МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ К молекулярно-генетическим методам диагностики относят амплификационные технологии, гибридизационный анализ нуклеиновых кислот, секвенирование ДНК, методы ДНК-чипов оптические сенсоры. Области применения генетических технологий Диагностика заболеваний, Мониторинг лечения Трансплантация органов и тканей Идентификация животных (сельское хозяйство) Идентификация личности (судебно-медицинская экспертиза) Палеонтология (палеоДНК), археология- ископаемые животные и растения, миграции вымерших видов. Идентификация бактерий,вирусов Обнаружение патогенов в продуктах и окружающей среде Определение мутаций вирусов и бактерий Определение резистентности к лекарственным препаратам Контроль фармацевтических производств Контроль качества вакцинных препаратов Обнаружение трансгенов в продуктах питания Терминология Амплификация (лат. amplificatio — усиление, увеличение), в молекулярной биологи — увеличение числа копий ДНК. Денатурация ДНК — переход ДНК из двунитевой формы в однонитевую при разрыве водородных связей между комплементарными парами оснований под воздействием высоких температур. Ренатурация или гибридизация — восстановление двухцепочечной структуры нуклеиновых кислот по принципу комплементарности. Терминология • ДНК-полимераза — фермент, обеспечивающий репликацию путем последовательного присоединении нуклеотидов к растущей цепи ДНК в направлении 5' → 3'; не способна инициировать процесс репликации, лишь добавляет нуклеотиды к уже имеющемуся небольшому двунитевому участку - праймеру (затравке). • Праймер — короткая олиго- или полинуклеотидная последовательность со свободной З’ОН-группой. • Рестриктазы — группа ферментов (известно около 500 бактериальных рестриктаз) класса гидролаз, катализирующих гидролиз нуклеиновых кислот. Каждая рестриктаза узнаёт специфическую последовательность из 4-6, реже 8-12 нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК (сайты рестрикции) и "разрезает" её в местах локализации этих последовательностей внутри участка узнавания или вне его. ПЦР (полимеразная цепная реакция) • Открытие Карри Мюллисом в 1983 году (США) метода полимеразной цепной реакции послужило толчком к активному развитию разнообразных технологий амплификации нуклеиновых кислот. Метод воспроизводит в искусственных условиях (in vitro) способность живых организмов к изолированному умножению гена или его фрагмента в процессе жизнедеятельности и (или) репликации. ПЦР (полимеразная цепная реакция) • Кстати, термостабильную ДНК-полимеразу, необходимую для этой реакции, впервые выделили и исследовали за несколько лет до этого советские ученые А.С. Каледин, А.Г. Слюсаренко и С.И. Городецкий из института ВНИИ генетика. Термостабильная ДНК-полимераза —фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfuполимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие. Этапы ПЦР-исследования • 1. Выделение нуклеиновых кислот. На первом этапе выделяется вся ДНК (для ДНК-содержащих микроорганизмов) или РНК (для метода NASBA или РНК содержащих вирусов) из исследуемого материала. • 2. Собственно ПЦР или амплификация. • 3. Учет результатов. Накопленные продуты амплификации (большое число копий ДНК между местами посадки праймеров) можно выявить путем электрофореза в геле. Помимо этого, при использовании флуоресцентно меченых зондов, возможен учет результатов по изменению флуоресценции относительно отрицательного контроля. Компоненты реакции ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать. Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК. Т ермостабильная ДНК-полимераза Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы. Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Амплификаторы • Реакционная смесь помещается в амплификатор. • Главный элемент ПЦР - это многократный тепловой цикл, при котором образец ДНК подвергается воздействию трёх различных температур. 94—96 °C денатурация 50-60°С отжиг 72 °C элонгация • Амплификатор – прибор, позволяющий быстро менять температуру смеси в соответствии с введенной программой. Первая стадия - денатурация Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Вторая стадия - отжиг. Температуру снижают(обычно до 50-60°С), и праймеры присоединяются к комплементарным участкам ДНК. Концетрация праймеров на несколько порядков выше концентрации ДНК из образца,поэтому отжиг праймеров протекает быстрее ренатурации ДНК. Третья стадия - элонгация Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C Полимераза - это фермент, умеющий достраивать вторую цепь ДНК. Для того, чтобы начать это делать, ей нужен кусочек, где ДНК уже двуцепочечная, в этом качестве и выступает место взаимодействия ДНК с праймером. Полимераза всегда достраивает цепь от 5' к 3'-концу (эти названия связаны с ориентацией сахара дезоксирибозы в цепи; в обычной двуцепочечной ДНК цепи направлены противоположно друг другу: 5'_____________3' 3'_____________5' • Если изначальные цепи ДНК можно было считать условно бесконечными в обе стороны, то нити, полученные в первом цикле, бесконечны в одну сторону, а со второй ограничены праймером. • Когда такие цепи будут взаимодействовать со вторым праймером, будут получаться кусочки, ограниченные с двух сторон. • Температурный цикл амплификации многократно повторяется. • За каждый следующий цикл амплификации происходит удвоение как исходного участка ДНК, так и вновь синтезированных фрагментов (амплификатов). • Результатом циклического процесса является экспоненциальное увеличение количества коротких фрагментов ДНК Учет результатов В зависимости от способа выявления результатов можно выделить три основных варианта ПЦР: Конвенциональная ПЦР ПЦР в реальном времени Цифровая ПЦР 1. Конвенциональная ПЦР Выявление результатов при конвенциональной ПЦР проводят с помощью гель-электрофореза. Этот метод позволяет оценить количество амплифицированной ДНК и её размер. Фрагменты ДНК разделяются по их подвижности в геле. Сахарофосфатный остов молекул заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК движутся через специальный агарозный гель от катода, заряженного отрицательно, к аноду. Более длинные молекулы проходят через гель медленнее, чем короткие молекулы ДНК, которые мигрируют быстрее. Гель содержит специальный краситель, который при взаимодействии с молекулами ДНК интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФ– лучах. 1. Конвенциональная ПЦР Выявление результатов при конвенциональной ПЦР проводят с помощью гель-электрофореза. Этот метод позволяет оценить количество амплифицированной ДНК и её размер. Фрагменты ДНК разделяются по их подвижности в геле. Сахарофосфатный остов молекул заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК движутся через специальный агарозный гель от катода, заряженного отрицательно, к аноду. Более длинные молекулы проходят через гель медленнее, чем короткие молекулы ДНК, которые мигрируют быстрее. Детекция. •Продукты ПЦР вносят в лунки геля •К гелю прикладывают напряжение. За часок-другой кусочки молекул ДНК (они имеют заряд) перемещаются в геле на расстояние, пропорциональное их массе. •Гель содержит бромистый этидий, который при взаимодействии с молекулами ДНК интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФ– лучах. • Гель кладут под ультрафиолет и масса одинаковых кусочков ДНК начинает светиться в том месте геля, где собралась. • Если собралась — значит в ДНК был участок, соответствующий праймеру, нужный «ген». Если ничего не светится, мутная полоска без четкого участка — значит, нужного участка в ДНК нет. • Электрофореграмма результатов ПЦР по амплификации участка ДНК хламидий длиной 264 пары оснований • М – ДНК-маркеры длины фрагментов • 1 – положительный контроль • 2 – исследуемый образец • 3 – отрицательный контроль • Результат: обнаружен соответствующий участок ДНК хламидий Пример Преимущества метода ПЦР 1. Универсальность. При помощи ПЦР можно определять ДНК в любых биологических образцах. Причем это в равной степени относится как к ДНК микроорганизмов,так и к ДНК человека. 2. Высокая специфичность. Специфичность определяется тем, что в ПЦР определяется уникальный участок гена, характерный только для данного возбудителя. 3. Высокая чувствительность. Полимеразная цепная реакция способна выявлять единичные копии ДНК. В среднем порог чувствительности большинства современных тест-систем составляет от 10 до 100 копий ДНК. Это значительно превышает чувствительность культуральных методов исследования. 4. Малый объем биологического материала. Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в педиатрии, неонатологии, неврологии, судебной медицине. 5. Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций.Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях. Недостатки конвенционального метода ПЦР – метод качественный 1. Амплифицируется ДНК как живого, так и погибшего микроорганизма.Это налагает определенные требования при использовании ПЦР для контроля эффективности лечения. В общем случае подобный контроль должен проводиться спустя промежуток времени, втечение которого происходит полная элиминация возбудителя. Однако, метод NASBA выявляет РНК только живых микроорганизмов и позволяет избежать этих ограничений. 2. Высокая чувствительность. Ряд микроорганизмов (условно патогенная флора, УПФ) в норме может существовать у человека в малом количестве. При помощи метода ПЦР определяются даже самые малые количества УПФ, даже при отсутствии патологии. Однако эта проблема решена с появлением метода количественного определения ДНК (Real-time PCR). 3. Различия при использовании разных тест систем. Как говорилось выше, для амплификации можно использовать различные участки генома возбудителя. Однако в случае различных мутации микроорганизмов возможно изменение или утрата генов. Это приводит к разным результатам при использовании тест систем разных производителей. 2. ПЦР в реальном времени • Принцип метода ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR) основан на детекции продуктов амплификации уже в процессе реакции и проведении мониторинга кинетики накопления ампликонов. • Это означает, что учет результата ПЦР (числа ампликонов) происходит после каждого цикла амплификации, а не в конце, как при обычной ПЦР. • Чем больше в исходной пробе было специфической ДНК, тем раньше и больше увеличится число специфических фрагментов. • "ПЦР в реальном времени" (Real-Time PCR) позволяет позволяет осуществлять количественную оценку содержания ДНК в исследуемом материале. 2. ПЦР в реальном времени • Для ПЦР в реальном времени необходимы амплификаторы, которые способны определять флуоресценцию смесей в ходе реакции. Детекция продуктов амплификации 1. Интеркалирующие красители. Этот способ детекции основан на том, что флуоресценция бромистого этидия и SYBR Green I значительно возрастает при их внедрении в двухцепочечные молекулы ДНК . Таким образом, можно наблюдать за накоплением продуктов амплификации. Детекция продуктов амплификации (факультативно 2. Выщепление 5' концевой метки (TaqMan Assay). • Данная методика основана на использовании 5'- экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входит флуоресцентная метка в 5'положении и гаситель флуоресценции в 3'положении, а также фосфатная группа в 3'положении. Эти зонды имеют места посадки внутри амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3'положении блокирует полимеразу. В ходе ПЦР во время стадии отжига праймеров происходит присоединение ДНКзонда к комплементарной цепи ДНК, причем чем больше продуктов амплификации образуется в ходе ПЦР, тем больше молекул зондов свяжется с соответствующими ампликонами. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и при достижении зонда начинает его расщеплять благодаря наличию 5'-экзонуклеазной активности. Таким образом происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения. Очевидно, что чем больше ампликонов было наработано в ходе ПЦР на данный момент времени, тем интенсивнее будет свечение. Кинетическая кривая PCR в координатах "Уровень репортерной (пропорциональной количеству продукта ПЦР) флуоресценции — цикл амплификации" имеет сигмоидную форму. В ней можно выделить три стадии График нарастания флуоресценции при амплификации. Стадии накопления ампликона в ходе ПЦР. Установление порогового значения и определение пороговых циклов для неизвестной пробы (Ct1) и образца сравнения (Ct2). • Исходное количество субстрата определяется по пороговому циклу (threshold cycle) - такой цикл n, на котором достигается некий заданный уровень репортерной флуоресценции Некоторые разновидности ПЦР • 1. «Вложенная» ПЦР (Nested PCR) - есть вторая пара праймеров, которая амплифицирует кусочек полученного кусочка. 2. «Инвертированная» ПЦР (Inverse PCR) - перед проведением ПЦР с помощью серии ферментативных реакций как бы приклеивают известные фрагменты на концы неизвестного, чтобы можно было его амплифицировать. 3. ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR) - берется РНК (молекула, которая является промежуточным этапом между ДНК и белками в живой клетке), а из нее с помощью фермента обратной транскриптазы получают ДНК, с которой уже проводят ПЦР. Это удобно, например, для того, чтобы выявить, какие именно гены в данной клетке экспрессируются. 4. Ассиметричная ПЦР (Assymetric PCR) - если нужны продукты амплификации преимущественно одной из двух цепей ДНК. Добавляют неравное количество праймеров. Некоторые разновидности ПЦР • 5. ПЦР длинных фрагментов (Long-range PCR) - чтобы амплифицировать длинный (больше 10 тысяч пар оснований) фрагмент, используют ПЦР с двумя полимеразами: одна из них, Taq-полимераза, может синтезировать длинную цепь, а вторая, ДНК-полимераза с 3'5'-экзонуклеазной активностью, может исправить ошибки, допущенные первой. 6. Multiplex PCR - добавляют несколько пар праймеров и одновременно амплифицируют несколько фрагментов. 7. NASBA (Nucleic Acids Sequence-Based Amplification)- в отличие от обычной ПЦР, мишенью для NASBA (Nucleic Acids Sequence-Based Amplification) служат молекулы РНК рибосом микроорганизмов, что дает целый ряд преимуществ • 8. Цифровая количественная ПЦР- реакционная смесь, содержащая флуоресцентный краситель, на огромное число микроскопических объемов; по окончании реакции анализируется доля капелек с положительной реакцией. Эта доля будет пропорциональна количеству искомой ДНК в образце В презентации использованы материалы лекции А.В. Чаплина
