду заданного состава (табл. 1) готовят в колбах на 250 мл. Все компоненты
растворяют в небольшом количестве водопроводной воды, затем объем доводят до 100 мл
водопрводной водой. Колбы со средой закрывают ватными пробками.
Определение рН питательной среды
В стеклянный стаканчик отбирают 25 мл содержимого каждой из колб и с
помощью иономера определяют рН среды.
Таблица 2.1
Варианты питательных сред
Компоненты,
на 100 мл среды
Сахароза, г
Глюкоза, г
Лактоза, г
Na NO3 (20% р-р), мл
KH2PO4 (10% р-р), мл
KСl (5% р-р), мл
MgSO47H2O (1% р-р), мл
FeSO47H2O (1% р-р), мл
СаО ( 10 % р-р ), мл
Витамины
РН
Вариант
1
3
5
2
1
1
1
0,3
6,5-6,8
2
3
5
2
1
1
1
0,3
6,5-6,8
3
3
5
2
1
1
1
0,3
6,5-6,8
4
3
5
2
1
1
1
0,3
+
6,5-6,8
5
6
10
4
2
2
2
0,6
6,5-6,8
6
3
5
2
1
1
1
0,3
4
Определение содержания сухих веществ в питательной среде
Определение проводят с помощью рефрактометра. Перед началом работы
рефрактометр проверяют по дистиллированной воде, при этом пунктирная линия,
нанесенная на окуляр, должна совместиться с границей света и тени на нулевой отметке
шкалы, значение при этом составляет 1,333.
Затем на призмы с помощью стеклянной палочки наносят несколько капель
исследуемой жидкости. Верхнюю призму опускают и плотно прижимают к нижней. После
этого перемещают окуляр вдоль прорези, пока граница света и тени не совместится с
пунктирной линией. По шкале прибора отмечают деление, через которое проходит
граница светотени. После определения поверхность призмы протирают фильтровальной
бумагой и промывают дистиллированной водой.
3
Подготовка посевной суспензии и засев питательной среды
Для получения посевной суспензии в пробирку с чистой культурой грибапродуцента вблизи пламени спиртовки наливают 9 мл стерильной воды.
Бактериологической петлей осторожно соскребают слой, содержащий споры, до
образования суспензии.
Засев питательной среды производят стерильными пипетками. Из пробирки
отбирают по 1 мл суспензии и количественно переносят в каждую колбу с питательной
средой. Колбы закрывают ватными пробками.
Установка колб в термостат
Каждую колбу подписывают (группа, фамилия, вариант среды) и устанавливают в
термостат на 7 суток при температуре 27С.
Второе занятие
1. Отделение биомассы гриба.
2. Определение массы сухого мицелия.
3. Определение содержания сухих веществ в культуральной жидкости.
4. Определение рН в культуральной жидкости.
Отделение биомассы гриба
На аналитических весах взвешивают пустые бумажные фильтры, предварительно
высушенные до постоянной массы (вес записывают), и вставляют в воронки. Колбу
открывают, и содержимое фильтруют через фильтр. Отделенная от культуральной
жидкости биомасса гриба является материалом для определения массы сухого мицелия.
После фильтрования замеряют объем культуральной жидкости и доводят до 100 мл
дистиллированной водой.
Определение массы сухого мицелия
Фильтры с биомассой гриба помещают в сушильный шкаф при температуре 130С
на 40 мин (до полного высушивания). Затем фильтры переносят в эксикатор для
охлаждения на 10-15 мин, после чего взвешивают на аналитических весах. Разность
между массой фильтра с сухим мицелием и массой пустого фильтра является массой
сухого мицелия (Х), образовавшегося за период культивирования гриба в термостате:
Х = Мм - Мф ,
(2.1)
где Х – масса сухого мицелия, г; Мф - масса пустого фильтра, г; Мм - масса фильтра с
высушенным мицелием, г.
Определение содержания сухих веществ в культуральной жидкости
Определение проводят с помощью рефрактометра (см. занятие 1).
Определение рН в культуральной жидкости
рН фильтрата определяют с помощью иономера (см. занятие 1).
Отношение прироста биомассы гриба к количеству потребленного субстрата
называют экономическим коэффициентом.
На основании полученных данных для каждого варианта рассчитывают
экономический коэффициент (Y) по формуле:
Х-Хо
Y =
,
(2.2)
4
S-So
где Y – экономический коэффициент; Х - масса сухого мицелия, г; Хо - масса посевного
материала, г; S - концентрация сухих веществ в питательной среде, %; Sо - концентрация
сухих веществ в культуральной жидкости, %.
Так как Хо часто бывает пренебрегаемо мало, то
Х
Y =
,
(2.3)
S-So
Таким образом, экономический коэффициент или выход биомассы показывает
массу клеток продуцента на единицу субстрата.
Общая скорость роста микроорганизма-продуцента (V) характеризуется
абсолютным приростом биомассы за единицу времени:
Х-Х0
V =
,
(2.4)
t2-t1
где V - общая скорость роста, г/сут; Х0 - масса посевного материала, г; Х - конечная
концентрация биомассы, г; t2-t1 - время культивирования, сут.
Полученные результаты вносят в таблицу 2. На основании полученных данных
делают вывод о физиолого-биохимических особенностях гриба Aspergillus niger и
выбирают оптимальный состав среды.
Таблица 2.2
Журнал наблюдений
№
п/п
РН
до
после
культивирования
Содержание
сухих веществ, %
до
после
культивирования
Масса
сухого
Экономический
Общая
скорость
мицелия,
г/100 мл
коэффициент
роста,
г/сутки
Контрольные вопросы:
1. Что такое субстрат?
2. Какие источники углерода используют в биотехнологическом производстве?
3. Какие источники азота усваиваются микроорганизмами?
1. Как вносится фосфор в питательную среду?
2. Каким образом в питательные среды вводят источники витаминов и
микроэлементов?
3. Как определяют содержание сухих веществ в питательной среде?
Список рекомендуемой литературы
1. Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология.М.:
Агропромиздат, 1990.- с.96-108.
2. Габинская О.С. Основы биотехнологии: Учебное пособие.- Кемерово:
КемТИПП, 1996.-54 с.
5