С.Д. Варфоломеев, С .В. Калюжный
БИО
ТЕХН О Г
О
ЛИЯ
Кинетические
основы
микробиологических
процессов
Допущ ено
Государственным ком итетом СССР по народном у образованию
в качестве учебного пособия для студентов биологических
и химических специальностей высших учебных заведений
Москва
«В ы сш ая ш кол а» 1990
ББК
УДК
30.16
В 18
574.6
Р ец ен зен ты :
кафедра микробиологии (зав. кафедрой — проф. А. Ленцнер) и л абор ато­
рия биоорганической химии (зав. л а б о р а т о р и ей - доц. Я. Ярв) Тартус­
кого государственного университета; акад. АН ЧСФ Р, проф. К. Мартинек
В18
Варфоломеев С. Д ., Калюжный С. В.
Б иотехнология; К инетические основы м и кр о б и о л о ги ­
ческих процессов: Учеб. пособие д л я биол. и хим. спец.
вузов. — М.: Высш. ш к., 1990, — 296 с.: ил.
ISBN 5-06-000645-Х
1 И зл о ж е н ы о сновы и м е т о д ы а н а л и з а кинетики м и кроб и ол оги ч ески х процессов.
Д е т а л ь н о р асс м о т р е н ы анал и ти чески е м о д е л и к л е то ч н о го р о с та, кинетические
зак о н о м е р н о с т и р о с т а м и кр о б н ы х п опуляци й в р азл и ч н ы х р еж и м ах , м ето д ы
оп р едел ени я кинетических п ар а м е т р о в процессов. Д ан коли чествен ны й а н а л и з
ф а к т о р о в , о сл о ж н я ю щ и х р о ст м и к р о о р га н и зм о в , и п р о и л л ю с т р и р о в а н ы в о зм о ж ­
ности п р и м ен ен и я к о м п ь ю т е р н о г о а н а л и з а д л я и ссл ед о ван и я зако н о м ер н о стей
м и к р о б н о й кинетики.
1903010000(4309000000) — 462
"
покои-ад
ISBN 5-06-000645-Х
,29~ 'м БВК^ ' 6
(jC) (J. Д . Варфоломеев, С. В. Калюжный, 1990
П РЕДИСЛОВИЕ
В последние десятилетия непрерывно возрастает интерес к изучению
и практическому использованию микроорганизмов, мир которых
чрезвычайно многообразен и динамичен. Микроорганизмы играют
большую роль в природных процессах и в течение многих лет
являются «полигоном», где современная наука исследует фундамен­
тальные основы живой материи. Достаточно сказать, что нынешнее
здание науки о молекулярных механизмах наследственности в значи­
тельной степени создано в результате изучения микробиологических
объектов. Микробиология— это и фундамент современной биотехноло­
гии. Ряд микробиологических систем в настоящее время уже весьма
продуктивно используется в крупномасштабных производственных
процессах. Еще более привлекательны возможности, открываемые при
использовании в микробиологической практике генетической инжене­
рии, а также весьма перспективно создание принципиально новых
процессов на основе ферментных систем микроорганизмов. Все это
служит мощным стимулом для дальнейшего совершенствования работ
по количественному описанию роста и развития микробных популяций.
В настоящее время количественная микробиология, основанная
на химико-кинетическом моделировании процессов микробного роста,
является активно развивающейся областью биокинетики, имеющей
много интересных фундаментальных и практических приложений.
Изучение кинетических основ микробиологических процессов ши­
роко представлено в учебных планах химико-биологических факуль­
тетов университетов и ряда технологических вузов. Однако до
настоящего времени в учебной литературе отсутствует сколько-нибудь
полное и последовательное изложение количественных основ роста
и развития микробных популяций. Данное учебное пособие призвано
восполнить этот пробел. Основой для написания этой книги послужили
исследования, проводимые в Московском университете, а также курсы
лекций, читаемых на химическом и биологическом факультетах.
Курс рассчитан на читателей, владеющих основами дифференциаль­
ного и интегрального исчислений в объеме общих курсов математичес­
кого анализа вузов. Основная задача книги — изложение кинетических
закономерностей, наблюдаемых при росте микробных популяций,
с целью дать экспериментатору достаточно простые и надежные
методы, позволяющие выявить наиболее характерные особенности
исследуемого процесса (например, истощение субстрата, ингибирование
роста культур избытком субстрата или продуктом, лизис и др.).
В первую очередь внимание было обращено на анализ кинетических
закономерностей автокагалитического роста микробных популяций
в закрытых системах при периодическом культивировании. Дано
кинетическое обоснование зависимости роста микроорганизмов от
концентрации лимитирующего субстрата, рассмотрен ряд механисти­
ческих моделей, позволяющих получить уравнение роста популяции
на основе использования современных представлений о механизмах
3
конверсии генетической информации при биосинтезе белка и нуклеино­
вых кислот (синтез ключевых метаболитов, репликация, транскрипция,
трансляция). Сделан анализ абсолютных скоростей роста популяции
с выявлением предельных и наиболее типичных, «средних», скоростей
роста микроорганизмов. Была предпринята попытка связать изучаемые
кинетические параметры с конкретными молекулярно-биологическими
процессами, протекающими в живой микробной клетке.
Значительное внимание в книге уделено анализу интегральных
кинетических кривых роста микробных популяций с учетом различных
осложняющих факторов. Рассмотрены проблемы кинетической диск­
риминации механизмов ингибирования, обсуждены механизмы процес­
сов, приводящих к появлению на кинетической кривой роста периодов
индукции.
Изложена кинетическая теория роста популяций микроорганизмов
при непрерывном культивировании в проточных системах. Как и для
периодического культивирования, основное внимание обращено на
кинетическое описание процессов с осложняющими факторами.
Использование методов кинетического моделирования с помощью
ЭВМ позволяет на качественно новом уровне решать ряд вопросов
кинетической микробиологии. В данной книге обсуждаются принципы
кинетического моделирования роста микроорганизмов, на основе
использования методов численного интегрирования дан ряд качест­
венных подходов, позволяющих идентифицировать особенности роста
популяции; рассмотрены кинетические модели роста с учетом лизиса
клеток, проблемы моделирования развития смешанных и симбиотрофных культур; анализируются закономерности роста фотосинтезиру­
ющих микробных популяций.
Методы анализа по мере возможности иллюстрируются литератур­
ными данными или данными, полученными авторами книги.
Весьма полезным представляется наличие в учебном пособии
задач, что поможет читателю лучше понять теоретические и прак­
тические аспекты кинетики роста микробных популяций.
Авторы выражают благодарность чл.-кор. АН СССР Е. Н. Конд­
ратьевой, а также рецензентам— академику АН ЧСФР К. Мартинеку
и коллективам кафедры микробиологии (зав. кафедрой — проф.
А. Ленцнер) и лаборатории биоорганической химии (зав. лаборатори­
ей— доц. Я. Ярв) Тартуского государственного университета за по­
мощь и ценные замечания при написании учебного пособия.
Поскольку настоящее издание является первой попыткой создания
учебного пособия такого рода, оно не свободно от недостатков. Авторы
будут признательны читателям, которые сообщат свои пожелания,
направленные на улучшение книги, по адресу: 101430, Москва, ГСП-4,
Неглинная ул., д. 29/14, Издательство «Высшая школа».
Авторы
ВВЕДЕН И Е
Каковы основные закономерности протекания во времени биологического
процесса на молекулярном или клеточном уровне? Каковы пути
и возможности ускорения процесса? Какая стадия определяет скорость того
или иного биологического явления? Постановка такого рода интересных,
хотя и сложных, вопросов связана с развитием области количественных
биологических исследований, получившей название биокинетики.
В задачи биокинетики входят выяснение механизмов, опреде­
ляющих скорости биологических процессов, и выявление их лимитиру­
ющих стадий. Составной частью биокинетики является математическое
описание протекания биопроцесса во времени при использовании
молекулярных представлений и законов физической и химической
кинетики. В настоящее время биокинетика является основой управля­
емого количественного биосинтеза.
Данная книга посвящена изложению одной из важных частей
биокинетики— анализу кинетических закономерностей роста и развития
микробных популяций. По своей природе микробиологические процес­
сы представляют собой ферментативные реакции, протекающие в полиферментных системах при переменной концентрации катализаторов
(ферментов). Специфической особенностью роста микроорганизмов
является автокаталитический характер процесса, определяемый увели­
чением общей концентрации ферментов в системе по мере развития
популяции. В силу этого оказывается целесообразным применение
в микробиологии ряда формальных методов и приемов, развитых при
анализе кинетических закономерностей ферментативного катализа.
Культивирование (рост) микроорганизмов может осуществляться
в двух основных режимах: периодическом и непрерывном. Первый
тип культивирования относится к процессам в закрытых системах,
второй — к открытым.
Вопросы кинетического описания роста микробных популяций давно
привлекают внимание ученых. В конце 40-х годов нашего столетия
Моно обнаружил и обосновал связь между скоростью роста культур
микроорганизмов и концентрацией в среде лимитирующего субстрата.
После этого работы по кинетическому моделированию роста культур
микроорганизмов получили достаточно большое распространение.
Широкое применение нашли методы непрерывного культивирования
микроорганизмов, и, как следствие, возникла кинетическая теория,
адекватно и плодотворно описывающая процессы роста микро­
организмов в открытых системах при непрерывном культивировании
(Н. С. Печуркин, 1978; Дж. Перт, 1978; Н. С. Печуркин, И. А. Терсков,
1979). Важно отметить, что в развитие кинетической микробиологии
большой и во многом определяющий вклад внесли советские
исследователи Н. Д. Иерусалимский, Н. С. Печуркин, И. А. Терсков.
Современный этап исследований в области кинетического описания
микробиологических процессов характеризуется рядом особенностей.
Во-первых, дальнейшее развитие получают экспериментальные методы
исследования процессов, протекающих в микробной системе, в резуль­
тате чего становятся доступными многопараметрические измерения,
анализ многокомпонентных систем, детальный биохимический анализ
микромолекулярных биосистем. Все это приводит к росту количест­
венной точности, полноты, информативности микробиологического
эксперимента. Во-вторых, заметное развитие получили методы ана­
литического рассмотрения кинетики роста микробных популяций, что
позволяет иметь богатую информацию о природе процессов на
основе первичных данных роста микробной культуры. В-третьих,
кардинальные изменения произошли в связи с использованием
электронно-вычислительных машин для анализа и кинетического
моделирования микробиологических процессов.
Обсуждаемые в книге методы и подходы, с одной стороны,
направлены на то, чтобы выработать у читателя навыки анализа
особенностей протекания процесса микробного роста, создания пред­
ставлений о механизмах явления, с другой стороны, дают возможности
поиска оптимизации микробного процесса. Таким образом, рассмат­
риваемые в данной книге кинетические основы микробиологических
процессов важны при решении вопросов как фундаментальной, так
и прикладной микробиологии. Последнее следует подчеркнуть особо.
Биотехнология в разных ее аспектах начинает играть все большую
роль в технологическом обеспечении современного общества, и при
этом возрастает роль новых, перспективных и экологически безопасных
процессов, основанных на использовании микроорганизмов.
По своей природе предмет обсуждения данной книги является
междисциплинарным. Методологической основой книги служат законы
химической кинетики. Решение многих вопросов, связанных с ростом
микробных популяций, как уже отмечалось выше, основано на
использовании методов, подходов и решений, найденных при изучении
кинетических закономерностей ферментативного катализа. Природа
изучаемых явлений имеет молекулярно-биологический, а также над­
молекулярный, клеточный, уровень. Раскрытие механизмов микроб­
ного роста часто делается с помощью математического аппарата
дифференциального и интегрального исчисления, теории систем диф­
ференциальных уравнений с элементами использования электронновычислительных машин.
Все выше упомянутое говорит о том, что кинетическая микроби­
ология— довольно сложная область, имеющая комплексный характер.
Однако читателя не должны пугать эти сложности. Проникновение
различных разделов друг в друга является отличительной чертой
современной науки и техники. Следует пожелать читателю успехов
в изучении и использовании кинетических основ клеточного роста,
изложенных в этой книге.
ГЛАВА
1
КИНЕТИЧЕСКИЕ М ОДЕЛИ
РО СТА К У Л Ь Т У Р М И К РО О РГА Н И ЗМ О В
Кинетические кривы е роста м и кр о о р ган и зм о в в закры ты х
систем ах (периодическое культивирование) и м ею т слож ны й
характер (рис. 1.1). В ы деляю т несколько фаз в разви тии
культуры .
1. П осле введения и н окулята обы чно н аб л ю д аю т индукцион­
ный период (лаг-ф азу) (7), в течение к о то р о го не происходит
сколько-ни будь зам етн о го увеличения числа клеток или о б р а зо ­
вания каких-либо продуктов. В это т период перестраивается
м етаб о л и зм клетки, синтезирую тся ф ерм енты , специфичные
к и сп ользован и ю новы х суб стратов, активируется биосинтез
белка.
2. И ндукционны й период см еняется фазой экспоненциального
роста (2), в течение ко то р о й бы стро н акап ли ваю тся б иом асса
и п родукты разны х реакций. Э та ф аза д о стато ч н о строго
описы вается экспоненциальной кривой.
3. В зам кн у то й систем е экспоненциальная ф аза роста не
м ож ет р азви ваться неограниченно. К ак правило, она переходит
в фазу линейного роста (3), характери зую щ ую ся равн ом ерн ы м
во времени линейны м р о сто м культуры . В этой ф азе уже
не н аб лю д ается лин еари зац ии кинетических кривы х роста
в полулогариф м ических коорд и н атах, т. е. им еет м есто о т ­
клонение точек в сторон у м еньш их значений количества
клеток или продуктов,
что служ ит эксперим ен­
тал ь н ы м кри тери ем пе­
рехода культуры в л и ­
нейную ф азу роста.
4. Ф аза линейного р о ­
ста м ож ет см ениться ве­
сьм а
н еп родол­
ж и тельны м
периодом ,
в течение к о то р о го ско­
рость
ро ста
культуры
Время
сниж ается д о нуля. Э то
фаза замедления роста Рис. 1.1. Типичная кинетическая кривая рос­
(4).
та популяции микроорганизмов:
5. В некоторы х случа­ 1 — индукц и онн ы й п ери од; 2 — ф а за эксп он ен ц и ал ь­
о го р о с т а; 3 — ф а за л и н ей н о го р о с т а; 4 — ф а за
ях ро ст культуры м ож ет нзам
ед л ен и я р о ста; 5 — с т ац и о н а р н а я ф аза; 6 — ф аза
переходить в д о стато ч н о
о т м и р а н и я ку л ьту р ы
7
устойчивую и п р одолж и тельн ую стационарную фазу. В этих
условиях культура развивается в режиме постоянства общ его числа
клеток. Реж им характеризуется д остаточ н о вы сокими скоростям и
отм и р ан и я клеток. П ри это м скорость п ри роста биом ассы
п олн остью ком пенсируется скоростью гибели и лизиса клеток.
6.
Если систем а п олн остью и стощ ается по субстрату или
накопление ингибирую щ их рост п родуктов является зн ач и тель­
ны м , то ск орость п ри роста биом ассы станови тся равн ой нулю ,
п роисходят сущ ественны е физиологические изм енения клеток
и, как п равило, н аб лю д ается фаза отмирания культуры (6),
со п р о в о ж д аем ая часто п олн ы м ли зи сом клеток.
▲ П ринципиальной особенностью кинетики микробных попу­
ляций является зависимость скорости роста культуры от концен­
трации одного или нескольких наиболее важных компонентов сре­
ды, обеспечивающих биосинтетическую основу м етаболизм а. Эти
компоненты, получившие название лимитирующих субстратов,
в определенной степени регулирую т скорость роста популяции.
В р езу л ьтате эксп ери м ен тальн ы х исследований зависим ости
скорости ро ста культур м и к р о о р ган и зм о в бы ли обнаруж ены
две особенности:
1. С ко р о сть изменения числа м и кр о о р ган и зм о в в реж име
его р о ста (в экспоненциальной ф азе) линейно связан а с кон­
центрацией клеток в системе:
^ = MN,
(1.1)
где N — число клеток; р — коэф ф ициент пропорц и ональн ости ,
получивш ий
название
удельной
скорости роста
( р = ——
у
N dt )
им еет р азм ер н о сть о б р атн о го времени. П редп ол агается, что
р не зависит о т времени в исследуем ом интервале. С обственно
это уравнение в и н теграл ьн ой ф орм е и п редставляет собой
уравнение экспоненциального роста. Его интегрирование при
н ач ал ьн о м условии t —О, N = N 0 п ри вод и т к функции
N = N 0e M'.
(1.2)
2. Б ы л о найдено, что в больш инстве случаев значение удельной
скорости ро ста зависит от концентрации
л им ити рую щ его
су б стр ата S и эта зави си м ость м ож ет б ы ть п редставлен а в ф орм е
n W
- J i.
(1 3 )
где р т
предельная м акси м ал ьн ая удельн ая ск орость роста;
Ks п ар ам етр , получивш ий н азван ие константы сродства суб­
страта к микроорганизму.
8
Впервые на зави си м ость скорости р о ста культуры от
(концентрации су б стр ата о б р ати л вним ание М оно, п оэтом у
С равнени е (1.3) получило название уравнения Моно. П о своей
(форме это уравнение соответствует зави си м ости скорости
ф ер м ен тати вн о й реакции от концентрации суб страта (уравнение
М и х аэл и са— М ен тен *). Н иж е обсуж дается уравнение М оно
и д аю тся п одходы к его кинетическому обоснованию .
1.1.
ЗА В И С И М О С Т Ь С К О РО С Т И РОСТА
К У Л Ь Т У Р М И К Р О О Р Г А Н И ЗМ О В
О Т К О Н Ц Е Н Т Р А Ц И И Л И М И Т И Р У Ю Щ Е Г О СУБСТРАТА.
«М А К Р О С К О П И Ч Е С К И Й » П О Д Х О Д
—У равнение, связы ваю щ ее скорость р о ста культур м и к р о о р ган и з­
м ов с концентрацией суб страта (уравнение М оно), им еет
эмпирический характер. Теоретическое рассм отрени е вопроса
на качественном уровне с привлечением представления о л и ­
м и ти рую щ ей стадии в слож ной п оследовательности ф ерм ен­
тати вны х превращ ений суб страта в клетке такж е указы вает
на то, что зави си м ость скорости роста м и кроорган и зм ов
д олж н а б ы ть ан алоги чн а зави си м ости , вы раж аем ой уравнением
М ихаэлиса
М ентен (Д. С. Ч ернавский, Н. Д . И ерусалим ский,
1968).
П ровед ем количественны й ан ал и з законом ерн остей роста
м и кробн ой популяции с целью ф изико-хим ического о б осн ова­
ния уравнения М оно. В оспользуем ся кинетическим п одходом
и п роан ал и зи р у ем р яд различны х кинетических схем процесса,
исходя из предполож ения, что разви тие популяции м и к р о о р га­
низм ов п ред ставляет собой автокатали ти ч ески й процесс.
1.1.1. Простейшая схема взаимодействия
клетки с субстратом
П редстави м себе простейш ую кинетическую схему ав то каталитической реакции с разлож ени ем каталитических центров
S + N-+ 2N + P,
(1.4)
где N — число центров, претерпеваю щ их удвоение при в заи м о ­
действии с су б стратом ; Р — продукт.
Ч и сло центров, с к оторы м и взаи м одей ствует субстрат,
и число клеток м и кр о о р ган и зм о в связаны меж ду собой п рям о
п роп орц и ональн ой связью , поскольку предполагается, что кл ет­
ки в среднем со д ер ж ат один аковое число центров, на которы х
* О боснование уравнения М ихаэлиса —М ентен, его свойства и методы
анализа рассмотрены в ряде монографий (см ., например, И. В. Березин,
С. Д . Варфоломеев, 1979; С. Д . Варфоломеев, С. В. Зайцев, 1983).
9
осущ ествляется трансф орм ация субстрата. В рам ках кинетического
п риближ ения ч астоту актов деления клеток м ож н о об означи ть
кон стантой к. С у бстрат S в р езул ьтате взаи м од ей ствия с ко м п о ­
нен там и клетки тран сф орм и руется с об р азо в ан и ем п родукта Р.
Д ин ам ику изм енения в системе концентрации ком пон ен тов
будут о п исы вать уравнения
(1.5)
dP_kSN
~dt
( 1.6 )
v
где Гр— коэф ф ициент п роп орц и он ал ьн ости , связы ваю щ и й кол и ­
чество образо вавш ей ся биом ассы и продукта ф ерм ен тац ион н ого
превращ ения:
N —N 0 = Гр (Р —P 0).
(1.7)
Е сли кон ц ен трац ия вещ ества S в систем е д остаточ н о велика
и за врем я процесса меняется несущ ественно, то м ож н о ее
сч и тать величиной постоян н ой (S = S0). В это м случае уравнение
(1.5) м о ж ет б ы ть п рои н тегри рован о отн оси тел ьн о числа клеток
N . Если и сп о л ьзо в ать н ачальн ое условие (г = 0, N = N 0), и нтегри ­
рован ие уравнения (1.5) д ает экспоненциальную функцию
N (/) = N 0e k4
( 1 .8 )
П о д стан о в ка уравнения (1.8) в диф ф еренциальное уравнение
(1.6) и последую щ ее его интегрирован и е (при допущ ении, что
Р о = 0) п ри вод и т к следую щ ей зави си м ости о т врем ени концент­
рации продукта:
e kSt dt =
P (/) =
(ekS°'— 1).
(1.9)
J
0
п р о ду кта бли зка к нулю , при б ольш и х врем енах реакции
долж ен н аб л ю д аться экспоненциальны й рост концентрации
продукта:
( 1.10)
У равнени я (1.8), (1.10) и соответствен но кинетическая схема
(1.4) о п и сы ваю т важ ную особен н ость кинетики р о ста м и к р о б ­
ной популяции — количество клеток в системе экспоненциально
растет во времени. У дельн ая ск орость ро ста p(S ), п редставляю 10
щ а я собой п о казател ь экспоненты в уравнениях (1.8) и (1.10),
(является линейной функцией концентрации субстрата:
ц ( S ) - k S 0.
( 1. 11)
У равнение (1.11) в отличие о т уравнения М оно д ает линейное
Неограниченное увеличение удельной скорости р о ста м и к р о о р га­
н изм ов с увеличением концентрации субстрата. Э то п роти воре­
чит эксп ери м ен тальн ы м д ан н ы м и требует доп ол н и тел ьн ого
услож нения простейш ей кинетической схемы (1.4).
1.1.2. Схема с равновесным «насыщением» клеток
микроорганизма субстратом
К инетическая схема процесса роста культуры м и к р о о р га­
н изм а вы гл яди т следую щ им образом :
S+
n
J
x
42N
( 1.12)
С убстрат о б р ати м о и равновесно взаи м одей ствует с м и к р о о р га­
н и зм ам и , д ав ая «насы щ енную » ф орм у клеток X, к о то р ая
способна к делению с возникновением двух «ненасы щ енны х»
состояний N . Н а схеме процесс равн овесн ого «насы щ ения»
клеток охар актер и зо ван кон стантой равновесия К, процесс
деления - кон стантой скорости п ервого п оряд ка к.
К инетика накопления ком понентов реакции при постоянной
концентрации суб страта (S = S0) м ож ет б ы ть описана систем ой
уравнений
(1.13)
(1.14)
(1.15)
И зм ер яем ая на опы те величина — о б щ ая концентрация клеток,
или концентрация биом ассы , — представляет собой сум м арн ую
величину М , в ко то р у ю входит как кон ц ен трац ия «насы щ енны х»
клеток X, так и концентрация «ненасы щ енны х» клеток N:
M (f) = X (f) + N (/).
(1.16)
И з это го уравнения следует
dU ( t ) _ d \(t) | rfN(Q
dt
dt
dt
(1.17)
или
(1.18)
и
К онцентрации клеток в состояниях N и X связан ы соотн ош е
нием (1.17). С оответствен н о исходя из уравнений (1.15) и (1.16
м ож но записать:
(1.19)
Т ак и м о б р азо м , Х (/) м ож н о в ы р ази ть через общ ую биом ассу
в соответствии с уравнением
( 1.20 )
Е сли п о дстави ть найденную функцию X (?) в уравнение (1.18),
получим
( 1.21 )
У равнение (1.21) п ред ставл яет собой диф ф еренциальное
уравнение п ервого п оряд ка с разд ел яю щ и м и ся перем енны ми.
Реш ение это го уравнения им еет вид
M (/) = N 0 exp
,
( 1.22)
где N 0 — количество биом ассы в системе после введения инокулята;
A:S0/( K + S 0) = p(S).
(1.23)
К инетическая схем а (1.12) оп исы вает экспоненциальны й рост
б иом ассы в системе. С равнение теоретически полученной
функции удельной скорости р о ста м и к р о о р ган и зм а от концент­
рации су б стр ата [уравнение (1.23)] с уравнением М он о (1.3)
п оказы вает, что это функции од н ого и то го же вида. П ри этом
м ак си м ал ь н ая удельная скорость р о ста ц,„ им еет см ы сл
кон станты скорости деления клеток м и к р о о р ган и зм а к, величина
К , — ко н стан та равновесия «насы щ ения» клеток су б стр ато м К.
ф Т ак и м о б р азо м , эмпирическое уравнение М оно получено
из теоретического ан ал и за кинетики ро ста м и кробн ой популя­
ции в р ам ках д о стато ч н о п ростой кинетической схемы (1.12)
и п редполож ения о равн овесн ом «насы щ ении» м и кроорган и зм а
су б стр ато м . Равновесие, характери зуем ое кон стантой К, м ож ет
о тр аж ать , н ап рим ер, ф ерм ен т-субстратное равновесие при о б р а ­
зован ии ком плекса М ихаэлиса с каки м -л и бо л и м и ти рую щ и м
процесс ф ерм ентом .
О чевидно, что м ехан и зм автокатал и ти ч еского ро ста био­
м ассы , представленны й схем ой (1.12), не является единственно
в о зм о ж н ы м
м ех ан и зм ом , оп и сы ваю щ и м эксперим ентально
н аб лю д аем ы е зави си м ости . П р о ти в кинетической схемы (1.12)
12
имеется возраж ение качественного характера. К ак правило,
субстрат, п опадая в клетку и взаи м одей ствуя с каким -либо
ф ерм ентом , претерпевает сущ ественную тран сф орм ац ию , и выход
его из клетки в н еи зм ен н ом состоянии, как это следует из схемы
(1.12), весьма маловероятен. П оэтом у мож но дум ать, что механизм
(1.12) сущ ественно уп рощ ает ситуацию . А н али з п оказы вает, что
кинетические схемы с н еоб рати м ой тран сф орм ац ией субстрата
внутри клетки при определенны х условиях такж е оп исы ваю т
эксперим ентальны е данны е и п риводят к зави си м остям удельной
скорости ро ста м и кр о о р ган и зм о в , бли зким к уравнению М оно.
1.1.3.
Схема с необратимой трансформацией
субстрата в клетке
Р ассм отри м кинетическую схему роста популяции с учетом
двух н еоб рати м ы х стади й процесса:
S + N р х-> 2N.
Ц р
(1.24)
С убстрат, взаи м одей ствуя с каталитическим и центрам и
внутри клетки (число ц ентров N п ропорц и ональн о числу
клеток в популяции), приводит к об р азо в ан и ю м етаб оли тов,
обеспечиваю щ их в о зм ож н ость деления клетки и удвоения
центров, с ко то р ы м и взаи м одей ствует субстрат.
К инетику процесса описы вает систем а уравнений (S п остоян ­
но, S = S0)
^
= 2£2Х —^ S o N ;
^ = M 0N -A :2X;
(1.25)
(1.26)
И зм ер яем ая на опы те биом асса (или общ ее число клеток
м и кр о о р ган и зм о в) п редставляет собой сум м у двух переменны х
величин:
M (f) = N (f) + X (/).
С истем а уравнений (1.25), (1.26) м ож ет б ы ть реш ена отн оси ­
тельно переменны х N (t) и Х (/). И з уравнения (1.25) следует:
x “ ^ f e + * .S o N l;
2k-, ) dt
dX
1
) t/2N , .
.
(1.28)
rfN
<1 2 9 >
13
П од стан о вка d X /d t и X в уравнение (1.26) приводит к диф ф ерен­
ц иальн ом у уравнению в то р о го п оряд ка с п остоян н ы м и коэф ф и­
циентами:
^ + ^ ( к ^ о+ к2) - к 2к ^ о^ 0 .
(1.30)1
Реш ив это уравнение отн оси тельн о N (/), м ож но, используя
уравнение (1.28), найти X ( t ) и соответствен но функцию от
времени общ его количества биом ассы М (t).
М ето д ы реш ения диф ф еренциальны х уравнения типа (1.30)
д етал ьн о рассм отрены в м атем ати ч еской о б щ еоб разовател ьн ой
литературе. О бщ ее реш ение уравнения (1.30) им еет вид
N (f) = C je V + c 2e 4
(1.31)
где Х15 Х2 — корни соответствую щ его характеристического урав­
нения; С 1, С 2 — кон станты , которы е м огут б ы ть найдены из
н ачальн ы х условий.
Х арактеристическое уравнение им еет вид
l 2 + (k l So + k 2) X - k 2k l S0 = 0.
Реш ение характеристического уравнения
корням и:
1) полож ительн ы й корень
(1.32)
п редставлено
двум я
2
2) отр и ц ател ьн ы й корень
(,.3 4 )
И з уравнения (1.31) следует
^ = Х 1С 1е 1* Ч Х 2С 2е 1*‘.
С учетом
получить
это го
соотн ош ени я
из
(1.35)
уравнения
Х (/) = С 1е х-( ^ ± М ° + с 2е ^ Ц
^ .
(1.28)
м ож но
(1.36)
Д л я нахож дения кон стант С , и С 2 восп ользуем ся н ач ал ь­
ны м и условиям и: / = 0, N = N 0, Х = 0. И спользовани е этих
условий для уравнения (1.31) и (1.36) приводит к системе
алгебраических уравнений
из которы х следую т значения C t и С 2:
C
r N
с 2=
2
Т аки м о б р азо м , д л я
jN м ож н о записать:
N (/) =
ДЛЯ
„ ^ ;
(1.39)
0 Xj-X.2
изм енения
Х2—^1
(1.38)
во
еV +
времени
числа
+ k ‘s°) е V
Aj —А2
клеток
(1.40)
состоян ия X
W f ) _ k l+ *lSQe M Noft'2+*1S0) | b2+ k iS0
W
2к 2
А .2-Х ,
,, Д,ч
n o(^i+^iSq)
2А:2
Х .,-Х 2
'
'
В уравнения (1.40) и (1.41) входят д в а экспоненциальны х
члена, при это м один из них им еет п олож ительн ы й п оказател ь
экспоненты , а другой — отри цательны й . С оответствен н о одна
экспоненциальная функция увеличивается от единицы д о беско­
нечности, в то р ая ум еньш ается о т единицы д о нуля. П ри
сои зм ерим ы х по аб со л ю тн ы м значениям предэкспоненциальны х
членов и п оказателей
Х2 в сум м арн ы х функциях (1.40)
и (1.41) через очень ограниченное врем я разви ти я процесса
м ож но с вы сокой степенью точности пренебречь членом ,
сод ерж ащ и м экспоненту с о тр и ц ател ьн ы м п оказателем . П о ­
скольку б ы ло принято, что X.J имеет п олож ительн ы й характер,
через очень н ебольш ое врем я п ротекани я процесса после
определенной л аг-ф азы им еет м есто экспоненциальны й рост
м и кр о о р ган и зм а:
N (f) —N° f 2+*lS°)e V ;
A2—Aj
(1.42)
^ _ No(k2+fr|S) ^ i+ ^ iS o e x,i
А2 —Ai
И зм ер яем у ю
уравнением
на
опы те
общ ую
(1 4 3 )
2к2
б иом ассу
м ож но
вы рази ть
С ледует о тм ети ть, что в кинетике р о ста м и кр о о р ган и зм о в
очень часто, почти всегда, н аб л ю д аю тся периоды индукции
после введения в систему инокулята. М и кроорган и зм ы ад ап ти ­
рую тся к новы м условиям . В рам ках обсуж даем ой м одели этот
процесс м о ж ет п ред ставл ять собой первую стади ю процесса
(1.24), при эт о м наличие в уравнениях н акопления биом ассы
экспоненты с о тр и ц ател ьн ы м зн аком , возм ож н о, количественно
объясняет д ли тельн ость и природу л аг-ф азы (другие м еха­
низм ы , приводящ ие к п оявлен ию индукционного п ериода на
кинетических кривы х роста культуры , об суж д аю тся в гл. 6).
Р ассм о тр и м зави си м ость от концентрации суб страта п ар ам етр а
и п редэкспоненциального м н ож и тел я А уравнения (1.44):
A = h±bh( 1 + ^
Х2—
у
о +Ч
2к2
(1.45)1
J
У равнение (1.33) м ож н о п р ео б р азо в ать к виду
) = k'S° ± h (
2
Если один
из
превы ш ает другой
соотнош ение
11 +
4 W ?— Д
(k,S 0+ к 2у
)
кинетических п ар ам етр о в
(A2 » A , S 0 или A^Sq : » / ^ ) ,
4 В
Д
„
^
(1.46)
сущ ественно
сп раведливо
( 1 4 7 )
(^So + ^2)2
Э то п о зво л яет ф ункцию , входящ ую в п одради кальн ое вы раж е­
ние уравнения (1.46), р азл о ж и ть в б ы стросходящ ийся ряд
отн оси тельн о сл агаем ого 4A1S0A2/(A1S0 + A2) 2 и ограничиться
п ер вы м членом разлож ени я. В этих условиях из уравнения
(1.46) следует
.
1
_ ^iS0A-2 _
k2Sp
k2+ k tS0 к2j(ki -ЬS0)*
/1 4 оч
Т ак и м о б р азо м , п оказател ь экспоненты в рам ках используе­
м ы х приближ ений является гиперболической функцией концент­
рации суб страта, что соответствует уравнению М оно
<L49)
Значение дт им еет см ы сл кон станты скорости процесса удвоения
числа ц ентров к 2, с к о то р ы м и взаи м одей ствует субстрат. K s
в уравнении М оно п ред ставляет собой отнош ение кон стант
скорости двух стадий процесса к 2/ к 1.
У равнение (1.49) получено как р езу л ь тат асим птотического
разлож ени я функции (1.46) в определенны х условиях. А нализ
а
0
!
2
4
1 /* ,,ч
6
8
5
2
4
Рис. 1.2. Зависимость удельной скорости роста популяции микроорга­
низмов в экспоненциальной фазе от концентрации лимитирующ его
субстрата (а); те же данные в двойных обратных координатах (б):
сравнение значений т о ч н о го [п ункти рн ая л ин и я, у равн ен ие (1.46)] и а с и м м ет р и ­
ческого [н епреры вная л»
»я. П р и р асч ете п ри н ято
п оказы вает, что точное значение
при л ю б о м соотнош ении
п ар ам етр о в к хS0 и к 2 весьм а б ли зко к асим птотической
гиперболической зави си м ости (1.47) (рис. 1.2). И з рисунка
видно, что асим птотическое приближ ение описы вает точное
реш ение. Н аи б о л ьш ее различие двух реш ений им еет м есто
при S0, сои зм ерим ы х с Ks = k 2/ k l . Э то отклонение м ож ет
д о сти гать 20% . К ак следует из рис. 1.2, а, при S0 < K s и S0 > K s
величина отклонения ум еньш ается и в пределе при S0 » A ^ s
и S0 <^K s ум еньш ается д о нуля.
▲ Н а рис. 1 .2 ,6 п риведены кри вы е д л я то ч н о го и аси м п ­
то ти ческо го реш ения в о б р атн ы х к о о р д и н а тах , н аи более ч асто
и сп о л ьзу ем ы х при оп ределении п а р а м е т р о в цт и K s из
эксп ер и м ен тал ьн ы х дан ны х. Видно, что эти ф ункции д о ­
стато ч н о близки. Если учесть, что удельн ы е ск орости при
д ан н о й ко н ц ен тр ац и и су б стр а та о п р ед ел яю тся с д о стато ч н о
б о л ь ш о й о ш и б ко й (10 — 20% ), то стан о в и тся ясно, что
эксп ер и м ен тат о р в есьм а о б о сн о ван н о будет и сп о л ьзо в ать
линейную аси м п то ти ч ескую зав и си м о сть. О ш ибки в оп ред ел е­
нии цт и K s будут в о зр а с т а т ь , если и сп ол ьзую тся дан ны е
эксп ер и м ен та, в ы п о л н яем о го то л ь к о в од н ой из областей:
S0 > K S или S0 < K s. Д л я то го чтобы б ы ть уверен н ы м в п р а в и л ь ­
ности оп ределен и я цт и Ks при и сп о л ьзо в ан и и лин ейн ого
аси м п то ти ч еск о го реш ения, н ео б х о д и м о эксп ери м ен т п р о в о ­
д и т ь в о б л а ст и обеих ветвей зав и си м о сти , как при S0 > K s,
так и при S0 < K s.
Р ассм отри м зави си м ость предэкспоненциального м н ож и теля
|'от'к6н цеН трац ии суб страта. В р и и сп о л ьзо в ать асим п тотическое
17
приближ ение, обеспечиваю щ ее разлож ени е в ряд рад и кальн ой
функции, входящ ей в вы раж ение д л я X,t и Х2, то м ож н о найти
* > --(*
а
+ *»+ 5 Ё 5 ; ) -
( | '50)
С оответствен н о на основе уравнения (1.45) значение А будет
представлено функцией
л _
^•'lS0^2
к> +*Г, SГ„ +Т fe2
Г
f^2 -f- Агi S 0 + 2
w
/
( и
£lS0&2
*iso+;* , S „ + fc2
, | 1 + ------
0.51)
^lSo"f*^2
С учетом то го , что Ks = k 2/ k l , уравнение (1.51) м ож н о п р ео б р а­
зо в ат ь к виду
1
V . So
1
2 + -^ -+
1 + ^ /S q /V
K s \+ K J S 0
1+ ,
2|
, + S°
Ks
(1.52)
1+A,/S0.
▲ И з уравнения следует, что при S0 ^> K S А ъ \ , а такж е
при S0 <^K s А х 1. Н аи б ол ьш ее отклон ен и е значения А от
1 н аб лю д ается при S0, сои зм ерим ы х с Ks. П ри S0 = A"s /1 = 0 ,8 7 5 ,
т. е. отклон ен и е А о т единицы составл яет 12,5%. Видно, что
значение А весьм а близко к единице при сам ой ш ирокой
вариации отн ош ен и я S0/K s. Э ксп ери м ен тальн о значение предэкспоненциального м н ож и теля определяется в п олул огари ф м и ­
ческих ко о р д и н атах из отрезка, отсекаем ого п рям ой ро ста на
оси орд ин ат. О чевидно, что в условиях эксперим ента с учетом
известной статистической ош ибки отклонение А от единицы
практически обнаруж ено б ы ть не м ож ет, п олучаем ое значение
п редэкспоненциального м н ож и тел я д о стато ч н о строго со о тв ет­
ствует значению N 0.
Т аки м о б р азо м , кинетическая схема (1.24) с учетом обы чно
н аб лю д аем ы х статистических ош ибок хорош о соответствует
им ею щ ем уся обш и р н ом у эксп ери м ен тальн ом у м атер и ал у и при­
води т к уравнению М оно (1.3), связы ваю щ ем у удельную
ск о р о сть р о ста м и к р о о р ган и зм о в с концентрацией субстрата.
П роведенное рассм отрени е д ает кинетическое обоснование
уравнению М оно.
• П ри н ци п иальн о важ н ы м в ы вод ом является утверж дение,
что уравнение М оно о тр аж ает м н огостади й ны й характер
процессов при росте культур. О дн а из стади й процесса
зави си т от концентрации суб страта, и ск орость этой стадии
м о ж ет б ы ть регули рована концентрацией суб страта. В торая
стади я не зави си т от концентрации су б стр ата и п редставляет
18.
собой некоторую л и м и ти рую щ ую стади ю в процессе клеточ­
ного деления. Если кинетическую схему процесса не разд ели ть,
по крайней мере на две стадии, то удельная скорость роста
популяции не будет представлена уравнением с «насы щ ением »
суб стр ато м , а будет д ан а линейной ненасы щ аем ой зави си ­
м остью о т концентрации субстрата. П ри низких концентрациях
суб стр ата процесс р о ста культур м и кр о о р ган и зм о в л и м и ти р о ­
ван процессом н акопления клеток в ф орм е X, процессом
н акопления необходим ы х м етаб оли тов. П ри высоких н асы щ аю ­
щих концентрациях су б страта л и м и ти р у ю щ и м станови тся субстрат-н езави си м ы й процесс удвоения центров. М акси м альн ая
удельн ая скорость ро ста характери зует именно э то т процесс.
1.1.4. Упрощенные методы анализа кинетики и механизмов
автокаталитического роста микроорганизмов.
М етод малого параметра
Выше приведен ан ал и з кинетики автокатал и ти ч еского роста
культур м и кр о о р ган и зм о в с точ н ы м реш ением систем уравне­
ний, описы ваю щ их дин ам ику процесса. И з ан ал и за видно,
что даж е в случае п ростейш его д вухстадий н ого м ехан изм а,
п редставленного схемой (1.24), для получения точного реш ения
требуется до стато ч н о б ольш ая ан алитическая р аб о та. С л о ж ­
ности ан ал и за кинетики процесса сущ ественно увеличиваю тся
с услож нением кинетической схемы процесса. Так, для того
чтобы найти характеристические врем ена д л я кинетической
схемы с участием двух пром еж уточны х состояний (трехстади й ­
ная схема), н еобходи м о аналитически реш ить кубическое у р ав ­
нение и д етал ьн о п р о ан ал и зи р о в ать свойства корней этого
уравнения. С лож ности стан овятся практически н еп реод оли м ы ­
м и, если ан ал и з кинетики сопряж ен с исследованием четы рех­
стадийны х или пятистадийны х процессов. Э то требует поиска
м етодо в ан ал и за кинетики на принципах сущ ественного уп рощ е­
ния с сохранением адекватности кинетического описания.
Р ассм о тр и м принцип и возм ож н ости такого п одход а на
прим ере п р о ан ал и зи р о ван н ого д вухстадий н ого процесса (1.24).
У равнение (1.28) м ож н о п ред стави ть в виде
1 dx
к2 dt
I
х —fe‘S° N.
к2
(1.53)
П ри определенны х условиях в левой части уравнения м ож но
пренебречь членом (1 / k 2) d X / d t по сравнению с X. Н айдем
условия, при ко торы х вы полняется неравенство
(1.54)
19
П од стан о вка значений X и ~
(1.54)
из уравнения (1.36) в неравенство
приводит к вы раж ению
С ,е ^ --^
So + k 2C 2e V - ^ у -° ^ С
, е
+ C 2e V ^ t ^ s ° .
АК2
[S° +
(1.55)
Если в это м вы раж ении пренебречь членам и, содерж ащ им и
о тр и ц ател ьн о е значение корня А.2, поскольку в очень ограничен­
ном интервале времени они будут равны нулю , в то время
как члены, содерж ащ ие п олож ительн ую экспоненту А,х, будут
неограниченно расти, то м ож н о получить неравенство
Xt Q e V ^ + y ° <g; c t e
ZK2
Z/C2
^
(1.56)
или
Ar2.
П ри выполнении этого неравенства в диф ф еренциальном
уравнении (1.53) м ож но пренебречь п ервы м сл агаем ы м и су­
щ ественны м о б р азо м уп рости ть реш ение.
М ож но п о казать, что всегда строго вы полняется неравенство
Xl < k 2. Если п одставить в неравенство (1.56) значение A.l5
вы раж енное из уравнения (1.46), то будем и м еть
+
_ k 2 k iS o _ l^
( 157)
ко то р о е эквивалентно неравенству к 2 > 0 .
Т аки м о б р азо м , для кинетической схемы (1.24) и системы
уравнений (1.25) — (1.27) весьм а вероятн о вы полнение н ера­
венства (1.57). Э то п озвол яет в диф ф ерен ц иальн ом уравнении
(1.53) в силу м ало сти п ар ам етр а \ / к 2 с вы сокой степенью
точности пренебречь членом ( \ / k 2) d X / d t по сравнению с X.
В это м приближ ении диф ф еренциальное уравнение (1.53) тр ан с­
ф орм и руется в алгебраическое:
X (f)= ^ N (r).
(1.58)
С учетом уравнения м атер и ал ьн о го б ал ан са м ож н о зап и сать
Х (< )= Л £ * -.
(1.59)
|+ К
г 1Э0
т
У чи ты вая, что
^
20
= Аг2Х ( г),
(1.60)
получаем
‘т
=ь т
.
.С1 .6 1 )
/сl^o
Э то уравнение п редставляет собой диф ф еренциальное уравнение
первого п оряд ка с разд ел яю щ и м и ся перем енны м и, реш ение
ко то р о го им еет вид
M (< )-N 0 e x p (jfa i& -< ),
(1,62)
т. е. реш ение системы п редставляет собой уравнение экспонен­
ц иальн ого ро ста культуры . П ри это м п оказател ь экспоненты
вклю чает суб страт-зави си м ы й п ар ам етр — удельную скорость
роста:
p(S) =
fciS0 + Ar2
Э то соответствует уравнению , полученном у при п олн ом реш е­
нии систем ы диф ф еренциальны х уравнений, а такж е согласуется
с эм пирическим уравнением М оно.
О бсуж даем ы й упрощ енны й п одход к ан али зу автокатал и ти ческой кинетики ро ста м и кр о о р ган и зм о в п озволяет ан ал и зи р о ­
вать субстрат-зави си м ую кинетику р о ста культур д л я кинети­
ческих схем практически л ю б ой степени слож ности. Р ассм отри м
использование этого п одход а для ан ал и за кинетики трехстадий ­
ного процесса и процесса с участием п рои звол ьн ого числа
п различны х состояний.
П редстави м , что кинетика процесса вклю чает несколько
сои зм ерим ы х по п ар ам етр ам п оследовательны х стадий:
S + N -^ 1X 1 -^2 X 2 -^ 2 N .
(1.63)
К инетику изменения во времени всех ком пон ен тов (при условии
п остоян ства S = S0) описы вает систем а уравнений
~
—2k3X 2 —k l S0bi;
•
(1.64)
^ i = ^ 1S0N -A :2X 1;
(1.65)
-d f = k 2X i - k 3X 2.
(1.66)
В ыраж ение д л я общ его количества биом ассы , вклю чаю щ ее
сум м ар н о е количество клеток во всех состояниях, им еет вид
M = N + X 1+ X 2
(1.67)
21
или
dM
dt
d N , dXt ,
,
+
dt ^ dt
X
—
dt
( 1.68 )
•
С лож ение диф ф еренциальны х уравнений (1.64) — (1.66) п риводит
к уравнению
dM
- = /с,Хл
dt
(1.69)
И з уравнений (1.65) и (1.66) следует:
_ k i S0
1 dX 'M Y
^ ^ T + Xl
N:
(1.70)
^2
* 2X ,
1
_1_ Y
E ~dT + X ^
(1.71)
В оспользуем ся излож ен н ы м вы ш е п одход ом , согласно к о т о ­
р о м у в силу м ало сти п ар ам етр о в \ / к 2 и 1/ к 3 м ож но пренебречь
в левой части уравнений (1.70) и (1.71) членам и, содерж ащ и м и
производны е d X l /dt и d X 2/d t■ Э то п ри вод и т к уравнениям
(1.72)
X ,= ^ N ;
*2
х2=Ьх,.
*з
(1.73)
С учетом этих соотнош ений уравнение д л я общ его количества
биом ассы м ож но зап и сать в виде
(1.74)
или
м (0
_
Х 2 (/) =
(1.75)
»
1+т^ +
к2 k,S0
Если п о дстави ть это уравнение в (1.69), будем им еть
dM (t)_
dt
k}M(t)
(1.76)
| + гЛ 2 + г§~
Реш ение это го д иф ф ерен ц иальн ого уравнения с разд ел яю щ и ­
мися перем енны м и при исп ользован и и н ач ал ьн ого условия
/ = 0, M = N 0 им еет вид
М (?) = N 0 exp
к,
l + — + — ?-
к2 к,S0
22
t
(1.77)
С оответствен н о уравнение удельной скорости ро ста культуры
м и к р о о р ган и зм а м ож н о зап и сать в виде
H s ) = -j~ /
, •
(1.78)
к3 к2 к3S0
П о д стави м
форме:
это уравнение в «классической» гиперболической
K ( S ) = |^ ;
при это м значения п ар ам етр о в цт и K s как функции
скорости элем ентарны х стади й д ан ы уравнениям и
(1.79)
констант
( , -8 0 )
K s~ k i (\/k3+ \/k2r k l {k3+ k 1j
(1>81)
\k J K = k v
(1.82)
Если на какой-либо стади и реакции образуется продукт, т. е.
S + N —+ X j I—
Х 2 —» 2 N ,
I ►Р
(1.83)
то зави си м ость его концентрации о т времени м ож но найти
из уравнения
- =
dt
Ур ’
П 841
где У0— экономический коэф ф ициент по продукту.
И з (1.84)
р ( ' Н у Ч е ц' - 1 ) .
(1.85)
7 Р
П ри врем енах, превы ш аю щ их 1/ц, в (1.85) м ож н о пренебречь
единицей по сравнению с экспоненциальны м
членом . П ри
это м сп раведли во уравнение
Р ( / ) = ^ е мГ.
( 1 .8 6 )
* Р
Э то уравнение экспоненциального ро ста культуры в условиях
детекции продукта ф ерм ен тати вн ого процесса. Л и неари зац ия
данны х
по продукту реакции
вполулогариф м ических
23
ко о р д и н атах п озволяет, так же как и при определении
биом ассы , оп редели ть удельную скорость р о ста культуры .
А И з уравнения (1.80) следует важ ное свойство кинетики
р о ста популяций м и кроорган и зм ов: м акси м ал ьн ая удельная
ск орость р о ста определяется наиболее медленной стадией. Если
к 3 ^ > к 2, то \im= k 2\ если к 2 » к 3, то \ьт= к 3.
Э т о т важ ны й вы вод им еет общ ий характер. Д л я его
п одтверж дения р ассм о тр и м кинетику процессов с учетом п воз­
м ож ны х состояний:
8+
м
Л
х
1Л
2Л . . . Л
х
~Ht
х
,.Ч \. Л х . , Ь '2 №
/Cn+iA"’
M (f) = N + £ X,-;
(1.87)
( 1.88 )
(1.89)
i= 1
k2\ l
k 3X 2
=A :jS 0 N;
= k 2X l;
(1.90)
^ и ^ я - l = ^n + l ^ n ..
С учетом соотнош ений (1.90) уравнение (1.89) будет и м еть вид
m m
=
x
„ (
i
+ ^ + * .* ‘! д }
Э то уравнение п озволяет вы рази ть перем енную
перем енную М (?), входящ ую в (1.88):
< Ш (/)_
dt
к„+ j М (г)
к
Т Г +‘-
"+ 1I '
1i
i1
=2 K
с - 91»
Х п через
(1.92)
И з это го уравнения следует
ц= -
1
"+1 1
г
к ! S0 + i1
= 2 ki
(1.93)
ИЛИ
1
M-m- n+i
К .=
1
»+i
(1.94)
,>
(1.95)
i=2
VmI K = k i24
(1.96)
В м акси м ал ьн о й удельной скорости роста м и кр о о р ган и зм о в
появляется л и м и ти р у ю щ ая стади я ф ерм ен тати вн ого процесса.
Если в слож ной п оследовательности тран сф орм ац и и вещ ества
в клетке им еется какая-либо стади я, характери зуем ая н аи м ен ь­
ш им значением kj, к } <^кь, / = 2 , ..., и + 1 , i ^ j , то значение
м акси м ал ьн о й удельной скорости р о ста будет равн о константе
скорости этой стадии:
(1.97)
В это м случае /-я стади я является лим ити рую щ ей.
1.1.5. Репликация, транскрипция, трансляция
в кинетике роста микробной культуры
Р ассм отрен н ы й п одход к описанию кинетики р о ста м и к р о б ­
ных популяций объясняет зави си м ость удельной скорости роста
о т концентрации л и м и ти рую щ его субстрата.
Кинетическое описание роста клеточной популяции мож ет бы ть
основано и на применении п одхода с и спользованием представле­
ний о м олекулярн ы х м ехан изм ах тран сф орм ац и и генетической
и нф орм ации. Р ассм отри м сущ ность этого подхода на прим ере
ан ал и за наиболее «грубой» схемы процесса. Ц ель этого ан ал и за
состоит в д ем он страци и то го ф акта, что подход, основанны й на
известны х представлениях о м ехан изм ах биосинтетических
процессов, д ает в о зм ож н ость объясни ть две принципиально
важные феноменологические закономерности: 1) экспоненциальный
рост биом ассы во времени; 2) зави си м ость удельной скорости роста
популяции о т концентрации ли м и ти рую щ его субстрата.
М ехани зм конверсии исходного суб страта S в клеточную
биом ассу вклю чает действие на суб страт л и м и ти рую щ его
ф ерм ен та Е:
(1.98)
П р о д у к то м этой ф ерм ен тати вн ой реакции является п ром еж у­
точны й субстрат S ', дал ьн ей ш ая конверсия к о то р о го обеспечи­
вает синтез всех основны х м етаб о л и то в . П ревращ ение S в S'
м о ж ет осущ ествляться как о тд ел ьн ы м ф ерм ен том , так и целой
п олиф ерм ентной систем ой, в кото р о й ф ерм ент Е является
л им ити рую щ и м .
П о д д ействием различны х ф ерм ентны х систем вещ ество
S' тран сф орм ируется в м етаб о л и ты (D N , R N , А А), обеспечива­
ю щ ие синтез основны х п олим ерны х ком пон ен тов клетки:
дезоксирибонуклеиновой кислоты (D N A ), рибонуклеиновой
25
кислоты (R N A ) и белка. О дним из ком пон ен тов син тези рован но­
го белка является лим итирую щ ий ферм ент Е. П ом и м о ком понен­
тов, непосредственно участвую щ их в биосинтезе белка и нуклеи­
новы х кислот, в системе м о гу т о б р азо в ы в ать ся н еобходим ы е
энергетические и структурно важ ны е соединения, сум м арн о
обозначенны е на схеме вещ еством Р.
Т ер м и н ал ьн ы м и стад и ям и схемы (1.98) яв л яю тся стади и
репликации (синтез D N A на м атрице D N A ), транскрипции (синтез
R N A на м атр и ц е D N A ) и тран сляци и (синтез белка на м атриц е
R N A , вклю чая синтез белка Е). О б разовавш и й ся в результате
тран сляци и белок Е является к а та л и за то р о м первой стадии
реакции, что обеспечивает автокаталитический характер процесса.
П р едп о л агается, что первая стади я процесса (ф ерм ен тати вное
превращ ение S в S ') им еет обы чны й ф ерм ен тати вн ы й характер
и м ож ет б ы ть описана уравнением ти п а М ихаэлиса — М ентен
d S _ k^ES0
dt
Км + S0 ’
(1.99)
где к%ат— каталитическая кон стан та скорости л и м и ти рую щ его
ф ерм ента; Км — ко н стан та М ихаэлиса ф ерм ен та Е. Такж е
п редполагается, что процесс исследуется на н ач ал ьн ом этапе, так
что р асх о д о м су б страта м ож н о практически пренебречь ( S « S 0).
С тад и и конверсии пром еж уточн ого соединения S ' м огут
б ы ть о х ар актер и зо ван ы кинетическими коэф ф ициентам и k d, kr,
ka, k p соответственно:
( 1. 100)
Р
В условиях, к о гд а конверсия S в S ' является лим ити рую щ ей
стадией, превращ ение S ' будет п ротекать по в то р о м у п орядку
о тн оси тельн о концентрации S' и концентрации соответствую щ их
ф ерм ен тов Ed, Е „ Еа и Е^. Э то следует из кинетической теории
п оли ф ерм ен тн ы х реакции, один из вы водов кото р о й состоит
в то м , что для полиферментной системы со строго лим итирую щ ей
стадией последую щ ие реакции п ротекаю т в реж им е реакции
в то р о го порядка. К он стан ты k d, k r, k a и k p и м ею т см ы сл кон стант
скоростей в то р о го п оряд ка (отнош ение к клт/К м соответствую щ их
ф ерм ентов). П редп о л агается, что состав клетки в процессе роста
культуры не меняется, т. е. концентрации ф ерм ентов Ed, Е „ Еа и Ер
связан ы с концентрацией ф ерм ен та Е линейны м и соотн ош ени ям и
где <J>d, Фг, Фл, Фр— соответствую щ ие коэф ф ициенты п роп орц и о­
нальн ости.
В соответствии с эти м диф ф еренциальное уравнение, описы ­
ваю щ ее изменение вещ ества S', м ож но зап и сать в виде
/'/S'
к
F <Ч
^ =]^ ^ -(
ф^
+
ф^
+
фа
+
ф а
) Е 8 '-
( 1Л02)
К онечны м и этап ам и биосинтетического процесса являю тся
стадии о б р азо ван и я D N A , R N A и Е. П редп олагается, что
скорость репликации зави си т как о т концентрации D N A
в системе, так и о т концентрации сум м арн ого и м он ом ерн ого
ком пон ен та D N . С оответствен н о скорость транскрипции оп ре­
деляется концентрацией D N A и R N , скорость трансляции
зависит от сум м арн ой концентрации ам ин оки слот (А А ) и R N A .
С истем у уравнений, описы ваю щ их накопление полим ерны х
ком пон ен тов D N A , R N A и Е, м ож н о п редстави ть в виде
4D N A
—~
осd D N A D N ;
dt
R
^ ^
= a r DNARN;
^
= a, R N A A A ,
dt
(1.103)
'
где a R, а г , а , — коэф ф ициенты пропорц и ональн ости , им ею щ ие
см ы сл кон стант скорости второго порядка.
Если счи тать, что основны е «оттоки» вещ еств D N , R N
и АА связаны с их вклю чением в п оли м еры , то диф ф ерен­
циальны е уравнения д л я этих ком пон ен тов системы м огут
бы ть записаны следую щ и м об разом :
^
= Ф Л Е 8 ' —a RD N D N A ;
^ ^ A E S '- o ^ R N D N A ;
(1.104)
ИА А
= ФаА:а Е S '—а, АА R N А.
С истем а уравнений (1.102) — (1.104) описы вает поведение обсуж ­
д аем о й авто катал и ти ч еской полиф ерм ентной реакции, и ее
реш ение м ож ет д ат ь уравнение изменения основны х ком пон ен ­
тов во времени.
В целях существенного упрощения анализа для решения р аз­
ностных уравнений (1.102) и (1.104) мож но использовать при­
ближение, основанное на малости парам етра перед производной:
___________!___________^ + s ' =
(Ф А + Ф А + Ф А + Ф /Р)Е dt +
= ----------------- k™S°___________ •
(*,+ 80)(Ф Л + Ф А + Ф А + Ф А )’
1
xr D N A
t/PN- + D N = <l>‘,fe‘|ES';
dt
^DN A’
п 1051
‘
(1.106)
27
1
rfRN | p N . * r * , E S ' .
a r DNA
dt
in „
arDNA’
a, R1N A ^ d t +
^
A A = a,vR NSA ’
^
(1 - Ю 8 )
В условиях м ало сти п ар ам етр а перед производной им еем
1
S':
DN :
RN :
AA :
dS'
Ф А +Ф А +Ф А +Ф А
1
</DN
>— .
*
a„D N A
dt
1
d RN
dt ’
.« д .
a r DNA
dt
1
dW
a, R N A
dt
п оэтом у уравнения (1.105) — (1.108) тран сф орм и рую тся к виду
S ' — ^ ат S°
*___________ .
/1 1 1Л\
^M+ S0 ® A + ® ,* r+ ® A + ® A ’
D N = --— E S ;
a„ D N A
RN
y
(1.111)
: ES ;
(i j (2)
a r DNA
A A = - !k"ES'.
a ,R N A
(1.113)
v
'
У слови я (1.109) со ответствую т услови ям стац и он арн ости по
п ром еж уточн ы м соединениям , согласно к о то р ы м d S '/d t = 0,
d D N / d t = 0, d R N / d t —0, d A A / d t —О. П о физическом у см ы слу
эти условия хар актери зую т реж им , в к о то р о м синтез п оли м ер­
ных м олекул D N A , R N A , Е п ротекает отн оси тельн о бы стро,
так что л и м и ти р у ю щ и м и оказы в аю тся стади и накопления
п редш ественн и ков.
И з уравнений (1.104) следую т соотнош ения
< /D N A _ a c „ D N
4R N A ~o^ RN’
4D N A
dE
a R DN DNA
a, A A R N A ’
(1.114)
rfRNA _ a T RN D N A
dE
oc, A A R N A
У равнения (1.114) м огут б ы ть п роин тегри рован ы . В условиях
разви ти я процесса на д остаточ н ую глубину [.Е0 « : Е , (D N A )0 «c
«с D N A , (R N A )0 « c R N A , где Е0, D N A 0, R N A 0 — начальны е
концентрации поли м ерны х ком пон ен тов ] будем иметь:
28
П -ПЭ)
1151
RNA оtT RN’•
U
D N A _ a s DN DNA,
E
aT AA RNA’
(11 1 6 )
RNA a r RN DNA
E
AA RNA'
( ! - 117)
Д л я то го чтобы найти реш ение системы , н еобходи м о проин тег­
ри р о вать то л ьк о одно уравнение, наприм ер
</DNA = a KDN</r.
(1.118)
Значение D N м о ж ет б ы ть найдено по уравнению (1.111).
О днако сн ачала н еобходим о определить отнош ение (E /D N A ),
входящ ее в это уравнение. И з уравнений (1.111) — (1.113)
следует:
DN а 7 Фdkd
О - 119)
DN а, Фdkd RNA
( 1. 120)
AA aR Фака DNA’
RN _ а, ФX RNA
( 1. 121)
AA~otT Ф Х DNA
П од стан о вка (1.119) в (1.125) д ает уравнение
DNA _ Ф^кл
RNA Фгк,
( 1. 122 )
С оответствен н о получаем
DNA = ^
Е
ФЛ:
(1.123)
П од становка это го соотнош ения в уравнение д л я D N и по­
следую щ ее и сп ользование полученного значения D N п риводят
к д иф ф еренциальном у уравнению
</DNA , . _, _ жг .
= ® e£e S D N A
dt
(1.124)
d D N A _ k ,„ S 0
Фака
DNA kM+ S0 Фака+Ф,,кл+ Фгкг+Фркр
(1.125)
или
И н тегри рован ие (1.125)| с и сп ользован и ем нача
н ачальн ого условия
t = 0, D N A = D N A 0 д ает
5Т функцию
D N A = D N A 0 e Mt,
где
(1.126)
С оответствен н о на основе и сп ользован и я соотн ош ени й (1.115) —
(1.117) м о гу т б ы ть найдены функции, оп исы ваю щ ие накопление
во времени других п олим ерны х ком понентов:
R N A = ^ ^ ( D N A ) 0 e M';
Е=
(D N A )0 e M‘.
(1.128)
(1.129)
Т аки м о б р азо м , полученны е реш ения оп и сы ваю т экспонен­
ц иальны й р о ст б иом ассы в системе. П ри это м удельная
ск о р о сть роста культуры является гиперболической функцией
от концентрации субстрата. Зави си м ость о т концентрации
су б стр ата о тр аж ает м ихаэлисовскую функцию д л я л и м и ти ру­
ю щ его ф ерм ента. М ак си м ал ьн ая удельная ск орость, реали зу­
ем ая при высоких концентрациях суб страта, им еет вид
> * --
ф,
* /ф *
Ф
^ак
лв
Ф
к
^ апа
ф~ Т -
(1Л30)
Ф а кха
Ф П роведенны й ан ал и з п оказы вает, что кинетическое об ос­
нование зави си м ости скорости роста популяции м и к р о о р ган и з­
м о в о т концентрации суб страта м ож ет б ы ть получено и на
основе подхода, и спользую щ его п редставлен и я о м еханизм е
биосинтеза нуклеиновы х кислот и белка. В ходящ ий в уравнение
п ар ам етр цт является слож н ой функцией кинетических х аракте­
ристик л и м и ти рую щ и х биохимических процессов, значение K s
в р ам ках данной м одели характери зует кон станту М ихаэлиса
л и м и ти р у ю щ его субстрата.
Зави си м ость скорости ро ста о т концентрации л и м и ти р у ю щ е­
го су б стр ата, д ан ная уравнением М он о, весьм а ш и роко и сп оль­
зуется на практике и, как п равило, в р ам ках точности
м и кроби ологи ческого эксперим ента н аход ит эксперим ентальное
подтверж дение. В разн ое врем я бы ли предлож ены и другие
уравнения, в то й или иной степени оп исы ваю щ ие кинетику
р о ста культур м и кр о о р ган и зм о в . Н ап ри м ер, удельн ая скорость
их р о ста м ож ет б ы ть представлен а экспоненциальной функцией
концентрации су б страта (уравнение Тейсиера)
B = llm(l —e ~ 'tS),
(1.131)
где к — кон станта, к о то р а я м о ж ет б ы ть найдена из эксперим ен­
тал ьн ы х данны х.
Д р у гая ап п рокси м аци я уравнения скорости ро ста популяции
им еет вид (Ц. О иву, Г. Л оусон и Г. Д ин, 1984)
^ = р М 1~ М^ ,
dt ^
1-м /м ;,
где М,„ и М ',— эмпирические константы .
30
(1.132)
О дн ако эти уравнения не и м ею т д о стато ч н о ясного м ол еку­
л яр н о го обосн овани я, гром озд ки и н аход ят ограниченное
прим енение на практике.
1.2.
ЗА В И С И М О С Т Ь С К О Р О С Т И РОС ТА
К У Л Ь Т У Р М И К Р О О Р Г А Н И ЗМ О В
О Т К О Н Ц Е Н Т Р А Ц И И Л И М И Т И Р У Ю Щ Е Г О СУБСТРАТА.
«М ИКРОСКО П ИЧЕСКИЙ » П О ДХО Д
Изложенный подход к описанию кинетики роста микробной
популяции имеет «макроскопический» характер. Рост культуры м и­
кроорганизмов представлен как автокаталитический процесс, иду­
щий с накоплением активных самовоспроизводящихся каталитичес­
ких систем. Видно, что такой подход приводит к уравнениям,
достаточно адекватно описываю щ им фундаментальные кинетичес­
кие особенности микробного ро ста— экспоненциальный характер
процесса и зависимость удельной скорости роста от концентрации
лимитирую щ его субстрата. М етодология построения кинетических
уравнений микробного роста мож ет бы ть основана и на другом
подходе— на расчете из химико-кинетических представлений време­
ни удвоения клеточного материала исходя из предположения, что
это время определяется каким-то лимитирую щ им биохимическим
процессом. При условии, что это время удается рассчитать, рост
популяции в экспоненциальной фазе будет описываться уравнением
М = М 0 -2 '/т,
(1.133)
где т — характеристическое врем я биохим ического цикла, л и м и ­
ти рую щ ее деление (врем я удвоения); М 0 — н ач ал ьн ая концент­
рац и я клеток.
Э то д о стато ч н о общ ий и ш ирокий подход, п озволяю щ и й
п р о ан ал и зи р о в ать кинетику ро ста л ю б о й клеточной популяции,
если им еется в о зм о ж н ость количественного определения т.
О чевидно, что врем я удвоения будет зависеть о т м ехан изм а
процесса и скорости отдельн ы х его стадий.
Р ассм о тр и м м ехан изм деления клетки, п ред полагая, что
действие ф ерм ен та (или ф ерм ен тной системы ), тр ан сф о р м и р у ­
ю щ его лим и ти р у ю щ и й субстрат, и процесс репликации Д Н К
являю тся сам ы м и м едленны м и стади ям и. Т ак ая ситуация часто
реализуется д л я активн о растущ их м и кр о о р ган и зм о в , постоянно
н аходящ ихся в процессе деления.
1.2.1. Простейшая схема
П р о ан али зи р у ем п ростейш ую кинетическую схему:
(1.134)
31
Н а первой стадии процесса п роисходи т тран сф орм ац и я
исходного л и м и ти рую щ его суб страта под действием ф ерм ента
(или ф ерм ентной систем ы ) Е с о б р азо в ан и е клю чевого м е т а ­
б о л и та S'. Э т о т процесс п редставляет собой обы чную ф ерм ен­
тати вн у ю реакцию , и кинетика его описы вается «классическим»
уравнением М ихаэлиса — М ентен. К лю чевой м е таб о л и т S ' уча­
ствует в процессе репликации и в других п араллельны х
процессах, п риводящ их к накоплению клеточн ого м атер и ал а
Р. П редп олагается, что ск орость синтеза Д Н К на м атри ц е
Д Н К п ро п о р ц и о н ал ьн а концентрации п ром еж уточн ого м е т а ­
б о л и та S ' и м о ж ет б ы ть о х арактери зован а кон стантой скорости
a K. П о физическому см ы слу эго м ож ет б ы ть кон станта
скорости удлинения поли м ерной цепи на одно основание.
В аж ны м такж е представляется предполож ение о то м , что
скорость биосинтеза ф ерм ен та Е и белков репликационного
ком плекса — отн оси тельно б ы стры е процессы , концентрации
этих ком пон ен тов постоянны и не входят в уравнения скорости
процесса. Л ю б о е из этих предполож ений м ож ет б ы ть неоп­
р авд ан н о, что сущ ественно и зм ен и т кинетическое описание,
о днако это не затр аги в ает принципы и зл агаем о го м етода.
К инетику процесса в рам ках кинетической схемы (1.134)
описы вает систем а уравнений
JA D N A
= a KS ;
dt
dS'
ES
dt
Ks + S
—(a K+ a )S ',
~
(1.135)
(1.136)
где A D N A
прирост Д Н К на исходной м атрице.
В условиях стац и о н ар а по п ром еж уточн ом у м етаб о л и ту
(d S '/d t = 0) им еем
1
S '= — —
0Сд +
к
FS
ос Ks + S
(1.137)
С оответствен н о
dA D N A _
dt
a„
k „ TES
a R + a Ks+ S
Н а н ач ал ьн о м этапе процесса
м ож ет б ы ть проин тегри рован о:
ADNA
в
реж им е
=
' '
(1.138)
S = S0 уравнение
(1.139)
ос„ + а
к , + S0
(при это м и сп ользован о н ачальн ое условие t = О, A D N A = 0).
Р епликационны й процесс закан чи вается, когд а количество
си н тези рован ной D N A соответствует количеству базовой , т. е.
A D N A = S , где В — количество б азовой Д Н К . В еличина В м о32
ж ет б ы ть о х ар актер и зован а разли чн ы м о б р азо м . Н апри м ер,
если ск орость процессов в клетке вы раж ается в единицах
моль
всекунду на клетку, то В м ож ет
б ы ть вы раж ено
в единицах м о л ь оснований Д Н К на клетку.
П ри t —i R, A D N A = Z? имеем
jg = _ « « _ .^ a I ESo
ot„ + a
(1.140)
Ks+ S0
ИЛИ
t r = ^ ± ^ - ^Ks+S° \
rt
k к а т FS^ 0
(1.141)
Т аки м о б р азо м , найдено врем я, н еобходим ое д л я удвоения
Д Н К . Видно, что оно зависит о т
концентрации суб страта
об р атн о п ропор ц и о н ал ьн о активности ли м и ти рую щ его ф ер­
мента.
Д и н ам и к а изм енения числа клеток в популяции с учетом
уравнения (1.141) определяется соотн ош ени ем
(1.142)
М (/) = М 0 2
т. е. удельная скорость роста культуры будет и м еть вид
..
2
ccRIn 2 ккятS0 Е
t * ~ a R+ a K s + S 0 В
..
[ ‘
1 Д-5 Ч
’
А У равнение (1.143) отр аж ает принципиальную особенность
кинетики м и кр о б н о го роста — зави си м ость удельной скорости
ро ста от концентрации ли м и ти рую щ его субстрата. П ри «насы ­
щ аю щ их» концентрациях суб страта им еем м акси м альн ую
удельную скорость
М. = - ^ Ь 1 п 2 % 5 .
olr
+ ос
(1.144)
d
И з уравнения (1.144) видно, что осн овны м и ф ак торам и ,
п ривод ящ и м и к сущ ественном у ум еньш ению ц т по сравнению
с Агкат, являю тся распределение п отоков клю чевого м етаб о л и та
[a R/( a R+ a) м о ж ет б ы ть сущ ественно м еньш е единицы, если
a / a R» l , т. е. если на репликационны й процесс идет н ебольш ая
д о л я вещ ества] и м алое количество в клетке л им ити рую щ его
ф ерм ен та по сравнению с Д Н К .
Величины Ks долж ны соо тв етств о вать константе М ихаэлиса
ли м и ти р у ю щ его ферм ента.
• Р ассм отренны й подход и полученное уравнение (1.143)
со о тветству ю т сам о м у п ростом у случаю - линейном у разви ти ю
во времени репликационного процесса. В реальн ой практике
2 З а к . 544
33
м и кр о б н о го р о ста м огут б ы ть отклон ен и я от этого закона,
определяем ы е более слож н ы м х ар ак тер о м процесса. Р асс м о т­
р и м некоторы е из этих ослож нений.
1.2.2.
Многостадийность трансформации субстрата
П р о ан али зи р у ем процесс ро ста клеточной популяции с уче­
т о м м н о го стади й н ости конверсии суб страта п од действием
ф ерм ен тной систем ы . В п ервом приближ ении это м у случаю
со о тветствует кинетическая схема
S0
Sj ^
S2 ^
... ^
S„ ^
DNA.
(1.145)
С ко р о сть отдельн ы х ф ерм ен тати вн ы х стадий зад ан а уравнением
ти па М ихаэлиса - М ентен. Кинетические коэф ф ициенты оц, ...
..., olr п р ед став л яю т собой м акси м ал ьн ы е скорости действия
ф ерм ентов са1= к 1Е 1,
а п= к пЕ„, где к и кп— каталитические
кон станты скорости.
К инетику процессов оп исы вает систем а уравнений
4ADNA
_
It
a RS„
~ К п+ S /
dS{
c(jSq
dt
ос2 S i
А-! + S0
4Sn
А"2 + S t
an-iS„-i
dt
, , s\
aRS„
K„ _ j + S„ _ ! K„ + S„
где
..., Kn— кон станты М и хаэли са соответствую щ их ф ерм ен ­
тати вны х реакций. Если поли ф ерм ен тн ая систем а функциониру­
ет в стаци он арн ы х условиях, т. е. если сп раведливы равенства
^
dt
= 0
— = 0
" " ’ dt
— = 0
’ ’" ’ d t
'
П 1471
U 1 4 /j
то им еет м есто соотнош ение
a lS0 .
К„ + S„
К 1 + S 0’
(1.1 48)
след о вательн о , ск орость репликации будет оп ределяться урав­
нением
4ADNA_
dt
a 1S0
.
Kl+S0
• Э то уравнение соответствует уравнению , полученному
ранее для д вухстадий н ого процесса. Д руги м и сл овам и , м ного34
стади й ность тран сф о рм ац и и суб страта в условиях, когда л и м и ­
тирует одна из стадий, не о траж ается на уравнении скорости
репликации.
1.2.3.
Многостадийность клеточного развития
Н аиболее общ ий случай разви ти я клетки вклю чает ряд
фаз, в которы х не происходит репликационного процесса
и клеточного деления. В кинетике роста каж дой и нди ви дуаль­
ной клетки м огут и м еть м есто периоды индукции, предш ест­
вую щ ие репликации или следую щ ие за ней. Э то вносит
определенны е изм енения в кинетику процесса.
Время удвоения клетки в этом случае определяется уравнением
*=
+
(1.150)
где т л — врем я репликации, представленное уравнением (1.141);
та — врем я нахож дения клетки в других ф азах клеточного цикла.
У чи ты вая уравнение (1.141), найдем
T = o^_t a _ A £±|o
( 1 1 51 )
Л... Ьп Ь
или
In 2
(1.152)
a R+ ot\ ^ s + S0 В
+т„
a R 7 ^кат^о Е
У равнение (1.152) м ож н о п р ео б р азо в ать к виду
к ытЕ \п 2
a R+ a
В + т Д „ тЕ
к
,
.
, + т < А .т Е а „
(1.153)
+S0
(a R + a )B
из ко то р о го следую т вы раж ения д л я кинетических п арам етров
уравнения М оно
И -= 7-
У
K S\ набл ~
|
I
" 2------
(1.154)
р
(1.155)
,
^кат V"R
(a * -fa ) В
где Ks — кон станта
срод ства суб страта
к м и кроорган и зм у.
У равнения (1.152) и (1.153) «вы рож даю тся» в более простую
зави си м ость вида (1.143) при условии
2*
35
Э то неравенство справедли во при отн оси тельн о небольш их
периодах та, т. е. если периоды времени, предш ествую щ ие
репли кац и онн ом у процессу или следую щ ие за ним , отн оси тел ь­
но м алы . Видно, что неравенство (1.157) вы полняется более
о тчетливо при больш их содерж аниях Д Н К (В) и м алы х
значениях активн ости л и м и ти рую щ его ф ерм ен та (А:кат Е). П ри
этих условиях деление клетки лим ити руется репликационны м
процессом .
М ож но п редстави ть и об ратн ую ситуацию , когда
видно из уравнений (1.154) и (1.155), в этом
реж име
in 2
й т= — ;
Т«.
к
*1 набл
_ K s B (a R + ot)
_ _ /,
Г-
(1.158)
(1 .1 59)
▲ М ак си м ал ьн ая удельн ая ск орость ро ста гиперболически
зави си т о т концентрации л и м и ти рую щ его ф ерм ен та, и в пределе
л и м ити рую щ ей стадией станови тся процесс, характери зуем ы й
п ерем енны м п ар ам етр о м та. П ри этом реж им е клетка б ольш ую
часть времени находится в состоянии п окоя, а процесс деления
п р о текает о тн оси тельн о бы стро.
И звестно, что процесс разви ти я клеток как м и кробн ого,
так и ж и вотного п роисхож дения вклю чает несколько диск­
рим инируем ы х стадий. В этой п ослед овательности тр ан сф о р ­
м аций клетки лиш ь одна стади я п ред ставляет собой истинную
репликационную стадию . О стальн ы е стадии, связанны е с и зм е­
нением м е таб о л и зм а , с вклю чением или вы клю чением опреде­
ленны х генов, со став л яю т совокуп н ость процессов, опреде­
л яю щ и х характеристическое врем я та. Б актери ал ьн ы е клетки
и м ею т высокие скорости роста и, вероятн о, в активн ой фазе
р азви ти я популяции постоянно находятся в состоянии м и тоза.
Д л я описания кинетики их роста, п о-види м ом у, наиболее
о п р ав д ан о и сп ользование уравнения (1.149). Д ля ж ивотны х
клеток в культуре ткани м и то з составл яет н еб ольш ой отрезок
врем ени их разви тия. В это м случае оп р ав д ан о описание
кинетики процесса с п ом ощ ью (1.158), (1.159). П ри этом
д оп олн и тельн ой кинетической д еш иф ровке долж ен б ы ть под-
4
вергнут п ар ам етр та, характери зую щ и й некую наиболее м ед ­
ленную м олекулярн ую тран сф орм ац и ю в процессе разви тия
клетки.
1.2.4. Влияние транспортных процессов
на кинетику роста популяции
Р ассм о тр и м законом ерн ости процесса д л я случая, когда
тран сп о р т вещ ества в клетку м ож ет вносить свой вклад
в л и м и ти рован и е процесса роста клетки. И звестно, что тр ан с­
п орт л и м и ти рую щ его суб страта, оп ределяем ы й действием перм еаз, м ож ет б ы ть отн оси тельно м едленной стадией. Ф орм альн о
эквивален тн ы м является случай, когда тр ан сп о р т л и м и ти рован
внеш недиф ф узионны м переносом субстрата. П ростей ш ая кине­
тическая схема им еет вид
S0— * S l - ^ S 2 ^ -* D N A ,
(1.160)
где vT— скорость тран сп ортн ы х процессов.
К инетику процесса описы вает систем а диф ф еренциальны х
уравнений
4S, _
dt
.
_ к ^
т
кг
(1.161)
S ,’
4 S 2 _ kKil ES t
dt ~ K l + S 1
dA D N A _
dt
(1.162)
* 2+ s 2 ’
a*
(1.163)
^ 2 + S2
П редп олагается, что скорость тран сп ортн ы х процессов м ож ет
линейно зависеть о т концентрации субстрата. Э то в д о с та ­
точной степени справедли во д л я л и м и ти рован и я процесса
внеш недиф ф узионны м переносом субстрата (С. Д. В арф олом е­
ев, Г.Ф . С удьина, 1980):
vT—k S 0 .
(1.164)
Если тр ан сп о р т вещ ества определяется действием белков-переносчиков (перм еаз), то скорость процесса м ож ет и м еть вид
уравнения М ихаэлиса
М ентен
I
(|165)
где V — м акси м ал ьн ая скорость тран сп орта; К — эффективная
субстратная кон станта. vT м ож ет б ы ть вы раж ена в м олях
суб страта на клетку в единицу времени.
Если в клетке им еет м есто стаци он арн ое состояние по
пром еж уточн ы м су б стратам S! и S2, т. е. если ~
= 0,
= 0, то
37
</ADNA
— dt
= vrl
/1 ,/ССЧ
(1-166)
следовательн о, скорость ро ста п оли м ерной цепи Д Н К
лими­
ти р о ван а скоростью тран сп о р та суб страта. В этом случае
удельная скорость роста популяции д олж н а б ы ть представлена
уравнением
Ц = ^1п2,
(1.167)
где В — количество Д Н К , вы раж енное числом м олей оснований
на клетку.
Т аким о б р азо м , удельная скорость ро ста клеточной куль­
туры м ож ет и м еть вид
Ц= ^ 1 п 2
(1.168)
D
[следствие уравнения (1.164)] или
“-ряяв
"|69)
[следствие уравнения (1.165)].
Т р ан сп о р т вещ ества в клетку м ож ет
и носить равновесны й характер. Э то м у
нетическая схема
б ы ть бы стры м
соответствую т ки­
S0 i s i _ E , S 2 — -”^-> D N A
(1.170)
и систем а уравнений
* = S X/S 0 ;
4 S 2 _ /c„TESj
dt
K s + S,
(1.171)
ocRS 2;
(1.172)
rfADN A
dt
- a « Sf
В реж им е бы строго и сп ользован и я S 2 (а велико) (1/а)
d S 2/ d t c S 2 им еет м есто стац и он арн ое состояние по S2.
С оответствен н о
rfA D N A _ к „ E St _ k m E K S 0
dt
У дельн ая ск орость
уравнением
роста
Ks + S ,
K s+ K S 0 '
популяции
в это м
случае дается
Ф Видно, что наличие бы строго равновесного тр ан сп о р тн о ­
го процесса о казы вает влияние на н аб лю д аем ую константу
сродства м и к р о о р ган и зм а к субстрату и не сказы вается на
м акси м ал ьн о й удельной скорости роста популяции.
1.2.5. Старение клетки в процессе роста
В есьм а важ н ы е явл ен и я, к о т о р ы е н а б л ю д а ю т с я в процессе
р о ста и н д и в и д у ал ь н о й кл етк и , св я за н ы с п р о ц ессам и ста р ен и я
или и н а к ти ва ц и и кл ю ч евы х ф ер м ен тн ы х си стем . И н ак ти в ац и и
м о ж ет п о д в е р г а т ь с я как р еп л и к ати в н ы й ком п л ек с, так и л и ­
м и ти р у ю щ и й ф ер м ен т. К ак т о т , т а к и д р у го й п роцесс д о л ж н ы
н ай ти о тр аж ен и е в ки н ети ке р о с т а м и к р о б н о й п оп уляц и и .
Р асс м о т р и м о б щ и й случай ста р ен и я кл етк и , к о г д а на д и н а м и ­
ку п р о ц есса н а к л а д ы в а е т с я к и н ети ка неспециф ических и накти вац и о н н ы х п р о ц ессо в, в ы зы в аю щ и х п о тер ю р еп л и кац и о н н о го п о тен ц и ал а и 'и н ак ти в ац и ю л и м и т и р у ю щ е го ф ер м ен та.
Т ак о го р о д а явл ен и я м о гу т и м еть м е сто , н ап р и м ер , при
«старен ии » м е м б р а н кл етк и , и н ак ти вац и и энергети чески х
процессов.
П ростей ш ую кинетическую схему, оп исы ваю щ ую сущ ность
таких процессов, м о ж н о п ред стави ть в виде
Е
S
DNA
S'
(1.175)
х
X
где S — исходны й лим и ти рую щ и й субстрат; S ' — п ром еж уточ ­
ный м етаб о ли т, л им ити рую щ и й репликацию ; Е — л и м и ти р у ю ­
щ ий ф ерм ент; Ек — ф ерм енты реп ли кати вного ком плекса; Е,,
Е- — инакти ви рован н ы е ф орм ы ф ерм ен та и репликативного
ком плекса. П редп олагается, что и нактивационны е процессы
и м ею т экспоненциальную природу и характери зую тся общ и м
кинетическим п ар ам етр о м X.
К инетику процессов будет оп исы вать систем а уравнений
dA
DNA
(1.176)
(1.177)
« « ( ' ) = « * 0е
-
Е ( 0 = Е ое " 1‘.
(1.178)
(1.179)
39
Н а н ачальн ом этап е разви ти я процесса в реж им е п остоян ства
концентрации исходного суб страта (S = S0) и стаци он арн ости
по S' им еет м есто соотнош ение
S ' - r ЛT0 T' +T о2С оответствен н о кинетику роста цепи Д Н К
уравнение
< M D N A _ * „ TE0S0
~dt
с - 180*
будет оп исы вать
,
•
(1Л81)
О бозн ачим
(1.182)
И нтегри рован ие (1.181) при условии ? = О, A D N A = 0 п риводит
к функции
A D N A (/) = ^ ( 1
(1.183)
Ф о р м ал ьн о схеме (1.175) эквивален тн а схем а с инактивацией
то л ьк о лиш ь реп ли кати вного ком плекса Е к , если «отток»
п ром еж уточн ого субстрата S' на репликационны й процесс
отн оси тельн о м ал:
s
S '< c
Q ^D N A
(1.184)
H r --------*■ Е (
П РИ а к0 ^ а уравнения, оп исы ваю щ ие кинетику, фактически
эквивалентны уравнениям (1.176)— (1.179), однако вм есто м н о ­
ж ителя 1/о£я0 в уравнении (1.180) появляется м н ож и тель 1/а, т. е.
Q' _ 1 *«aiES0
(1Л85>
/t
и соответствен но в уравнении (1.181) — м н ож и тел ь а к /а :
rfADNA
dt
М г п е Vа /
П ри конечном росте п оли м ерной цепи, соответствую щ ей
Д н к клетки, уравнение (1.183) п озвол яет оп редели ть врем я
реп ли кац и онн ого процесса тк . Если прин ять, что при t = т„
A D N A = B, то имеем
В = х ( ' - е' Н
(1.186)
И з это го уравнения следует
t j t = - |l n f l - — Y
X
40
\
v0
(1.187)
С оответственно
X In 2
In 2
( 1. 1 8 8 )
XB
In
»o
К ак функция начальн ой концентрации суб страта уравнение
удельной скорости р о ста будет и м еть вид
Ц =
г
In
П ри м алы х значениях X, когда
т
ХВ
хв
^катЕ \
к,
1 + - М « : 1, логари ф м и чес­
Sq
кий зн ам ен ател ь уравнения (1.189) р азл агается
сходящ ийся ряд, что п риводит к функции
Мт-.о —кк
(1-189)
(i+ а д )
в
бы стро
(1.190)
Э та функция соответствует уравнению удельной скорости роста
типа М он о (см. (1.143)].
Внешне функция (1.189) м а л о похож а на «классическое»
уравнение М оно, о днако графически эти функции весьм а
близки. Э то созд ает определенны е трудности д л я дискри м и ­
нации двух м ехан изм ов на основе конкретны х эксперим ен­
тальн ы х данны х. Н а рис. 1.3, а приведены рассчитанны е
Рис. 1.3. Зависимость удельной скорости роста клеточной популяции от
концентрации субстрата в условиях проявления клеточного старения (а);
те же данные в цветных обратных координатах (б):
Функции рассчи тан ы по у р авн ен и ю (1.189) при и сп о л ьзо ван и и сл еду ю щ их п а р а м е т ­
ров: ЛГ,= 1 • 10 1 М; В/Х „т, Е = 0,66 ч
Значения X дан ы ц и ф р ам и н а кривы х (ч )
41
з н а ч е н и я ц как функции концентрации суб страта при различны х
значениях кон стан ты скорости и нактивации X. Д л я сравнения
на это м же рисунке приведена кри вая д л я случая не­
ослож ненного «старением» ро ста (кривая с >. = 0). Видно,
что удельная скорость ро ста культуры д л я случая «старения»
клетки в процессе роста такж е «насы щ аем а» субстратом :
Л П ринципиальное отличие этих двух функций вы является при
ан али зе их поведения в условиях м ал ы х концентраций субстрата.
П ри старении клеток в процессе роста д олж н а сущ ествовать
пороговая минимальная концентрация субстрата, ниже которой
м икробны й рост невозможен. И з уравнения (1.195) следует условие
(1.192)
из к о то р о го получаем
(1.193)
Видно, что чем б ольш е кон стан та скорости инактивации X,
тем вы ш е значение SKp.
В м и кр о б и о ло ги и часты случаи, ко гд а рост клеток весьм а
чувствителен к концентрации л и м и ти рую щ его суб страта; рост
культуры п олн остью п рекращ ается при переходе к низким его
кон ц ен трац иям . Р азви тая кинетическая м одель, бази рую щ аяся
на п редставлении о «старении» клеточны х м ехан и зм ов в процес­
се ро ста популяции, м ож ет служ ить основой д л я объяснения
феном енов этой группы . Ф изический см ы сл критических эффек­
то в заклю чается в т о м , что при м алы х концентрациях суб страта
репликационны й процесс идет н астол ько м едленно, что инактивационны е процессы успеваю т б л о к и р о в ать рост клетки.
О тли чи ть рост культуры со старен ием о т неослож ненного
ро ста м ож н о на основе изучения зависим ости удельной ско­
рости р о ста о т концентрации и сходного суб страта. В случае
зам етн ы х эф ф ектов инактивации клю чевы х элем ен тов клеточн о­
го деления кинетические данны е не долж ны ли н еари зи роваться
в о б р атн ы х ко о р д и н атах (рис. 1.3,6). В озм ож н ость ди скри м и н а­
ции м ехан и зм ов в зн ачительн ой степени зави си т от точности
эксперим ента, в первую очередь от точности определения
удельны х скоростей ро ста популяции.
Д л я определения кинетических п ар ам етр о в роста культуры
из эксперим ентальны х данны х м ож н о в осп ол ьзоваться прибли42
ц ен ны м и уравнениям и, осн ован ны м и на разлож ени и в ряд
логариф м ического члена уравнения (1.189). П ри концентрациях
субстрата вы ш е критической разлож ение в ряд логари ф м и ческо­
го члена уравнения (1.189) и и спользование первых двух
членов п р и во д ят к уравнению
1п 2
ц = -
хв
/
2 Х , а1 Е
у
К.
Х „ ТЕ
+
к,
+
(1.194)
S 0
Э то уравнение справедли во при невы сокой степени нелинейнос­
ти эксперим ентальны х данны х в коорд и н атах 1/р от \ / S 0 .
У равнение (1.194) м ож ет б ы ть записано в ф орм е
К,
1+
X In 2
So
1 +
где р т =
К,
1 +
Цт
. (1.195)
2Ц т
Х „т Е 1п 2
В
П ри м алы х значениях 1/S0 (больш ие концентрации суб стра­
та) м ож ет б ы ть сделана оценка Ks и рт на основе и спользования
асим птотической п р ям ой , оп исы ваем ой уравнением
1=±+*!±.
В
Цт
(1.196)
Цт S0 '
п р ям ая в к о о р д и н атах 1/р от 1/S0, и м ею щ ая вид
касательной к точке 1/|дт . О ценка Ks на основе этой п рям ой
позволяет рассчитать функцию Ф при л ю б о й концентрации
субстрата:
Э то
Ф =1+£.
(1.197)
С учетом это го уравнение (1.195) м ож ет б ы ть тр ан сф о р м и р о ­
вано к виду
1 _
цф
1 + Х1п2
Цт
(1.198)
2ц£ '
▲ В ко о р д и н атах 1/р Ф о т Ф эксп ери м ен тальн ы е данны е
д олж ны б ы ть представлены п рям ой линией, п арам етры которой
д аю т значения р т и X.
1.2.6. Кинетика роста микробной клетки
с ускорением
П ри создан и и вы ш е рассм отренн ы х м оделей клеточного
роста исходили из представления о линейном характере
репликационного процесса во времени или о его зам едлении,
43
связан н о м со «старением » клеточны х структур и с потерей
их ф ункциональной активности. О дн ако в л и тературе обсуж ­
д аю тся возм о ж н о сти нелинейного ро ста клетки и нелинейного
процесса репликации. Р ассм атр и в аю тся закон ом ерн ости экс­
поненциального или квад рати ч н ого р о ста (JI. Н. Д р о зд о в -Т и ­
хом и ров, А. В. Д о р о д н о е, 1984). П редставляет интерес изучение
кинетических м оделей так о го р о д а процессов.
У величение скорости репликационного процесса возм ож н о,
если скорость п оследую щ ей репликации зави си т от белка,
«записанного» ранее, т. е. для последую щ ей репликации необхо­
д и м п редварительн ы й биосинтез белкового ком понента. Р ас­
см о тр и м несколько м оделей так о го рода.
ДНК-зависимая стадия конверсии лимитирующего субстрата.
К инетическая схем а процесса м о ж ет б ы ть п редставлен а в виде
s
adna
s-<r
V
.
о-1")
1
“V ^ N A
Ф ер м ен тати вн ая стади я об р азо в ан и я п ром еж уточн ого м е т а б о ­
л и т а м о ж ет б ы ть резко ускорена за счет доп ол н и тел ьн ого
биосинтеза ф ерм ен та, а это т биосинтетический процесс, в
свою
очередь,
определяется
п ри ростом
ДНК.
С истему
уравнений, описы ваю щ их кинетику процесса, м ож но п ред­
стави ть в виде
^ f ^
dA S'
= a RS ';
/cA D N A S 0
,
(1 .200 )
.c,
где кон станта скорости к им еет эф ф ективны й характер и вкл ю ­
чает некую
постоянную начальн ую кон ц ен трац ию л и м и ти ­
рую щ его ф ерм ента. В стац и он арн ом состоянии по п ром еж уточ ­
ном у м етаб о ли ту (d S '/d t = 0) им еем
S '_
ь -(JC.+S.X . .+ « ) ’
(1 '202)
^ 7 ^ “ —
I^rA D N A .
dt
<xR + (x K s+ S0
(1 .2 0 3 )
Видно, что скорость п ри роста D N A линейно зависит от
количества реплицированной нуклеиновой кислоты .
ДНК-зависимый репликационнмй процесс. Если скорость
репликации зави си т о т белкового ком пон ен та, синтез которого
зак о ди р о ван в Д Н К , и для н о р м ал ь н о го разви тия процесса
н еобходим п редварительны й синтез одного из ком понентов
р еп ли кац и онн ого ком плекса, то кинетические законом ерн ости
44
процесса
тельно,
будут аналогичны
■
рассм отрен н ы м
</ADNa = o^ S ' a
?
dn
выш е. Д ей стви ­
A;
(1.204)
= ^ - ( « + « k A D N A ) S ',
(1.205)
или (при d S '/d t = 0)
I
5 , -
м
з
.
)
(
^
а
Щ
:
4ADNA _
at'„ADNAKKalES0
dt
(A:s + S0)(a + a'RADNA)'
< | М
6
>
(1.207)
При a'flA D N A : » а уравнение скорости репликации приним ает вид
tMDNA _ ^ . alES0
dt
K s+ S a
(1.208)
т. e. будет со о тв етств о вать известном у случаю линейного роста.
О днако если a ^ a ^ A D N A , то
4 A D N A
dt
_
O r ^ к аг^ О
Д
(1.209)
a Ks + S„
т. e. им еет м есто зави си м ость скорости п ри роста D N A от
количества A D N A .
У равнения типа (1.203) и (1.209) п редставляю т собой урав­
нения с разделяю щ им ися перем енны ми и м огут б ы ть легко
проинтегрированы . Э ти уравнения м ож но записать в ф орм е
d A D N A _ ^ ( s o) A D N A ,
Л
где A (S0) =
и
gS°
a ^ s-t-S0
A (S0) = —^
ое + ад
[
(1.210)
[в случае уравнения (1.209)]
в
случае уравнения (1.203)]
И нтегри рован ие (1.210) в предполож ении, что при / = 0 A D N A =
= A D N A 0 , т. е. в начальн ы й м о м ен т времени в системе
имеется часть реп ли кац и рованн ой D N A , приводит к уравнению
j
4D N A =
(§ v
AD NA 0
1 07
21
К
'
Если это условие не вы полняется, то уравнение (1.211) теряет
см ы сл и процесс репликации не м ож ет идти. У равнение (1.211)
п оказы вает, что репликационны й процесс п ротекает экспонен­
ц иальн о во времени:
45
A D N A (?) = A D N A 0e'4<so,‘.
(1.212)
Н а основе это го уравнения м ож но рассчитать врем я репликации
т при условии, что при / —т прирост вновь си нтезированной
Д Н К A D N A д о сти гает определенного значения, равн ого
D N A „, т. е.
1 ,,
Х~
DNA„
П Д DNA0’
,, _,
(1.213)
и соответствен но при исп ользован и и связи меж ду временем
репликации и удельной скоростью ро ста популяции м ож но
рассчитать удельную скорость роста:
0 .2 ,4 )
ПЛ DNA0
Видно, что уравнение удельной скорости ро ста как функция
концентрации су б страта им еет «классический» гиперболический
вид, а м акси м ал ьн ая удельн ая ск орость ро ста вклю чает в себя
зави си м о сть о т количества «затравки», реп ли ци рован ной в н а­
чальн ы й м о м ен т врем ени D N A .
ДНК-зависимая как ферментативная, так и репликационная
стадии. В случае зави си м ости о т A D N A скорости как ф ерм ен­
тати вн о й , так и репликационной стади и си стем а характери зует­
ся квад р ати ч н ы м х арактером уравнения скорости:
(1.215)
Л
DNA
Д ля д ан н о й кинетической схемы систем а уравнений им еет вид
^ H ^ = a k S 'A D N A ;
|
= ^
A
_
(t(, 4 D N A + a ) s , i
где к им еет т о т же см ы сл,
С оответствен н о (при d S '/d t = 0)
S '—
(1.216)
что
и
вуравнении
fcSpA D N A
( K s + S 0) ( oi+<x ' rA D N A )
(1 2 1 7 )
(1.201).
9181
{ ■ l6)
или при a » a l , A D N A
S ' — ^ S 0A D N A
ь
( I '2 I 9 )
rfADNA_aR
dt
46
.
A:S0
X. + SJ i D N A >2 -
<U 2 0 >
У равнение (1.220) п редставляет собой диф ф еренциальное у р ав ­
нение с р азд ел яю щ и м и ся перем енны м и и м ож ет б ы ть проин тег­
р и ровано. Если об означи ть
kS!L. = A (S0),
(1.221)
® ^s + So
то им еем
<L222>
dA D N A
И нтегри рован ие при и сп ользован и и н ач альн ого условия t = 0,
A D N A = A D N A 0 д ает уравнение
— !-------------!— = H (S 0R
ADNA0
A DNA,
(1.223)
v 0/
v
где A D N A , — текущ ее значение A D N A при времени t.
К оличество реплицированной Д Н К резко увеличивается во
времени:
A DNA, =
'
А PNA°
1 —A (S0)A D N A 0 f
.
(1.224)
К ак следует из это го уравнения, с ростом t сущ ественно
увеличивается скорость репликации.
Если принять, что репликация заверш ается за время,
соответствую щ ее полн ом у синтезу D N A клетки, т. е. при / = т,
A D N A = D N A „, с учетом уравнения (1.223) находим
т = ( — !----------- lуА DN A0
) - L
(1.225)
D N A „ y ^ (S 0)
ИЛИ
ц = — = ___jn2^ (s° ) [
(1.226)
A D N A 0 _ DNA„
Если
количество
«затравки»
количества, т. е. D N A , и ,
сущ ественно
A DNA0
:»
м еньш е
общ его
1 , то
DNA„
p = /l( S 0)ln 2 A D N A 0 .
(1.227)
У дельн ая скорость ро ста зависит по М оно о т концентрации
ли м и ти рую щ его суб страта, а м акси м ал ьн ая удельная скорость
линейно связанц с количеством «затравки»:
pm= ^ A D N A 0.
ос
(1.228)
• Рассм отренны е кинетические м одели оп исы ваю т феномен
нелинейного ро ста клетки или феномен нелинейной репликации.
У равнения удельной скорости роста популяции, вы текаю щ ие
47
из этих м оделей, д аю т зави си м ости скорости роста от
концентрации ли м и ти рую щ его суб страта. П ри н ци п иальн о важ ­
ной особенностью уравнений нелинейного р о ста является
вклю чение в качестве п ар ам етр а количества «считанной» Д Н К
в начальны й м о м ен т времени A D N A 0 . П роцесс репликации
начинает идти с ускорением, если в клетке им еется определен­
ное количество реп ли ци рован ного н аследственного м атери ала.
Т аки м о б р азо м , в д ан н о м разд ел е рассм отрены подходы
к п остроению кинетических уравнений р о ста популяции при
различны х предполож ениях о м олекулярн ы х м ехан изм ах кле­
точны х процессов. Р азвиты е подходы п о зво л я т осущ ествить
переход o r «микроскопических» п редставлений о м еханизм ах
процессов к «м акроскопическим » явлениям роста клеточны х
п опуляций, и сследуем ы м эксперим ентально.
1.3. П РЕ Д Е Л Ы С К О РО С Т И РОСТА
К У Л Ь Т У Р М И К Р О О Р Г А Н И ЗМ О В
П р едставляет интерес ан ал и з числовы х значений п арам етров
цт и Ks, входящ их в уравнение скорости роста м и к р о о р ган и з­
мов. Значение ц,„ характери зует врем я увеличения популяции
м и кр о о р ган и зм о в в е раз и м ож ет б ы ть сопоставлено со
врем енем удвоения каж дой клетки:
т 1/2 =
0,69/рш.
(1.229)
В р ам ках всех рассм отренн ы х м оделей п ар ам етр K s связан
с кон стантой М ихаэлиса наиболее м едленно раб о таю щ его
ф ерм ента, осущ ествляю щ его конверсию л и м и ти рую щ его суб­
стр ата.
А в то р ам и по л и тер ату р н ы м д ан н ы м бы л составлен пул
значений цт и K s д л я разли чн ы х популяций м и кроорган и зм ов.
Всего бы л о и сп ользован о окол о 50 значений д л я каж д ого из
п ар ам етр о в, характеризую щ их рост культур на ли м и ти рую щ ем
субстрате. Значения цт найденны х величин в арьи ровал и в д и а­
пазоне К Г 2 — К Г 5с ~ \ значения А",
в диап азон е 10-2 —
- К Г 8 М.
Значения п ар ам етр о в процесса удобн о х ар ак тер и зо в ать фу­
нкцией п лотности распределения. Д л я получения представлений
о распределении величины весь пул найденны х значений бы л
р азб и т на группы с прибли зительн о один аковы м и значениям и
Ks в пределах од ного порядка. Д алее б ы ло п одсчитано число
значений в каж дой группе и полученная величина разделена
на общ ее число значений в пуле. Т ем сам ы м найдена
в ероятн ость обнаруж ения величин с зад ан н ы м значением
кон станты Ks.
Н а рис. 1.4 приведены полученны е значения п лотности
распределения как функции л о гар и ф м а значений Ks. К ривая
48
распределения близка к н о р м ал ь ­
ном у логари ф м и ческом у распре­
делению . Э та функция д ает пред­
ставление о вероятн остны х значе­
ниях K s д л я л ю б о го м и к р о о р га­
н и зм а и суб страта, а такж е п о­
звол яет подсчи тать вероятн ость
нахож дения величины в зад ан н ом
интервале значений. И з рисунка
видно, что с вер о ятн о стью около
0,5 н аугад взяты й ор ган и зм бу­
д ет х ар актер и зо ваться констан­
той сродства с ли м и ти рую щ и м
суб стр ато м , равн ой 10“ 5 М .
▲ Д ля сравнения на ЭТОМ же
^
'
Рис- 1-4. П лотность распределения
кинетических характеристик ферментативных реакции (А- ,, Км в
М) и кинетических параметров роста микробных популяций (цт , к у ­
рисунке
Приведены
ПЛОТНОСТИ
распределения кон стант М ихаэлиса д л я ф ерм ен тати вн ы х реакв с 1)
ций (С. Д. В арф олом еев, С. В. Зайцев, 1982). Видно, что п л о т­
ности распределения кон стант М ихаэлиса ф ерм ентативны х
процессов и кон стант срод ства суб стратов к м и кр о о р ган и зм ам
в зн ачительной степени п ерекры ваю тся.
▲ О собы й интерес п редставляет ан ал и з численных значений
м акси м альн ы х удельны х скоростей ро ста м и кроорган и зм ов.
И з рис. 1.4 видно, что значения дт л еж ат вокруг среднего
значения цт ср= 10” 4с _ 1 . Т аки м о б р азо м , среднее значение
времени удвоения м и кробн ы х клеток составл яет окол о 2 ч.
Э то наиболее вероятн ое значение д л я н аугад взятой популяции
м и кр о о р ган и зм о в. В вы борке практически о тсутствую т м и к­
р о о р ган и зм ы , характери зуем ы е цт вы ш е 10” 2 и ниже 10” 6с - 1 .
Н иж ний предел скорости роста культур м и кроорган и зм ов
определяется, по-види м ом у, м ал о й ж и зн есп особн остью популя­
ции клеток, им ею щ их отн оси тельно низкие скорости роста.
В озникает вопрос: каковы физические м ехан изм ы , огран и ­
чиваю щ ие верхний предел скорости р о ста м и кроорган и зм ов?
А бсолю тн ы й предел в скоростях удвоения клеток определяется
скор о стям и синтеза п олим ерны х м олекул. Н ап ри м ер, синтез
м олекулы Д Н К зан и м ает отрезок времени, п ревы ш аю щ ий
15 мин. П р о и л л ю стр и руем это п росты м расчетом . М олекула
Д Н К с М г~ 1 0 7 содерж ит ~ 1 0 5 связей, ф ерм ен тати вн о о б р а ­
зуем ы х в процессе ее синтеза. К ак известно, наиболее харак­
терны е числа о б о р о то в ф ерм ен тов равны окол о 102с ” 1 (рис.
1.4), т. е. о д н а связь образуется за 10” 2 с. Если д л я синтеза
п оли м ера н еобходи м ы м является последовательны й рост п оли ­
м ерной цепи, то это т процесс м ож ет заверш иться л иш ь за 103 с.
Т ак и м о б р азо м , значения м акси м альн ы х удельны х скоростей
ро ста м и кр о о р ган и зм о в , соответствую щ ие значениям 2,0—
49
2,5 ч
являю тся, п о-видим ом у, аб сол ю тн ы м и предельны м и
значениям и скорости роста клеток м и кроорган и зм ов.
B этой главе бы ли рассм отрены кинетические м одели
роста популяции м и кр о о р ган и зм о в для вы явлени я связи
ф меж ду удельной скоростью роста популяции и концент­
рацией л и м и ти рую щ его суб страта. Д ля этих целей м ож ет
б ы ть и сп ользован о д ва подхода. П ервы й подход осн ован на
представлении о росте м и кробн ой популяции как ав то к атал и ти ческом процессе, идущ ем с накоплением каталитических цент­
ров, на которы х п ротекаю т биохимические процессы . Во
вто р о м подходе рассчиты вается врем я удвоения клеточного
м атер и ал а с учетом того, что это врем я определяется какимлибо биохимическим процессом , в частности врем енем биосин­
теза Д Н К . О ба подхода п риводят к ф ункциональной зависи­
м ости удельной скорости роста от концентрации л и м и ти р у ­
ю щ его субстрата.
К инетическое м одели ровани е, как всякий м одельны й подход,
п о зво л яет п р о ан ал и зи р о в ать различны е возм ож н ы е м ехан изм ы
процесса при п ослед овательном усложнении схемы процесса.
Так, бы ли р ассм отрены п ростей ш ая схем а, схем а с равн овесн ы м
«насы щ ением » клетки суб стратом , схема с су б стр ато м , н еоб ра­
ти м о тр ан сф о р м и рую щ и м ся в клетке. П оследние две схемы
д аю т зави си м ость удельной скорости роста о т концентрации
су б стр ата типа уравнения М оно. В ообщ е м ож н о зап и сать
бесчисленное число кинетических схем, реш ения которы х п риво­
д ят к зависим ости удельной скорости роста от концентрации
су б стр ата типа уравнения М оно или М ихаэлиса
М ентен.
Н еобход и м ы м общ и м элем ен том всех этих схем является по
крайней мере д вухстадий н ость процесса. Т аки м о б р азо м ,
уравнение М оно
отраж ение м н огостади й н ости тр ан сф о р м а­
ции суб страта, при это м первая стади я процесса является
субстрат-зави си м ой , скорость второй стади и не зави си т от
концентрации субстрата.
П ри ан али зе кинетических схем весьм а полезны упрощ енны е
м етоды ан ал и за, прежде всего м е то д м а л о го п ар ам етр а перед
п роизводной. Э то т п одход п озвол яет п олучать приближ енны е
реш ения д л я кинетических схем л ю б о й степени слож ности.
В частности, в этой главе рассм отрен а кинетическая схема
с участием п + 1 различны х стадий процесса роста, п роан ал и зи ­
р ован а схем а процесса, основанная на введении в м еханизм
р о ста степени репликации, тран сф орм ац и и и трансляции.
Весьма п родуктивны м д л я построения кинетических моделей
и д л я их ан ал и за является подход, основанны й на расчете
времени биохим ического цикла, л и м и ти рую щ его клеточное
деление. Рассм отрены кинетические м одели , базирую щ иеся на
п редполож ении, что синтез Д Н К м ож ет п р ед ставл ять л и м и ти ­
Y
50
рую щ ую стади ю клеточн ого деления. В ыведенное уравнение
д ля удельной скорости ро ста п оказы вает, что эта величина
определяется концентрацией суб страта, каталитической кон ­
стантой скорости действия ли м и ти рую щ его ф ерм ен та и о т ­
нош ением количеств ли м и ти рую щ его ф ерм ен та и Д Н К .
П олучены уравнения, учиты ваю щ ие м н огостади й н ость тр ан ­
сф орм ац ии су б стр ата и м н огостади й н ость клеточн ого развития.
П ри нципиально важ ны м и п олезн ы м при ан али зе кон крет­
ных эксперим ентальны х данны х является и сп ользование кинети­
ческой м одели , учиты ваю щ ей «старение» клетки в процессе
ро ста. П р едп о л агается, что «старение» клеточн ого ап п ар ата
вы раж ается в инактивации клеточны х ф ерм ентны х систем.
У равнение д л я удельной скорости ро ста ф ункционально м а л о
похоже на «классическое» уравнение М он о, однако графически
весьм а к нему близко. В ажны й вы вод состоит в то м , что
в систем ах со «старением » долж ны и м еть м есто критические
явления при низких концентрациях суб страта. Р ост культуры
м о ж ет п роходи ть то л ьк о при концентрации суб страта вы ш е
критического п орога. У казани ем на то, что рост исследуем ой
культуры клеток п ротекает в рам ках м ехан изм а, отраж аю щ его
«старение» клеток в процессе роста, м ож ет служ ить нелиней­
н ость зави си м ости скорости роста о т концентрации суб страта
в о братн ы х коорд и натах. С корость ро ста резко падает при
низких концентрациях суб страта, соответствен но в обратн ы х
ко о р д и н атах 1/ц резко возрастает.
И сследованы такж е м одели роста, в которы х скорость
деления клеток зависит и о т ф ак то р а роста, п редварительны й
синтез последнего необходим д л я роста клеточной популяции.
Э то так н азы ваем ы е м одели роста м и кробн ой клетки с ускоре­
нием. О собенностью р о ста в этих условиях является вклю чение
в качестве п ар ам етр а в уравнение роста количества п ред­
вар и тел ьн о «считанной» Д Н К . В отсутствие так о го п ред ва­
ри тел ьн о го процесса, т. е. внеклеточного или внутриклеточного
ф ак то р а роста, рост популяции вообщ е п ротекать не м ож ет.
В аж ны ми п ред ставляю тся оценки «типичных» значений
кинетических п ар ам етр о в м икроби ологи ческого роста — значе­
ний м акси м ал ьн о й удельной скорости ро ста и кон станты
срод ства к су б стр атам . Значения Ks д л я м и кроб н ого роста
по своем у распределению весьм а близки к кон стан там М ихаэлиса
ф ерм ентативны х
реакций.
Типичное
значение
цт = 10~4 с , т. е. среднее значение врем ени удвоения м и к р о б ­
ных клеток составляет окол о 2 ч.
51
ГЛАВА 2
Э К С П О Н Е Н Ц И А Л Ь Н А Я ФАЗА
РОСТА К У Л Ь Т У Р М И К РО О РГА Н И ЗМ О В
В условиях п о стоян ства концентраций суб стратов и других
ком пон ен тов, необходим ы х д л я ро ста м и кр о о р ган и зм о в , п ро­
цесс увеличения числа клеток им еет автокатали тический харак­
тер. О сновны е законом ерн ости роста популяций в этом реж име
рассм отрены в гл. I. А втокатал и ти ч еская п рирод а процесса
озн ачает, что скорость накопления м и кробн ой биом ассы (ско­
рость накопления клеток) п рям о п роп орц и он ал ьн а числу клеток
в системе. К оличество биом ассы м ож ет вы раж аться в р азл и ч ­
ных единицах (в r /л , в числе клеток в единице о б ъем а и др.).
Р ассм о тр и м зако н о м ерн ости разви ти я м и кробн ы х популяций
в экспоненциальной ф азе роста.
2.1 О П Р Е Д Е Л Е Н И Е П А Р А М Е Т РО В
РОСТА К У Л ЬТУ РЫ
У равнение скорости роста при постоянстве концентрации
суб страта представляет собой диф ф еренциальное уравнение
первого порядка с разд ел яю щ и м и ся перем енны м и и м ож ет
б ы ть легко п роин тегри рован о:
M (f) = N 0e M',
(2. 1)
где N 0 — количество биом ассы , число клеток в н ачальны й
м о м ен т времени. В полулогариф м ических коорд и н атах это
уравнение им еет вид
ln M (/) = ln N 0 + p/.
(2 .2 )
В качестве эксп ери м ен тальн ого п рим ера м ож н о рассм отреть
данны е, приведенны е на рис. 2.1, о, на ко то р о м представлена
д и н ам и к а изм енения числа клеток в процессе ро ста м етан образую щ ей бактерии Methanolobus tindaris. Видно, что число клеток
экспоненциально увеличивается во времени. Д ан ны е рис. 2.1, а
д о стато ч н о хорош о лин еари зую тся в коорд и н атах уравнения
(2.2) в течение первых 20 ч процесса. Значение ц, найденное из
линейного участка кривой рис. 2.1,6, равн о 0,28 ч ’ 1.
М ож но п редлож ить и другую процедуру определения р.
Э то так н азы ваем ы й разностный метод анализа. И сходя из
уравнения (2.2) в данны й, конкретны й, м о м ен т времени г;
справедли во равенство
ln M ; = ln N 0 + p /;,
52
(2.3)
во врем я, соответствую щ ее
периоду tj,
InM j— lnN o + pf;. (2.4)
Если
вычесть
уравнение
(2.4) из (2.3), то получаем
(2.5)
Т аки м о б р азо м , если из­
о б р ази ть графически урав­ Рис. 2.1. Кривая роста культуры М. tindaris на среде с метанолом при 37° С,
нение (2.5) в коэфф ициентах pH 7,0 (а); те же данные в полулогариф­
1п(М,-/М;); (/,- —tj) при усло­ мических координатах (6 ) (К . О. Stetter,
G. Caad, 1983)
вии, что кинетика процесса
описы вается экспоненциальной функцией (2.1), то м ож но п о­
лучить прям ую , тангенс угла н аклон а которой дает значение
удельной скорости роста р. Более подробн о и в более общ ем
виде разн остн ы й м ето д анализируется в гл. 3.
В аж ны м эксперим ентальны м ф актом , обнаруж енны м и ис­
след ован н ы м на б о л ьш о м числе прим еров, является зависи­
м ость удельной скорости роста м и кроорган и зм ов от кон ц ен тра­
ции суб страта, количество кото р о го лим и ти рует скорость роста
культур м и кр о о р ган и зм а (1.3).
У равнение (1.3) отраж ает участие л и м и ти рую щ его ф ерм ента
в росте м икробн ой популяции. П оэтом у при ан али зе разви тия
м икробны х культур в условиях экспоненциальной ф азы роста
прим еним д о стато ч н о хорош о разр аб о тан н ы й набор м етодов
д л я описания стаци он арн ой кинетики ф ерм ентативны х реакций
(М . Д иксон, Э. У эбб, 1966; И. В. Березин, С. Д. В арф оломеев,
1979; С. Д . В арф олом еев, С. В. Зайцев, 1982).
М етод ы ан ал и за зависим ости удельной скорости роста
м и кр о о р ган и зм о в от концентрации суб страта рассм отри м на
п рим ере ро ста м етан ообразую щ ей бактерии Methanobacterium
thermoautotrophicum. И звестно, что эта бактерия развивается
на м и н еральной среде в атм осф ере м олекулярн ого водород а
и д иоксида углерода, причем последний является единственны м
источником углерода. Зависим ость удельной скорости роста
р о т концентрации каж дого из газов при фиксированной
концентрации другого газа приведена на рис. 2.2 и 2.3. К ак
видно из рисунка, р по гиперболическом у закону зависит от
концентрации Н 2 и о т концентрации С 0 2 во входящ ем газе.
П о ан алоги и с уравнением М ихаэлиса — М ентен для кинетики
ф ерм ентативны х реакций р т и K s м огут б ы ть определены на
основе линеаризации уравнения (1.3):
1 1
Ks 1
й
йт S '
йт
(2.6)
53
1
Л '
0,5 ~
1 0,0
а
0,5
/
/ > , 1м
/
0,2
/
■ 0,1 - /
О
Н2 в газовой фазе,%
Рис. 2.2.
Зависимость
удельной
скорости роста М . thermoautotrophiсит от концентрации Н 2 во входя­
щ ем газе (а); (pH 7,0, 65° С, 20%
С 0 2), те же данные в двойных
обратных координатах (б)
5
3
y i
0,1
0,2 1/С02
-J-------- 1_____ 1_____ I_____ L—
5
10
15
20
25
С02 в газовой фазе, %
Рис. 2.3.
Зависимость
удельной
скорости роста М. thermoautotrophiсит от концентрации С 0 2 во вхо­
дящ ем газе (pH 7,0, 6 5 1 С, 80%
Н 2); те же данные в двойных
обратны х
координатах
(б)
(P. Schonheit et. al., 1980)
И з данны х рис. 2.2,6 и 2 3 , 6 бы ли найдены следую щ ие
значения п ар ам етр о в: ц “ 2 = 0 , 4 9 ч - 1 ; .£ “ 2 = 2 0 % (значения м а к ­
си м альн ой удельной скорости роста и кон станты сродства,
найденны е при вариации концентрации во д о р о д а и при п осто
янной концентрации С 0 2, равн ой 20% ); ц „ ° 2 = 0 ,6 1 ч l .
£ j r 0 2 = l l % (значения м акси м ал ьн ой удельной скорости роста
и константы сродства, найденны е при вари ац ии С 0 2 и п о сто ­
янной концентрации во д о р о д а, равн ой 80% ).
К р о м е ан ам о р ф о зы (2.6) л ин еари зац ию м ож н о п ровод и ть
такж е и другим и способам и, нап рим ер, используя уравнения:
(2.7)
S_K,
S .
Ц
Ц т’
Цт
Ц= Ц т _ ^
s
к,
( 2 .8 )
(2.9)
к '
Н а рис. 2.4 приведены прям ы е, соответствую щ ие л и н еар и за­
ции данны х рис. 2.2, а в коорд и н атах уравнений (2.7) и (2.8).
С огласн о анализу, проведенном у Э. К орни ш -Б оуден (1979),
наим енее уд о вл етво р и тел ьн ы е р езу л ьтаты д ает наиболее рас­
п ростран ен н ая м оди ф икац ия уравнения (1 .3 )- - м е т о д двойны х
54
Рис. 2.4. Данные рис. 2.2, а в координатах уравнений (2.8) и (2.9)
об р атн ы х к о о р д и н ат (2.6). Граф ическое представление р езу л ьта­
тов с и сп ользован и ем этого м ето д а не д ает почти никакой
визуальн ой инф орм ации о статистической ош ибке. Э та ош ибка
лучш е всего визуализируется при и спользовании коорд и нат
S'/д от S [уравнение (2.8)].
В принципе для определения п ар ам етр о в цт и Ss д остаточ н о
двух изм ерений удельной скорости ро ста д,- и д;- при двух
разли чаю щ и хся концентрациях суб страта S ( и Sy.
(2 .10)
К = P j/S j- H f /S .- ’
S .-S ,
( 2 . 11 )
-SjlV j
В силу сущ ествую щ их реальн ы х статистических ош ибок в оп ре­
делении скоростей и концентраций ком пон ен тов обы чно п р о ­
водят 5 — 10 изм ерений скорости при концентрациях субстрата,
сои зм ерим ы х с K s. Д л я каж дой пары измерений м ож но
вы числить значения дт и Ks и затем провести статистическую
о б р аб о тку р езу л ьтато в, определив среднее значение и средне­
квадрати чное отклонение п ар ам етр а о т среднего значения.
Д ля граф ического определения дт и K s и визуального
нахож дения ош ибки удобно в осп ол ьзоваться м ето д о м К о р ­
ниш -Боуден. И з уравнения (1.3) следует уравнение связи меж ду
п ар ам етр ам и дт и К у
В, , = Ц + § * .-
( 2 . 12 )
В к о о р д и н атах дт от K s эта зави си м ость д олж н а бы ть
представлена п р ям о й с тан ген сом угла н аклон а д /5 1 и отрезк ом
д. Т ак и м о б р азо м , д л я л ю б о й пары эксп ери м ен тальн о и зм е­
ряем ы х перем енны х д и i значения д т и Ks л еж ат на этой
55
п рям ой , а точка пересе­
чения прям ы х в к о о р ­
ди н атах р от —S, если
так о вая
сущ ествует,
д ает значения цш и Ks.
П реим ущ ество э т о ­
го
м ето д а
связано
с тем , что при опре­
делении
п арам етров
нет необходим ости в
предварительн ой о б р а­
ботке и пересчете эк­
сп ери м ентальн ы х д ан ­
ных. В аж ны м п редста­
вляется х орош ая визу­
ал и зац и я статистичес­
кой ош ибки в опредекП
лении рт и Ks.
Н а рис. 2.5 привеРис. 2.5. Данные рис. 2.2, а в координатах К ор- дены данны е скорости
ниш — Боуден
ро ста
М. thermoautotrophicum в коорд и натах р ( —S ). П рям ы е пересекаю тся в одной
точке, коорд и н аты точек пересечения д а ю т значения р т и Ks.
В настоящ ее врем я графические м одиф икации уравнения
М ихаэлиса — М ентен, как и уравнения М оно, п рим ен яю т для
визуальной и ллю страц ии соответствия эксперим ентальны х д ан ­
ных гиперболической зави си м ости (1.3). Д л я численного опреде­
ления цш и Ks чащ е использую т м етоды статистической обработки
резу л ьтато в и Э В М , д аю щ и е п ом и м о числовы х значений
п ар ам етр о в достоверн ы е сведения о статистических ош ибках.
2.2. М Н О Г О С У Б С Т Р А Т Н Ы Е М И К Р О Б Н Ы Е П РО Ц ЕС С Ы
П о своей п рироде м и кробн ы й процесс обы чно м н о го ­
субстратен. Н апри м ер, аэробны й процесс ды хания идет с осу­
щ ествлением следую щ его превращ ения углерода:
С 6Н 120 б + 6 0 2 - > 6 Н 20 + 6 С 0 2
(2.13)
А наэробны е м и кр о о рган и зм ы , как п рави л о, такж е исп ользую т
в качестве суб стратов слабы е восстанови тель и окислитель.
Н ап р и м ер , обсуж даем ая вы ш е су м м ар н ая реакц ия с участием
М. thermoautotrophicum м о ж ет б ы ть зап и сан а в виде
4 Н 2 + С 0 2 —> С Н 4 + 2 Н 20
(2.14)
В д ан н о м случае в одород и диоксид углерода вы ступаю т
в качестве р авн оправн ы х суб стратов м и кр о о р ган и зм а. Д ля
56
ф ототроф н ы х м и кр о о р ган и зм о в типа м и кроводорослей и ци­
ан о б актер и й су м м арн ое уравнение ассим иляции С 0 2 им еет вид
С 0 2 + Н 20 - ^ ( С Н 20 ) + 0 2
(2.15)
где (С Н 2 О) — условное обозначение образую щ и хся вещ еств
в клетке. В д ан н о м случае м и кробн ы й процесс трехсубстратен,
при эт о м в качестве одного из суб стратов вы ступает свет.
Рост м и кр о о р ган и зм а м ож ет п ред ставл ять собой и псевдоодносубстратн ы й процесс, если один из ком пон ен тов находится
в б о л ьш о м избы тке или поддерж ивается п остоян н ы м в процессе
разви тия популяции. Н апри м ер, б ольш ая группа ан аэробны х
м и кр о о р ган и зм о в д л я получения энергии использует конверсию
углеводов по пути Э м бден а
М ейергоф а, химическое уравнение
к о то р о го в о д н о м из вари ан тов вы гл яди т следую щ и м об разом :
С 6 Н 120 6 + Н 20 -> 2 С 0 2 + 2 Н 2 + С 2Н 50 Н + С Н 3С 0 0 Н
(2.16)
Здесь за счет б о льш о го избы тка воды процесс им еет псевдоодносубстратн ы й характер.
Реакции (2.13)— (2.16), протекаю щ и е с расходом основны х
суб стр ато в и накоплением конечных п родуктов ф ерм ентации,
м ож но н азв ать базовыми химическими реакциями м и кроб н ого
процесса. К аж д ая группа м и кр о о р ган и зм о в м ож ет б ы ть о х ар ак ­
тер и зо ван а своей собственной базовой химической реакцией.
Р ассм о тр и м зако н ом ерн ости ро ста м и кр о о р ган и зм о в в экс­
поненциальной ф азе с учетом м н огосуб стратн ости м и кроб и ­
ологического роста.
2.3. П РО С ТЕЙ Ш И Е
кинетические
схем ы
И з ф ерм ен тати вн ого катал и за известны две принципиально
различны е простейш ие кинетические схемы , проводящ ие к диск­
ри м и н и р у ем ы м зави си м остям скорости процесса о т концен­
трац и й двух субстратов. С учетом автокатал и ги ч еск ого про­
цесса м и кр о б н о го р о ста эти две схемы м огут б ы ть пред­
ставлены в так о м виде:
S2
S 1+ N ? ± S 1N ?± S 1S2N - > 2 N - |- P
Sj + N ^ S j N ^ X + Pj j
S 2 + X +± S2X —>2N + P J
(2.17)
(2.18)
М еханизм (2.17) вклю чает две о б р ати м ы е равновесны е
стади и присоединения суб стратов (механизм тройного комплек­
57
са), в м еханизм е (2.18) стади и присоединения суб стратов
разделены по крайней мере одной н еоб рати м ой стадией.
В терм ин ах м ех ан и зм ов ф ерм ен тати вн ой кинетики группа
м ехан изм ов типа (2.18) получила н азван ие пинг-понг-механизмов.
Д ве
разли чн ы е кинетические схемы п ри вод ят к двум
р азл и чаю щ и м ся зави си м остям скорости р о ста от концентрации
субстратов. Д ля м ехан изм ов группы (2.18) (пинг-понг-м еха­
низм ы ) хар актер н а следую щ ая зави си м ость от концентрации
субстратов:
l + t f , / S l + K 2 / s 2’
(2 Л 9 )
где K i и К 2 — эффективны е кон станты срод ства м и к р о о р ­
ган и зм а к су б стр атам Sj и S 2.
Д ля м ехан изм ов группы (2.17) (в од н ом из вари ан тов)
уравнение удельной скорости ро ста м ож ет б ы ть записано в виде
и — --------------- ^ --------------- .
^
i + * 2/ s 2+
k
1k 2/ s 1s 2
( 2 .2 0 )
у
J
П ринципиальное различие уравнений (2.19) и (2.20) в той
ф орм е,
в ко то р о й они записаны , закл ю ч ается в то м , что
уравнение (2.20) содерж ит член, п ред ставл яю щ и й собой п рои з­
ведение S, S 2 (м еханизм с м ул ьти п л и ц и рую щ и м и субстратам и ).
Э г о п о зво л яет из зависим остей удельны х скоростей ро ста от
концентрации су б стр атов отл и чи ть м ехан изм (2.17) от м ехани­
зм а (2.18). Д л я дискрим инации м ехан и зм ов необходи м о ис­
сл ед о вать зави си м ости удельной скорости ро ста о т кон ц ен тра­
ции одного суб страта при постоян н ой концентрации д ругого
су б стр ата, варьируя от серии к серии эксперим ентов концен­
тр ац и ю последнего.
▲ П ри ан али зе эксперим ентальны х данны х в соответствии
с м ето дам и , разви ты м и д л я м н огосуб стратн ы х ф ерм ентативны х
реакций (С. Д . В арф олом еев, С. В. Зайцев, 1982), удобно и сп оль­
зо в ать один из двух подходов.
1. В о б р атн ы х коорд и н атах д л я м ехан и зм ов групп пингпонг-зависим ости (немультиплицирующие субстраты) скорости
от концентрации су б страта будут п редставлен ы серией п ар ал ­
лельны х, непересекаю щ ихся, п рям ы х (рис. 2.6). Д л я м ехан изм ов
с тр о й н ы м ком плексом (мультиплицирующие субстраты), у р ав ­
нения скорости которы х вкл ю чаю т произведение переменных
S jS 2 в о б р атн ы х коорд и н атах, эксп ери м ен тальн ы е данны е
долж ны ли н еар и зо ваться, что приводит к серии пересекаю щ ихся
п рям ы х (рис. 2.7).
2. В некоторы х случаях в озм ож н о провести эксперимент
с определением ц ^ , ц ^ , K l ц К
где ц ^ , К * i — м акси м ал ьн ая
58
4 S,
1/st
Рис. 2.6. Зависимости удельной скорости роста микроорганизмов
от концентрации субстратов (S, и S2) в обратных координатах для
группы пинг-понг-механизмов
удельная скорость роста и кон станта сродства, найденны е по
субстрату Sj при како м -то ф и ксированном значении концен­
трац и и су б стр ата S2;
К р — м акси м ал ьн ая удельн ая ско­
рость ро ста и кон станта сродства, найденны е по субстрату
S 2 при ф и кси рован н ом значении S 2. М ехани зм ы (2.17) и (2.18)
разл и чаю тся по зависим ости ц ^ , К
от S2;
K sp от S ,.
Так, д ля группы м ехан изм ов с н ем ультиплицирую щ им и суб­
стр а там и (группа пинг-понг-м еханизм ов) из уравнения (2.19)
следует:
<2'21)
(2'22)
Видно, что зависим ости
о т S 2,
от S l 5 ATfi о т S2,
K s z о т Sj и м ею т гиперболический характер и долж ны лине­
ари зо ваться в о братн ы х коорд и натах, при это м значение
(г,,/ / K s„i не до лж н о зависеть о т концентрации в то р о го субстрата
(рис. 2 . 8 ).
Рис. 2.7. Зависимость удельной скорости роста микроорганизмов от концент­
рации субстратов (Si и S2) в обратных координатах для механизмов
с мультиплицирующими субстратами
59
I
1/st
Щ
Рис. 2.8. Зависимости параметров ц„,‘ и К 5\ найденные при вариации
субстрата S 1( от концентрации второго субстрата S2 для групп пинг-понг
механизмов
Д л я м ехан изм ов с равн овесн ы м тр о й н ы м ком плексом [схема
(2.17), (2.20)] вид зависим остей
о т S2, K b от S2,
от
S x и K s 2 от Sj соверш енно другой следую щ ий:
(2.23)
(2.24)
• Н а рис. 2.9 и 2.10 приведены зави си м ости p ^ ( S 2); A ^ i(S 2),
N / ^ s 1; М-Sr(S j); K b (S,); \ i b / K b - С опоставлен ие эксперимен-
V
1/St
Рис. 2.9. Зависимость кинетических параметров pi*1 и А:*', найденных
при вариации субстрата S l5 от концентрации второго субстрата S2 для
механизма с мультиплицирующими субстратами
60
Рис. 2.10. Зависимость кинетических параметров ц*2 и К*2, найденных
при вариации субстрата S2, от концентрации первого субстрата S, для
м еханизма с мультиплицирующими субстратами
тальн ы х данны х с теоретическим и, представленны м и на рис.
2 . 6 — 2 . 1 0 , п о зво л яет определить, к какой кинетической группе
относится т о т или иной м икробны й процесс.
2.4.
О БО БЩ ЕН Н АЯ М О Д Е Л Ь
М Н О Г О С У Б С Т Р А Т Н О Г О М И К Р О Б Н О Г О П РО Ц ЕС С А
М н огосуб стратн ую кинетику м и кроб н ого ро ста в экспонен­
ц иальной ф азе м ож н о р ассм отреть и в более общ ем виде,
восп ользовавш и сь теорией м ногосубстратны х ф ерм ентативны х
реакций (П. В. Вржещ, С. Д . В арф олом еев, 1985).
С хему м икроби ологи ческого превращ ения суб стратов ро ста
п редставим в следую щ ем виде:
*1
“2
«,
«j
X,
Х2
...
X,
...
X j * ± ... ^ х п 4 х „
(2.25)
Pi
I»,
Pj
где X, м о гу т им еть см ы сл различны х состояний ф ерм ентов,
осущ ествляю щ их тр ан сф орм ац и ю л им ити рую щ и х субстратов;
а и Р — константы скорости процессов взаим опревращ ений
ф орм X,-. К о н стан ты < Х ;(1^г^«) м огут о тр аж ать как процесс
м о н о м о л ек у ляр н о го превращ ения п ром еж уточн ой ф орм ы X,
в Х 1 + 1 (в это м случае а , =
где к \ — кон станта скорости
реакции п ервого порядка), так и процесс взаим одействия
ф ор м ы X с м олекулой суб страта S (в этом случае а, = /с" [S ],
где к " — кон станта скорости реакции в торого порядка). Все
п ар ам етр ы а полож ительны .
Р ассм о тр и м процессы в экспоненциальной фазе роста, когда
концентрации п родуктов ф ерм ентации м ал ы и им и м ож но
61
пренебречь. С оответствен н о п ар ам етр ы Р* ( 1
— 1) являю тся
ко н стан там и скорости реакции п ервого п орядка, некоторы е
из них м о гу т б ы ть равн ы нулю . П р и условии р„ = 0 не
сниж ается об щ н ость схемы (2.25), так как л ю б а я стадия роста,
соп р о во ж д аю щ аяся о б разован и ем м олекулы п родукта, д олж н а
им еть н ео б р ати м ы й характер. П риписав этой н еоб рати м ой
стадии индекс п, получим схему (2.25).
И спользовани е м етодов расчета стац и он арн ой скорости
ферментативных реакций, разработанны х на основе теории графов,
п о зво л яет зап и сать вы раж ение д л я удельной скорости роста:
П
Л
И= а „ А / X А ,
(2.26)
где A ( 1 sA*S«) — ба'зовый оп редели тель пром еж уточной ф орм ы
Х ;. В ы разив все базовы е определители через п ар ам етр ы а и (3,
п р еоб разуем уравнение (2.26) к виду
п
п
Ц = а 1 а 2 ••• а п/ X X bij>
i= lj= l
где
(2-27)
btj= a t a 2 . .. o t j - i P i f t + i ... p ,- ! • l a J+1 ...a„ (i< j) ;
biJ= a 1a 2 ...oii- r l a i+ 1 ...oin (i = j ), bu = 0 ( i > j ) .
У равнение (2.27) м ож но
д л я ан ал и за форме:
1 /ц
где
аи = Р, Р.- +
1
••• Р; -
1
зап и сать
в следую щ ей
удобной
= X X
t= ij= 1
/ К a .-+
1
(2-28)
••• olj) (i < /) , au = 1 /a, (i = ;).
▲ О тм ети м основны е свойства уравнения (2.28).
Свойство 1. У равнение (2.28) им еет гиперболический характер
отн оси тельно п ар ам етр а a, ( 1 < / < « ) :
1/р = С 0 + С ,/а „
(2.29)
где С 0 и С ,—^строго п олож ительн ы е коэффициенты .
Д ей ствительн о, каж ды й член сум м ы в п равой части уравнения
(2.28) содерж ит п ар ам етр а, тол ьк о в степени минус единица или
нуль; Со > 0 , так как л ю б ой из членов вида й, = l / a (( / # / j
полож ителен и не содерж ит а,; С; > 0, так как сум м а в правой
части уравнения (2.28) содерж ит ненулевой член аи = 1 /а,.
Свойство 2. У равнение (2.28) содерж ит произведение —X
\
a ,“m
(1
т о гд а и то л ьк о то гд а, когд а в схеме (2.25) все
стади и взаим оп ревращ ени й меж ду ф о р м ам и X, и Хт о б р ати м ы ,
т. е. Рьт^О д л я всех l ^ k ^ m — 1 .
62
Д ействительн о, если ( 3 ^ 0 д л я всех I ^ к ^ т — 1, то уравнение
(2.28) содерж ит произведение ( 1 / а ,) ( 1 / а т ), так как в него входит
ненулевой член а (т = Р,Р, + 1 ... Рт - 1 /(<х,а1+ 1 ... а т). И, н аоб орот,
все члены сум м ы в п равой части уравнения (2.28), содерж ащ ие
произведение ( 1 / а , ) ( 1 / а т ), сод ерж ат и произведение j3 ; p/+ 1 ...
...p m- i . Если произведение (1 /а ,)(1 /а т ) входит в уравнение
(2.28), то это озн ачает, что Р,|3; + 1 ... Рт ( # 0 или (3*^0 для всех
к ^ т —1 .
С в о й с т в о 3. У равнение
(2.28) не содерж ит произведения
П /а ,)(1 /а т ) т о гд а и то л ьк о то гд а, когда в схеме (2.25) между
ф о р м ам и X, и Х т есть по меньш ей мере одна н еоб рати м ая
стадия, т. е. найдется l ^ k ^ m - 1 такое, что Р ^ О . Д о к а за ­
тельство свой ства 3 ан алоги чн о д о казател ьств у свойства 2 .
Д ля систем ати зац и и дальнейш их вы кладок введем опреде­
ление скалярной связности ф орм X.
П ром еж уточны е ф орм ы X, и Х т связаны [их скалярн ая
связн ость (/, т ) равна единице], если в м еханизм е роста
м и кр о о р ган и зм а найдется участок, соединяю щ ий эти ф орм ы
и состоящ ий из об р ати м ы х стадий взаи м оп ревращ ени й . В п р о ­
ти вн ом случае X, и Х т не связаны [(/, /и) = 0 ], т. е. Pt = 0
д ля всех l ^ k ^ m — 1 .
С учетом введенного понятия скалярн ой связности и свойств
1— 3 уравнение (2.28) отн оси тельно а, и а т будет им еть вид
~ = С0 + С1/а, + Ст/а.т+ (1, т ) С 1т/(а ,а т ).
И
(2.30)
А налогично, эти рассуж дения м ож н о п родолж и ть для трех
и б ольш его числа п ар ам етров а.
• С делаем теперь вы воды отн оси тельно характера зависи­
м ости удельной скорости роста от концентрации субстратов.
1. Если субстрат п риним ает участие в реакции (2.25) один
раз, т. е. взаи м одей ствует то л ьк о с одной ф орм ой Х ,( 1 < / ^ и ) ,
то в уравнение (2.25) концентрация суб страта входит тол ьк о
вместе с а,. П о д ставл яя равен ство a, = A:J'S в уравнение (2.30),
получим
^ d o + d J lS ],
(2.31)
где d0 = С 0 > 0 , й?1 = С ,/^ [ > 0 .
2. Если в реакции (2.25) п ри н и м аю т участие субстраты
и S2, причем S t взаи м одей ствует то л ьк о с одной п ром еж уточ­
ной ф о р м ой X,, S 2 взаи м одей ствует то л ьк о с п ром еж уточн ой
ф орм ой Х т , то уравнение (2.30) отн оси тельно [S, ] и [S 2 ]
им еет вид
l/ji = rf0 + rf1 / [ S I ] + rf2 /[S 2 ] + (/, m ) d 1<2 l{[S\ ] [S 2 ])•
(2.32)
63
Т аки м о б р азо м , ск ал ярн ая связн ость пром еж уточны х ф о р м X,
с к о то р ы м и взаи м од ей ствую т суб страты S, и S 2 в м еханизм е
реакций (2.25), является кри тери ем вида зави си м ости удельной
скорости роста м икроорган и зм а о т концентрации этих субстратов.
Граф ик зави си м ости р о т концентрации одного из суб стратов
в двойны х об р атн ы х коорд и н атах при различны х фиксированны х
концентрациях д р угого суб страта п редставляет собой: а) веер
прям ы х, пересекаю щ ихся в одной точке во в то р о м или тр етьем
квадранте, в случае связны х ф орм (см. рис. 2 .7 , я; б) серию
параллельны х прям ы х в случае несвязны х ф орм (см. рис. 2 .6 ).
В заи м н ая о д нозн ачн ость в свойствах 2 и 3 п озволяет
сд елать об р атн о е утверждение: п ар ал л ел ьн о сть прям ы х в д в о й ­
ных об р атн ы х коорд и н атах сви детельствует о то м , что в м е­
ханизм е м н о го су б стратн ого ро ста м и к р о о р ган и зм а субстраты
Sj и S 2 взаи м о д ей ствую т с несвязны м и пром еж уточн ы м и
ф о р м ам и X, наличие точки пересечения сви детельствует о то м ,
что в м еханизм е процесса субстраты взаи м од ей ствую т со
связн ы м и пром еж уточн ы м и ф о р м ам и X.
3.
С у бстр ат S м ож ет п ри н и м ать участие в процессе (2.25)
два р аза, реагируя с пром еж уточн ы м и ф о р м ам и X, и X
П од ставл яя в уравнение (2.32) равен ство [S 2 ] = [S 2 ] = [SJ,
получим
1/й = ^о +
(^1
+ ^ г ) / И + (Л m ) d l 2 / [ S ] 2.
(2.33)
В двойны х об р атн ы х коорд и н атах зави си м ость (2.33) будет
линейной то л ьк о в то м случае, если пром еж уточны е ф орм ы
X, и Х т несвязны [(/, т) = 0]. В п роти вн ом случае [к о гд а (/,
т ) = 1 ] зави си м о сть (2.3з) не ги перболи чн а и в двойны х
об р атн ы х коо р д и н атах п редставляет собой п араболу. К ва д ­
рати чная зави си м ость 1/р от S не будет эксперим ентально
пр о явл яться, если м еж ду точ кам и ввода суб страта имеется
хотя бы о д н а н ео б р ати м ая стадия.
2.5. М Н О Г О С У Б С Т Р А Т Н О С Т Ь В К И Н Е Т И К Е РОС ТА М . T H E R M O A U T O T R O PH 1C U M
С пециф ика ро ста м и кр о о р ган и зм о в с точки зрения м ногосуб стратности заклю чается в то м , что суб страты акцептирую тся
и кон верти рую тся разли чн ы м и ф ерм ен тны м и си стем ам и. П ри
эт о м весьм а вероятн о наличие хотя бы одной сущ ественно
н ео б р ати м о й стади и м еж ду точ кам и ввод а суб стратов в ка­
талитический цикл. Э то д ел ает случай с несвязны м и ф о р м ам и
ф ерм ен тов (случай п ин г-понг-м еханизм а) наиболее в ероятн ы м
в кинетике ро ста м икробны х популяций. М ож но п олагать,
что зави си м ости типа представленны х на рис. 2 .6 , 2 . 8 долж ны
бы ть наиболее характерн ы м и при ан али зе кинетики роста
64
м и кробн ы х популяций по разл и чн ы м суб стратам . С о о тветст­
венно при описании кинетики роста культур м и кроорган и зм ов
справедливы уравнения (2.19), (2.21), (2.22).
Д ля и ллю страц ии законом ерн остей ро ста м и кроорган и зм ов
в д вухсубстратн ом реж им е воспользуем ся д ан ны м и по кинетике
роста культуры М. thermoautotrophicum при и спользовании С 0 2
и Н 2. Зависим ость удельной скорости роста этой бактерии
от концентрации каж дого из суб стратов при фиксированной
концентрации д р у го го приведены на рис. 2.2 и 2.3. О бразован и е
м етан а бактериям и , в то м числе М. thermoautotrophicum, м ож но
п редстави ть следую щ им об р азо м .
\Н ,
COj + Х-Н-Х-СООН —
\Н,
\На
Х-СНО ^ - Х - С Н 2ОН
, Hj
х-сн3 -^>сн4 + х-н
н,о
н,0
(2.34)
где X — ряд коф ерм ен тов м етаногенеза.
Видно, что во д о р о д как субстрат используется четы ре раза
в реакциях восстановления С 0 2 д о С Н 4. В двойны х обратн ы х
коо р д и н атах эксперим ентальная зави си м ость 1 /р от 1 /Н 2
представляет собой п рям ую (см. рис. 2.2). Э то гов о р и т о то м ,
что все четы ре акта активации во д о р о д а п роизвод ятся несвяз­
ны м и ф о р м ам и ф ерм ентов, другим и сл овам и , стадии ввода
четы рех м олекул в о дород а в каталитический цикл разделены
д оп олн и тельн ы м и н еоб рати м ы м и химическими реакциям и, что
согласуется со схемой (2.34). Если бы в м еханизм е процесса
им ело м есто п оследовательное равновесное присоединения хотя
бы двух м олекул в о дород а типа
. . . ? ± Х ^ Х Н 2 <=>Х(Н2)2 <=>...
(2.35)
то уравнение скорости роста долж н о б ы ло бы содерж ать
член [ Н 2] 2 и кинетические данны е не долж ны бы ли бы
л и н еар и зо ваться в об ратн ы х коорд и н атах в соответствии
с уравнением см еш анн ого нулевого и п ервого порядка. П ри
п ослед овательном присоединении четы рех м олекул в одород а
уравнение скорости им ело бы четверты й п орядок по водороду.
С тадии ввода в реакцию в одород а и С 0 2 в соответствии
со схемой (2.34) такж е разделены н еоб рати м ы м и химическими
тран сф о р м ац и ям и . Э то указы вает на то, что кинетические
законом ерн ости ро ста долж н ы и м еть характер, со ответствую ­
щий пинг-понг-м еханизм у.
И спользовани е уравнений, характерны х д л я кинетики роста
с несвязны м и ф о р м ам и ф ерм ен та (уравнение пинг-понг-механизма), п озволяет из значений
ц ^ , К *ц K s 2 получить истинны е
значения кон стант п ар ам етр о в роста популяции.
И з эксперим ентальны х данны х, представленны х на рис. 2.2
и 2.3, определены п ар ам етр ы роста бактерии по каж д ом у из
суб стратов при заданной постоянной концентрации второго
3 З а к . 544
65
су б стр ата, т. е. вычислены п арам етры кинетики роста при
вариации концентрации в одород а Цт 2 и
(эти величины
зави сят от концентрации С 0 2), р с ° 2 и К с ° 2 (эти величины
найдены при вариации концентрации С 0 2 и зави сят от
концентрации водорода). И з уравнений (2.19) — (2.20) д л я роста
культуры М. thermoautotrophicum следует:
к"р(1+к™2/ с о 2) .
1 - i - ( * W H a)(K°“v c o 2)’
^ ( 1 + ^ / Н 2) ,
2 _ 1 —(а:"2 / н 2 )(л:с° 2 / с о 2)’
к _
1
;
р т = р » 2 ( 1 + Х с° 2 / С 0 2);
(2.38)
цт = Р ™ 2 ( 1 + Х н5 2 / Н 2).
(2.39)
И спользование эксперим ентально найденны х п арам етров
р “ 2, р с° 2, X ” 2, K cos* п озвол яет по уравнениям (2.36) — (2.39)
оп редели ть следую щ ие значения истинны х п ар ам етр о в роста;
А-, = 35,9% (сродство бактерий к водороду); Х 2 = 15,9% (срод ­
ство бактерии к С 0 2). Значения р т , рассчитанны е по уравнени­
ям (2.38) и (2.39), со в п ад аю т и равны 0,88 ч - 1 . Э то м ак си м ал ь ­
ная удельная скорость роста, которую д олж н а и м еть популяция
М. thermoautotrophicum при бесконечно больш их концентрациях
м о л еку л яр н о го в о д о р о д а и д иоксида углерода.
2.6. И Н Г И Б И Р О В А Н И Е И АК ТИ ВА Ц И Я
РОСТА М И К Р О О Р Г А Н И ЗМ О В
И нги би рован ие или активац и я роста популяции м и к р о о р га­
н и зм о в — ш и роко распростран ен ное явление, в б о л ь ш о м числе
случаев определяю щ ее ск орость разви ти я культуры (И. Л. Раб о тн ова, И. Н. П о зм о го в а, 1973).
С ущ ествует две основны е классиф икации и нги б иторов роста
м и кр о о р ган и зм о в: 1 ) по «миш ени», на к о торую действует то
или иное вещ ество; 2 ) по кинетическому м еханизм у действия.
А В рам ках первой классиф икации м ож но вы делить следую ­
щ ие типы воздействия.
1. Ингибиторы, действующие на Д Н К. Х арактерны й при­
м е р — нали ди ксовая кислота, и нгибирую щ ая синтез Д Н К
у Escherichia coli, Bacillus subtilis, Hypomicrobium neptunium
и других бактерий.
2. Ингибиторы, действующие на РНК. И н ги би тор, н ап рим ер
актин ом и ц ин D, р азо б щ ает процесс транскрипции — о б р а зо в а ­
ние Р Н К на м атри ц е Д Н К .
3. Ингибиторы синтеза белка, н ап рим ер хлорам ф еникол,
левом и цетин , эритром и ц и н, тетраци кли н , п о д авл я ю т процессы
об р азо в ан и я пептидны х связей, что очень часто п риводит
66
к зн ач и тельн ом у накоплению м и к р о о р ган и зм ам и свободны х
ам ин оки слот.
4. Ингибиторы синтеза полимеров бактериальной клеточной
стенки — м уреина и тейхоевы х кислот. Н аиболее изучено
действие Р-лактамны х антибиотиков, в особенности пенициллина.
5. Мембраноактивные вещества. Д ействие этих ингибиторов
связан о с повреж дением ц итоп лазм ати ческой м ем бран ы и н а­
руш ением ее п роницаем ости. К таки м вещ ествам относятся
детергенты , органические раствори тел и (толуол, хлороф орм ),
спирты , ф енолы , четвертичны е ам м он и евы е основания, полипептидны е и полиеновы е антибиотики.
6 . Ингибиторы
энергетических процессов. Специфическим
и н ги б и то р о м энергетических процессов является 2,4-динитро­
ф ен о л — р азо б щ и тел ь оки сли тельного ф осф орилирования. Он
п ро во д и т протоны через м ем бран у и и зм ен яет гради ен т pH ,
при это м р о ст м и кр о о р ган и зм о в ингибируется.
7. Ингибиторы лимитирующего фермента. К ак известно,
ф ерм енты весьм а «чувствительны » к разли чн ы м соединениям,
б локирую щ им ф ункционально важ ны е группы активн ого центра
(Э. У эбб, 1969). В м и кробиологической кинетике это п роявл яет­
ся в уменьш ении скорости ро ста популяции.
▲ С точки зрения кинетики действия м ож н о вы делить
следую щ ие основны е классы ингибиторов.
1.
Вещ ества, н еоб рати м о взаи м одей ствую щ и е с ком п он ен та­
м и растущ ей м и кробн ой клетки, со став л яю т класс необратимых
ингибиторов. К инетика их действия в диф ф еренциальной ф орм е
м ож ет в больш и н стве случаев б ы ть описана уравнением
(2.40)
соо тветству ю щ и м схеме
N + I-+ N I,
(2.41)
где N — число клеток; I
концентрация н ео б р ати м о дей ствую ­
щ его и нгибитора; N1 — число заи н гиби рованн ы х клеток; к —
к он станта скорости в торого порядка. К ак п равило, н еоб рати ­
м ое ингибирование — отн оси тельно м едленны й процесс, р азви ­
ваю щ ийся во времени.
2.
Вещ ества, бы стро и о б р ати м о взаим одействую щ ие с молекулами-«миш енями», объединяю т в класс обратимых ингибиторов.
П роцесс о б р ати м о го и нгибирования м ож н о оп исать схемой
N + l^ N I,
(2.42)
где К — эф ф ективная кон стан та равновесия. Д ействие о б р ати ­
мы х инги биторов п роходи т, как п равило, отн оси тельно бы стро,
з*
67
практически м гновенно с точки зрения времени разви ти я
м икробн ой популяции.
3. Д ля м икробиологических процессов весьм а характерен
эффект ингибирования продуктом ферментации, в резул ьтате
чего его накопление в достаточн ы х количествах м ож ет п риво­
д и ть к зам едлени ю скорости роста популяции. И нгибирование
п родуктом ф ерм ентации м ож ет и м еть как об рати м ы й , так
и необрати м ы й характер.
4. Важный регуляторны й микробиологический феномен связан
с ингибированием избытком субстрата. В это м случае субстрат,
ко то р ы й при отн оси тельно низких концентрациях увеличивает
скорость ро ста популяции, при более высоких концентрациях
м ож ет б ы ть эф ф ективны м и н ги б и тором роста м и кроорган и зм ов.
К инетические зако н ом ерн ости процессов с и нги бирован и ем
су б стр ато м и п р о дуктом при периодическом и непреры вном
культиви рован ии д етал ьн о ан али зи рую тся в гл. 4, 5, 7.
Активаторами н азы ваю т соединения, которы е, не будучи
н еобходим ы д л я роста, м огут зам етн о увеличивать м ак си м ал ь ­
ную ск орость р о ста культур м и кроорган и зм ов.
Р ассм о тр и м основны е законом ерн ости о б р ати м о го ингиби­
рован ия и активации роста популяции м и кр о о р ган и зм о в в эк­
споненциальной фазе.
2.6.1. Общая схема действия обратимых эффекторов
на кинетику роста микроорганизмов
П о аналоги и с кинетикой ф ерм ентативны х реакций влияние
эф ф ектора R в процессе ро ста биом ассы с л и м и ти рую щ и м
су б стр ато м м ож ет б ы ть передано схемой
(2.43)
где К ,, K R— кон станты диссоциации ком плекса суб страта
S и эф ф ектора R с м олекулой-«м иш ен ью » клетки N; цт
м акси м ал ьн ая удельная скорость роста.
М ож но п о казать, что м атем ати ч еская о б р аб о тк а схемы (2.43)
приводит к следую щ ему вы раж ению для удельной скорости роста:
o* k+ PR s
оt K R -j- R
(2.44)
Р ассм о тр и м некоторы е важ ны е частны е случаи, им ею щ ие
особое значение д л я описания кинетики ро ста культур м и кр о ­
ор ган и зм ов.
68
5
1/S
Рис. 2.11. Зависимость ц от S в обычных и двойных обратных координатах
при конкурентном (а) и неконкурентном (б) ингибировании роста микро­
организмов
1.
Полное конкурентное ингибирование (а-> о о , Р = 0). В этом
случае удельная скорость роста в экспоненциальной фазе
определяется вы раж ением
Зави си м ость в о б ратн ы х коорд и н атах им еет вид пучка
п рям ы х, пересекаю щ ихся на оси ор д и н ат (рис. 2.11, а). К о н стан ­
ту конкурентного ингибирования K R м ож н о определить с п о­
м о щ ью вы раж ения
(2.46)
если п редстави ть эксперим ентальны е данны е в коорд и н атах
* э Ф о т R.
Д л я определения K R м ож н о такж е п рим ен ять метод
Диксона, согласно ко то р о м у эксперим ентальны е данны е о тк л а­
д ы в аю т в коорди натах (1 /р , [R ]) (рис. 2.12).
2.
Полное неконкурентное ингибирование. В это м случае
удельная скорость р о ста культуры определяется вы раж ением
и = _____ ________
( \ + R / K R) ( K s + S y
(2.47)
69
Рис. 2.12. Зависимость ц (а) и 1/ц (б) от концентрации ацетата при росте
Е. coli в анаэробных (кривые / ) и аэробных (кривые 2) условиях
Зави си м ость в коорд и н атах Л ай н уи вера-Б ёрка им еет вид
пучка прям ы х, пересекаю щ ихся на оси абсцисс (рис. 2 . 1 1 , б).
К онстан ту неконкурентного ингибирования м ож но определить
с п о м о щ ью вы раж ения
Pm
(2.48)
путем п остроения граф ика в коорд и н атах ( l / p m, [R ]) или
с п о м о щ ью м ето д а Д иксона. В качестве и ллю страц ии р ас см о т­
рим данны е Г. В. С м и рн овой и О. Н. О ктяб рьского (1985),
которы е исследовали и нгибирование ац ета то м роста Е. coli
в аэробны х и ан аэробны х условиях. И м и установлено, что
ац етат является неконкурентны м и н ги б и тором роста. Зависи­
м о сть ц от концентрации ац етата приведена на рис. 2 . 1 2 , а.
На рис. 2.12, б эти же дан ны е представлены в коорди натах
Д иксона, которы е п о зво л я ю т оп редели ть константы некон­
курентного
ингибирования:
для
ан аэроб н ого
процесса
А^ = 1 1 м М , Для а э р о б н о го — К к = 23,5 м М .
3.
Неконкурентная активация ( а = 1 , Р > 1 ). К ак следует из
уравнения (2.44), в этом случае м акси м ал ьн ая скорость роста
увеличивается:
ц=
Пт--------- S
т K„+R
Ks+ S
(2.49)
Зави си м ость скорости р о ста в коорд и н атах Л ай н уивера-Б ёрка
им еет вид пучка прям ы х, пересекаю щ ихся на оси абсцисс.
А н али з уравнения (2.49) м ож но п ровод и ть с п о м о щ ью
вы раж ения
=
70
(2.50)
п рео б р азо ван н о го к виду
(2.51)
И з это го вы раж ения видно, что построение граф и ка в коордип озвол яет провести разд ельн ое определение кон стант |3 и K R. П о м еханизм у неконкурентной
активации описы вается реакция клеток H ela человека на
инсулин. П ри недостатке инсулина скорость их роста очень
низка. Введение инсулина зам етн о увеличивает скорость роста
клеток. И м ею тся и другие ф акты , говорящ и е об активи рую щ ем
действии р азн о о б р азн ы х вещ еств на рост м икробны х клеток
и клеток культуры тканей (Дж. П ерт, 1978).
4. Смешанные типы ингибирования и активации
Р # 1).
Г раф ики в двойны х об ратн ы х коорд и н атах и м ею т вид пучка
прям ы х, соответствую щ их разли чн ы м кон ц ен трац иям эф ф екто­
р а и пересекаю щ ихся в общ ей точке с коо р д и н атам и
(2.52)
(2.53)
И з вы раж ений (2.52), (2.53) видно, что полож ение точки
пересечения определяется ли ш ь значениям и а и [3 и не зависит
о т K R. Т аки м о б р азо м , вид граф ика в обратн ы х коорди натах
м ож ет б ы ть и сп ользован д ля определения типа влияния
эф ф ектора на процесс р о ста популяции м и кроорган и зм ов.
2.7.
ВЛ И Я Н И Е pH
НА К И Н Е Т И К У РОСТА М И К Р О О Р Г А Н И ЗМ О В
О дним из важ нейш их ф акторов, определяю щ их скорость
роста популяции м и кроорган и зм ов, является концентрация
ионов в о до р о д а. М ногие м и кр о о р ган и зм ы растут в достаточ н о
узком диап азон е pH , при это м как увеличение концентрации
ионов во д о р о д а (пониж ение pH ), так и ее уменьш ение (повы ш е­
ние pH ) п риводят к сущ ественном у зам едлени ю скорости
м и кроб н ого процесса и даж е к его прекращ ению . Влияние
концентрации ионов в одород а на скорость роста м и кр о о р ган и з­
м о в — д о стато ч н о слож ное явление. Ее изменение м ож ет з а т р а ­
ги вать м ногие сто р о н ы ф ункционирования м и кробн ой клетки.
П реж де всего концентрация ионов в одород а м ож ет регули­
р о в ать ионное состояние суб страта в то м случае, если
субстрат содерж ит ионогенную группу. Н апри м ер, весьма
71
распростран ен ная группа суб стратов — а м и н о к и сл о ты — сод ер­
ж ит две ионогенны е группы , присоединение и онов в одород а
к к о т о р ы м сущ ественны м о б р а зо м и зм ен яет зар я д м олекулы
и соответствен но п рон и ц аем ость клеточной м ем бран ы для
это го субстрата. О дин из важ ны х суб стратов для м ногих
м и кр о о р ган и зм о в — диоксид угл ерод а в водны х р астворах —
сущ ествует в трех ф орм ах. Если клетка акцептирует этот
субстрат лиш ь в од н ом и онн ом состоянии, то изменение
концентрации ионов во д о р о д а д о значений, вы ходящ их за
пределы соответствую щ его значения р К а, долж н о изм енить
концентрацию необходи м ого суб страта и тем сам ы м скорость
ро ста культуры . П о это м у в первую очередь при интерпретации
p H -зависим ости р о ста м и кр о о р ган и зм о в н еобходи м о о б р ати ть
вним ание на в о зм о ж н ость отраж ен ия в кинетике роста ионны х
состояний субстрата.
Д р у гая важ ная особенность p H -зави си м остей роста м и кро­
о р ган и зм о в закл ю ч ается в т о м , что кон ц ен трац ия ионов
во д о р о д а внутри клетки м ож ет сущ ественны м о б р азо м о тл и ­
чаться о т pH в растворе. В силу буферных свойств м ол ек ул яр­
ных ком пон ен тов клетки л и б о в силу действия спец и али зиро­
ван ного м ехан изм а стаби ли зац ии pH в клеточной среде pH
м о ж ет б ы ть см ещ ен на н екоторое значение по сравнению
с pH ку льтуральн ой среды . Д рН определяется м н оги м и
ф ак то р ам и , о днако м ож но д у м ать , что эта величина постоянна.
Д р у ги м и сл о вам и , это озн ачает, что концентрация ионов
во д о р о д а в каком -ли б о ко м п ар тм ен те клетки линейно связана
с концентрацией Н + во внеш ней среде.
Р ассм о тр и м следую щ ую простейш ую м од ел ь. П редстави м
себе м ем брану, п олупроницаем ую д л я и онов водород а, через
к о то р у ю осущ ествляется перенос ионов в о д о р о д а в п рям ом
и о б р атн о м направлениях. В это м случае кинетика переноса
м ож ет б ы ть описана следую щ и м диф ф ерен ц иальн ы м уравнени­
ем в предполож ении, что скорости переноса п роп орц и ональн ы
Н + во внеш ней (Н в^ сш) и во внутренней ( Н в+нутр) среде:
+
внутрэ
(2.54)
где а, Р кинетические коэффициенты .
Если равновесие переноса устанавли вается отн оси тельно
бы стро, < / Н В н у т р / dt = Q, то соответствен но имеем
внеш •
(2.55)
К онц ен трац и и и онов в о д о р о д а во внеш ней среде и внутри
к о м п ар тм ен та связан ы линейны м соотн ош ени ем , при этом
если а / Р > 1 , то в клетке п оддерж ивается более «кислая»
среда; если а = (3, то значение pH внутри и во вне клетки
один аково, если а / Р < 1 , т о в клетке устанавли вается более
щ елочная среда.
Н аиболее сущ ественны м ф ак то р о м , оп ределяю щ и м кинети­
ческое поведение популяции м и кр о о р ган и зм о в при различны х
p H , является зави си м ость о т pH кинетики действия ф ерм ентов,
прежде всего л и м и ти рую щ его рост ф ерм ента. П редставим себе
случай, при к о т о р о м состояние активн ого центра л и м и ти р у ю ­
щ его ф ерм ента определяется двум я ионогенны м и группам и
с ко н стан там и ионизации К л и К ъ:
К
к
E H i+ * ± E H + *± E
(2 .5 6 )
Если каталитически активн а лиш ь ф о р м а Е Н +, то кинетическую
схему м ож н о п редстави ть в виде
n h
2+ +
s
— -:L-
N H 2+S
| | Ka
* aJt
”
NH
Ks
+
S
N H S ------ —
+
S
NS
2NH+
(2.57)
If 4
K b it
N
где N H | + , N H +, N — состоян ия клетки, содерж ащ ие л и м и ти ­
рую щ ий ф ерм ент в ф орм ах Е Н 2 + , Е Н +, Е соответственно.
К инетической схеме (2.57) соответствует уравнение роста
l + H
+ / * a + K b / H +
п
,п ч
<2ЭД
*\+Н +1К: + К'ь1Н +
где Н + — внутренняя концентрация ионов во д о р о д а в ком п артменте, в к о то р о м ф ункционирует ферм ент.
У равнение (2.58) соответствует «классическом у» уравнению
р о ста м и кр о о р ган и зм о в, в ко то р о м м акси м ал ьн ая удельная
скорость и ко н стан та срод ства зави сят от концентрации ионов
водорода:
.. каж
__________ Mm__________ .
(2 59)
\ + н +/к :+ к 'ъ1 Н +’
r,a «
Ks
J + H +W
/H +
п Ат
- К Ч + Н + 1 К ' Ш+ К ' Ъ1 Н ~ -
В соответствии с вы раж ением (2.58) граф ик зависим ости
от pH п редставляет собой си м м етри чн ы й колокол.
И з уравнений (2.58) — (2.60) следует, что ан ал и з зависим ости
ц „ ж о т pH п о зво л яет найти значения кон стант диссоциации
73
групп ком плекса л и м и ти рую щ его ф ерм ен та с су б стратом (К'.л
и К ь’ ), а ан али з p H -зависим ости отнош ения ц “ / ^ , 'аж п риводит
к значениям кон стант диссоциации ли м и ти рую щ его ф ерм ента
в отсутствие связы ван и я с су б стр ато м (К й и А ь).
Э ксп ери м ен тальн о исследуется зави си м ость ц от Н™еш,
т. е. от концентрации ионов в о д о р о д а в культуральн ой среде.
В соответствии с эти м уравнения (2.59) и (2.60) м одиф ициру­
ю тся к виду
ц каж _____________________ Ц т___________________ .
О
1+а/Р(Яв+яет/ ^ ) + р/а(Аь/Нв+неш)’
К клж — К
П
‘
^ ~t" OtH внеш/ Р A a T р/ос (А 'ь / Н вне,ц)
_
s 1 + а Н в+неш/ р А ; + р / а ^ / Н , +неш •
1 '
’
И з уравнений (2.61) и (2.62) видно, что различие внешней
и внутренней концентрации ионов во д о р о д а п риводит к р а з­
личию в эксперим ентально оп ределяем ы х значениях кон стант
ионизации:
А Г = Р /(а А а);
А Г = Р /(а А ь).
(2.63)
(2.64)
Н а практике ш и роко распростран ен случай, когд а субстрат,
связы ваясь с ф ерм ен том , не изм ен яет значений констант
диссоциации ионогенны х групп л и м и ти рую щ его ф ерм ента
[К а —К'а, К Ь= К 1, по схеме (2.57)]. В это м случае константа
связы ван и я K s не зависит от pH :
-4- Н +
/ К ' к а ж _i_ ('к а ж /и +
| 11 внеш/Л
а
I Л ), / П внеш
K s+
s
//-ч s г \
9
причем
Цт “
1
+ Н в+неш/А Г + А Г /Н ввсш-
(2’66)
П ри исследованиях p H -зависим остей эксп ери м ен татору ж ела­
тел ьн о р а б о т а т ь в условиях A s « : S , в это м случае ц = ц£?ж
и для определения кон стант диссоциации удобн о прим енять
логариф м ические коорд и н аты (lg p Ka*, pH ). Л о гар и ф м и р у я в ы р а­
жение ( 2 .6 6 ), получаем
lg ц каж = lg p m- lg (1 + Н в+неш/ К Г + К Г /Н в+неш).
В кислой
области , где Н в+неш» А важ,
м а л ы м и членам и получаем
(2.67)
после пренебрежения
lg ц каж = lg ц т - lg Н в+неш + lg К Г
(2.68)
lg р каж = lg
(2.69)
или
74
+ p H внеш —р К Г -
Граф ик зависим ости в л огарифмических
коорд и натах
(lgp, pH ) в кислой об ласти
им еет вид п рям ой с тангенсом
угла н аклон а + 1 .
П охож ая кар ти н а н аб л ю д а­
ется в щ елочной области , где
К™ж» Н ^ еш,
то гд а
после
упрощ ений получаем
lgj i Ka*
О
l g p - = !g p m- р Н внеш + р * Г .
(2.70)
График зависим ости в л о га­
рифмических координатах так- р и с 2 .1 3 . Т е о р е т и ч е с к и е з а в и с и м о с т и
же п рям ая, но с тангенсом —1.
л о г а р и ф м а ц*** о т p H
В о б ласти н ейтральны х pH ,
если К ааж и Кьаж сильно р азл и чаю тся (п л ато кол окол а
обш ирное), то
l g p Ka*
= lg p m.
(2.71)
Если же К а и К ъ р азл и чаю тся м еньш е чем на порядок
(п л ато ко л о ко л а отсутствует или очень узкое), то д л я описания
зави си м ости ц о т p H н еобходи м о прим ен ять вы раж ение (2.66)
в неи зм ен н ом виде.
• Т ак и м о б р азо м , p H -проф иль р в логариф м ических к о о р ­
ди н атах долж ен и м еть ф орм у двух соединенны х в центре
си гм ои д и из точек пересечения касательны х к обеим ветвям
каж дой из си гм о и д м ож но оп редели ть рК *аж и рК £аж.
И з теории действия ф ерм ен тов следует, что присоединение
од н о го п р о то н а к активн ом у центру ф ерм ен та отраж ается
в p H -зави си м ости скорости в логариф м ических коорди натах
изм енением тангенса угла н аклон а на единицу. Так, в со о тв ет­
ствии со схем ой (2.56) присоединение п ротон а к ф орм е
Е с о б р азо в ан и ем Е Н + п ри вод и т к изм енению тангенса
угла н аклон а от
—1 до 0 (рис. 2.13, а). М ож ет бы ть
и более слож н ая зави си м ость (рис. 2.13, б), где тангенс
угла н аклон а при переходе от низких значений pH к вы сш им
изм еняется следую щ и м о б разом : 2 : 1 : 0 : —2. Э то соответствует
кинетической схеме
E H ^ + < ± E H i+ ? ± E H i + * ± E H + +±E
(2.72)
Н а двух последних стади ях присоединение п ротон ов проис­
ходит с о д и н ако вы м значением рАГа, так что тангенс угла
н аклон а изм еняется о т — 2 д о 0 .
Р ассм о тр и м ряд эксперим ентальны х данны х (рис. 2.14). Рост
дрож ж ей Candida utilis на среде с глицерином кон троли руется
75
одной ионогеннои груп­
пой с р К™жменьш е 4 (пе­
реход тангенса угла на­
клона от
1,0
д о 0 ).
Bacillus megaterium растет
в более узком д иапазоне
pH , при этом рост б ак­
терии кон троли руется по
крайней мере четы рьм я
и оногенны м и группами:
двум я с р К™ж окол о 5,5
и д вум я с рЛ ^аж около
(переходы от 2 до
8
0 в об ласти pH 5,5; пе­
реход о т 0 д о — 2 в о б ­
ласти pH 7,5— 8,0). Еще
более остры е p H -зависи­
м ости роста и м ею т М.
thermoautotrophicum
и
Methanococcus maripaludis,
нек
Зависимости ц “аж от pH для роста
и спользую щ ие д л я роста
и ° ТоРых культур микроорганизмов (в)
м олекулярн ы й
в одород
е Же данные в логарифмических коори
С
0
2.
С
корость
роста
динатах (б):
М.
thermoautotrophicum
реева
u ,'l's на среде с гл и ц ер и н о м (Е. А . А ндс г * и Др., 1970); 2 — Вас. m egaterium на среде
кон трол и руется
одной
м Т'Жозой и ц и т р а т о м (3. В. С ах а р о в а , 1970); 3 —
ионогенной
группой
Р ЧыГl'm oaulotrophicum на га зо в о й см еси Н 2 и С О ,
ludit
nheit et al., 1980); 4 — M ethanococcus maripaС рА^ааж окол о 6,5 и п я­
Ha газо в о й см еси H 2 и С О , (W . Jan es e t al.,
ть ю ионогенны м и груп­
1983)
п ам и с рЛ ^аж окол о 7,5
(тангенс угла н аклон а правой ветви кривой около - 5 ).
Л'Пособ представления эксп ери м ен тальн ы х данны х в логаР ФМических ко о р д и н атах д ает во зм о ж н о сть провести с той или
0и то ч н о стью определение рАГ“аж О сновн ы м м ето д о м провер_ и уточнения найденны х значений р К*™ (в случаях кривых
*: 'Зави си м ости л ю б ой ф орм ы ) является проведение теоретичеси кривой p H -зави си м ости и осущ ествление коррекции ее
м ен °ТЬ до о п ти м ал ьн о го согласовани я с р езу л ь тата м и экспериен та . Т акую процедуру удобн о п р о во д и ть на Э В М , при этом
' Шакэт несколько раз п рям ую зад ач у по п одбору рА ^аж или
Р атн ую задачу — н аход ят р К™ж м ето д ам и м иним изации
Клонений эксп ери м ен тальн ой кри вой о т теоретической.
В дан ной главе б ы ла п р о ан ал и зи р о в ан а кинетика роста
^ Клеточной популяции в наиболее активн ой ф азе ро ста —
ч * экспоненциальной. И з зави си м ости числа клеток (колиРо ТВа б иом ассы ) о т времени м ож н о найти удельную скорость
С[а культуры . О пределение это го п а р а м е т р а не зави си т от
1
Э то уравнение м ож но зап и сать в виде
х
^ М"!— 1^ = ем',
р — (3.4)
где X = M / N 0.
Из уравнения (3.4) X м ож н о в ы рази ть как явную функцию
времени:
*
<
>
)
=
(
3
-
5
)
где
а=
!------;
Mm/N0- r
(3.6)
v ’
b=
(3.7)
Р ассм о тр и м свойства полученного реш ения: 1. В начальны й
м ом ен т времени 7= 0 X = M / N 0 = 1. О бщ ее количество биом ассы
всистеме равн о введенной величине
N 0. 2. П ри бесконечно
б о л ь ш о м врем ени при /-> оо X ( t ) = - = — .
a
N0
К оличество
клеток
(концентрация биом ассы ) вы ходит на предельны й м акси м ал ь­
ный уровень.
П ри отн оси тельно м алы х врем енах процесса на н ач альн ом
этапе его р азви тия, когда яем'<?с 1 , и м еет-м есто экспоненциаль­
ный рост числа клеток:
Х (/) ~ /> е Г
(3.8)
О бы чно м икробиологический процесс п ровод ят в реж име,
когда M m/ N 0 : » l . В этих условиях
a = N 0 /M m; Ь = 1.
▲ С оответствен н о кинетика накопления
п редставлен а логистическим уравнением
х (0 = — S — •
1 + — е*1
'
Мт
(3.9)
биом ассы
будет
< зю )
Н а рис. 3.1 приведена зави си м ость Х (?) при различны х
значениях п ар ам етр о в кривы х N 0 / M m и д. Видно, что значение
N 0 / M m определяет предел накопления биом ассы ; д — скорость
разви ти я процесса.
К ривы е ти па (3.10) н азы ваю т логистическими. Э ти кривые
си м м етри чн ы отн оси тельно времени т, при к о то р о м скорость
разви тия процесса м акси м ал ьн а- В ремя т, при ко то р о м
79
концентрация биом ассы д ости ­
гает половины
предельного
значения, м ож н о вы числить
по уравнению (3.10), прира..
ML
вняв Х = —f :
2 N0
рт = 1п М*
Nn
(3.11)
С оответствен н о, если экспери­
м ен тальн о и сследована вся ки­
нетическая
кривая
роста
и
определены
п арам етры
т и M m/ N 0, значение удельной
скорости ро ста м ож н о д о с т а ­
точно точно определить, ис­
пользуя уравнение
In M ra/ N 0
Рис. 3.1. Кинетика накопления био­
массы [ X ( t ) = M ( t ) / N 0 ], описываемая
логистическим уравнением (3.10):
а — за в и с и м о ст ь
X (/)
при
п о ст о я н н о м
N o/M m= 0 ,0 5 и р а зл и ч н ы х р (уел. ед.):
/ 0 , 5 ; 2 — 0,73; 3 — 1,0: 4 — 2,0; 6 — зави си ­
м о с т ь x ( t ) при п о ст о я н н о м p = i (уел. ед.)
и р а зн ы х
зн ачени ях
N 0/M,„:
/ — 0,05;
2 — 0,04; 3 — 0,028; 4 —0,025; 5 — 0,022
▲ Э ксперим ентальны м
кри тери ем соответствия н а­
б лю д аем ой кинетической кри ­
вой роста логистической кривой м о ж ег служ ить линеаризацИЯ Э к с п е р и м е н т а л ь н ы х Д а Н -
ных
с 0 0 хвехсхвую щ их КООр-
д инатах. И з уравнения (3.3) при M m/ N 0 » l
1п
(3.12)
M „,/N 0X
M m/ N 0 —X
-[It.
следует
(3.13)
Если неизвестно количество клеток в н ачальны й м ом ен т
времени, а известна кинетика М во времени, то м ож но
восп о л ьзо ваться уравнением
М
In м „ -м
=|Л + С,
(3.14)
где C = l n ( N 0 / M m).
Т ангенс у гл а н аклон а зави си м ости логари ф м и ческой функ­
ции уравнения (3.13) или (3.14) о т времени д ает возм ож н ость
определить удельную скорость р о ста р.
▲ Л огистические кривы е часто и сп ользую т для описания
п опуляционной д инам ики р о ста м и кро- и м акр о о р ган и зм о в.
В ряде случаев н аб лю д ается хорош ее соответствие меж ду
теоретическим и кривы м и и эксперим ентов. О д н ако н еобходим о
и м еть в виду, что это описание имеет чисто ф орм альн ы й
80
характер, так как введение в диф ф еренциальное уравнение роста
отр и ц ател ьн о го кв ад р атн о го члена [см. (3.1)] не им еет ясного
м олекулярн о-биологи ческого обоснования. А н али з кинетики
ро ста м и кр о о р ган и зм о в в систем ах с истощ ением (см. ниже)
п оказал, что в н екоторы х частны х случаях кинетика р о ста строго
описы вается уравнением логистической кривой, однако физичес­
кая сущ ность это го связан а не со «взаи м н ы м ингибированием »
роста, а с р асх о д о м в системе л и м и ти рую щ его субстрата.
3.2. И Н Т Е Г Р А Л Ь Н А Я Ф О РМ А У Р А В Н Е Н И Я
К У Л ЬТУ РЫ М И К Р О О Р Г А Н И ЗМ О В
РОСТА
О дним из главны х ф акторов, п ривод ящ и м к зам едлени ю
скорости р о ста популяции клеток, является расход л и м и ти р у ю ­
щ его суб страта. Е сли это т ф актор — единственны й, которы й
огран и чи вает р о ст культуры , то его м ож но учесть в той или
иной м одели роста.
Р ассм о тр и м п ростейш ую двухстадийную м од ел ь ро ста м и к­
робной популяции, п риводящ ую к гиперболической зависим ости
скорости р о ста о т концентрации суб страта, и учтем, что
м еж ду концентрацией биом ассы в зам кн утой системе и кол и ­
чеством су б стр ата им еется линейная связь.
У равнение скорости роста культуры им еет вид ^ М / Л = цМ ,
или
- У 5^ = р М .
(3.15)
Знак минус п оказы вает, что субстрат расходуется в процессе
роста. К оэф ф ициент Ys им еет см ы сл стехиом етрического коэф ­
фициента, к о то р ы й в м и кроби ологи ческой л и тературе получил
название экономического коэффициента. П редп олагается, что
во всем врем енн ом интервале разви ти я культуры Ys постоянен.
И з уравнения (3.15) следует
Ysd S = - d M .
(3.16)
И н тегри рован ие последнего соотн ош ени я приводит к линей­
ной связи м еж ду концентрацией суб страта и биом ассы :
M -N
0
= F s (S 0 - S ) ;
(3.17)
S = S0 - ^ o .
(3.18)
I)
У равнения (3.15) — (3.18) справедливы д л я всех м еханизм ов
роста, характери зуем ы х м н огостади й н остью превращ ения суб­
с тр а т а при отсутствии ослож няю щ их ф акторов, таких, как
и нгибирование и зб ы тко м суб страта или п родуктом ф ерм ен та­
ционного превращ ения.
81
Если в уравнение (3.15) п одстави ть
уравнению (3.18) через М , то получим
Ш
dt
ц м
=
1 +-
М —N 0
Sn-
S,
вы раж енное
U
Чт
1
М
•
по
(3-19)
M (S 0 Ks- M + N 0)
У равнение (3.19) п редставляет собой диф ф еренциальное
уравнение первого порядка с разд ел яю щ и м и ся переменны ми:
dM
77 +
М
(3.20)
M (S 0 r s- M + N 0)
И н тегри рован ие этого уравнения следует вести по перем ен­
ной М в пределах о т N 0 д о М, по перем енной t в пределах
от нуля д о t :
м
Y JC JU
.In —
м Ь
,
Nn
M (S0 y 5- M + N 0)
(3.21)
М-
N„
П о д и нтегральн ую функцию в уравнении (3.21) м ож н о п ред­
стави ть в виде
1
:=
77
M ( y sS0 - M + N 0)
М
(3.22)
+:
KsS0 —M + N 0 ’
где коэф ф ициенты А и В связаны уравнением
H ( y sS0 - M + N 0) + 5 M = l.
(3.23)
И з этого уравнения следует си стем а уравнений, п о зво л яю ­
щ ая найти значения коэф ф ициентов А и В:
- А + В = О,
Л (Г Д > + М 0 ) =
1
(3'24)
г * +Т 5 -
(3'25)
или
А = В —-
С оответствен н о и нтеграл уравнения (3.21) м ож н о зап и сать так:
,
К,А'//М .
М
1 = .. . . In y A + N 0 ‘" N 0
УЛ
ln y,S„ + N о — М
ySo + No ”
1
у. So
‘
(3'26)
С учетом этого и н теграл ьн ая ф о р м а уравнения (3.15) будет
и м еть вид
Э то уравнение известно как интегральн ое уравнение М оно
(см. Д ж . П ёрт, 1978). Запиш ем уравнение (3.27) в ф орм е
(3.28)
( 1 + е ) 1п Д - е 1п
где
(3.29)
Если перейти к б езразм ерн ой перем енной X = M / N 0, то
уравнение (3.28) м ож но п редстави ть в виде
(1
+ (2 ) ln X —£H n(l + а —аХ) = \imt.
(3.30)
где a = N 0 / ( r sS0), или
(3.31)
К у л ьти вирован и е
м и кр о о р ган и зм о в
обы чно
п ровод ят
в условиях, когда предельное накопление биом ассы сущ ественно
п ревы ш ает биом ассу в исходном инокуляте: TsS 0 » N 0, или
а
1. П ри эт о м условии уравнение п ри об ретает вид
(3.32)
П ри н ци п иальн о важ ны д ва следую щ их реж им а функциони­
рования системы .
1.
Условия малого накопления биомассы и небольшого расхода
субстрата:
яХ «1,
Х <к- = 2 ^
О
(3.33)
N0
В эт о м реж им е второй логариф м ический член уравнения
(3.32) близок к нулю:
(3.34)
(3.35)
Т аки м о б р азо м , им еет м есто экспоненциальны й рост культу­
ры и эксперим ентально п роявляется экспоненциальная ф аза
роста.
2.
Режим, близкий к истощению субстрата, я Х -> 1 . П ри
это м условии
-^ -1 п (1 -а Х )» 1 п Х ;
So + * s
(3.36)
83
(3.37)
(3.38)
П ри бесконечно больш их врем енах (при / - » оо)
(3.39)
или
(3.40)
Н акопление биом ассы в системе им еет предел, определяе­
м ы й концентрацией субстрата.
В несколько более общ ем случае с учетом сл агаем ого
а во в то р о м логари ф м и ческом члене уравнения (3.31) пре­
дельное накопление биом ассы будет д ан о функцией
М = r sS 0 + N 0-
(3.41)
■00
• И так, уравнение (3.31) описы вает наиболее характерны е
особенности кинетической кривой роста м икробн ой популяции
в зак р ы то й системе: экспоненциальны й р ост на н ач альн ом
этапе процесса и предельное накопление биом ассы , связанное
с п о лн ы м истощ ением системы по субстрату.
Ф о р м а кинетической кривой накопления биом ассы зависит
о т соотн ош ени я н ачальной концентрации суб страта и кон стан ­
ты К 1.
Рост в условиях первого порядка по субстрату. Если
A^s» S 0, K J S 0 ^ > \, то уравнение (3.32) будет и м еть вид
1пХ -1п(1-аХ ) = ^
(3.42)
или
X
1 —а Х
(3.43)
Э то уравнение логистической кривой [см. уравнение (3.4) и его
реш ение].
Зави си м ость Л'(г) в условиях Ks ^>S0 (систем а не насы щ ена
су б стр ато м ) будет представлена функцией
(3.44)
84
И з уравнения (3.44) проясняется м олекулярн ое и столкование
уравнения Ф ерхю льста. В условиях истощ ения суб страта в з а м ­
кнутой системе в д иф ф ерен ц иальн ом уравнении роста возникает
отри цательны й квадратичны й по биом ассе член вследствие
того , что концентрации суб страта и б иом ассы связаны меж ду
собой линейной связью . Д ей ствительн о, если Ks^>S0, то
dt
К,
v
’
С учетом то го , что S = S 0 ———— , имеем
У.
4 M _ n„S0M
dt
К,
ц,М (М -М 0)
И 46)
K,YS
П о своей ф орм е это диф ф еренциальное уравнение эквива­
лентно уравнению (3.1).
К ан али зу кинетических кривы х роста в условиях Ks^>S0
п рим еним ы м ето ды , используем ы е при исследовании л оги сти ­
ческих кривых:
а. Если найдено врем я т, в течение к о то р о го
величина
X д о сти гает п олови н ы от предельно возм ож н ой , то при
известн ом значении EsS 0 / N 0 м ож но определить группу п а­
рам етров:
К
= _ No.
т
(3.47)
б. Л и неари зац ия кинетической кривой во всем интервале
времени в ко о р д и н атах уравнения
I n—
=^ ° / + С
м т- м
к,
(3.48)
п озво л яет из тангенса угла н аклон а п рям ой определить
п ар ам етр \xmS0/ K s. Если исследование кинетики роста м и к р о ­
ор ган и зм о в п ровод и тся при нескольких различны х начальны х
концентрациях су б стр ата, то н аб лю д аем ы е тангенсы долж ны
линейно зависеть от концентрации суб страта (критерий справед­
ливости соотнош ения A^s: » S 0). Э то п озвол яет из эксперимен­
тальн ы х данны х найти п ар ам етр цт/ Ks.
2.
Рост в условиях нулевого порядка по субстрату. Если
н ачальн ая концентрация суб страта сущ ественно превы ш ает
значение кон станты Ks(S0 ^ * K s), то уравнение роста популяции
в неявной ф орм е будет д ан о вы раж ением
1 п Х - ^ 1 п ( 1 + « Х ) = цт г.
(3.49)
85
В это м случае кине­
тическая кри вая ро ста не
будет и м еть вид си м м ет­
ричной
логистической
кривой (рис. 3.2). В слу­
чае нулевого порядка по
субстрату систем а значи­
тельн ы й период времени
разви вается экспоненциа­
л ьн о, однако затем на
ограниченном
отрезке
времени
вы ходит
на
Рис. 3.2. Сравнение кинетических кривых
предельное значение био­
роста микробной популяции в режиме пер­
массы . Т аки м о б разом ,
вого (Xs » S 0, кривая I) и нулевого ( К5<r S 0,
качественны й вид зависи­
кривая 2) порядков по концентрации лими­
м ости X ( t ) м ож ет д ать
тирую щ его субстрата:
пунктирными линиями обозначены проекции верх­
первичную инф орм ац ию
ней половины кинетических кривых, получаемых
о соотнош ении н ач ал ь­
в результате их двойного зеркального отражения
относительно осей, обозначенных штрихпунктирной концентрации суб­
ными линиями
стр а та и Ks.
И н тегральн ое уравнение роста м икробн ой популяции в усло­
виях истощ ения суб страта м ож н о п редстави ть в ф орм е
1 п Х — Ф 1п(1 — а Х ) = цЦ
(3.50)
где
Ф=
к.
(3.51)
S0 + * , ’
0
=
М А.
So + V
а = -No
М
(3.52)
(3.53)
'
Э то же уравнение м ож н о зап и сать в виде
х
:= е
(1 -аЛ')ф
(3.54)
при этом
Ф = 1, если A , » S
0
Ф<?с 1 , если A^s« : S 0.
(3.55)
И з трех п ар ам етр о в Ф, ц и а, входящ их в уравнение
(3.50), из эксперим ентальны х данны х наиболее п росто оп ределя­
ется а по отнош ению количества концентраций введенных
клеток к п редельн ом у количеству (концентрации) клеток. Если
известно а, то п ар ам етр ы Ф и ц м ож но определить, восп оль­
зовавш и сь одной из линеари зованн ы х ф о р м уравнения (3.50).
Н ап р и м ер , уравнение (3.50) м ож но тр ан сф о р м и р о в ать к виду
86
! ^ = ц + ф ! п Ы
.
(3 .5 6 )
В эт о м случае зави си м ость 1п(Х Д ) д олж н а б ы ть линейной
функцией перем енной In [(1 —а Х ) / /] ; при это м отрезок, отсекае­
м ы й на оси о р д и н ат, д ает п ар ам етр ц, им ею щ ий разм ерн ость
о б р атн о го времени, тангенс угла н аклон а п озвол яет определить
б езразм ерн ы й п ар ам етр Ф.
Д л я определения п ар ам етр о в Ф и р м ож н о и сп ользовать
такж е другую ан ам о р ф о зу уравнения (3.50):
In (11ПХ
—а Х)
Ф+
1п(1 —аХ)
(3-57)
В это м случае отрезок, отсекаем ы й зави си м остью 1пХ/1п(1 —
—аХ ) о т f / l n ( l —аХ ) на оси орд и н ат, равен Ф, тангенс угла
наклон а ц.
А налогично, равн о п равн ой ан ам о р ф о зо й является уравнение
1п(1—я Х )_ 1
In X
Ф
ц
t
Ф 1пХ ’
^
}
по к о то р о м у м ож н о найти п ар ам етр ы 1/Ф и ц/Ф.
П ри известной начальн ой концентрации суб страта и опреде­
ленны х из эксперим ента п ар ам етр ах кривой ро ста Ф и р м ож но
вы числить значение Ks (при Ф, отл и чн ом от единицы), т. е.
(3-59)
и соответствен но найти м акси м ал ьн ую удельную скорость:
вт = ^ .
(3.60)
• Т ак и м о б р азо м , на основании одной кривой р о ста
м и к р о о р ган и зм а при и спользовании и нтегральн ого уравнения,
учиты ваю щ его дин ам ику расхода суб страта, м ож н о найти оба
кинетических п ар ам етр а ро ста м и кроорган и зм а: константу
срод ства Ks и м акси м ал ьн ую удельную ск орость роста р т .
3.3.
П Р И Б Л И Ж Е Н Н Ы Й М Е Т О Д АН АЛИ ЗА
И Н Т Е Г Р А Л Ь Н О Й К И Н Е Т И Ч Е С К О Й К РИ В О Й
РО С ТА П О П У Л Я Ц И И М И К Р О О Р Г А Н И ЗМ О В
П РИ БО ЛЬШ ИХ ГЛ У Б И Н А Х К О Н В Е Р С И И СУБСТРАТА
И н тегральн ую ф орм у уравнения роста популяции м и кр о ­
о р ган и зм о в м ож н о зап и сать в ф орм е
1п£ - ф | п ( ' - £ ) = “ '•
<3 6 1 )
87
представлен в виде степенного ряд а, при это м приближ енное
описание при конечном числе членов ряд а будет тем полнее
со о тв етств о вать точ н ом у значению , чем меньш е степень кон­
версии субстрата:
s0 - s _ м
(3.62)
1п
(1 - $ ) = - $ - у - у
(3.63)
Д ля приближ енного описания кинетики процесса при
м ож н о восп о л ьзо ваться п ервы м членом разлож ения. В этом
случае кинетика процесса будет д ан а уравнением
^ - + Ф^ = ц/
(3.64)
^ + 1п $ + Ф£ = ц/.
(3.65)
1п
или
1п
В несколько более общ ей ф орм е при М, сои зм ерим ы х с N 0,
разлож ени е второго логари ф м и ческого члена уравнения (3.61)
в р яд д ает приближ енное уравнение кинетики ро ста культуры :
(3.66)
О чевидно, что приближ енны е уравнения (3.64) — (3.66) сп равед ­
ливы л иш ь при соотнош ении (М —N 0 ) / M m« : 1, т. е. при
н ебольш их глубинах процесса. В озникает вопрос: до каких
глубин м ож н о и сп ол ьзовать дан ное приближ ение? Ч тобы
о тв ети ть на него, проведем следую щ ий расчетны й анализ.
М ож н о счи тать, что приближ енное уравнение д остаточ н о
х орош о описы вает кинетику процесса, если отклонение п риб ли ­
ж енного реш ения о т точ н ого м еньш е или равн о статистической
ош ибке изм ерения эксперим ентальны х величин. О бы чная то ч ­
н ость изм ерения удельной скорости ро ста популяции м и кр о ­
о р ган и зм о в не превы ш ает 10— 12% . Запиш ем точны й вид
левой части и нтегральн ой ф орм ы уравнения ро ста
(3.67)
а приближ енны й — в виде
(3.68)
88
О тн оси тельное отклонение приближ енного реш ения от точного
будет и м еть вид
ф
Уг - Уп
АУ
У’
У<
In
-In
И*?.>*«-Э]
'■-а
(3.69)
Видно, что отн оси тельное отклонение п риближ енного значе­
ния от точного зависит о т глубины расхода л им ити рую щ его
суб стр ата и определяется двум я б езразм ерн ы м и п арам етрам и:
Ф и M m/ N 0. Д ля оценочны х расчетов м ож но п рин ять значения
M m/ N o = 10, это соответствует весьм а распростран ен ном у слу­
чаю , при ко то р о м число клеток в процессе культивирования
увеличивается в 10 раз. Н а рис. 3.3 приведена зави си м ость
(ут—Уп)/Ут Для ДВУХ п ринципиально важ ны х реж им ов п ротека­
ния процесса: 1) д л я Ф = 1 (это случай S0 <^Ks, реж им первого
п орядка по субстрату, т. е. линейной зави си м ости скорости
процесса о т концентрации субстрата); 2) д л я Ф = 0,1 (это
случай S
р е жи м нулевого п орядка по концентрации
суб страта, т. е. незави си м о­
сти скорости процесса от
концентрации
субстрата).
Видно, что д л я точности
определения
скорости
в 1 0 % приближ енное реш е­
ние описы вает динам ику
процесса д о глубины кон­
версии суб страта 60— 70%
(при Ф = 1 , кривая 1).
Важно
о тм ети ть,
что
в
реж им е
м акси м ал ьн ой
скорости процесса (S0 » / Q
обсуж даем ое приближ ение
с линейны м разлож ени ем
в то р о го логари ф м и ческого
члена адекватно описы вает
кинетическую кривую роста
при весьма высоких глуби­
нах процесса (кривая 2 ).
Рис. 3.3. Зависимость относительного от­
Если значение Ф пре­ клонения приближенного уравнения от
вы ш ает
единицу
(такого глубины протекания процесса для различ­
ных режимов:
р о д а эф фекты м о гу т н а­
* , » • S0, Ф = 1 ; 2 — S o » * , , Ф = 0,1; 3 — ре­
б лю д аться, когда м и кр о ­ жУ—
и м и н ги би р о ван и я п р о д у кто м ф ерм ентац ии ;
бный процесс со п р о в о ж д а­ Ф = 5, уравн ен ие (3.69); 4 К » S0, Ф = 1,0;
ется и нги бирован и ем п р о ­ 5 — S0 »A Ts, Ф = 0,1. уравн ен ие (3.71). Г о р и зо н ­
т а л ь н о й лин и ей о тм еч ен а о б ы ч н ая стат и ст и ­
д у к то м реакции, см. гл. 5),
ческая о ш и бка в о пределении ц (12% )
89
м
t
Рис. 3.4. Кинетические кривые рос­
та микробной популяции в режиме
СИМС
0)
первого порядка (кривая 1, As » >SS 0)
и нулевого порядка (кривая[ 22,,
S0 » Ks) по лимитирую щ ему субстрату:
д в ой н ой
за ш т р и х о ва н н о й
о б л а ст ь ю
п ред ставл ен ы вр ем ен а и гл у би н ы п р о ­
цесса, при ко то р ы х с п р а ве д л и во экспон ен ц и ал ьн о е п рибли ж ен ие; о д н о к р а тн о
за ш т р и х о ва н н о й о б л а с т ь ю п р едставл ены гр ан и ц ы п р и м ен и м о сти п р ибли ж ен п уравнения
v n ;iмнения
н по гго
го обсуж даем ы й приближенны й
п одход им еет основание для
и сп ользован и я при ^ 0 , 5 (кри­
вая 3).
Д л я сравнения на рис. 3.3
п редставлены данны е по отн оси ­
тел ьн ом у отклонению скорости
от точно вы числяем ой величины
в зави си м ости о т глубины п ро­
текания процесса в то м случае,
если используется
первое, наибогглее грубое, приближ ение и анализируется л иш ь экспоненциаль­
ная ф аза роста:
у п= 1 п ^ Ч .
(3.70)
i N0
О тносительное
О Т К Л О Н в Н И е Щ )И блИ Ж вН Н О Г О З н а ч е н и я ф уН К Ц И И ОТ
точ н ого им еет вид
(3.71)
А Видно, что экспоненциальное приближ ение имеет весьма
ограниченную о б ласть прим енения. Без опасения допустить
серьезную ош ибку экспоненциальное приближ ение м ож н о ис­
п о л ьзо в ать до глубин процесса, не п ревы ш аю щ и х 0,15 (кривая
4 на рис. 3.3). Если реакция п ротекает по нулевом у порядку
отн оси тельно су б страта ( Ф « : 1 , S0 ^>K S, то экспоненциальное
приближ ение м ож ет д остаточ н о точно оп исы вать процесс и до
более высоких степеней превращ ения суб страта (кривая 5 на
рис. 3.3). И то ги проведенного ан ал и за и лл ю стри рует рис. 3.4.
С л ед о вател ьн о , при анализе кинетики ро ста м и кробн ой
популяции д л я кинетического описания процесса практически
во всех случаях м ож но об осн ованн о и сп о л ьзо в ать приближ ен­
ные уравнения (3.64) — (3.66), если глубина конверсии субстрата
(глубина р о ста культуры д о м акси м ал ьн о во зм ож н ой полноты )
не превы ш ает 0,7 (рис. 3.3, кривая 7). Э то сущ ественно
р асш и ряет д и ап азон времен, в к о то р о м кинетика процесса
м ож ет б ы ть описана более п росты м уравнением . Н а основе
это го более п р о сто го уравнения м о гу т б ы ть найдены п ар ам етр ы
ро ста культуры . Н ап ри м ер, кинетические данны е, леж ащ ие
в об ласти ^ < 0 ,7 , долж н ы д о стато ч н о хорош о л и н еари зоваться
в к о о р д и н атах уравнения
90
'
м .|
(3.72,
'
Э то уравнение при известных N 0 и М т позволяет найти
п ар ам етр ы р и Ф и соответствен но определить числовые
значения кон стант \хт и Ks.
П ри анализе эксперим ентальны х данны х удобно и сп ол ьзо­
вать разн остн ы й м етод, которы й д ает возм ож н ость избеж ать
неопределенностей, связанны х с неточностью нахож дения N 0
и периода индукции т. Д ля фиксированны х времен tt и tj
справедливы соотнош ения
1пМ ( —1ПЫ 0 + Ф ^ —
(3.73)
In М - I n N q + Ф ^ —Ф — = р/..
1
0
мт
мт и 1
Вычитание этих уравнений п риводит к равенству
|П 5 Гj + ! Гт ( М < - М < 'Ь И < .- 'Л -
<3-74»
П редставление эксперим ентальны х данны х в коорд и натах этого
разн о стн о го уравнения
1п М ,/М ,
li-tj
Ф М .- М )
Mm t , - t j
п озво л яет определить п ар ам етр ы р и Ф /М т и при известном
М т найти константы рт и K s.
3.4.
П РИ М Е РЫ
АН АЛ И ЗА Э К С П Е РИ М Е Н Т А Л Ь Н Ы Х
РОСТА П О П У Л Я Ц И И
КРИ ВЫ Х
Р ассм о тр и м на нескольких прим ерах ан ал и з кривых роста
популяции м и кр о о р ган и зм о в в рам ках интегральны х кинетичес­
ких кривых и п р оиллю стри руем , какую и нф орм ац ию о природе
п ротекаю щ и х процессов м ож но получить используя обсуж дае­
мы й подход.
Н а рис. 3.5 приведена кинетическая кривая роста водородокисляю щ ей бактерии Alcaligenes eutrophus. Рост культуры
л и м и ти р о в ан по азоту, и через какое-то врем я в результате
расхо да азо тн о го ком пон ен та он останавли вается. Д ля кол и ­
чественного ан ал и за эксперим ентальны х данны х удобно провес­
ти следую щ ие операции.
1.
Оценка параметров ц и N 0 из начального участка
кинетической кривой. Н а н ачальны х этап ах разви ти я процесса
до глубин накопления М в 1 0 2 0 % от п редельного значения
91
Рис. 3.5.
Кинетика роста
A. eutrophus
с лимитацией по источнику азота (а)
(Г. А. Заварзин, 1978) и линеаризация
начального участка кривой в полулога­
рифмических координатах (б)
Рис. 3.6.
Линеаризация
данных
рис. 3.5 в координатах уравнения
(3.77)
М т (первы е четы ре точки на кинетической кривой) м ож но
с д о стато ч н о й степенью достоверн ости пренебречь расходом
субстрата. В этих условиях рост культуры п роисходи т экспонен­
циально и д и н ам и ка процесса м ож ет б ы ть представлена
простейш им уравнением
(3.76)
In М = In N 0 + \it.
И спользовани е этого приближ ения п озвол яет сд елать оценку
п ар ам етр о в N 0 и ц. П ар ам етр N 0 п редпочти тельн о определять
независим о как начальную концентрацию клеток в инокуляте
(или величину, линейно связанную с н ачальной концентрацией
клеток, н априм ер оптическую п лотн ость в начальн ы й м ом ен т
времени). С другой сторон ы , N 0 м ож н о найти кинетическим
м е т о д о м из экстраполяции кинетических данны х к нулевом у
м о м ен ту времени (в предполож ении, что на кинетической
кривой отсутствует период индукции).
Н а рис. 3.5, б приведены данны е н ач альн ого участка кинети­
ческой кривой рис. 3.5, а в полулогариф м ических коорди натах.
Т ангенс угла н аклон а этой зависим ости д ает оценку ц = 0,13 ч - 1
и оценку N 0 = 6 • 10 ~ 2 on. ед. (данны е рис. 3.5 приведены
в единицах оптической п лотности, соответствен но и значение
N 0 такж е дается в единицах оптической плотности).
2.
Линеаризация всей кинетической кривой в координатах
интегрального уравнения роста с истощением субстрата.
У равнение (3.56) м ож но п р ео б р азо в ать к виду
ln ( M /N 0) _
t
92
n„,S0
S0 + K s
К,
S0 + K s
In (1 —M /M ,,)
l
(3.77)
где
M m— м акси м ал ьн ое
значение биом ассы , н а­
б лю д аем о е при п олн ом
расходе субстрата. И з эк­
сп ери м ентальн ы х данны х
это значение оп ределяет­
ся как асим птотическое,
к ко то р о м у стрем и тся ко ­
личество биом ассы в си­
стеме.
Д ля
данны х
рис. 3.5 величина М т р ав ­
на 17,2 ОП. ед.
Рис. 3.7. Линеаризация данных рис. 3.5 в коТ аки м о б р азо м , опреординатах уравнения (3.78)
д елив эксперим ентальны е значения N 0 и М т , м ож но вычислить
функции l n ( M /N 0)/r и l n ( l - M / M m) / / и п острои ть зави си м ость
одной перем енной величины от другой. Если эксп ери м ен таль­
ные данны е со о тветствую т интегральн ой кривой роста м и к­
ро о р ган и зм а, то эта зави си м ость д олж н а и м еть линейны й
характер; при это м м ож но определить два п ар ам етр а прямой:
p=
и Ф=^s+ S o
s
К ‘
0 + a: s
Важно о б р ати ть вним ание на следую щ ее обстоятельство.
Н аи б о л ьш ей статистической ош ибке в коорд и н атах уравнения
(3.77) подверж ены точки, леж ащ ие вблизи значения М -* 0 и
М -> М ш (первая и последняя точки на кинетической кривой
рис. 3.5). П о это м у при об раб отке данны х рис. 3.5 в этих
коор д и н атах эти две точки не учиты вались (рис. 3.6). И з
рисунка следует, что тангенс угла н аклон а п рям ой дает
значение Ф, равное 1,1 ± 0 ,1 ; отрезок, отсекаем ы й на оси
ор д и н ат,— удельную скорость роста ц = 0 ,1 3 ± 0 ,0 5 " '.
Д ля ан ал и за эксперим ентальны х данны х м ож но восп ол ьзо­
ваться и другим и линейны м и
ан ам о р ф о зам и
уравнения
(3.50). Н апри м ер, на рис. 3.7 приведена кинетическая кривая
роста указанной водородоки сляю щ ей бактерии в коорди натах
уравнения
ln ( M /N 0)
ф
|
l n ( l —M /M J
______ 1________________
In(1—M /M m) ’
И 78)
KD' , 0 )
И з рисунка видно, что р д остаточ н о надеж но определяется
по тангенсу угла н аклон а п рям ой , в то врем я как Ф, равн ая
отрезку, о тсекаем ом у п рям ой на оси орд ин ат, определяется
с больш ой ош ибкой: р = (0,135 + 0,05)4 1 и Ф = 1 ,5 + 0,7.
Н аконец, м ож н о в осп ол ьзоваться уравнением
In (1 —M /M m) _ 1
ln (M /N 0)
Ф
р
t
Ф ln (M /N 0)
(3.79)
93
В соответствии с эти м у р а­
внением отрезок, отсекаем ы й
п рям ой на оси орд и н ат, равен
1/Ф, а тангенс угла н аклон а —
п арам етру ц/Ф (рис. 3.8). В ко­
орд ин атах уравнения (3.78) п а­
р ам етр Ф определяется с за ­
м етной ош ибкой: Ф = 1,1 + 0 ,1 5 ,
в то же врем я ц определяется
д остаточ н о
точно:
р = (0 ,1 3 3 ± 0 ,0 0 3 )ч -1.
Все и сп ользован н ы е здесь
к оорд и н аты п ри вод ят к со­
гласую щ им ся значениям п ар а­
м етр о в Ф и р.
Э ксп ери м ен тальн о найден­
Рис. 3.8. Линеаризация данных рис. 3.5
ное значение Ф равн о единице.
в координатах уравнения (3.79)
Э то озн ач ает в соответствии
с уравнением (3.51), что в р ам ках проведенного эксперим ента
Ks » S 0, т. е. использован н ая на опы те концентрация суб страта,
в д ан н о м случае источника а зо т а 1 г/л , сущ ественно меньш е
н аб лю д аем о й кон станты срод ства исследуем ого о р ган и зм а
к д ан н о м у субстрату. С оответствен н о из п роведенного экс­
перим ента н евозм ож но определить п ар ам етр ы р„, и K s, а м ож но
лиш ь найти их отнош ение.
О п ы т по вы ращ и вани ю культуры Al. eutrophus п роводи лся
в реж им е S0 <s:Ks. К ачественно это м ож н о б ы ло бы п ред­
полож ить из вида кривой (см. рис. 3.5), поскольку она
практически си м м етри чн а отн оси тельно точки перегиба. О п ре­
деление Ф п о казал о, что это дей ствительн о так. П ри Ф ~ 1
кривая р о ста д о лж н а и м еть си м м етри чн ы й характер, при
Ф <к1 д о л ж н а возни кать аси м м етри я (см. рис. 3.2). Э то о з­
начает, что данны е рис. 3.5 долж ны л и н еари зоваться и в ко­
о р д и н атах более п ростого уравнения Ф ерхю льста, которое,
как б ы ло показано, является частн ы м случаем общ его у р ав ­
нения (3.30), реали зую щ егося при условии
3.5. РА ЗН О С ТН Ы Й М Е Т О Д АН АЛИ ЗА
П О Л Н Ы Х К И Н Е Т И Ч Е С К И Х К РИ ВЫ Х
РОС ТА М И К Р О О Р Г А Н И ЗМ О В
П ри ан али зе кривых р о ста м и кр о о р ган и зм о в , как правило,
во зни каю т некоторы е ослож н яю щ ие об стоятел ьства. Ч асто они
связаны с тем , что эксп ери м ен тальн о труд н о бы вает определить
начальн ую кон ц ен трац ию б иом ассы N 0 или начальн ую концент­
рац и ю ввод и м ого в систему п родукта (если ан ал и з кинетики
94
ро ста культуры ведется по каком у-л и б о продукту реакции).
Их концентрация м ож ет б ы ть сущ ественно ниже п орога
чувствительности м ето д а их регистрации. Вычисление п ар ам ет­
ра N 0 п о экстраполяции экспоненциальны х кривы х к нулевому
времени с и сп ользован и ем уравнения (3.76) м ож ет приводить
к сущ ественны м ош и б кам , если кинетика роста м и кроорган и зм а
вклю чает период индукции, в течение к о то р о го идут ад ап ­
тац и онн ы е процессы, не связанны е с накоплением биом ассы .
Важно о тм ети ть, что часто вообщ е н евозм ож н о сказать, имеет
ли м есто на кинетической кривой роста период индукции,
поскольку он м о ж ет «м аски роваться» экспоненциальной фазой.
У казанны х слож ностей п озвол яет и збеж ать применение
разн о стн о го м етода ан али за. Запиш ем уравнение (3.61) для
н екоторого ф иксированного времени
—т, где т — период
индукции;
— общ ее врем я р азви ти я процесса:
In М, - In N 0 - Ф In (M m- М,.) + Ф In M m= ц (/,• - т),
(3.80)
где М,. — количество (концентрация) биом ассы , соответствую ­
щее времени
—т.
Д л я какого-ли бо д ругого времени t} —т уравнение (3.61)
будет и м еть вид
In М ; —l n N 0 —Ф 1п(М т —М^) + Ф1п М т = ц (/; —т).
Е сли вычесть
будем им еть
уравнение
(3.80)
из
уравнения
(3.81)
(3.81),
то
<3-82>
Видно, что полученное уравнение не вклю чает неопределен­
ные п ар ам етр ы N 0 и т. У равнение (3.82) весьм а полезно при
ан али зе кривых ро ста м и кроорган и зм ов. Если имеется к эк­
сперим ентальны х точек, то м ож н о получить к ( к —\)12 п оло­
ж ительны х разностей
и такое же количество значений
функций
In ^
и I n M" M j. Величины Ф и ц м огут бы ть
М,
Мт —м,
найдены из ан ал и за полученного пула числовы х значений при
исп ользован и и л ю б о й из возм ож н ы х линейны х м одиф икаций
уравнения (3.82). Н апри м ер, на рис. 3.9 приведены данны е по
кинетике ро ста водородоки сляю щ и х бактерий AI. eutrophus
(рис. 3.5) в коо р д и н атах уравнения
1п м
In (M j/M ,) _
tj-tl
+ ф
т- м у
M m- M ,
tj-ti
Видно, что эксперим ентальны е данны е весьма хорош о
описы ваю тся уравнением (3.83). П ар ам етр ы ц и Ф соответственно
95
C H .O H ,
Рис. 3.9.
рис. 3.5 в
Линеаризация
данных Рис. 3.10. Кинетические кривые расхода
координатах уравнения метанола (а) и накопления метана (б)
(3.83)
и диоксида углерода (в) в процессе роста
Ms. vacuolata
равны (0,13 ± 0,01) ч - 1 и 1,15 + 0,15 и близки к ранее найденны м
п ар ам етр ам д л я этой же системы по уравн ен иям (3.77) —(3.79).
В качестве д р угого п рим ера р ассм о тр и м кинетику м е та б о ­
л и зм а м и кробн ой популяции Methanosarcina vacuolata (рис. 3.10).
Т ак как исследование кинетики процесса ведется по субстрату
N
или продукту, то уравнение (3.83) при условии, что — < 0 ,1 ,
Мш
м ож ет бы ть записано в виде
In
So —Sj
so - s ' - n , ф И Э Д .
(3.84)
p -P
In (P,/P,)
*1
‘i - ' i
,
= Ц+ Ф
In —
—
p ,-p .
(3.85)
tj-tl
О б р аб о тк а эксперим ентальны х данны х по м етаб о л и зм у Ms.
vacuolata в коо р д и н атах уравнений (3.84) — (3.85) п риводит
к значениям:
Ф = 0 ,6 5 + 0,13 (данны е по кинетике расходы м етан ола);
ц = (0 , 2 2 + 0 ,0 2 ) сут ~ 1;
96
тическая кри вая р о ста общ его числа клеток им еет типичны й
вид, вклю чаю щ и й экспоненциальную ф азу с зам ед лени ем ро ста
и вы х о д о м на предельны й уровень. С оверш енно п о-другом у
вы гл яди т п опуляционная кривая числа клеток (М я), сохран я­
ю щ и х способность к делению (рис. 3 .1 2 ,6 ). Видно, что типичная
кинетическая кри вая изм енения в системе ж изнеспособны х
клеток в н ачальны й период времени экспоненциально растет,
д ости гает м акси м у м а и в д ал ьн ей ш ем бы стро п адает, т. е.
н аряд у с процессом экспоненциального ро ста ж изнеспособны х
клеток п ротекает процесс их инактивации, заканчиваю щ ийся
почти п олн ы м объединением популяции по ж изнеспособны м
клеткам . Ч ерез 15— 20 ч общ ий р о ст популяции д ости гает
насы щ ения, при эт о м в популяции остается всего лиш ь
несколько процентов клеток, способны х к делению .
К инетические кривы е типа представленны х на рис. 3.12 м огут
б ы ть получены на основе по крайней мере двух м одельны х
представлений. Н азо вем эти м одели прогрессирующая некомпе­
тентность и запрограммированный отказ. Р ассм отри м кинети­
ческие зако н о м ер н о сти д л я обоих м ехан и зм ов процесса.
Прогрессирующая некомпетентность. И зм енение кон ц ен тра­
ц и и ж изнеспособны х клеток М я м ож н о п ред стави ть в виде
^ р яМ я- Ш
я)
(3.88)
где
ця — удельн ая скорость роста делящ ихся клеток, ко то р ая
зави си т о т концентрации ли м и ти рую щ его суб страта, явл яю щ е­
гося, в свою очередь, функцией времени; X — кон стан та ск о р о ­
сти
инактивации, частота «отказов», приводящ их к потере
способности клеток к делению .
Н акопление в системе «неком петентны х», не способны х
к делению клеток М , описы вает уравнение
^ = Ш
,.
(3.89)
О бщ ее число клеток (М ) в системе определяется сум мой:
М = Мд + М;.
(3.90)
С оответствен н о
\л
dt
"•
(3.91)
С истем а уравнений (3.88)— (3.91) описы вает основны е зак о н о ­
м ерности р азви ти я популяций. К сож алению , аналитическое
и нтегрирование этой систем ы уравнений неосущ ествим о, однако
м ож но получить д о статоч н о д етал ьн ую и н ф орм ац и ю о свой­
ствах систем ы на основе ее качественного ан ал и за и численного
интегрирования.
4*
99
В ажной особен н остью в поведении систем ы является ее
экстрем альны й характер по М а. К ром е того, кинетическое
поведение системы в зн ачительн ой степени определяется д и н а­
м икой изменения в систем е концентрации субстрата.
К ак видно из уравнения (3.88), по мере разви ти я процесса
первый полож ительны й член его ум еньш ается, второй о тр и ­
цательны й растет за счет роста М а и соответствен но возникает
ситуация, в ко торой d M a/dt = 0. Э то условие м акси м ум а
концентрации ком петентны х клеток.
Если принять, что удельная скорость роста как функция
концентрации су б страта дается уравнением М оно (1.3), то из
уравнения (3.88) при условии d M a /dt = 0 следует
(3.92)
где tm— врем я достиж ения м ак си м у м а по М а.
И з уравнения (3.92) м ож н о найти концентрацию клеток
М (/т ) в м о м ен т м акси м ал ьн ой плотности популяции по
ком п етен тн ы м клеткам :
(3.93)
П оскольку концентрация суб страта и общ ее число клеток
М связаны линейно, кон ц ен трац ия суб страта в м о м ен т п рохо­
ж дения м акси м у м а по М а им еет вид
(3.94)
В ремя достиж ения м акси м ум а по М а соответствует точке
перегиба на кинетических кривых роста общ его числа клеток
М или расхода суб страта S (это следует из условия равенства
нулю d М j d t 2 в точке перегиба). И нтересно о тм ети ть, что
концентрация су б страта в м акси м ум е по М а или в точке
перегиба кинетической кривой расхода суб страта определяется
то л ьк о кинетическими п ар ам етр ам и роста цт , X, Ks и не
зависит о т начальн ой концентрации субстрата.
А У добн о п р о ан ал и зи р о в ать поведение систем ы в двух
приближ ениях.
1.
Начальный период развития процесса при малых глубина
расхода субстрата. В период экспоненциального роста кон­
центрация ли м и ти рую щ его суб страта сохраняется практически
постоянной: S (/) = S0, ца = цт , а. С оответствен н о уравнение (3.88)
м ож н о зап и сать в виде
100
(3.95)
И н тегри рован ие это го уравнения при начальны х условиях t = О,
M u = M uo приводит к функции
М а = М ио е < ^ “- Х^
(3.96)
Д ин ам ику изм енения концентрации н еком петентны х клеток
м ож но найти из уравнения (3.89), подставив в него уравнение
(3.96), и провести интегрирование:
(3.97)
И наконец, из условия (3.90) н аходим
jyj
Цм, дМдО
,а —X)t
(3.98)
Цт.о-7.
Видно, что кинетику накопления биом ассы описы вает экс­
п оненциальная функция, при этом оп ределяем ая на опы те
удельная скорость ро ста д ается уравнением
(3.99)
2.
Развитие процесса на большую глубину, т. е.
в реж им истощения субстрата, когда S « 0 и р „ ~ 0 .
В это м реж им е, согласно (3.88), имеем
dM
~dt
переход
(3.100)
где M 0>m— м акси м ал ьн ая кон ц ен трац ия М в.
И н тегри рован ие это го уравнения п ри вод и т к функции
(3.101)
В это м реж им е концентрация ком петентны х клеток д олж н а
экспоненциально падать.
Запрограммированный о тказ. О граничение ро ста клеточной
популяции м о ж ет и м еть специфический характер зап р о гр ам м и ­
рован н о го о тказа. Биохим ические м ехан изм ы , останавли ваю щ и е
п роли ф ерац ию клеток, и м ею т, по-види м ом у, различную п ри ­
роду. В настоящ ее врем я ясно, что в ряде случаев остановка
р о ста связан а с потерей чувствительности клеток к ро сто в ы м
ф ак то р ам среды . В качестве п рим ера рассм о тр и м особенности
ро ста популяции л и м ф оц итов, и ндуц ирован н ого действием
ростовы х ф акторов. Н апри м ер, д ин ам ика появления и исчез­
новения на клеточной м ем бране Т -ли м ф оц и тов рецептора
к ф актору ро ста характери зуется тем , что б ы страя экспрессия
рец еп тора см еняется стадией его потери. В озм ож но, что
101
«десенситизация» рец еп тора к р о сто в о м у ф актору связан а
с м ех ан и зм о м его инактивации в процессе реакции.
Р ассм о тр и м кинетику процесса и проследим , как дин ам ика
экспрессии рец еп тора м ож ет отр аж ать ся на д ин ам ике роста
клеточной популяции. К инетику изменения числа рецепторов
(R ) на клеточной м ем бран е д о стато ч н о строго описы вает
уравнение
R = / * ( e - x,- e - " ) ,
(3.102)
где А — п остоян н ая, оп ред еляем ая кинетическими п арам етрам и ;
а — кинетический коэффициент, связанны й с дин ам икой роста
количества рецепторов; X— кинетический коэффициент, оп ре­
деляю щ и й ск орость инактивации, потери рецептора.
Если предполож и ть, что ск орость деления клеток п р о п о р ­
ц и он альн а числу рец еп торов на клеточной м ем бран е, т. е.
Ц = Ц0 К ,
(3.103)
то кинетика ро ста ком петентны х клеток будет д ан а уравнением
М а = М о0ЦоК'.
(3.104)
Если
п ар ам етр ы а и X отл и чаю тся сущ ественно
( а » Х ) , то
уравнение скорости роста ком петентны х клеток будет им еть вид
M a = M a0 e ^ ° e Ч '.
(3.105)
▲ Р ассм о тр и м свойства уравнения (3.105).
1. Ч исло репликационно ком петентны х клеток экспоненци­
ал ьн о растет в н ачальны й период времени (когда сп раведливо
соотнош ение Xt « : 1):
М а = М а0 е Цо?.
(3.106)
2. Н аличие м акси м ум а при
tm= 1/Х,
(3.107)
т. е. врем я достиж ения м акси м ум а определяется то л ьк о кине­
тическим п ар ам етр о м экспоненциального о тк аза и не зависит
от концентрации суб стратов, начальн ой концентрации клеток
[уравнение (3.107) следует из условия d M a/dt = 0].
3. К оэф ф ициент ам плиф икации М а>т, или м акси м альн ое
число ком петентны х клеток, определяется кинетическими п а­
р ам ет р ам и процесса в соответствии с уравнением
^
М „о
= е Цо/Х-е.
(3.108)
v
’
4. П ри бесконечно больш их врем енах процесса число к о м ­
петентны х клеток вы ходи т на исходны й уровень:
102
Рис. 3.13. Кинетические закономерности роста В-лимфоцитов, индуцированного
фактором роста В-клеток (кривая 1), и Т-лимфоцитов, индуцированного
интерлейкином (кривая 2): прямые 3, 4 отраж аю т преобразование кривых 1, 2
в координатах уравнения (3.113)
lim М й = М а0.
Г—*00
(3.109)
У равнение (3.106) уд о вл етвори тел ьн о описы вает дин ам ику при­
менения В- и Т -ли м ф оц и тов в культуре ткани (рис. 3.13). Э то
уравнение получено из предпосы лок, связанны х с экспонен­
ц иальной потерей чувствительности клеток к ростовом у ф ак то ­
ру, о днако оно справедли во д ля л ю бы х систем с экспонен­
ц и альн ы м о тк а зо м (экспоненциальная инактивация реплициру­
ю щ его ком плекса, экспоненциальная инактивация клю чевых
ферм ентны х систем и др.).
3.6.2. Сравнение и дискриминация кинетических моделей
ограничения клеточного роста
К ак следует из вы ш еизлож енного, сущ ествует две группы
м ехан изм ов, определяю щ их пределы ро ста клеточны х популя­
ций: 1 ) р асход л им ити рую щ и х субстратов; 2 ) появление в про­
цессе ро ста культуры субпопуляции клеток, п отерявш их способ­
ность к активн ом у делению . П оследн ю ю группу м ехан изм ов
м ож н о разб и ть на д ва подкласса: п рогрессирую щ ая неком ­
петентность и зап р о гр ам м и р о в ан н ы й отказ.
О тли чи ть м еханизм истощ ения систем ы по субстрату от
м ехан изм а появления неактивной субпопуляции клеток д о с та ­
точно просто. Н аиболее надеж ны м сп особом представляется
определение в процессе роста культуры числа клеток, способны х
к активн ом у росту. Д ля б актериальн ы х клеток это м ож ет
103
б ы ть м е то д подсчета колоний при посеве на тверды е среды
д л я клеток культуры ткани — м етод, основанны й на и сп ол ьзова­
нии витальн ы х красителей.
К ак следует из рис. 3.12 и 3.13, ограничение роста как
бактери альн ы х клеток, так и л и м ф оц и то в связано с н акоп ­
лением неактивной клеточной субпопуляции. Естественно воз­
никает вопрос: м ож но ли в рам ках этого м ехан изм а р а згр а ­
ничить случаи зап р о гр ам м и р о в ан н о го о тк аза и прогрессирую ­
щей неком петентности?
Рассмотренны е модели роста путем накопления субпопуляции
клеток, потерявш их способность к репликации, приводят к качест­
венно близким кинетическим карти н ам разви тия активной
субпопуляции клеток. О днако количественные различия позволяю т
ди скр и м и н и р о вать м одели и из ан ал и за эксперим ентальны х
данны х получить и нф орм ац ию о м еханизм е остановки роста.
М ожно предлож ить следующие критерии дискриминации моделей.
▲ 1. Кинетическое поведение на начальном этапе развития
процесса. О тклонение от экспоненциального поведения в случае
м ехан изм а прогрессирую щ ей н еком петентности определяется
степенью конверсии суб страта и долж н о н аб лю д аться при
д о стато ч н о высоких глубинах реакции, в то врем я как в случае
зап р о гр ам м и р о в ан н о го о тказа отклонение от экспоненциаль­
ного поведения до лж н о н аб лю д аться уже при м алы х конверсиях
субстрата.
О тклонение от экспоненциального роста в случае за п р о гр а м ­
м и р о ван н о го о тк аза весьм а сущ ественно. И з уравнений (3.88),
(3.104) следует
41г>м„
,
(3.110)
прогрессирующая некомпетентность
^
= ц0 е - * ' ( 1 - ? 4
(3.111)
запрограммированный отказ
В условиях сп раведли вости (3.110) d\n M a /<7? = const до
20 40% конверсии суб страта в случае зап р о гр ам м и р о в ан н о го
о тк аза с сам о го н ачала долж н о н аб лю д аться уменьш ение
тангенса угла н аклон а н ач альн ого участка кривой в п олу­
логариф м ических коорди натах. Д аж е при постоянной концен­
трац и и су б стр ата м ехан изм зап р о гр ам м и р о в а н н о го о тказа
обеспечивает полное прекращ ение клеточн ого роста.
И з рис. 3.14 видно, что культура Namalva, лиш енная
м ех ан и зм а зап р о гр ам м и р о в ан н о го о тказа, разви вается экспо­
ненциально (2 ), что гов о р и т о д о стато ч н о м количестве суб стра­
тов, в то врем я как н орм ал ьн ы е клетки В -лим ф оцитов
зам ед л я ю т, а п о том п рекращ аю т свой рост (7).
104
0
5
10
15
i,4
----------------1
1---------------------- 1-------------------- 1----------------
1п[(1 пТ^г)/ *1
0
98
96
m
192 t,4
Рис. 3.14. Сравнение кинетических
кривых роста нормальных В-лимфоцитов (1) и клеток лимфоидной
культуры Namalva (2) (рост клеток
индуцировался действием специфи­
ческого белкового фактора роста
В-клеток)
0
25
50
15
t, 4
Рис. 3.15. Сравнение кинетических
кривых роста популяции Е. coli
(кривая I) и Т-лимфоцитов (кривая
2) в координатах уравнения «за­
програм мированного
отказа»
(3.113)
2.
Различия в кинетических уравнениях и их анализ. И з
уравнения м одели зап р о гр ам м и р о в а н н о го о тк а за (3.105) следует
(3.112)
т. е. эксперим ентальны е данны е в случае реали заци и этого
м ехан изм а остановки ро ста долж ны л и н еари зоваться в ко о р д и ­
натах 1п(1/г) и 1п(Ма/М й0) от t, в то врем я как кинетические
данны е по развитию популяции с м ехан изм ом «прогрессирую щ ей
неком петентности» не долж ны описы ваться эти м уравнением.
И з рис. 3.15 видно, что эксперим ентальны е данны е по росту
Г -ли м ф оц итов д о статоч н о хорош о оп исы ваю тся уравнением
(3.112), т. е. о становка ро ста популяции ли м ф оц и тов осущ ес­
твляется по механизм у зап рограм м и рован н ого отказа. Н апротив,
рост E.coli не описы вается уравнением (1.112) и, п о-видим ом у,
согласуется с м ех ан и зм ом прогрессирую щ ей неком петентности.
3.
Запрограммированный отказ — жесткий механизм, ограни­
чивающий рост клеток. М акси м ал ьн ое увеличение числа
клеток определяется уравнением (3.108). Если известны р 0
и X, то м о ж ет б ы ть вычислено теоретическое значение
коэф ф ициента ам плиф икации. Т ак, из эксперим ентальны х д ан ­
ных по росту E.coli, представленны х на рис. 3.12, а такж е
105
из серии нескольких независим ы х эксперим ентов б ы ло оценено
р « 2 ч - 1 , Х. = 0 , 4 ч - 1 . С оответствен н о теоретический коэф ф и­
циент ам плиф икации д л я этой систем ы ца т долж ен бы ть
равен 6,35. Э ксп ери м ен тальн о н аб лю д ается величина выш е
600. Видно, что рост популяции Е. coli не описы вается
уравнениям и м ехан изм а зап р о гр ам м и р о в ан н о го отказа.
Т аки м о б р азо м , сравнение эксперим ентальны х данны х по
росту б актери альн ой и л и м ф оц и тарн ой клеточны х популяций
п оказы вает принципиальное различие в м ехан изм ах остановки
клеточн ого роста. В то врем я как предельная п лотность
б актери альн ой популяции определяется м ехан и зм ом прогресси­
рую щ ей неком петентности, рост популяции В- и Т -ли м ф оц и тов
ограничивается м ех ан и зм о м зап р о гр ам м и р о в а н н о го отказа.
• П о -ви д им ом у, в м еханизм е репликации клетки Е. coli
залож ен процесс, п риводящ ий к потере репликационного потен­
циала. Э то м ож ет б ы ть как специфическая инактивация
реп ли кац и онн ого ком плекса (наприм ер, через терм ои н акти вац и ю
или протеолиз), так и неспецифический процесс «старения» клет­
ки, связанны й, наприм ер, с разруш ением м ем бранн ы х структур.
О граничение ро ста лим ф оц и тарн ы х клеток происходит по
сущ ественно более «ж естком у» м еханизм у. Н аиболее вероятн ы м
представляется м ехан изм десенситизации рецепторов к специфи­
ческим б елковы м ф ак то р ам роста.
В д ан ной главе рассм отрены кинетические уравнения,
оп исы ваю щ ие д ин ам ику роста м и кробн ой популяции во
всем диап азон е времени процесса. С учетом связи между
* расх о до м су б страта и накоплением м и кробн ой биом ассы
уравнение скорости ро ста м ож ет б ы ть п роин тегри рован о
и получено соотнош ение в неявной ф орм е м еж ду числом
клеток и времени. О дн ако и в неявной ф орм е найденное
реш ение м ож н о со гл асо вать с эксп ери м ен тальн ы м и дан ны м и
и оп редели ть п ар ам етры роста популяции м и кроорган и зм а.
Важно о тм ети ть, что тради ци он ное представление о зам едлении
скорости ро ста культуры при вы сокой п лотности популяции
(появление о тр и ц ател ьн о го кв ад р атн о го члена) является о т ­
раж ением расхода субстрата.
В д ан ной главе обсуж дается несколько м етодов, п озво­
ляю щ и х и н тер п р ети ровать эксп ери м ен тальн ы е данны е в рам ках
интегральн ой ф орм ы уравнения роста. В ряде случаев наиболее
удобен разн остн ы й м е то д ан ал и за полны х кинетических кривых.
П о м и м о расхода л и м и ти рую щ его суб страта зам едление
роста м ож ет б ы ть вы зван о накоплением п родуктов
ингиби­
то р о в ро ста, а такж е появлением в популяции клеток, п отеряв­
ших способн ость к разм нож ен ию . П оследний случай м ож но
оп исать в р ам ках двух м оделей: п рогрессирую щ ая н еком петен т­
ность и зап р о гр ам м и р о в ан н ы й отказ.
1
106
ГЛАВА 4
ИНГИБИРОВАНИЕ РОСТА ПОПУЛЯЦИИ
МИКРООРГАНИЗМОВ ИЗБЫТКОМ СУБСТРАТА
О дной из характерны х особенностей роста м и кроорган и зм ов
являю тся часто н аб лю д аем ы е эффекты его ингибирования
и збы тко м субстрата. У дельн ая скорость роста культур м и кр о ­
орган и зм о в на н ач альн ом участке зави си м ости растет с увеличе­
нием концентрации суб страта, вы ходит на «насыщ ение», а затем
при высоких концентрациях суб страта начинает ум еньш аться.
В силу этого активны й рост популяции становится возм ож н ы м
л и ш ь в узком диапазоне концентраций субстрата. Ф еномены
так о го р о д а тр еб у ю т тщ ател ьн ого ан ал и за и объяснения.
Р ассм о тр и м ряд кинетических схем, объясняю щ их эффекты
ингибирования ро ста м и кр о о р ган и зм а и збы тком субстрата,
и попробуем вы яви ть общ ие их особенности.
4.1. К И Н Е Т И Ч Е С К И Е М О Д Е Л И РОСТА
С И Н Г И Б И Р О В А Н И Е М С У БСТРАТО М
4.1.1. Простейшая кинетическая схема
П ростейш ий кинетический м ехан изм , объясняю щ ий эффект
и нгибирования автокатали тической реакции и зб ы тко м суб стра­
та, м о ж ет б ы ть представлен схемой
S+ N -^ L
X
—^
2N
(4.1)
XS
Если в р ам ках хим ико-кинегического приближ ения зап и сать
систему уравнений д л я каж д ого из состояний N, X и XS,
кон ц ен трац ия которы х изм еняется в ходе процесса, то получим
систему уравнений при условии, что концентрация суб страта
п остоянна и равна S0:
^ = 2 k X + k _ sX - k s S 0 X;
(4.2)
^ = A:sS 0 N + A :_ iXS —(A: + k t + k _S)X\
(4.3)
d- ^
= k iS 0X - k - i( XS).
(4.4)
107
О бщ ее количество биом ассы М в систем е равн о
M = N + X + XS
(4.5)
или
4М
4N
dX
d( X S)
dt
dt
dt
dt
— = — + - 7- + - ^ -
(4.6)
П о д стави в уравнения (4.2) — (4.4) в (4.6), получим
d M J V d X d _ £ S ) = k x
dt
dt
dt
dt
Если процессы на о б р ати м ы х стади ях схемы (4.1) п роте­
каю т отн оси тельно бы стро и эти реакции и м ею т р ав н о ­
весный х арактер, то м ож н о вы рази ть связи м еж ду пере­
м енны м и X, N и XS с п ом ощ ью уравнений д л я констант
равновесия
(4.8)
К= —
■
(4 9)
(XS) ’
^
где Ks = k „ J k s и Ki = k „ ilki — равновесны е кон станты диссо­
циации ком плексов.
В это м случае уравнение (4.5) м ож ет б ы ть записано в виде
M = X( l + § + |)
(4-Ю)
х =—
1+ £ + ^
(4. 11)
или
So
к,
П од стан о вка этого соотн ош ени я в уравнение (4.7) п риводит
к д иф ф еренциальном у уравнению
dМ
т г
£М
-
г
50
Решение его при использовании
M = N 0 им еет вид
. . .
-
а
К,
н ач ал ьн ого
условия
/ = 0,
к
М (/) = N 0e 1 +*./So+s0/*/.
(4.13)
О бщ ее число клеток экспоненциально увеличивается во времени,
при это м удельная скорость роста д олж н а б ы ть представлена
уравнением
108
С вой ства этрго уравнения обсуж даю тся ниже, после ан ал и за
н екоторы х возм ож н ы х кинетических схем.
LU
4.1.2.
Двухстадийная кинетическая схема
Р ассм о тр и м кинетическую схему с н еоб рати м ой тр ан сф о р м а­
цией су б стр ата на первой стадии процесса:
S + N — ‘А +
х
к, S U k -i
**_»2N.
(4.15)
XS
П редстави м себе, что п ром еж уточное состояние X способно
о б р ати м о и равновесно о б р азо в ы в ать ком плекс с суб стратом ,
при это м состояние (XS) теряет свою сп особн ость к делению
с об р азо в ан и ем двух новы х клеток N.
С истем а уравнений по всем и зм ен яю щ им ся во времени
п ерем енны м будет и м еть вид (S = S0)
^ = 2k2X - k 1S0N;
at
(4.16)
^ = j f c 1 S 0 N + ik _ ,(X S )-f c 2 X - ^ S 0 X;
(4.17)
d^ ± = k iS0X - k _ i(XS).
(4.18)
С лож ив уравнения (4.16)— (4.18), получим
dt
dt
dt
dt
(4.19)
Если о б р азо ван и е ком плекса (XS) п ротекает бы стро и р ав н о ­
весно [d (X S )/d t = 0 ] , то из уравнений (4.17) и (4.18) следует
д ва важ ны х соотнош ения:
Y
S„N .
— Г- ’
(4.20)
is
к ~ i_ X Sp
Э ти соотн ош ени я п о зво л я ю т вы рази ть кон ц ен трац ию X через
М на основе и сп ользован и я уравнения (4.5):
109
х —
l+ -—+—
k t S0
/
(4.21)
/
К,
П о д стан о вка это го соотнош ения в уравнение (4.19) п риводит
к следую щ ем у д иф ф еренциальном у уравнению , которое
легко
м ож ет б ы ть п роинтегрировано:
dM
dt
22)
1
+ А _ Л ‘
к, S0
'
А',
Реш ение это го уравнения с и сп ользован и ем н ач альн ого условия
/ = О, М = N 0 д ает уравнение экспоненциального роста
M (/) = N 0 e M',
(4.23)
где удельн ая скорость ро ста представлен а функцией
к,
(4.24)
|+ А _ + ? °
к, S0 К,
У дельн ая скорость роста, как и во всех преды дущ их случаях,
п редставлен а коэф ф ициентом перед перем енной М в диф ф ерен­
ц и ал ьн о м уравнении (4.22).
4.1.3.
Трехстадийные кинетические схемы
Р ассм о тр и м более услож ненные м ехан изм ы разви ти я автокаталитического процесса с учетом возм ож н ой м н о го стад и й ­
н ое™ :
S+ N -M *
Xl
-А х .- А ш .
(4.25)
XS
П р едстави м себе, что субстрат равновесно об разует ком плекс
с состоян ием Х 15 блокируя его дальнейш ее превращ ение.
С истем а уравнений, соответствую щ ая схеме (4.25), им еет вид
™ =2Ar3 X 2 + £ 1 SoN;
^ i = A : 1 S 0 N + ^ _ i(X S )-fc 2 X 1 - ^ S
d- £
по
(4.26)
0
X 1;
(4.27)
= ^ 2X j —к 3Х 2;
(4.28)
^ = A : iS0X j - ^ _ i(X 1S).
(4.29)
И з э т о й \с и с т е м ы уравнений с учетом того, что
m = n + x 1 + x 2 + x 1 s,
следует
(4.30)
\
\
dM
dt
= к 3Х 2.
(4.31)
Если п рин ять во вним ание, что d X ^ / d t = 0, а такж е соответ­
ствую щ ие уп рощ аю щ ие условия д л я уравнений (4.27) и (4.28),
то будем иметь:
к i S0N —к 2Х ^;
(4.32)
№
(4.33)
= кз^-2’
> _ (Х,) S0
(X .S ).
К,
(4.34)
И з этих уравнений и уравнения (4.31) следует
М = Х,
1 4 -^
к jSq
к2\
(4.35)
К,
С оответствен н о (4.31) м ож н о п ред стави ть в виде
4М
~dt"
к3М
1 +-
(4.36)
- +к^2 'П + |
к 1S0
Реш ение (4.36) приводит к уравнению экспоненциального роста
с удельной скоростью
кг
1
(4.37)
кз
къ
к\ S0
к2
+
+ - — +—
К
кото р о е м о ж ет б ы ть м од и ф и ц и рован о к виду
кг
1 + к 3/к
■So
r+ S0 +
k i ( l + k 3/k2)
(4.38)
\ + к 3/ к 2 К,
Если Х 2 о б разует ком плекс с м олекулой исходного субстра­
та, то при это м это т ком плекс является нереакционноспособ­
н ы м с точки зрения последую щ их превращ ений, а кинетическая
схема процесса м ож ет б ы ть зап и сан а в виде
S+ N Ь х . Ь
х2
^3
2N .
(4.39)
Ю и к -,
ill
С о о тветству ю щ ая систем а уравнений, оп исы ваю щ ая дин ам ичес­
кое поведение автокатал и ти ч еского процесса, и м е е у вид
^ = 2A:3 X 2 -A : 1 S 0 N;
(4.40)
^ i =^S
(4.41)
0
N - f c 2 X i;
^ ^ = ^ 2X j +A:_i (X 2 S) —Ar,S0 X 2 —/с3 Х 2;
^
(4.42)
= A:i S0X 2- A : _ i ( X 2S);
(4.43)
M = N + X 1+ X
(4.44)
2+ X 2s.
С лож ение уравнений (4.40) — (4.43) приводит к диф ф ерен ц иаль­
н ом у уравнению
(4.45)
В условиях
1 (/х ,
,
а так ж е м алости п ар ам етр о в 1/ к 2 и I/ к 3
v
1 dX2
,
v
\
г —г <^ к 2 Х 1', — —± < ^ к г Х 2 ) и м ею тся дополн и тельн ы е соотК2
м(
/сз a t 1
нош ения меж ду переменны ми:
Х , = ^ Х 2;
(4.46)
2
N = т у Х 2.
(4.47)
Кj
К онц ен трац и я ком плекса X 2 S м ож ет б ы ть найдена как функция
концентрации Х 2 из уравнения д л я кон стан ты диссоциации
ком плекса:
X 2S = ^
,
(4.48)
С оотнош ения (4.46)— (4.48) и уравнение (4.47) приводят к функции
*
2
=
s
J
<
I <•«»)
1+— + —+ — —
К, к 2
A,S„
и соответствен но к д иф ф еренциальном у уравнению
т
4/
А, м
(4 5 0 ^
S0 А3 А3
х, А2 A, S0
Решение (4.50) п р ед ставляет собой экспоненциальную функцию
времени (f = 0, M = N 0)
112
где
\
уделцная
М (?) = N 0 e M',
(4.51)
скорость роста д ан а функцией
(4.52)
0
1.1
или
(4.53)
11=
П роведение ан ал и за нескольких схем процесса п озвол яет ср ав ­
н ить основны е р езу л ьтаты и вы яви ть общ ие инвариантны е
и наиболее характерны е свойства обсуж даем ы х законом ерн остей
ингибирования ро ста м и кроорган и зм ов и збы тком субстрата.
▲ Если п р о ан ал и зи р о в ать уравнения удельной скорости
роста д л я всех рассм отренны х м ехан изм ов процессов, то
м ож но увидеть, что все кинетические схемы п риводят ф ор­
м альн о к о д ном у и то м у же уравнению
У равнение качественно соответствует н аб л ю д аем ы м зависи­
м о стям скорости ро ста от концентрации субстрата. П ри м алы х
концентрациях в условиях S § //fi 3 (M, « : S 0, S0 « ; ^ : s3(M) удельная
скорость р о ста д олж н а увеличиваться с возрастан и ем концент­
рации субстрата:
(4.55)
П ри больш их
и S 0 » АГ„
концентрациях
Ц
суб страта,
когда
8
о » Л ^ зфф
(4.56)
т. е. скорость ро ста д олж н а ум еньш аться при увеличении
концентрации суб страта и в пределе д олж н а стрем и ться к нулю.
О чевидно, что зави си м ость удельной скорости роста от
концентрации суб страта п роходи т через м акси м ал ьн ое значение
(рис. 4.1).
Э ксп ери м ен тальн о при проведении исследования удельной
скорости р о ста от концентрации суб страта м о гу т б ы ть найдены
три п арам етра: д т , Ks,|фф и Л^зфф (м етоды определения этих
п ар ам етр о в обсуж даю тся в последую щ их разд ел ах этой главы ).
В таб л. 4.1 приведены функции цт , ЛГ5Эфф и Л'Ьфф для всех
рассм отренны х кинетических схем.
113
а
кривы е за ви с и м о сти при п о сто я н н о й А ,- 1 1 (1 4 М и р азл и ч н ы х значениях
А-, 10 М: ^ I — 1,0; 2 — 2,0; 3 — 3,0; 4 — 5,0; 6 — кри вы е зави си м о сти при
п остоян н ой К: = 4 1 0 4 М и р азл и ч н ы х значениях К , • 104 М: 1 — 0,5; 2 — 1 0 '
3 — 1,5; 4 — 2,5
Таблица 4.1
Кинетические параметры процессов роста популяции микроорганизмов с ингиби­
рованием избытком субстрата
№
1.
К ин ети ческая схем а
S + N к X Л 2N
ифф
к
Ks
k2
к г /к г
^Чэфф
K;
X + S 5 XS
fcj
2.
к2
S+ N - X - 2 N
К
X + S J XS
fcj
3.
S+
к2
к,
N -* X, - » X 2 4 2N
1
k3
k3
\ + k 3/ k 2
к , [ \ + к 21к2 )
k3
k3
1
l + k 2/ k 2
k\ (1 + k 3/ k 2)
(:i + k 3/ k 2) K ,,
X, + S S X ; S
4.
S + N кЛ х 1 кЛ х 2 - > 2 N
X2 + S ^ X 2S
114
Видно, что в зави си м ости от м ехан изм а процесса дт , K s,)фф
и
м огут и м еть несколько различаю щ ийся см ы сл.
• качествен н о об щ и м свой ством всех обсуж даем ы х м еха­
н изм ов является о б р азован и е ком плекса пром еж уточны х со ­
стояний со вто р о й м олекулой субстрата, т. е. ком плекса,
кото р ы й не о б л ад ает реакционной сп особн остью для д ал ьн ей ­
шей
тр ан сф орм ац ии .
С равнение
кинетических
схем
3 и 4 (табл. 4.1) п оказы вает, что принципиально неваж но,
с каки м ко м п о н ен то м процесса X ls Х 2 или каки м -ли бо
п оследую щ им происходи т ком плексообразован ие. У равнения,
описы ваю щ ие кинетику процесса, будут соверш енно ан ал оги ч ­
ны. П о своем у физическом у см ы слу кинетические схемы,
приведенны е в таб л . 4.1, м огут им еть д ва равн оправн ы х
истолкования.
П ри чисто авто катал и ти ч еском истолковании и сходят из
предполож ения, что X t , Х 2, ..., Х„ — интерм еди аты в м ехан из­
м ах тр ан сф о р м ац и и суб страта в акти вн ом центре л и м и ти ­
рую щ ей ф ерм ентной системы . С тад и я удвоения к а тал и зато р а
предствляет собой стади ю биосинтеза белка. И н терм еди аты
Х 1 5 ..., Х„ способны о б р азо в ать совокупность м етаб оли тов,
необходи м ы х д л я удвоения активны х центров л и м и ти рую щ его
ф ерм ента. О б разован и е нереакционноспособного ком плекса суб­
стр а та с л ю б ы м из и н терм ед и атов п риводит к и нги бирован и ю
процесса, поскольку м ож ет происходить б локи ровка синтеза
м етаб о л и то в , необходим ы х д л я удвоения активны х центров
катал и зато р а.
В торое и столкован и е предполагает, что N , Х 1? Х 2 пред­
ставл я ю т собой состоян ия клетки на различны х этапах ее
разви тия. О б разован и е ком плекса суб страта с каки м -то специ­
фическим ко м п о н ен то м клетки м ож ет б лок и ровать ее дал ьн ей ­
ш ий цикл разви тия. Э то м ож ет привести к и нги бирован и ю
ро ста клеточной популяции при высоких концентрациях суб­
страта.
4.2. О П Р Е Д Е Л Е Н И Е П А Р А М Е Т РО В РОСТА П О П У Л Я Ц И И
М И К Р О О Р Г А Н И ЗМ О В В Э К С П О Н Е Н Ц И А Л Ь Н О Й ФАЗЕ
П Р И И Н Г И Б И Р О В А Н И И П РО Ц ЕС С А
ВЫ С О К И М И К О Н Ц Е Н Т Р А Ц И Я М И СУБСТРАТА
У равнение удельной скорости роста м и кр о о р ган и зм о в при
ингибировании процесса суб стратом м ож но п редстави ть сле­
дую щ и м об р азо м :
йгл^о
(4.57)
115
П ри ан али зе эксперим ентальны х данны х часто приходится
вы числять п ар ам етры , входящ ие в это уравнение.
У равнение (4.57) — трехп арам етри ческое и д остаточ н о часто
используется в стационарной кинетике ф ерм ентативного катализа.
П о м и м о су б стр атн ого торм ож ен и я трехпарам етрическое уравн е­
ние описы вает p H -зависим ости ф ерм ентативны х реакций, ак ти в а­
цию , и нгибирование и он ам и м етал л о в и другие процессы . Д ля
определения числовы х значений п арам етров, если Л ^ ф и Л^.)фф
сущ ественно разли чаю тся, наприм ер А '„фф/ ^ зфф < 0 , 1 , с д о стато ч ­
ной степенью точности м ож н о и сп о л ьзо в ать асим птотические
приближения. П ри относительно низких концентрациях субстрата,
когда S 0 « : А^Ьфф, уравнение (4.57) тран сф орм ируется к виду
<4 -58)
Л5Эфф ' ^0
т. е. п редставляет собой обы чное уравнение М оно, из кото р о го
стан д ар тн ы м и сп особам и м огут б ы ть найдены п арам етры
Ц« и К .
П ри высоких концентрациях суб страта (S 0 » ^ эфф) скорость
ро ста м и к р о о р ган и зм а будет описы ваться уравнением
(4.59)
1
+>
эфф
И з это го уравнения при исп ользован и и ан ам орф озы
- = - + —
S0
(4.60)
м о гу т б ы ть найдены п арам етры дт и
эфф.
Если кон станты ЛГ5Эфф и А'Ьфф сои зм ери м ы , использование
указанны х приближ ений п риводит к б о л ьш и м ош и бкам . В по­
добны х случаях лучш е и сп ол ьзовать разн остн ы й м етод, р а з­
виты й О. М . П о л то р ак о м с сотр. (1976). С ущ н ость
м етода
заклю чается в следую щ ем . У равнение (4.57) м ож н о п р ео б р а­
зо в а ть к виду
у = а х 2 + Ьх + с,
(4.61)
где
а, b и с — постоянны е; у и х —г- некоторы е функции
эксп ери м ен тальн о определяем ы х переменны х величин. Н а п р и ­
м ер, уравнение удельной скорости при ингибировании суб стра­
то м м ож н о зап и сать так:
! о
_
^
ф
ф
+
1
§
о
+
_
1
S
2
( 4 6 2 )
эфф
В это м случае у = S 0 /p , x = S0 . Если провести изм ерение
скорости при двух различны х концентрациях суб страта х, и х т
116
и вы числить соответствен но у , и у т, то, взяв р азн ость м еж ду
этим и величинам и, будем им еть
А у = а А х { х 1+ х т) + ЬАх.
(4.63)
Э то уравнение м ож но п редстави ть следую щ им об разом :
Yx = a { x i + x m) + b ,
(4.64)
где А у / А х — отнош ение разн остн ы х функций.
К ак видно из уравнения (4.64), из зави си м ости А у / А х от
(х, + х т ) м ож н о найти п ар ам етр ы а и Ь. И з уравнения (4.62)
следует, что а = 1/(рт Л'1-.,фф), Ь = 1 /р т . Э то п озвол яет определить
п ар ам етр ы
рш и Л^эфф. Д л я нахож дения п ар ам етр а
Л ^ фф
воспользуем ся п реобразован ием :
1 _ * « , фф 1 + 1
цт
HS0
So
* + J _
цт S 0
(465)
Kt эфф
Если
и сп о л ьзо вать
другие
перем енны е,
т. е.
y = l / ( p S 0)
и x = l / S 0, то соответствую щ ее уравнение запиш ется в виде
A( i /nS„ ) _
A(l/S0)
1
к ,т
Цт
Цт
S
I + \ S
0 / I
'
(4.66)
0
И з линейной зави си м ости А у / А х о т (.v, + .vm) будут найдены
п ар ам етр ы 1 / р т и Л:„фф/ р т и тем сам ы м п ар ам етр ы р т и Л:5Эфф.
• Р азн остн ы е м етоды — удобны й инструм ент при анализе
м н огоп арам етрически х уравнений. О дн ако прим ен ять их следует
с известной осто р о ж н остью . Н ап ри м ер, они м а л о п ригодны
д л я эксперим ентальны х данны х, полученных с б ольш ой случай­
ной погреш н остью , так как разн остн ы е функции д аю т зн а­
чительны й разб р о с точек, что п ри вод и т к вы сокой неоп­
ределенности в иском ы х п арам етрах. К р о м е того, при п о­
строении разностны х функций н еобходи м о и сп о л ьзо в ать д о ­
стато чн о больш и е значения Ау и А х, так чтобы они сущ ест­
венно
п ревосходили
случайную
ош ибку
эксперим ента.
Ц елесооб разн о д л я вычисления разн остей п рим ен ять значения
функций на различны х «восходящ их» и «нисходящ их» участках
эксп ери м ен тальн ой зависим ости.
4.3. А Н А Л И З П О Л Н О Й К И Н Е Т И Ч Е С К О Й К Р И В О Й
РОСТА
Р ассм о тр и м кинетику процесса д о п олн ого исчерпания
субстрата. Д иф ф еренциальное уравнение роста культуры в усло­
виях инги бирован и я су б стр ато м и м еет вид
117
dU
ИГ
H.MS
(4.67)
As+ S + 5 !’
a,
где S — текущ ая концентрация субстрата; К , и
— эффективные
значения субстратной константы и константы ингибирования. Э то
уравнение после разделения переменны х м ож но зап и сать в ф орм е
MS
(4.68)
d M + - — d M = \imdt.
К, м
м
Первы й член это го уравнения соответствует обы чн ом у случаю
без и нгибирования суб стратом , и при его и нтегрировании
м ож н о во сп о л ьзо ваться полученной ранее и нтегральн ой ф орм ой
уравнения (3.27).
С учетом б алан сового соотн ош ени я S = S 0 + ^ — у интеграл
'5
S
о т вто р о го сл агаем ого уравнения (4.68) им еет вид
м „
N0
М
N0
S° + ~ F ~ ‘F
so+ ^ r
м
,
K', / M = — ^ l n ^ - - L ( M
Nn
А, Г.
A,M
K,
S4 M
Лем"
- N 0).(4.69)
N„
П оскольку обы чно достаточ н о строго вы полняется неравенство
S 0 : » N 0/ Y s, и нтегральн ую ф орм у уравнения (4.67) м ож но
зап и сать следую щ им об разом :
i_MN.
1+ * + *
Sn
А,
N0
S0
\
A,K,
Mm
(M —N 0) = p m/. (4.70)
Видно, что отличие этого уравнения о т уравнения д л я процесса
в отсутствие ингибирования су б стр ато м заклю чается в д о п о л н и ­
тел ьн о м члене при м н ож и теле п ервого логари ф м и ческого
сл агаем о го и в д оп ол н и тел ьн ом о тр и ц ател ьн о м линейном
члене. И з уравнения (4.70) следует, что при К { -* со (отсутствие
или очень «плохое» и нгибирование суб стратом ) уравнение
(4.70) тр ан сф орм и руется в обы чное и нтегральн ое уравнение
ро ста культуры [см. (3.27)].
У равнение (4.70) м ож но п р ео б р азо в ать к виду
In
М
Nn
K J So
In I
к
So
So
К,
1+ — + —
M -N 0
м.
A,
-
и
S0
(4.71)
1+7Г + Т7
П р авая часть вы раж ения (4.71) п редставляет собой удельную
скорость р о ста культуры в экспоненциальной фазе. Д ей стви ­
тельно, когда величина М близка к N 0 (M —N o « 0 ), уравнение
(4.71) тр ан сф орм и руется к
118
I n — = ц/,
(4.72)
где
(4.73)
У дельн ая скорость ро ста культуры в этом случае является
экстрем альной функцией концентрации субстрата: при низких
концентрациях су б страта скорость роста культуры растет
с увеличением его концентрации, при высоких — падает. Д ля
то го чтобы вы яви ть ингибирование процесса ро ста культуры
и збы тко м суб страта, в первую очередь необходи м о и сследовать
его дин ам ику в экспоненциальной ф азе и п оказать соответствие
эксперим ентальны х данны х уравнению (4.73).
Р ассм о тр и м приближ енное реш ение в условиях сп раведли ­
вости разлож ения в торого логари ф м и ческого члена уравнения
(4.71) в степенной ряд и при и спользовании п ервого линейного
члена разлож ени я (это разлож ение справедли во до значений
0,5— 0,6 по глубине конверсии субстрата). Разлож ение этого
логари ф м и ческого члена в ряд им еет вид
Мя
)
Мт
2^
мт
)
мт
)
Если перем енная (М —N 0 ) /M m
1, то это бы стросходящ ийся
ряд; для п риближ енного реш ения м ож н о восп ользоваться
первы м членом этого ряда. П ри так о м условии l n [ l —(М —N 0)/
/М т ] к —(М —N 0 ) /M m и уравнение (4.71) тран сф орм ируется в
—
44
£
-
-
^
<4 7 5 >
Если учесть, что M m/Y s « S 0, то м ож н о отри ц ател ьн ы й член
это го уравнения п редстави ть в виде
M -N 0
Ц
( M - N q)S q
1+§ + | )
(4.76)
M"KV + so+si
Т аки м о б р азо м , уравнение (4.71) м ож н о зап и сать так:
=
,4.77)
Nn
где
"к,
Ф=
1+
—+ —
S0
So
s0
(4.78)
к,
К,
119
С л ед о вател ьн о , в это м уравнении уд ал ось сгруп п ировать
перем енны е так и м о б р азо м , чтобы эксп ери м ен тальн ы е данны е
м ож н о бы л о п редстави ть в виде линейной ан ам о р ф о зы , при
это м п ар ам етр ы Ф и ц зави сят от начальн ой концентрации
суб страта, что п о звол яет и денти ф и ц ировать случай разви тия
процесса с и нгибированием и зб ы тко м субстрата.
• У равнение (4.27) является общ ей ф орм ой уравнения роста
д о глубин 0,5 0,6 и сп раведли во как для процессов без
ослож нений р о ста, так и д л я процессов и нгибирования продук­
т о м (см. гл. 5). Э то же уравнение вы п олн яется и д л я роста
культуры , ингибируем ой и збы тком суб страта.
П арам етры ц и Ф м огут бы ть найдены по известной процедуре
линеаризации экспериментальных данных в координатах уравнения
ln(M/N0) _
ф M -N 0
/
(4 79)
fM m
v
’
или разн о стн о го уравнения
ш (м,/м л _
i,
ф ч .- Ч .
- i,
(4 8 0 )
)м .
▲ К ак видно из уравнения (4.78), п ар ам етр Ф весьма
слож но зависит о т н ачальной концентрации субстрата. М ож но
вы дели ть три области этой зависимости.
1. — »
S0
— или S 0 « J КSK {. П ри этом
Ki
Ф= - Л - .
(4.81)
tfs + S 0
П ар ам етр Ф не вклю чает в себя кон станту ингибирования,
и, сл ед овательн о, ингибирование и зб ы тк о м суб страта не о б н а­
руж ивается.
2. ATf/S 0 Sq/АГ,- или S 0 « J K sK t. Здесь п роявляется м акси ­
м альн ая независимость удельной скорости роста от концентрации
суб страта, при это м Ф « 0 , а м и кроб н ая популяция развивается
стр о го экспоненциально вп лоть д о глубины конверсии 0 , 6 — 0 . 8 .
К
S
So
Ki
3. — <§: — или
S0 »
г-------
у / K tK s.
В
этой
об ласти
Ф
им еет
о три ц ательн ое значение:
<482)
а скорость ро ста культуры увеличивается по мере и зрасхо­
довани я субстрата; накопление п родукта реакции и рост клеток
опереж аю т экспоненциальны й рост.
Д ля того чтобы определить константу ингибирования из­
бы тком субстрата, необходимо исследовать зависимость от
концентрации субстрата, в первую очередь в режиме S0 »
KSK{.
120
П ри это м м ож н о во сп ол ьзоваться п реоб разован и ем уравнения
(4.82) к виду
— 1 /Ф = 1+ K J S Q .
(4.83)
Л и неари зац ия эксперим ентальны х данны х в коорди натах
зави си м ости — 1/Ф от 1/S0 п озвол яет оп редели ть К (.
В о б щ ем случае при ан али зе зави си м ости Ф от концентрации
суб страта м ож но и сп ол ьзовать тран сф орм и рован н ое уравнение
4 I+H ) =STT'
(484)
Н еобходи м о о б р ати ть вним ание, что
1+ ^ + ^ = ^ .
ъ0 Л,
(i
(4.85)
С учетом соотнош ения (4.85) уравнение (4.84) запиш ется как
Ф ^ц = Г
а 0 ~ Тл.-
(4-86)
У равнение (4.86) м ож н о п ред стави ть следую щ и м об разом :
L
nS0
к,'
(А « 7'1
( ■ *
при это м весь пул измерений при росте культур м и кр о ­
ор ган и зм о в в условиях и нгибирования су б стр ато м долж ен
лин еар и зо ваться в коорд и н атах зави си м ости ® pm(p S 0) от 1/S q Из этой зави си м ости оп ределяю тся п ар ам етр ы Ks и К {.
П ри ан али зе эксперим ентальны х данны х, если есть основания считать, что процесс м ож ет и нги бироваться и зб ы т­
ком су б стр ата, м ож н о рек ом ен д овать следую щ ую п р о ­
цедуру. Н еобход и м о и сследовать зави си м ость накопления
клеток (или п родуктов реакции) в экспоненциальной ф азе при
различны х н ачальны х концентрациях суб страта с определением
ц известны м и и описанны м и ранее способам и. Если зависи­
м ость обнаруж и т экстрем альны й характер (см. рис. 4.1), это
будет однозн ачн о сви детел ьствовать в п ользу процесса с ин­
гиби рован ием и збы тком субстрата.
Однако информ ацию о том , что развитие микроорганизм а
связано с ингибированием избы тком субстрата, мож но получить
и из анализа одной-единственной кинетической кривой роста. Если
использовать линеаризацию экспериментальных данных в коор­
динатах уравнений (4.79), (4.80) д о степени конверсии 0,4— 0,6,
то мож но определить значения ц и Ф. В то м случае, если
найденное Ф отрицательно, мож но с уверенностью утверждать,
что процесс протекает с ингибированием избы тком субстрата.
1
121
ГЛАВА 5
И Н ГИ Б И РО В А Н И Е РОСТА
П О П У Л Я Ц И И М И К РО О РГ А Н И ЗМ О В
П Р О Д У К Т А М И Ф ЕРМ ЕН ТА Ц И И
Один из наиболее часто встречаю щ ихся эф ф ектов, приводящ их
к отклон ен и ю кинетики роста м и кр о о р ган и зм о в от экспонен­
циальной кривой, связан с и нгибированием их роста п ро­
д у ктам и ф ерм ен тати вн ы х превращ ений. Н акопление какого-л и ­
бо одного п р о ду кта превращ ения суб страта или их совокуп ­
ности способно п риводить к зам етн о м у ум еньш ению скорости
ро ста культуры , переходу ее в стади ю стац и он арн ого роста
и даж е к п олной остановке процесса.
В качестве и ллю страц ии м ож н о у казать, что наиболее
типичны м случаем ингибирования роста м и кр о о р ган и зм а п ро­
ду ктам и
ж изнедеятельности
является
случай
накопления
в культуре органических кислот, сниж аю щ их значение pH
среды культиви рован ия. К ак известно, скорость ф ерм ен тати в­
ных процессов и, как следствие, скорость р о ста м и кр о о р ган и з­
м о в p H -чувствительны . Если п ротоны , взаи м одей ствуя с фун­
кц и ональн о важ н ы м и ком п он ен там и клетки, б локи рую т м е­
таболические процессы , ф еном енологически это озн ачает, что
они вы ступаю т в качестве и нги б иторов роста.
Д р у ги м х ар актерн ы м п ри м ер о м м огут б ы ть процессы,
протекаю щ и е с накоплением органических п родуктов, в част­
ности спиртов. К ак п равило, сп иртовое брож ение о стан ав ­
ливается при накоплении в систем е определенной концентрации
продукта. Э ф ф екты так о го род а весьма распростран ен ы , в силу
это го они тр еб у ю т тщ ател ьн о го кинетического ан али за.
5.1. К И Н Е Т И Ч Е С К И Е М О Д Е Л И
И НГИБИРОВАНИЯ
П РО ДУКТО М
Р ассм отри м кинетику ро ста м икробн ой популяции в при­
ближ ении, учиты ваю щ ем кинетически дискри м и ни рован ны е два
процесса: стади ю взаи м одей ствия суб страта с клеткой и стади ю
деления клеток.
5.1.1.
Ингибирование продуктом
на стадии взаимодействии субстрата с клеткой
а
122
Если продукт реакции Р образуется на
процесс инги бирован и я заклю чается во
второй стадии,
взаим одействии
п ро ду кта с ф о р м о й N , то кинетическую схему процесса м ож но
п редстави ть в виде
S
+
( 5 . 1 )
NP
К ачественно и нгибирование процесса п родуктом зак л ю ч а­
ется в то м , что об разуется его ком плекс с активной ф орм ой N,
при это м частица N P теряет сп особн ость к осущ ествлению
последую щ его превращ ения в X и дальн ей ш ем у делению клетки.
П ри развитии процесса с накоплением п родукта все б ольш ая
и б о л ьш ая д о л я N д о лж н а уводиться из реакционноспособного
состояния, что до лж н о то р м о зи ть процесс роста культуры .
В реж им е постоян ства концентрации суб страта (S = S0)
перем енны м и во врем ени ком п он ен там и систем ы являю тся
частицы X, Р и NP. Э ти переменны е связаны меж ду собой
систем ой диф ф еренциальны х уравнений
л/N
~
=
2 £ 2 X
"
-
A
: 1 S 0 N
-
-
£
i P
N
+
M
£
_
.
/7NP
^ ^ .P N -A r^ N P ) .
i ( N
P ) ;
( 5 . 2 )
N
( 5 . 3 )
(5.4)
С лож ение этих уравнений с учетом того, что об щ ая б иом асса
М является сум м ой концентраций отдельн ы х составляю щ и х, т. е.
M = N + X + NP,
(5.5)
п риводит к соотн ош ени ю
"
=
dt
"
+
dt
^
dt
+
в
=
*
2 Х .
( 5 . 6 )
dt
Если п родукт Р вы ступает в качестве бы строго и о б р ати м о го
и нгибитора (это озн ачает, что d{H?)j dt « 0 ) , то процесс о б р а зо ­
вания ком плекса активн ого центра какого-ли бо ф ерм ента
с п родуктом м ож ет бы ть охарактеризован константой равновесия:
К —
— ^
71
(5-7)
В это м реж им е дин ам ика накопления п родукта описы вается
уравнением
£ £ -* ,Х ,
(5.8)
где Ер стехиом етрический коэффициент, характеризую щ ий
количество п р о ду кта на единицу клеточной биом ассы .
123
И з уравнений
отнош ение
(5.6)
и
(5.8)
следует
весьм а
важ ное
Ypd P = d M .
со­
(5.9)
Э то озн ачает, что п родукт реакции и биом асса связаны меж ду
собой простой линейной связью
Ур(Р —Р 0) = (М —N 0) или, если Р 0 « Р ,
N 0 « : M , то
УрР ж М .
(5.10)
Д ля д альн ей ш его ан ал и за воспользуем ся условиям и м алости
п ар ам ет р а при производной в уравнении (5.3). Если значение
кон станты скорости процесса к 2 д о стато ч н о велико, то в у р ав ­
нении (5.3) м ож но пренебречь членом (1 / k 2) d X / d t по сравнению
с X. Э то приводит к следую щ ем у соотн ош ени ю меж ду
перем енны ми:
N=
К
(5.11)
, So
С учетом (5.11) уравнение (5.5) м ож н о зап и сать в виде
м-х(>+&+&0
Если учесть, что перем енны е Р и
уравнению (5.10), то будем и м еть
Х=
М
£
м
1 + *1 8 о1 ‘ + УЛ
связаны
г.
(5-|2)
линейно
по
(5.13)
П о д ставл яя это вы раж ение в (5.6), получим диф ф еренциальное
уравнение, описы ваю щ ее динам ику изм енения в системе общ его
количества клеток или общ ей биом ассы :
(5.14)
«.s0l
y, k ,
У равнение (5.14) м ож ет б ы ть записано в ф орм е
<т
М =»„М,
~dt
(5.15)
где
Л
С р~
х.
Р\
к
( р т= к 2, K = k 2 / k v
124
<5 1 6 >
+ 5о
P = M /Y p).
Видно, что по своем у содерж анию уравнение (5.16) со о тв ет­
ствует случаю конкурентного инги бирован и я п родуктом . Э то
уравнение с разд ел яю щ и м и ся перем енны м и
к
. + !kt=S0и £ + -Ypk l S0Ki- d M = k 2dt,
(5.17)
кото р о е м ож ет б ы ть д о стато ч н о п росто п роинтегрировано:
М
М
I
dМ
~dt
dt
dM =
(5.18)
t *—
,S 0 ))
или
1 м h, 1
1 П----
N0
(5.19)
YpK i k 2 + k i S0
Е сли процесс разви вается д остаточ н о глубоко, то в урав­
нении (5.19) м ож н о без особой погреш ности пренебречь N 0
по сравнению с М и т о гд а оно п ри м ет вид
^
^2
1In —
м ,Ь 1
N0 YpK i k 2-\-kl S0
к 2 ky Sq
(5.20)
С ледует о б р ат и т ь вним ание на то, что м н ож и тел ь перед
t в правой части уравнения (5.20) п редставляет собой удельную
ск орость ро ста м и кр о о р ган и зм а в отсутствие процесса ингибирован ия п р о ду кто м I д
\
к к S
\
2 1 0 1 С учетом этого уравнение
к 2 + к х S0
(5.20) м ож н о зап и сать так:
1
м
_ ц М _
N0
= цг.
(5.21)
▲ С истем а будет ф ун кц ион и ровать в двух принципиально
различающихся крайних реж имах.
1.
Если соотн ош ени я п ар ам етр о в уравнения (5.21) таковы ,
что в исследуем ом интервале времени
11п —
м»N0
цМ
Y .K ,k t S0
(5.22)
(наприм ер, и склю чительно велика кон станта ингибирования,
А^->оо), то кинетика роста популяции м и кр о о р ган и зм а им еет
обы чны й экспоненциальны й вид
М (/) = N 0e t“
(5.23)
и процесс ингибирования п родуктом никоим о б р азо м не
отраж ается на кинетике роста популяции. Э ф фекты ингиби­
рован ия пренебреж им о м алы .
125
2. Если соотнош ения п ар ам етр о в уравнения (5.21) таковы ,
что им еет м есто об ратн ое неравенство
In — <§;— ^ — М
N0
(5.24)
YpK ,k l S0
v
(м ал о значение K t или k 1S0), то кинетика р о ста культуры
не описы вается экспоненциальной кривой и д олж н о н аб л ю д ать ­
ся линейное увеличение биом ассы :
M( t ) = k 1S0 YpK i t.
(5.25)
Д ля вы явления необходим ы х соотнош ений меж ду п ар ам е­
т р ам и , регулирую щ их направление неравенств (5.22) и (5.24),
зап и ш ем (5.22) в виде
— » е х р ( — ^— М ) .
(5.26)
N0
У
So
)
’
П оскольку сравнивать функции, указанны е в правой и левой частях
неравенства, достаточно неудобно, сравним их производные в точке
М = 0, так как неравенство производны х в этой точке практически
однозначно приводит к неравенству функции при п роизвольном М.
Д иф ф еренцирование п равой и левой частей неравенства (5.26) по
перем енной М в точке М = 0 приводит к вы раж ению
n0
W
1*
i s<>
(5.27)
или
M-Nq
, „ «1.
W iS o
(5.28)
v
'
С оотнош ен ие (5.28) м ож ет б ы ть записано как
^
r d .
YpK i (k2 + k l S0)
(5.29)
v
;
С учетом то го что в рам ках и сп ользуем ой схемы k 2 / k 1 = Ks,
неравенство (5.29) будет и м еть вид
- 7 No - ч <к
У ^ ( 1 + 8 0 /А .)
1.
(5.30)
V
И з этих неравенств следует, что экспоненциальны й или л и ­
нейный р о ст м и кроби ологи ческой систем ы зависит от м ногих
п ар ам етр о в: начальн ой концентрации клеток, удельной ско­
рости р о ста, концентрации суб страта. О дн ако наиболее важ ны м
является значение K t. Н а качественном уровне м ож н о утвер­
ж д ать, что чем м еньш е А), тем б ольш е значение коэффициента
перед линейны м членом уравнения (5.21) и тем сильнее
п р о яв л яю тся эффекты и нгибирования п родуктом .
126
Введем безр азм ер н ую перем енную M /N 0. У равнение (5.21)
при сои зм ерим ы х М и N 0 м ож н о зап и сать в виде
1п|
*
)+ _
1 NJ
М
^
YpKik j S0 \ N 0
- 1
=ц/
(5.31)
или
(5.32)
= р / ,
где 9 = N 0 p/(/TiA:1S0 Yc). Э то уравнение м ож ет
ставлено р я д о м линейны х модиф икаций:
1.
М
I
N0
-1п — = Ц — ф
In (М/ N 0)— I
К
У
M/ N0 0
/
= 1+ ф
M / N 0 —1
M / N 0 —1
M / N 0 —1
пред­
(5.33)
In (M / N 0)
l n ( M / N 0)_
б ы ть
■ф.
(5.34)
(5.35)
Если м ех ан и зм процесса сопряж ен с инги бирован и ем п родуктом
реакции, то эксперим ентально н аб лю д аем ы е зави си м ости д о л ж ­
ны лин еар и зо ваться в коорд и н атах уравнений. Н апри м ер, как
следует из уравнения (5.33), д олж н а сущ ествовать линейная
зави си м ость эксперим ентально оп ределяем ой величины ( 1 / ? ) х
x l n ( M / N 0) от ( M / N 0 — 1)/t. В соответствии с уравнением
(5.33) о трезок, отсекаем ы й этой линейной зави си м остью на
оси о р д и н ат, равен удельной скорости роста; тангенс угла
зави си м ости д ает п ар ам етр ф.
• Величина ф является б езразм ерн ы м п ар ам етр о м и харак­
теризует эффекты ингибирования продуктом . Если эксперим ен­
тал ь н о найденное значение ф бли зко к нулю , то м ож но
утвер ж д ать, что в исследуем ой систем е отсутствую т эффекты
ингибирования продуктом . Если значение ф в рам ках стати сти ­
ческой ош ибки отлично от нуля, это гов о р и т о зам етн о м
вкладе ингибирования п родуктом в кинетику ро ста популяции.
Значение кон станты ингибирования К { м ож н о определить из
уравнения д л я ф, если известны п ар ам етр ы удельной скорости
роста и значение N 0/ Y p.
5.1.2. Ингибирование продуктом
на стадии деления клетки
Р ассм о тр и м кинетику ро ста м и кроб н ой популяции для
двухстадийной схемы в предполож ении, что ингибирую щ ее
воздействие п р о ду кто м осущ ествляется на стадии взаи м од ей ст­
вия его с п ром еж уточн ой ф о р м о й X:
127
s + N ^ u ^ t 2N
Ml
P
(5.36)
XP
Т ак же как в рассм отрен н ом вы ш е случае, д л я кинетической
схемы м ож но зап и сать соответствую щ ую систему диф ф ерен­
ц иальны х уравнений. П ри исп ользован и и предполож ения о м а ­
лости п ар ам етр а в уравнении д л я скорости изменения ф орм ы
X эта систем а уравнений сведется к реш ению диф ф ерен ц иальн о­
го уравнения вида
(5.37)
dt
(
М
к2
ИЛИ
^
= Ц„М,
(5.38)
dt
где
ц _
Цр
Pm/Q+P/K-l)
g
(5 39)
[Xs/(1 + P/X,.)] + S0 °'
Ф о р м альн о это эквивалентно случаю бесконкурентного ингиби­
р ован ия (одинаковое влияние п родукта на ц„, и K s). И н тегр и р о ­
вание это го уравнения приводит к функции
или
In
'м
\ +
No j
г ( — —1 ) =
у К (.
W
k2 \ у N0
J
(5.41)
1 + k 2/ ( k l S0)
4 s ,
П олученное уравнение п олн остью ан алоги чн о рассм отрен н о­
м у уравнению (5.32) с той л иш ь разницей, что для м ехан изм а
(5.36) п ар ам етр ф им еет вид
-4 2 )
Ф = --------------------------------------------------------(5
к2
5.1.3. Одновременное ингибирование продуктом
обеих стадий
Н аконец, м ож н о р ассм отреть и трети й случай, когда
п родукт ж изнедеятельности м и к р о о р ган и зм а один аково в заи м о ­
действует с ф о р м ам и N и X, равновесно уводя их из
авто катал и ти ч еско го процесса:
128
S + N -^ 2- X
2N
*4f *4f
p
NP
(5.43)
XP
В это м случае основное уравнение ро ста популяции м ож но
зап и сать следую щ и м об разом :
</M
k 2S0M
dt
(S0 + k 2l k l ) [ \ + M I ( Y pK l) ]
(5.44)
или
(5-45)
где
и = ________
Цр (Б0+К' ) ( \ + Р/ к у
("5 46)
И н ги би тор влияет то л ьк о на р т , т. е. это случай неконкурентно­
го и нгибирования п р одук том [см. (2.47)].
И нтегри рован ие (5.44) при н ач ал ьн ом условии / = 0, M = N 0
приводит к уравнению
N0
YpK i \ N 0
J
(5-47)
где |i, как и в преды дущ их случаях,— истинное значение
удельной скорости ро ста при дан ной концентрации суб страта,
не ослож ненное и нгибированием п родуктом .
▲ О бщ и м свой ством уравнений (5.32), (5.41), (5.47), описы ­
ваю щ их процесс р о ста с ингибированием п родуктом , является
отличие ф о т нуля. Если ф близко к нулю , процесс в р ас­
см атр и ваем ы е пром еж утки врем ени разви вается экспоненци­
ал ьн о и эф ф ектам и и нгибирования м ож н о пренебречь.
Д л я обсуж даем ы х выш е случаев д олж н а н аб лю д аться
зави си м о сть п ар ам етр а ф о т концентрации субстрата:
Ф = — 5- (неконкурентное ингибирование);
(5.48)
YpKi
Ф
=
— К~— (конкурентное ингибирование);
(5.49)
YpKi S 0 + X s
ф
=— —
(бесконкурентное ингибирование).
(5.50)
YpKj S 0 + K s
Если и нги б итор взаи м одей ствует с ф орм ой N, то увеличение
концентрации суб страта долж н о приводить к уменьш ению
п ар ам етр а ф . П ри взаи м одей ствии инги битора с ф орм ой X рост
концентрации су б стр ата долж ен увеличивать ф по зависим ости
с «насы щ ением » при вы сокой концентрации субстрата.
5
З а к . 544
129
Рис. 5.1. Зависимость ф (S) для различ­
ных кинетических схем с ингибирова­
нием роста популяции микроорганиз­
мов продуктом ферментации:
9 ( s)
* tM
1 — н еко н ку р ен тн ое и н ги би рован и е; 2 — бес­
ко н ку р ентн о е
и н ги би рован и е; 3 — кон ку­
рентн ое и н ги би рован и е; 4 — неослож нен ны й
рост
О
5,о
• Н а рис. 5.1 приведены кривы е зави си м ости (p(S) для
обсуж даем ы х кинетических схем, а такж е д л я неослож ненного
роста. Зависим ости <p(S) м о гу т б ы ть основой д л я ди скри м и н а­
ции м ех ан и зм о в ингибирования.
5.1.4.
Трехстадийная схема
Р ассм о тр и м несколько более общ ий
трехстадий н ой кинетической схемы:
случай
в
рам ках
(5.51)
NP
Х ,Р
Х 2Р
Б удем счи тать, что п родукт способен о б р азо в ы в ать нереакцион­
носпособные комплексы с каж ды м из состояний клетки — N , X t или
Х 2. Э ти процессы и м ею т бы стры й и об р ати м ы й характер и м огут
б ы ть о х ар актер и зован ы кон стан там и диссоциации K i<0, К ии K i<2.
Запиш ем систему уравнений, описы ваю щ их динам ическое
поведение каж д о го из ком пон ен тов системы :
^
—
M = N + N P + X 1 + X 1P + X 2 + X 2P;
(5.52)
=2А:3Х 2 —/l1S0N + / cj0,(NP) —A:i0)PN ; '
= k i0,PN —k (°{(N P) ~ 0;
~
dt
d lX .P )
= k l S0N - k 2X 1+ k 4 \ ( X 1P ) - k \ " P X 1-,
...........
= k i1*PN —k (l \ (X P ~ 0);
~
= к 2Х 1- к 3Х 2 + к Щ Х 2Р
2 ) ~ к ^ Р Х 2;
= к !2)P X 2 —к \2) (X 2P) ~ 0.
Г
(5.53)
С лож ение уравнения (5.53) с учетом (5.52) приводит к осн овно­
м у д иф ф еренциальном у уравнению
I
^
= * зХ 2.
(5-54)
П оскольку в условиях равновесия г /(Х ,Р )Д //~ 0 , d ( X 2P)/
/ dt ^O, (/(N P )/c //~ 0 , кинетика накопления п родукта описы вается
следую щ и м об р азо м :
I
(5'55>
тР^ = к ^
Если справедливы основны е п редполож ения о м алости п ар ам ет­
ров перед производны м и d X J d t и d X 2/dt, т. е. справедливы
неравенства (1 / k 2) d X 1/ d t ^ : X u (1 / k 2) d X 2/ d t c X 2, то меж ду
п ерем енны м и N, Х : и Х 2 сущ ествую т соотнош ения
k 1S0N = k 2X l ;
к 2Х , = к 3Х 2.
(5.56)
(5.57)
С учетом этих соотнош ений, а такж е уравнений для констант
диссоциации ком плексов с п родуктом
т Ц О ) _
N P
_
v W —
*
[ Р
К ' -(№ )• к ' " М
•/ И 2 > _
'
* * Р
/<;
' " М
(
’
уравнение (5.52) вы гляди т так:
Р ■къ ( л .
М = Х,
к ? ] кЛ
У чи ты вая линейную
п роду кта и биом ассы
Р 1.
К\'Ч
/. ■ Р
А-, s0 V
зави си м ость
(5.59)
а:)0’
меж ду
концентрациям и
Гр Р = М,
(5.60)
м ож н о зап и сать
['
Х 2- -
^
^
^
Т3 Т3
м-
'
+ Y „K \1>+ k 2 + к 2 УрК Г + к Х + к ^ 0 + YpK \ 0'
П од стави м это вы раж ение в диф ф еренциальное уравнение (5.54):
dм _
dt [ .
к3
к3 \
1 + A-2 + Ar,S0;
к3м
М / 1 Аэ 1
к3
I у
(5.62)
' Ур \ К \ 2)' к 2 К \ 1^ к 1Б0 К [ 0\
Д л я кинетической схемы (5.51) м огут р еали зоваться все
основны е типы законом ерн остей ингибирования. У равнение
(5.62) м ож н о п редстави ть в виде
5*
131
V
k2 kfioj " V*!2’ ' к2К\"' kx$0K\m)
Если продукт взаи м одей ствует со всеми ф о р м ам и N , X ,,
Х 2 с один аковой эф ф ективностью , т. е. если К \ 2) = К [ 2) = К[ ^,
то им еем
къ
_ (1 +к3/к2)(\ + Р / Kj) S °
---------------------S
I
0
•
(5 .6 5 )
3
A j ( l + * 3/fta)
Видно, что кон ц ен трац ия п родукта влияет на цт ; это типичны й
случай неконкурентного ингибирования.
Если продукт и зби рател ьн о взаи м одей ствует ли ш ь с ф орм ой
N , К \ *-> 0 0 , К \ 2)-+ оо, то уравнение р о ста культуры будет
и м еть ф орм у
.. _
къ1\(\ + k l lk2)S0\
ЦР -----------------^
т
р -г,
( 5 .6 6 )
*!01/
что соответствует м еханизм у конкурентного ингибирования.
В общ ем случае при п р о и зв о л ьн о м соотнош ении меж ду
к о н стан там и К \ ° , К \ 0) и К \2' им еет м есто смешанное ингибиро­
вание продуктом. Если ввести обозначения
\
1 + ^* 2 + /М
Г §кЭ0" = й + ^ ’
къ \
къ \
d
^5'67^
W ) + T2W )+ k J o W ) = c + s~o’
^5'68^
то уравнение скорости ро ста популяции м ож н о зап и сать так:
„ _ [ *к31(а
3/(e+cP)]S0
М Т ’
S0 +
(5'69)
а+сР
т. е. и нги б итор о казы в ает влияние на цт и на K s.
Введем п ар ам етр , о б озн ачаю щ и й н аб лю д аем у ю кон станту
и и нгибирование п родуктом
I
I
I
, к3
В числовое значение ХЭфф н аи больш и й вклад вносит процесс
и нгибирования с наим еньш ей кон стантой диссоциации. Д ей ст­
вительно, если в сум м е (5.70)
j-_^
L
^ 2 л:i, ) Ч 1 s0*^0),
л:|2)
(5 71)
то
К Эфф = *Р>.
(5.72)
Э то озн ачает, что ингибирование осущ ествляется путем б локи ­
ровки состоян ия X ,.
Если
» JL +
к2к \ "
к \ 2'
(5 73)
*2
’
А:28 0а:}0»’
то
=
(5.74)
КЪ
Э то соответствует м еханизм у инги бирован и я через ф орм у Х 2.
С оответствен н о если
L » J _ +
к & К Р
K \ 2'
L
(5 7 5
k 2S0 K \ " '
)
’
то
K 3M = K \0)k~ ^ ,
(5.76)
k3
т. e. п родукт взаи м одей ствует с ф орм ой N.
Запиш ем уравнение (5.62) следую щ и м об разом :
= * А.
k2
k t Sо ) dt
Y„K , м
(5.77)
3
И н тегри рован ие это го уравнения с и сп ользован и ем начальны х
условий
t —0,M = N 0 п ри вод и т к уравнению
1п£+
S
-
N0
/
k-, ,
n
. к-, \
i -
i .
к* ,
к-.
(5.78)
П о своей ф орм е это уравнение п олн остью совп адает с получен­
н ы м и ранее д л я двухстадийны х схем ро ста м и кроорган и зм ов
с ингибированием продуктом :
In^+ qjM z^p/,
N0
Т
N0
(5.79)
К
где
Ц = _ Д Т _
1 + — "I
(5.80)
—
k2 кхS0
133
• Т ак и м о б р азо м , уравнение (5.79) является о б щ и м уравне­
нием д л я кинетики ро ста с и нгибированием п родуктом и его
вид не зависит от числа пром еж уточны х состояний. Д ля
ан ал и за процесса в об суж д аем ом вари ан те п олн остью п рим е­
ним подход, описанны й д л я двухстадийной схемы , поскольку
и нтегральн ы е ф о р м ы здесь п олн остью эквивалентны .
5.1.5.
М ногостадийная схема
Р ассм о тр и м кинетику ро ста м и кробн ой популяции, когда
в м ехан изм е ро ста участвует п роизвольное число п различны х
состояний. Б удем считать, что продукт способен бы стро
и о б р ати м о взаи м од ей ствовать с каж д ы м из этих п ром еж уточ ­
ных состояний и это взаи м одей ствие м ож ет б ы ть о х арак­
тер и зо ван о кон стантой равновесия
4 4 *>") Ait rlt
NP
XiP
Х 2Р
Х,-Р
X„P
р (182)
К ин ети ка накопления биом ассы (общ его числа клеток) описы ­
вается уравнением
-d^ = k n+1X n,
dt
гда
(5.83)
п
п
M = N + N P + X Х ; + X Х,Р.
i= 1
П ри
условии м алости
(5.84)
i= 1
п ар ам етр о в
перед п роизводны м и
( —1—d X J d t ^ X i ] концентрации различны х ф о р м связаны меж ду
y^i+i
)
собой соотнош ениям и
К онцентрации ком плексов (N P ), (Х ,Р ),
н айдены по уравнениям
(Х„Р) м огут б ы ть
(NP)
(5.86)
(Х.Р)
Э т о т н аб о р уравнений п озвол яет в ы рази ть концентрации
состояний N, ..., Х я-х и ком плексов (N P), ..., (Хп- хР) через
концентрацию Х„ и соответствую щ ие кинетические п арам етры .
П ри это м необходи м о п рин ять во вним ание, что меж ду
М и Р имеется линейная связь
M=x-(1+^ +t- * S ^ ) +^ ( ^ +A“ r | !P p +^ )
(5.87)
И спользуя это уравнение, м ож но в ы рази ть Х„ через М:
М
1\ . М (
+ * л + | "+ \ ~ 2 V
I
.7
у
' j_ k„+i \
п+ 1 , г 2 * ]% к М " )
(5.88)
или
X .— 2 L - ,
(5.89)
fi+yfi
1 Р
где
/ . - * + к&
+ * . * . i I- 2f !1
^оо
im 'ik s c
(590)
<5'911
Д иф ф еренциальное уравнение (5.83) прим ет вид
dM
dt
£„+iM
(5.92)
М
fi + y f i
1 Р
Э то уравнение е разд ел яю щ и м и ся перем енны м и
135
(5.93)
и нтегрирование
M = N 0 дает
к о то р о го
с
и сп ользован и ем
условий
?= 0 ,
П олученное уравнение им еет т о т же вид, что и рассм отренн ы е
уравнения д л я случаев двухстадийного и трехстадий н ого п р о ­
цессов.
П ри этом
(5.95)
(5.96)
• Г лавны й вы вод ан ал и за заклю чается в то м , что экспери­
м ен тальн о н аб л ю д аем ая кинетика роста м и кроорган и зм ов
в условиях инги бирован и я процесса п р о д у к то м не зави си т от
числа п ром еж уточн ы х соединений и числа стади й реакции.
К инетику р о ста в этих условиях описы вает общ ее уравнение
(5.92). Э то п о зво л яет в о сп ол ьзоваться при ан али зе кинетики
процесса общ ей процедурой, д етал ьн о рассм отренн ой в следую ­
щ ем разделе при сравнении кинетических законом ерн остей
н еослож ненного р о ста и р о ста при инги бирован и и суб стратом
или п родуктом .
5.2. А Н А Л И З П О Л Н Ы Х К И Н Е Т И Ч Е С К И Х
К РИ ВЫ Х
РОСЛА
Р ассм о тр и м кинетические закон ом ерн ости ро ста м икробн ой
популяции в условиях, когда процесс разви ти я ингибируется
п р о ду кто м реакции и п ротекает во всем диап азон е времени
до п олн ого исчерпания субстрата.
5.2.1. Конкурентное ингибирование продуктом реакции
В т о м случае, если д и н ам и к а р азви ти я м и кроб н ой популяции
ингибируется накоплением продукта по конкурентном у м еха­
низм у, уравнение д л я скорости процесса описы вается след ую ­
щ и м об р азо м :
136
С учетом двух б алан совы х уравнений
7 s (S 0 - S ) = M - N 0;
(5.98)
rLрХ
nP =
n~
»M
— iM
.. - N
j 1o
‘V1*
(5-99)
кинетическое уравнение р азви ти я популяции будет и м еть вид
N0
M \w
</М
(5.100)
M
~dt"
N0
М
У. к + 8 о+ 1 ^ - к
Э то уравнение с разд ел яю щ и м и ся перем енны м и мож но п ред ста­
вить в ф орм е
М
К.
+
I
No
dM +
м ,
K.dM
= |i J -
-
,
N0
М
(5-101)
У Л \ So + д г - т г
П ервая часть это го уравнения соответствует диф ф еренциально­
м у уравнению д л я полной кинетической кривой роста м и к р о о р ­
ган и зм а в отсутствие процесса ингибирования продуктом [см.
(3.27)]. В торое слагаем ое левой части уравнения (5.101) при
и нтегрирован и и д ает функцию
N0
Ys&s | n
y k
J
I
Na YJC,[
N0
М
So + ^ - v
r*
M
0 + T*P~ Trs
s 0+^
(5.102)
'
В соответствии с этим общ ее вы раж ение д ля интегральной
ф орм ы уравнения ро ста культуры с участием процесса конк}/
рен тн ого и нгибирования п родуктом имеет вид ( п р и S0 » - ^
<5ЛЮ)
или (учиты вая, что
FsS 0 = M m)
In — —Ф1п
N0
M -N ,
= [lt,
(5.104)
М .
* Предполагается, что в процессе роста микроорганизма
существенное накопление биомассы по сравнению с No-
происходит
137
где
(5.105)
П а р ам етр Ф о тр аж ает эффект инги бирован и я продуктом :
(5.106)
И з уравнения (5.106) видно, что, если кон стан та ингибирования
п р о ду кто м сущ ественно б ольш е используем ой н ачальной кон­
центрации су б стр ата (y ,S 0 « c YpK^), эф ф ектом ингибирования
п р о ду кто м м ож н о практически пренебречь. В предельном
случае, когда ингибирование п родуктом вообщ е отсутствует
(К{ —►оо), уравнение (5.103) тран сф орм ируется в и нтегральн ое
уравнение роста культуры без ослож нений ро ста (3.27).
Если кинетика процесса исследуется д о глубин конверсии
ли м и ти р у ю щ его суб страта 0,5— 0 ,6 , то кинетику процесса
д о стато ч н о стр о го оп исы вает уравнение
(5.107)
Э то уравнение получается при разлож ени и в ряд второго
л огари ф м и ческого члена уравнения (5.103) и и спользовании
т о л ьк о первого члена разлож ения.
• П ри н ци п иальн ое отличие кинетики процесса с конку­
р ен тн ы м и нгибированием п родуктом о г процесса без ин­
гиби рован ия заклю чается л иш ь в зави си м ости п ар ам етр а Ф от
концентрации суб страта. Д л я процессов без ингибирования
п р о ду кто м , как п равило, Ф <§; 1. В случае и нгибирования
п р о ду к то м
при S 0 ->oo. Видно, что при YSK S= YpK t
*pA-i
Фсо=1; если YsK s< Y pKf, то Ф 0 0 < 1 ; если к он стан та и нгибироваг
-| с кон стан той срод ства
5,2.2. Неконкурентное ингибирование продуктом
Д л я кинетической схемы процесса с неконкурентны м ингиби­
р о ван и ем ро ста культуры п родуктом реакции скорость роста
культуры д о лж н а б ы ть представлен а уравнением:
</М _
~dt
138
HmSM
(5.108)
Д иф ф еренциальное уравнение (5.109) п редставляет собой у р ав ­
нение с р азд ел яю щ и м и ся перем енны ми:
A + ± + J ^ L + - L ) < / M = pmf.
SM
М
K,SM
MKj J
(5.110)
Ит
v
7
С учетом соотнош ений Fs [S 0 —S] = M —N 0; КрР = М уравнение
(5.110) м ож ет б ы ть записано в виде
1
М
+
/
,
“ К
4 --^ +
N0
М\
+ т Ы
/
Г *
N0
S„+ ^
М
- -
(5.111)
Видно, что в эт о м уравнении слагаем ое в скобках совп адает
с уравнением (5.101), оп исы ваю щ им кинетику процесса с конку­
рен тн ы м и нги бирован и ем п родуктом . С л ед овател ьн о, при ин­
тегри рован ии уравнения (5.111) по сравнению с (5.103) п оявл яет­
ся один д оп олн и тельн ы й линейны й член:
So/
N0
I So
Y К, I
I
Mm
I
YpK,
01
(5.112)
И з уравнения (5.112) следует, что при «плохих» константах
и нгибирования п р о дуктом (в пределе при А ^ -ю о ) уравнение
(5.112) тран сф орм ируется в обы чное уравнение ро ста культуры
(члены, вклю чаю щ ие 1/ К {, становятся пренебреж им о м алы ).
Д ополн ительн ы й линейны й член в уравнении (5.112) сущ е­
ственны м о б р азо м м еняет кинетику процесса. Кинетические
данны е в случае м ехан изм а неконкурентного ингибирования
п р о ду кто м тер я ю т способность лин еари зоваться в ко о р д и ­
натах l n ( M / N 0) / / от l n ^ l - M~ N-^ / r К аки х-ли бо прием лем ы х
коо р д и н ат, п озволяю щ и х л и н еари зовать эксперим ентальны е
данны е, найти не представляется возм ож н ы м , поскольку в урав­
нение (5.112) входят три перем енны е функции: l n ( M /N 0),
In ( 1 —M ~ Ng I, M —N 0. О пределенны е возм ож н ости в анализе
\
м™/
^
кинетического процесса д ает приближ енны й подход, в к о то р о м
и спользуется разлож ение в степенной ряд логари ф м и ческого
члена
1п( 1 —M ~ N° [.
V
м- у
Если
кинетика
исследуется
до
глубин
0,5— 0 ,6 , то д о статоч н о обосн ованн о м ож н о восп ользоваться
уравнением
1
+ *
S J
M -N ,
to “ + ( * + * £ + *
VS 0
N0
▲ Э ксп ери м ен тальн ы е
в коорди натах
In
YpKi
данны е
м /
К /
(5.113)
YpKj
долж ны
М —N ,
t от
м.
2
л ин еари зоваться
//:
K . Y,
So
In — / 1= __ —____
N0 /
Y, K,
к.
l + A s/ S 0
M -N n
М .
+-
М ./
(5.114)
s o.
Н а основе тако й линеаризации м огут б ы ть найдены ц и п а­
р ам етр Ф, ко то р ы й равен
К
K.Y.
ф=^
м.
У ч ,
(5.115)
Y. K,
1+Г
Если учесть, что М т— YsS0, то функция м ож ет б ы ть п р ео б р азо ­
вана к виду
ф = . к.
k,
5 .3 .
+
О П РЕДЕЛЕН И Е
ИЗ
РОСТА
ВИДА
s0
1
+
*
У.К,
(5.116)
2
М ЕХ А Н И ЗМ А
И Н ГИ БИ РО ВА Н И Я
КИНЕТИЧЕСКОЙ
ПОПУЛЯЦИИ
КРИВОЙ
М И К РО О РГА Н И ЗМ О В
К ак п равило, кинетические исследования в м и кроб и ологи и
зак л ю ч аю тся в изучении кривы х роста м и кроб н ой популяции.
П ри это м важ но из так ого род а данны х получить м ак си м ал ь ­
ную инф орм ац ию . П роведенны й ан ал и з д ает возм ож н ость из
вида изм ененной кривой роста ответи ть на вопрос: им еет ли
м есто в д ан н о м кон кретном случае неослож ненны й рост или
разви тие культуры сопряж ено с эф ф ектам и ингибирования
п р о дукто м или субстратом ?
С равнение кинетических уравнений д л я процессов без инги­
б и рован и я с уравнением д л я конкурентного ингибирования,
н еконкурентного и ингибирования и збы тком суб страта п оказы ­
вает, что в р ам ках приближ енного рассм отрен и я при глубинах
140
процесса, не превы ш аю щ их 0,5— 0 ,6 , кинетика ро ста популяции
м ож ет б ы ть описана ф о р м альн о одним и тем же уравнением
\
v
1 п ^ -+ Ф ^ -^ = р /;
(5.117)
1п
(5.118)
мт
N0
\
^ + (р М ^ £ = И ,
\
N0
N0
где Ф, ф — п ар ам етр ы , о траж аю щ и е м ехан изм процесса.
Различие п ар ам етр о в Ф и ф заклю чается в использовании
н орм и р о во ч н о го м н ож и теля, п риводящ его перем енную М —N 0
к безр азм ер н о м у виду. Если эксперим ентальны е данны е получе­
ны в условиях,\ при которы х наиболее точно определяется
м акси м ал ьн ая п ло тн о сть культуры М,„ или Ys и S0, то
наиболее правильн о и сп о л ьзо в ать б езразм ерн ую перем енную
(М —N 0 ) / M m. Э то п ри вод и т к уравнению (5.117) и со о тв ет­
ственно
кп ар ам етр у Ф. Если д остаточ н о
точно найдено
значение N 0, то удобно н о р м и р о вать данны е M - N 0 на
значение N 0, что приведет к п ар ам етр у ф.
В таб л . 5.1 приведен вид п ар ам етр о в Ф и ф как функций
концентрации S 0 и п ар ам етр о в M m, N 0, S0, К и Видно, что
неослож ненны й рост, ингибирование п родуктом и суб стратом
м огу т б ы ть диф ф еренцированы , если эксперим ентально найти
значение Ф или ф . Д ей ствительн о, в условиях глубокого
эф ф ективного ингибирования п родук том п ар ам етр Ф сущ ествен­
но больш е единицы, д л я и нгибирования су б стратом Ф < 0
(отри ц ательн ое число), в то врем я как д ля неослож ненного
ро ста х арактерн о 1 > Ф > 0 . У ж е на основании определения
Ф м ож но провести идентиф икацию условий ро ста популяции.
Д ля определения п ар ам етр а Ф (или ф ) н еобходи м о восп оль­
зо в аться одной из линейны х ан ам о р ф о з уравнения (5.117)
[(см., н ап рим ер, уравнения (5.33) — (5.35)]. Важно ещ е раз
п одчеркнуть, что значение Ф (или ф ) определяется из экс­
п ери м ен тальны х данны х для всех условий разви ти я процесса
по о д ном у и то м у же уравнению , н ап рим ер, из зависим ости
l n ( M / N 0)/ f от * ^ / t :
1 п ^ / ?= р - Ф
N0 /
^ .
(5.119)
M mt
Д л я определения р и Ф м ож н о такж е восп ользоваться
разн о стн ы м м ето д о м , поскольку М,- и М^, определенны е
при двух ф иксированны х врем енах
и tj, связаны между
собой уравнением
1п
^ / ( ^ . ) = ц -Ф ^ Ц ^ .
М; / ' *
J'
^
(5.120)
М„
141
5.1
Таблица
о
Z с
*
\
7
8
. Т
Ц© ЦУ
^ °Z
in
+
ся х
4*
^"8
t
©-
^О 8
— 00 <У?Т
А +. + Ь<
€> <
*N
^ а.
О
^5 о
2
^*8
Т
9-
СО |S x f
сл I*
^ |<У?
тI
Xйи °
*с
5о
о.
«
3
X
X
оX
*о
х
8
о
X
5
о
н
м
п
X 8.
н
Я с
<D
8.S
X
к л03
о О
ъс аЯ
ю
142
•
я
к
7.
5
о
ь
^
>.
1 сх
|
□
я с
Й
СХ и
S
F я
В
Я 1
со
о о
« (X
Vя
х ёя
и
ю
о
а>
я
я
л
СО
О
Он
я
*g
S S
g
fe
s* g.
&
J?\*+
В этих
уравнениях
парам етр
Ф определяется как тангенс угла
\
1 1
наклона зависимости
In
U h - t j J')
Mf / u
эис. 5.2). Видно, что
(tr
при си льн ом ^проявлении осл ож ­
няю щ их эф ф ектов м ехан изм р о ­
ста культуры м ож ет б ы ть иден­
ти ф и ци рован весьма строго.
Д ан ны е по м еханизм у роста
с и нгибированием и зб ы тко м суб­
стр а т а приведен/}) на рис. 5.3, из
к о то р о го видно, что ц = 0,032 ч - 1 , Рис. 5.2. Кривые роста, построен­
а Ф = —0,85. Т ак как и н ги б и рова­ ные в координатах уравнения
(5.120) для случаев:
ние зам етн о , то\ это гов о р и т
/-ингибирования продуктом (Ф>1);
о то м , что о б ласть используем ы х
2 — неосложненного роста (0 < Ф < 1);
концентраций сульф ита сравн и м а
3— ингибирования субстратом (Ф<0)
с Ki и п ревы ш ает K s, т. е. для
определения числовы х значений кинетических п арам етров м о ж ­
но восп о л ьзо ваться уравнением (4.82), п реоб разовав его к виду
ОТ
^ i = S0(l —Ф)/Ф.
Н айденное значение К ( = 50 м г/м л .
П ри
сравнении
кинетических
кривых
роста
М. thermoautotrophicum и Bacillus thuringiensis (рис. 5.4) видно,
что р о ст первого м и кр о о р ган и зм а осущ ествляется без ослож не­
ний (Ф < 1), в то врем я как рост Вас. thuringiensis характеризуется
эф ф ективны м и нгибированием п родуктом (Ф > 1 ).
В озмож ен и более глубокий анализ. Н апри м ер, теоретически
м ож н о д и скр и м и н и р овать м ехан изм ингибирования (отличить
конкурентное ингибирование о т неконкурентного) и найти
числовы е значения п арам етров, в первую очередь кон станты
и нги бирован и я К {. П ри это м нужно и м еть в виду, что
с услож нением ан ал и за в о зр аста ю т треб ован и я к точности
эксп ери м ен тальн ого изучения кривы х роста культуры . П ов и д и м ом у, точность изм ерений в об ы ч н ом м и кроби ологи ческом
эксперим енте в больш инстве случаев н едостаточн а д л я углу­
бленного ан али за. Т ем не менее интересно р ассм отреть прин­
ц ипиальны е возм ож н ости м етода.
Д л я то го чтобы достоверн о вы яви ть и нгибирование п родук­
т о м , иденти ф и ц ировать м ехан изм ингибирования, н еобходи м о
снять кривы е р о ста культуры при нескольких исходны х кон­
центрациях су б стр ата в ш и роком диапазоне его концентраций.
Д л я идентиф икации м ехан изм а и определения кон станты
и нги бирован и я п р о ду к том п редлагается следую щ ая п роцедура.
143
Рис. 5.3. Кинетическая кривая роста Propionibacterium shermanii в присутствии
сульфита (a) (JI. И. Воробьева, И. А. Чарахьян, 1983) и те же данные в координатах уравнения (5.119) для роста с ингибированием субстратом (б)
Рис. 5.4. А/нализ кривых роста
М. thermomltotrophicum
(/),
Вас.
thuringiensis (2) построен с использованием уравнения (5.119). Неосложненный рост характеризуется
Ф = 0 ,5 2 < 1 , прямая /; ингибирова­
ние продуктом Ф = 2,1 > 1, прямая 2
И сследование зави си м ости кинетической кривой ро ста от
концентрации су б страта д ает д ва п арам етра: ц и Ф. Значения
цт и K s н ах о д ят из обы чной лин еари зац ии уравнения для
удельной скорости ро ста (см. гл. 2). Д алее, д л я каж дой
концентрации S 0 при н айденном значении Ks м ож ет бы ть
вы числена функция K J ( K S+ S0). В осп ользовавш и сь дан ны м и
таб л . 5.1, м ож н о зап и сать соотнош ения:
К +S
(
\
~ к ° ) ~ ^ (неослож ненны й рост); (5.121)
ф | ^ + s9 [ -
К J
К +S
1
- |_ 1 ^ (конкурентное ингибирование); (5.122)
1
+ -4 -^
\
Ф (-^ — 5 =
к, I
УРК,
YS /
Упкл
S >
1
н—5) (неконкурентное ингибирование).
к,,
(5.123).
Видно, что м ехан изм ы роста м о гу т б ы ть д искри м и ни рован ы
на основании зави си м ости эксп ери м ен тальн о найденны х п а­
р ам етр о в , представленны х в левой части уравнений (5.121) —
(5.123) о т концентрации субстрата. К ак следует из уравнения
(5.121), в т о м случае, если при разви тии культуры отсутствую т
процессы
ингибирования
и збы тка
п родукта,
зави си м ость
Ф
144
S°^) 0Т концентРации суб страта д олж н а б ы ть представ-
разви тие культуры соп ровож д ается кон курентн ы м ингибирова-
ро б н о го процесса с неконкурентны м и нги бирован и ем продук-
характер. Э ксп ери м ен тальн ы е д ан ны е д л я м ехан и зм а некон­
курентного ингирирования п родуктом долж ны л ин еари зоваться
в коо р д и н атах зави си м ости <&(Ks + S0) / K s от S0 (l + S 0 / ^ j .
Тангенс угла н аклон а кривой этой зави си м ости равен Y J ( Y pk i).
• Т аки м о б р азо м , кинетический ан али з п озвол яет и нтерпре­
ти р о в а ть д о стато ч н о слож ны е кривы е роста популяции м и к­
р о о р ган и зм о в в условиях и нгибирования п родуктом и суб­
с т р а т о м и определить основны е количественны е характеристики
процесса.
B д анной главе рассм отрены особенности м и кробн ого
роста, ослож ненного инги бирован и ем п родук том ферменФ тации. Н аб л ю д аем ы й ф еномен м ож ет б ы ть описан с п о­
м о щ ью нескольких кинетических схем, которы е, однако,
х ар а к т е р и зу ю т с я п охож ей ф о р м о й ки н ети ческой кр и в о й р о ­
ста. П р и с и л ь н о м и н ги б и р о в ан и и п р о д у к т о м реакц ии на
ки нетических кр и вы х р о с т а к л ето ч н о й п о п у л яц и и о т с у т с т ­
вует яр к о в ы р а ж ен н ая э к сп о н ен ц и ал ь н а я ф аза. Р азв и ти е
кл ето ч н о й п о п у л яц и и как бы с р а зу п ер ех о д и т в ф азу
л и н е й н о го р о ст а . Э т о н ах о д и т свое о тр аж ен и е в м а т е м а т и ч е с ­
к о м о п и сан и и п роцесса. Д л я м е х а н и зм а , п р о т е к а ю щ е го с яр к о
в ы р аж ен н ы м и н ги б и р о в ан и ем п р о д у к т о м , п а р а м е т р Ф (или
ф), х ар а к т ер и зу ю щ и й о тк л о н ен и е си стем ы о т эк сп о н ен ц и ал ь ­
н о го р а зв и т и я , м о ж е т б ы ть сущ ествен н о б о л ь ш е еди ни ц ы .
В т о же в р ем я Ф д л я н ео сл о ж н ен н о го р о с т а м е н ь ш е еди ни ц ы ,
а д л я сл у ч ая и н ги б и р о в ан и я с у б с т р а т о м э т о т п р и м ер о т ­
ри ц ател ен .
Т аки м о б р азо м , возникает общ ий п одход к ан али зу ки­
нетических кривых роста м и кробн ы х популяций. Важно п о д ­
черкнуть, что наличие ингибирования и его м еханизм м ож но
проясн и ть на основе использован и я единственной кинетической
кривой ро ста популяции. Д л я этого н еобходи м о определить
п ар ам етр Ф, используя эксп ери м ен тальн ы е данны е до 50— 60%
конверсии суб страта. Э т о т п ар ам етр м ож ет б ы ть найден либо
на основе прим енения уравнения (5.117), л и б о разн остн ого
уравнения (5.120). Вычислив его и используя данны е таб л. 5.1,
м ож н о и денти ф и ц ировать м ехан изм протекани я процесса.
f
145
И ден ти ф икац ия м ехан и зм а д ает в руки и сследователя или
п р акти ка м ощ ны й инструм ен т управления р о сто м популяции.
Если р азви тие процесса п ротекает в условиях неослож ненного
р о ста, интенсиф ицировать рост клеток д о определенного пре­
д ел а м о ж н о путем увеличения концентрации суб страта. Если
п ар ам етр Ф отри цателен и процесс п ротекает с ингйбированием
су б стр ато м , это т эффект м ож но п р ед о твр ати ть уменьш ением
концентрации су б страта, при этом скорость ро</га популяции
возрастет. Если обнаруж ено, что Ф сущ ественно превы ш ает
единицу, то инги бирован и ю п родуктом м ож но восп реп ят­
ств о в ать, уводя его из зоны ф ерм ен тац ион н ого процесса.
ГЛАВА
6
П Е Р И О Д Ы И Н Д У К Ц И И НА К И Н Е Т И Ч Е С К И Х КРИ ВЫ Х
РО СТА М И К РО О РГ А Н И ЗМ О В
Ч асто н аб лю д аем ы е периоды (лаг-ф аза) индукции на кинетичес­
ких кривы х р о ста м и кр о о р ган и зм о в м о гу т и м еть разли чн ую
природу. М ож но п ред стави ть себе по крайней мере три
м ехан изм а, реали заци я которы х п ри вод и т к появлению на
кинетической кривой р о ста популяции периода, в течение
к о то р о го не происходит увеличения числа клеток или зам етн ого
об р азо ван и я продуктов реакции. С ледует подчеркнуть, что
период индукции трудно обнаруж ить из зависим ости числа клеток
или количества п родуктов от времени при п р ям о м наблю дении за
этим и п ар ам етр ам и , поскольку логариф м ический рост культуры
приводит к появлению каж ущ ейся л аг-ф азы . П ери од индукции
т определяется при ан али зе экспоненциальной ф азы роста
в полулогариф м ических коорди натах из зависим ости ln ( M /N 0) от
t как о трезок, отсекаем ы й на оси абсцисс при l n ( M / N o) = 0.
▲ П ер и о д индукции м ож ет о тр аж ать следую щ ие процессы.
1. Неспецифическую, неферментативную трансформацию ис­
ходного субстрата в продукт, п рием лем ы й д л я д альн ей ш его
м е т аб о л и зм а м и кр о о рган и зм ом :
S ' i s
(6 . 1 )
В ещ ество S' не используется м и кр о о р ган и зм о м
в силу его
химической природы или физического состояния.
П роцесс
перехода вещ ества S' в суб страт S характери зуется кон стантой
скорости к0 и м ож ет п ред ставл ять собой химическое превращ е­
ние вещ ества или его физическую тран сф орм ац и ю (наприм ер,
переход из одной ф азы в другую ).
2. Адаптационные процессы в клетке, в первую очередь
синтез н еобходи м ого ф ерм ен та или ф ерм ентной системы:
N ' -^ % N
(6.2)
С остояние клеток N ' характери зуется отсутстви ем н еобходим ой
ф ерм ен тной систем ы и неспособностью клетки усваи вать т о т
или иной су б стр ат и п ровод и ть ак т деления (автоум нож ения
биокатали ти ческой системы ). О б р азо в ав ш аяся в результате
ад ап тац и о н н о го процесса клетка в состоянии N способна
к авто катал и ти ч еско м у росту:
147
N -» 2 N
(6.3)
3.
Присутствие в культуральной среде ингибитора рост а,
блокирую щ его разви тие популяции. С течением времени кон ­
центрация и нги б итора / м ож ет п ад ать в р езул ьтате его расхода
или вы вода из системы:
IА * А
(6.4)
В качестве типичного п рим ера д ан н ого м ехан изм а, в ы зы в а­
ю щ его период индукции, м ож но привести влияние ки слорода
на рост ан аэробны х м и кроорган и зм ов. В присутствии зам етны х
количеств ки слорода рост популяции блокирован, однако за
счет процессов восстановления ки сл ород а или вы теснения его
в газо ву ю ф азу систем ы «избавляется» от сильн ого и нги б итора
и начинается рост м и кробн ой популяции.
Т ри обсуж даем ы х м ехан изм а, приводящ их к возникновению
пери ода индукции, м огут б ы ть диф ф еренцированы путем
кинетического ан ал и за и эксперим ента.
6.1.
ТР А Н С Ф О РМ А Ц И Я
П РЕС У БС ТРА ТА В СУБСТРАТ
В т о м случае, если накопление суб страта всистем е
идет
в соответствии со схемой ( 6 . 1 ), кинетику его роста описы вает
уравнение
§ =№
(6-5)
интегрирован и е к о то р о го дает
S = S 0 (1 —е " * ° г),
( 6 .6 )
где S0— начальная введенная в систему концентрация вещ ества S'.
Если зави си м ость скорости ро ста м и к р о о р ган и зм а о т кон ц ен тра­
ции су б стр ата определяется классическим уравнением М он о (1.3),
то диф ф еренциальное уравнение ро ста будет им еть вид
4М _ nmS0(l —е “ *0,)М
dt
(6.7)
As + S 0 ( l —е - *0' ) '
Э то уравнение с разд ел яю щ и м и ся перем енны ми:
с/М
М
n .S 0( l - e - * ' ' ) M
As+ S 0 ( l - e _/t°')'
И н тегри рован ие правой части этого уравнения дает
с
с
t
e ~ k"'dt
dt
-в *
А,
К
Эл
148
о 1+^^1 - е
(6.9)
Если ввести обозначение
a = \ + K J S 0,
(6.10)
то и н тегр ал п равой части уравнения ( 6 .8 ) будет и м еть вид
а
к0 \ а
I
ln ^ L -X
а- 1
(6 . 1 1 )
Т ак и м о б р азо м , реш ение диф ф еренциального уравнения п ри н и ­
м ает ф орм у
ln sN 0r = а- ' + к0
r (у —a J^)1п^ аТ- 1^
(6-12)
С учетом зави си м ости а от концентрации суб страта и м еем
1
No
+ ~ —e
к0 \ K s + S0 l
K,+S0
K J S0
ко t
(6.13)
И з уравнения (6.13) следует, что при Г= 0 ln (M /N o) = 0 или
M = N 0, т. е. уравнение (6.13) сп раведливо при данны х н ач ал ь ­
ных условиях.
Впроцессе
р азви тия систем ы экспоненциальны й
член,
входящ ий в логариф м ическую часть уравнения (6.14), ум ень­
ш ается и д о сти гает уровня, когд а справедли во неравенство
е " ^ '« 1
(6.14)
(или в общ ем случае e ~ k°'<sza). П ри это м условии уравнение
(6.14) тр ан сф орм и руется к виду
N0
а
к0 \ а )
« .
а- 1
(6.15)
Э то уравнение п рям ой , тангенс угла н аклон а кото р о й п ред ­
ставл яет собой нечто иное, как удельную
скорость ро ста
м и кр о о р ган и зм а:
Цт / я = ц.
В точке l n ( M / N o) = 0, где / = т, имеем
b -t_ _ £ (iz £ )i„ _ i.
а
ко у а )
а- 1
(6 , 1 6 )
Ts = ^ i l n - ^ .
ко а—1
(6.17)
или
• Т аки м о б р азо м , на кинетической кривой ро ста культуры
в случае наличия в м ехан изм е процесса кинетической стади и
149
тр ан сф о р м ац и и исходного вещ ества в прием лем ы й м етаб о л и т
долж ен н аб л ю д аться период индукции. П ротяж ен н ость периода
индукции связан а с начальн ой концентрацией пресубстрата
соотн ош ени ем
(6.18)
И з уравнения (6.18) следует важ н ая особен н ость кинетики
процесса д л я м ехан изм а, вклю чаю щ его стади ю тран сф орм ац и и
пресубстрата: высокие концентрации п ресубстрата м огут п о л ­
н остью эли м и н и р о вать период индукции.
Р ассм отри м два частных случая.
1.
Если н ач альн ая кон ц ен трац ия п ресуб страта очень м а л а
по сравнению с кон стантой Ks, S0 <s:Ks, то
(6.19)
и
(6 .20)
П ериод индукции не зави си т о т концентрации суб страта
и определяется то л ьк о кон стан той скорости тран сф орм ац и и
п ресуб страта в субстрат.
2.
Если н ач альн ая концентрация п ресуб страта сущ ественно
п ревы ш ает значение кон станты Ks, S0 ^ > K s, то им еем
„ _ ( K J S 0) \ n ( S J K s)
s
к
К0
( 6 .21)
П ер и о д индукции сущ ественно ум еньш ается с увеличением
н ачальной концентрации п ресубстрата. В пределе при S 0 - > оо
т 5 -> 0 , т. е. при больш их концентрациях суб страта период
индукции отсутствует.
6.2.
А Д А П Т А Ц И О Н Н Ы Й П РО Ц Е С С
Е сли пери од индукции связан с каталитической адап тац и ей
о р ган и зм а к н о вы м услови ям , то п опуляция введенны х в си­
стем у клеток будет состоять из двух видов:
М = N + N a,
(6 .22)
где клетки типа N не адап ти рованы к новы м условиям (не прош ел
синтез необходим ы х ф ерм ентов); клетки ти п а N a — ад ап ти р о ван ­
ные клетки, способны е к акти вн ом у процессу деления.
К инетическая схем а д л я об суж д аем ого случая им еет вид
N - ^ N a;
N a->-2N.
где к 0 — к о н стан та скорости ад ап тац и он н ого процесса.
150
(6.23)
С истем у уравнений, описы ваю щ их кинетику роста, м ож но
п редстави ть в виде
/ ч,
0 ’
(6-24)
^ = £ 0N + p N a.
(6.25)
Д л я то го чтобы н айти, как в системе растет общ ее число
клеток, н еобходи м о рассчитать дин ам ику изменения количества
(концентраций) клеток типа N и N 0 и затем , используя (6.24),
вы яснить дин ам ику изм енения общ его числа клеток:
N = N 0 e~ * 0',
(6.26)
где N 0 — н ач альн ая концентрация клеток, введенная
кулятом .
И спользуя уравнения (6.25) и (6.26), находим
^ - p N a = A:0 N 0 e - 4
У равнение
уравнение
им еет вид
с ино-
(6.27)
(6.27) п редставляет собой неоднородн ое линейное
с п о сто ян н ы м и коэф ф ициентам и;
его реш ение
N a (t ) —C ( t ) e ' a,
где функция
C ( t ) м ож ет б ы ть найдена путем
функции N а(/) (6.28) в уравнение (6.27):
^
(6.28)
подстановки
е “' + цсм'С ( / ) - ц С ( / ) е»“ - £ 0 N 0e Ч
(6.29)
И з это го уравнения следует
dC
Tt^ o N
o e ^ + t 1) '
(6.30)
или
I
C ( t ) = f ^ 0 N 0 e - ^ + ^ ) ^ = M ^ [ l + e -(* o + n )n
J
*o+ Ц
о
соответствен но
N a ( ' ) = v ^ eM' - e ~*0')-
(6.31)
<6-32)
П осле п одстан овки (6.26) и (6.32) в (6.22) им еем
M = r 2 r ieM' + r ,^ - e - V .
С>+ц
С>+и
(6.33)
v
’
151
И з уравнения (6.33) видно, что при / = 0, M = N 0, при больш их
/, когда ^ 0 е ц' » ц е -/с°', уравнение (6.33) тран сф орм ируется
в обы чное уравнение экспоненциального роста.
П р ео бр азу ем уравнение (6.33) в ф орм у, удобную для ан али за
в полулогариф м ических координатах:
<
1
In — = ц/ + 1п
«
4 >
(6.35)
к0
И з уравнения
(6.35) следует, что при больш их
временах
процесса в условиях, когда ( ц Д 0 ) е ~ ^ 0+,4' « ; 1 , зави си м ость
от времени (6.35) вы рож дается в линейную функцию:
1 п -^ = цж
П -А -.
No
(6.36)
к 0 + у.
Т ангенс угла н аклона зави си м ости (6.36) равен удельной
скорости р о ста м и кроорган и зм а; отрезок, отсекаем ы й п рям ой
на оси врем ени (период индукции), им еет вид
т = - In (1 + т - )•
(6-37)
А Если и сп о л ьзовать д ля р уравнение типа уравнения
М оно, м ож н о найти зави си м ость п ери ода индукции от концен­
трац и и субстрата:
Т = ! In f 1 + JM
ц
\
(6.38)
ко
Р ассм о тр и м три важ ных частных случая :
1. Если удельная скорость роста о р ган и зм а сущ ественно
превы ш ает скорость адап тац и онн ого процесса ( р » А : 0), то период
индукции им еет конечное значение, п редставленное уравнением
х = 1п(ц/Ч
а
ц
(6.39)
2. Если ск орость ад ап тац и он н ого процесса сущ ественно
выш е, чем удельная скорость р о ста культуры , то
период
индукции, связанны й с ад ап тац и он н ы м процессом , не будет
зам етен. Д ействительн о, если
\i/k0 c \ ,
р « :/с 0 5
т 0
х а =
°-
( 6 -40)
3. У величение концентрации суб страта п риводит к увеличе­
нию удельной скорости роста культуры . В пределе при
S0 ->oo им еем
152
X,а
(6.41)
Э то п редельн ая величина периода индукции, к о то р а я д олж н а
н аб л ю д аться при бесконечно больш ой концентрации субстрата.
6.3.
РА С Х О ДУ ЕМ Ы Й И Н Г И Б И Т О Р РОСТА
Р ассм о тр и м кинетику процесса в условиях присутствия
си льн ого и нги битора, расходуем ого в н езави си м ом от роста
культуры процессе. П редполагается, что и нгибитор, равновесно
взаи м одей ствуя с клю чевой ф ерм ентной систем ой, п р ед отвра­
щ ает рост культуры :
К,
I + N*±NI.
(6.42)
П ри это м ком плекс N1 не активен в автокатал и ти ч еском
процессе роста.
К онц ен трац и я
и нги битора
в системе
в соответствии
со схем ой (6.4) м ож ет бы ть описана диф ф еренциальны м
уравнением
(6.43)
и как функция времени будет и м еть вид
1
=
10е
(6.44)
"Ч
где 1 0 — концентрация инги битора в начальн ы й м о м ен т
времени.
Д иф ф еренциальное уравнение д л я скорости р о ста культуры
в условиях, при которы х часть клеток будет н аходиться
в н еактивн ом ком плексе N1, м ож н о зап и сать в ф орм е
(6.45)
£=H(N-NI).
К онц ен трац и я клеток
д ан а функцией
в и н акти ви рован н ом
состоянии
будет
(6.46)
П осле п одстановки (6.46) в (6.45) им еем
(6.47)
153
Реш ение это го д иф ф ерен ц иальн ого уравнения с р азд ел я ю щ и ­
мися перем енны м и им еет вид
In
|ицj(,
Л=м
,+М
(е
1)
(6.48)
или
In N - >*-s o' +
N0
K ,+S0
Io>t”So
k 0K , ( K , + S 0 ) '
11
('6
^
( 6 -4 У )
491
С течением времени экспоненциальны й член, входящ ий
в уравнения (6.44) и (6.49), ум еньш ается при временах,
п ревы ш аю щ и х 1 / к 0, и станови тся пренебреж им о м а л по
сравнению с единицей. В это м случае зави си м ость l n ( N / N 0)
п редставляет собой линейную функцию о г времени:
<б -5 0 >
▲ Тангенс угла н аклон а этой зави си м ости п ред ставляет
собой удельную скорость ро ста культуры ; отрезок, отсекаем ы й
на оси врем ени,— период индукции, равны й
Tt = ( l 0I K t) { l l k 0).
(6.51)
В это м случае период индукции на кинетической кривой ро ста
культуры не зави си т от концентрации суб страта или удельной
скорости р о ста м и кр о о р ган и зм а, а определяется то л ьк о концен­
трац и ей и нгибитора.
6.4. Д И С К Р И М И Н А Ц И Я М Е Х А Н И ЗМ О В
И О П Р Е Д Е Л Е Н И Е К И Н Е Т И Ч Е С К И Х П А Р А М Е Т РО В
П роведенны й вы ш е ан ал и з п оказы вает, ч то три обсуж даем ы х
м ех ан и зм а появления на кинетических кривы х ро ста периода
индукции оп исы ваю тся разл и чаю щ и м и ся уравнениям и, которы е
м о гу т б ы ть сопоставлены с эксп ери м ен тальн ы м и данны м и.
Д о стато ч н о неслож но п о казать участие или отсутствие
в м ехан изм е процесса и нги б итора, блокирую щ его разви тие
культуры . Если эксп ери м ен тальн о найденны й при различны х
концентрациях су б страта период индукции не зави си т от
концентрации су б стр ата или удельной скорости ро ста культуры ,
то м ож н о д у м ать , что период индукции связан с действием
расходуем ого и н ги б и тора [уравнение (6.51)]. С тр о ги м д о к а за ­
тел ьство м это го м о ж н о сч и тать обнаруж ение линейной зависи­
м ости м еж ду концентрацией введенного в систему и нги битора
и п ери одом индукции.
154
а
Рис. 6.1. Кинетические кривые рос­
та микробных популяций в экспо­
ненциальной фазе в полулогариф­
мических координатах для различ­
ных механизмов роста:
а — конверсия пресубстрата в субстрат;
б — адаптационный процесс; в — расход
ингибитора роста
|
!
:
[
Рис. 6.2. Зависимость перио­
да индукции от концентра­
ции субстрата для различ­
ных механизмов, определяю ­
щих период индукции:
I — кон версия
п ресуб страта
в
су бстр ат;
2 — ад ап тац и о н н ы й
процесс; в — расход уем ы й и нги ­
б и т о р роста
И з рис. 6.1, в видно, что кинетические кривы е ро ста в эк­
споненциальной ф азе зави сят от концентрации субстрата (это
указы вает на м ехан изм с расходуем ы м и н ги б и тором роста).
В двух других случаях (рис. 6.1, а, 6) н аб лю д ается ярко вы ­
раж енная зави си м ость т о т концентрации суб страта, при это м
предельно больш ой период индукции, реали зуем ы й при м алы х
концентрациях су б стр ата, соответствует о б р атн о м у значению
кон станты скорости конверсии пресубстрата в субстрат (рис.
6.1,
а) или ад ап тац и он н ого процесса (рис. 6.1, б). Д л я м еха­
н изм а с конверсией пресубстрата в субстрат период индукции
элим инируется вы соким и концентрациям и субстрата. П ри адаптац и о н н о м процессе, даж е при очень высоких концентрациях
суб стр ата, м ож ет д етекти роваться остаточн ы й предельны й
период индукции.
# Д ва последних м ехан изм а м ож н о д и скри м и н и ровать
на основании изучения зави си м ости п ериода индукции от
155
начальн ой концентрации суб страта или удельной скорости
роста.
И з уравнений (6.18) и (6.38) следует, что при So - » 0 S 0 / K s
станови тся м н о го м еньш е единицы , а
t s —>1 / к 0;
Sq
П ри Sо/ ATS
0
та —* 1/ к 0.
(6-52)
S q- ^►
О
1 логариф м ические функции в уравнениях (6.18)
и (6.38) р азл а га ю т ся в быст ю расходящ ийся ряд отн оси тельно
п ар ам етр а S 0/ K s или
ц -А
Э та зави си м ость п озвол яет опре-
д елить п ар ам етр к 0:
к 0 = 1 / lim т .
(6.53)
s 0- o
О дн ако при больш их концентрациях суб страта зави си м ости
периода индукции от начальн ой концентрации суб страта су­
щ ественно разли чаю тся:
т5(при S o -m o ) = 0;
1п(|+г)
т 0 (при S 0 -m o ) = —--------- —.
(6.54)
(6.55)
В случае ад ап тац и он н ого м ехан и зм а период индукции не
сн и м ается вы соким и кон ц ен трац иям и субстрата.
Рис. 6.2 и ллю стрирует зави си м ость периода индукции о т
концентрации су б страта д л я всех обсуж даем ы х м ехан изм ов
процесса. С оверш енно ан алоги чн о в ы гл я д я т зави си м ости пери­
од а индукции о т удельной скорости ро ста популяции.
Зависим ости периода индукции д л я м ехан изм ов (6.1) и (6.2)
о т эксп ери м ен тальн о найденной удельной скорости роста
и м ею т вид
t s= ^ 2 H l n - ^ - ;
(6.56)
т- ” ; | п ( 1 + £ ) '
<6'57)
С оверш енно аналогично
т5 (при ц ->■()) =
1
Д 0; *а (пРи Ц -» 0 ) = 1 Д о>
(6-58)
в то же врем я больш и е концентрации суб страта и
высокие
удельны е скорости роста ( ц - > ц т ) п ри вод ят к уравнениям (6.54)
и (6.55).
156
Рис. 6.3. Кривые роста Pseudomonas aeroginosa Р1 (г/л) на среде
с хинолином при различных концентрациях ионов железа (М ) в полулога­
рифмических координатах (Н. В. Д зум едзей и др., 1983):
a — Fe2+; б — Fei +; CF e 106 ( / — 13; 2 — 72; 3 — 36; 4 — Щ
П а р ам ет р к 0 м ож ет б ы ть вычислен на основе использования
уравнений (6.56) и (6.57). Д ля м ехан изм а с участием стадии
конверсии пресубстрата
(6.59)
А: 0 = ^ - ^ 1п
П ри
р= (
1
найденном
—— I In (
1
значении
\ат и
вычислении
переменной
— — ) в случае сп раведли вости это го м ехан изм а
V в/ V »ч/
долж н о н аб л ю д аться постоян ство р / т 5 при вариации удельной
скорости р о ста культуры . Э та п остоян н ая р ав н а константе
скорости конверсии пресубстрата в субстрат.
В случае м ехан изм а (6.2) долж но вы п олн яться соотнош ение
е цт*=
1
+р/А -0,
(6.60)
т. е. д о лж н а н аб лю д аться линейная зави си м ость меж ду пере­
м енной е цт* и р, проходящ ей через единицу. Тангенс угла
н аклон а этой зависим ости д ает значение \ / к 0.
П р о и л л ю стр и р у ем сделанны е вы воды , им ею щ иеся в л и тер а­
туре, эксп ери м ен тальн ы м и д ан ны м и (рис. 6.3). О пределим при­
роду н аб лю д аем ы х лаг-п ери одов, представленны х на рисунке
отр езкам и , отсекаем ы м и на оси абсцисс. Т ак как периоды
индукции д л я обоих п рим еров зави сят от концентрации иона
ж елеза и ум еньш аю тся с ростом его концентрации, то м ож но
исклю чить из рассм отрени я м ехан изм с расходуем ы м ингиби­
то р о м р о ста (см. рис. 6.1). В случае F e 2+ лаг-п ери од с увеличе­
нием концентрации су б страта ум еньш ается и стрем и тся к п осто­
янном у значению ( ~ 16 ч) (рис. 6.3, а), что гов о р и т об ад ап ­
тац и о н н о м м еханизм е п рироды т. Д л я F e 3+ ситуация сложнее.
157
М, ед. опт. пл.
С одной сторон ы , увели­
чение концентрации F e 3+
п риводит к ум еньш ению
т, которы й не стрем и тся
к постоян н ом у значению
(рис. 6.3, б), что говорит
в п ользу м ехан и зм а с
конверсией пресубстрата.
В д ан н ом случае, по-види м ом у, осущ ествляется
переход
F e 3 + —►F e 2 +.
С другой сторон ы , даж е
при отн оси тельно б о л ь ­
ш их концентрациях F e 3+
Рис. 6.4. Кривые роста термофильной в одо­
л аг-п ер и од не сним ается.
родообразую щ ей бактерии Thermoanaerobium
Э то говори т о т о м , что
lactoethylicum при различных концентрациях
п рирод а т в д ан н ом слу­
глюкозы
(1 — 2,8 мМ;
2 — 5,5 мМ;
3—
чае см еш анная. Н аряд у
13,9 мМ ; 4 — 27,8 м М ) (а) и зависимость
величин периодов индукции от концентрации
с м ехан и зм ом конверсии
кислорода (б) (В. И. Скляр и др., 1986 г.)
п ресубстрата
( F e 3 + ->
—> F e 2 + ) сущ ественную рол ь играет и м еханизм , связанны й
с ад ап тац и о н н ы м и процессам и в клетке. К инетику этих процес­
сов и ллю стрирует рис. 6.3, а, на к о то р о м отчетливо виден
предел ум еньш ения п ери ода индукции т.
О пределим некоторы е п арам етры . К ак видно из рис. 6.3, а,
та (при S 0 -»oo) равен 16 ч. В соответствии с уравнением
(6.60) им еем
е^»т*= 1 + ц т/ к 0,
поскольку процесс п роводи тся при насы щ ении по субстрату.
С л ед о вател ьн о ,
fe0 = B « / e ^ T- l .
Д анны е, приведенны е на рис. 6.3, д а ю т значение цт = 0,1 ч - 1 ,
о тсю д а к 0 = 0,025 ч - 1 .
К ак о тм ечал о сь выш е, типичны м прим ером п роявления
м ех ан и зм а с расходуем ы м и н ги б и тором роста является влияние
м о л ек у л яр н о го ки сл ород а на разви тие анаэробны х бактерий
(рис. 6.4, а). Видно, что л аг-п ери од практически не зависит
о т концентрации гл ю козы как ли м и ти рую щ его субстрата.
С опоставлен ие этих эксперим ентальны х р езу л ьтато в с теоре­
тическими (см. рис. 6 .2 ) указы вает на то, что в д ан н ом случае
наиболее вероятен м ехан изм , согласно к о то р о м у в течение
лаг-ф азы ки слород как инги битор расходуется в процессе
р азви ти я популяции (п оглощ ается как окислитель или вы тес­
няется из среды о б разую щ и м ся во д о р о д о м ). Д о к азател ьств о м
это м у служ ит линейная зави си м ость п ериода индукции от
158
начальн ой концентрации ки сл ород а в культурной среде
(рис. 6.4, б). И з тангенса угла н акл он а этой п р ям о й в со о т­
ветствии с (6.54) получаем произведение K J k 0, равное
3,6 ( % - ч J). О трезок, отсекаем ы й на оси орд и н ат, по-види м ом у,
соответствует значению ад ап тац и он н ого лаг-п ери од а ( ~ 2 ч).
В д ан ной главе бы ли рассм отрены основны е м ехан изм ы ,
п риводящ ие к появлению на кинетической кривой роста
м и кробн ой популяции хорош о идентиф ицированны х пери­
о дов индукции. Л аг-ф аза в росте культуры м и кр о о р ган и з­
м ов м ож ет б ы ть связан а с процессом накопления в среде
вещ ества, являю щ егося истинны м су б стр ато м д л я м и к р о о р га­
н и зм а, м ож ет оп ределяться ад ап тац и он н ы м и процессам и синте­
за необходим ы х ф ерм ентов и служ и ть отраж ен ием процесса
расхода си льн ого и нги битора роста. П о-ви д и м ом у, эти случаи
не исчерпы ваю т всей совокупности возм ож н ы х процессов,
приводящ их к затя ж к а м на кинетических кривы х ро ста м и к р о ­
о рган и зм о в, о днако оп исы ваю т значительную д о л ю н аб л ю д ае­
м ы х эксперим ентальны х кривых.
П роведенны е кинетические расчеты п о казы ваю т, что эти
основны е случаи м огут б ы ть различены , определены и интер­
п рети рованы на основе кинетического эксперим ента. О сновой
интерпретации, как это часто б ы вает в кинетике, являю тся
зави си м ости кинетического п ар ам етр а, в д ан н о м случае периода
индукции, от начальной, вводи м ой в процесс концентрации
суб страта. И н ф орм аци я, полученная так и м путем , м ож ет бы ть
и сп ользован а д л я интенсиф икации процесса и эли м и н ирован и я
п ро долж и тельн ой лаг-ф азы .
?
ГЛАВА
7
К У Л ЬТ И В И РО В А Н И Е М И К РО О РГ А Н И ЗМ О В
В РЕЖ И М Е ХЕМ ОСТАТА
К у л ьти вирован и е м и кр о о р ган и зм о в в откры ты х систем ах (п ро­
точны х реакторах) — один из наиболее перспективны х и р азв и ­
ты х способов их вы ращ и вани я. П реим ущ ества этого способа
культиви рован ия состоят в стан д ар тн о сти условий проведения
процесса, вы сокой п роизвод ительн ости , возм ож н остях тон кого
управления кинетикой роста популяции. Кинетические зак о н о ­
м ерности ро ста и эволю ц ии м и кробн ы х популяций в откры ты х
систем ах д о стато ч н о просты и наиболее изучены *.
Н иж е ан али зи рую тся основны е уравнения, описы ваю щ ие
р о ст популяции в реж им е хем остата, при этом главное
вним ание о бращ ено на дискри м и наци ю м ехан изм ов и условий
р о ста, на сопоставление теории и эксперим ента, на определение
эксперим ентальны х данны х п арам етров роста культур.
7.1. Н Е О С Л О Ж Н Е Н Н Ы Й
РОСТ
Р ассм о тр и м кинетические законом ерн ости роста м и к р о о р га­
н изм ов в о ткр ы то й систем е при непреры вной п одаче субстрата.
П редстави м , что в сосуд о б ъ ем о м V подается раствор
л и м и ти р у ю щ его су б страта с концентрацией S 0 с объем ной
ско р о стью и. П о д действием м и к р о о р ган и зм а суб страт конвер­
тируется в продукт (продукты ) Р и осущ ествляется прирост
биом ассы . П оскольку систем а ограничена по объем у, и збы точ ­
ный р аство р неп рореаги ровавш его суб страта, продуктов реак­
ции и часть клеток м и кр о о р ган и зм о в вы вод ятся из реакц ион н о­
го о б ъем а с то й же объем н ой скоростью и. П редп олагается,
что реж им п ерем еш ивания в реакторе орган и зован таким
о б р азо м , что обеспечивает постоянны е по всему объем у
концентрации су б страта S, п родукта Р и клеток М. Эти
условия так н азы ваем о го б езград и ен тного ф ерм ентера известны
еще и как реж им хемостата.
Ч ерез некоторое врем я в систем е устан авл и ваю тся стац и о ­
н арны е концентрации исходного суб страта, продуктов реакции,
числа клеток (биом ассы ) м и кр о о р ган и зм а. Р ассм отри м , каково
* Читатель м ож ет ознакомиться с основами кинетики роста м икроор­
ганизмов
в проточных
реакторах
в монографиях
Дж . П ёрта
(1978)
и Н. С. Печуркина (1975).
160
значение стаци он арн ы х концентраций ком пон ен тов процесса,
как эти стаци он арн ы е концентрации зави сят от п арам етров
ро ста культуры , от скорости ввода в систему субстрата.
Д и н ам и к а изм енения в системе концентрации клеток
М определяется ско р остью роста культуры р и скоростью
вы вода ее из ф ерм ентера:
— = р М —- М .
dt
V
(7.1)
у
’
П а р ам ет р и / V, и м ею щ ий разм ерн ость о б р атн о го времени,
назы вается скоростью разб авлен и я D.
Э ксп ери м ен тальн о п ар ам етр D м ож ет б ы ть найден при
изучении кинетики вы м ы ван и я какого-л и бо вещ ества А, присут­
ствую щ его в ф ерм ентере в начальны й м ом ен т времени / = 0 .
С кор о сть вы вода вещ ества А описы вается уравнением
~ — —D A ,
(7.2)
которое п риводит к экспоненциальной зависим ости вида
А( / ) = А 0 е - в',
(7.3)
где А 0 — концентрация А в н ачальны й м ом ен т времени.
Л и неари зац ия эксперим ентальны х данны х
в коорди натах
уравнения
ln ^ = -D /,
А0
(7.4)
п озво л яет утверж дать, что используем ая систем а достаточ н о
хорош о описы вается уравнениям и и деальн ого, б езградиентного,
реакто р а с перем еш иванием и п озволяет определи ть п ар ам етр
D.
И зм енение концентрации исходного суб страта будет описы ­
ваться диф ф еренциальны м уравнением
^ = DS0 - O S - i p ( S ) M .
(7.5)
П ервое слагаем о е в этом уравнении характери зует скорость
ввода суб страта, второе
вы вод из систем ы н еп рореаги ровав­
ш его
суб страта, т р е т ь е - расход суб страта в результате его
потребления для роста культуры .
С оответствен н о концентрация продукта ф ерм ентационной
конверсии Р такж е зависит от скорости роста м и кроорган и зм а
и скорости протока:
— = — p(S)M -Z)P.
dt
6
З а к . 544
Y /
W
(7.6)
161
П ервое сл агаем о е характери зует скорость ф ерм ен тац ион н ого
накопления п родукта, в торое — вы вод п родукта из ф ерм ентера.
Если принять, что удельн ая ск орость р о ста м и кр о о р ган и зм а
как функция концентрации суб страта дается уравнением М оно
(1.3), то все кинетические зак он ом ерн ости ро ста культуры
в реж им е х ем о сгата описы вает си стем а уравнений
d U _ n mSM
dt
a:s + s
DM;
- = Z)(S 0 - S ) - 1 ^ ^ ;
dt
' 0
1
dt
'
Y ,K S+ S ’
BmSM
(7.7)
(7.8)
v
'
(7 9
)
Yp K s + S
Если систем а ф ункционирует при постоян н ой скорости
разб авлен и я D д о статоч н о б ольш ое врем я, то концентрации
биом ассы , субстрата и продукта стан овятся п остоян н ы м и, не
зави сящ им и от времени. В этих условиях d M / d t —0, d S / d t = 0,
d P / d t = 0. У словия равенства нулю во врем ени всех ком п он ен ­
то в процесса со о тветствую т условиям стаци он арн ости .
• И з уравнений (7.7) — (7.9) в условиях стаци он арн ости
следует ряд важ ны х вы водов.
В стационарном реж име удельная скорость рост а микроорга­
низма соответствует скорости разбавления. П ри с/М jd t = О
из уравнения (7.9) следует
n(S) = Z>.
Т аки м о б р азо м , ск оростью разб авлен и я в рам ках определен­
ных ограничений (см. ниже) м ож н о за д а в а т ь удельную скорость
роста культуры .
Стационарная концентрация субстрата S CT в ферментере
определяется скоростью разбавления и кинетическими парамет­
рами рост а микроорганизма и не зависит от начальной
концентрации субстрата. И з уравнения (7.7) следует
SCT= ^
.
(7.10)
С тац и о н ар н ая кон ц ен трац ия су б стр ата в ф ерм ентере тем
меньш е, чем б ольш е м акси м ал ьн ая удельн ая скорость роста
культуры и чем м еньш е значение кон станты срод ства м и кр о ­
о р ган и зм а к субстрату K s. Важно подчеркнуть, что S CT не
зави си т о т концентрации ввод и м ого суб страта. Э го п озволяет
го в о р и ть об ау то стаб и л и зац и и условия р о ста культуры по
субстрату в реж им е х ем о стата (Н . С. П ечуркин, 1978).
Зави си м ость стац и он арн ой концентрации суб страта о т ско­
рости р азб авл ен и я и м еет слож ны й характер. П ри низких
скоростях р азб авл ен и я в условиях
стац и он арн ая кон162
Рис. 7.1. Зависимость относительной
стационарной концентрации субстрата
SCJ/K S от скорости разбавления при
различных значениях ц„„ ч 1 (цифры
на кривых):
п ункти рны е лин и и — Dc = ц,
Рис. 7.2. Зависимость относительной
стационарной концентрации биомассы
от скорости разбавления при различных значениях цт , ч ' 1 (цифры на
кривых):
S0/ K s п р и н я то р а в н ы м
5,0; Г , = 0,5
центрация су б стр ата линейно зависит от скорости разбавлен и я
(рис. 7.1):
(7.11)
П ри скоростях разбавлен и я, п риближ аю щ ихся к p m[D -> цт ),
стац и о н ар н ая концентрация суб страта начинает неограниченно
расти.
Стационарная концентрация биомассы линейно зависит от
концентрации вводимого в ферментер раст вора субстрата. И з
уравнения (7.7) следует (рис. 7.2)
(7.12)
Видно, что при D —>0 M CT« S 0 y s (рис. 7.3).
И з рисунка следует, что стац и он арн ая концентрация м етан о ­
ла при постоянной D не зависит от концентрации вводи м ого
раство р а суб страта, а стац и он арн ая кон ц ен трац ия биом ассы
в условиях неослож ненного роста линейно в озрастает с увеличе­
нием начальн ой концентрации м етан ола.
Рост культ уры в реж име хемост ат а характеризуется
критической скоростью разбавления D c, выше которой не
наблюдается роста популяции. П ри скоростях разбавлен и я,
сои зм ерим ы х с м акси м ал ьн ой скоростью роста м и кр о о р ган и з­
м а, культура вы м ы вается из ф ерм ентера. Значение критической
скорости разб авлен и я м ож ет б ы ть найдено из уравнения (7.12)
при условии, что М ст = 0 (при это м S = S0):
6*
163
D =
Mms 0
* s+ s 0
(7.13)
Графически D c м ож ет бы ть
найдено из точки пересечения
кривы х
с
осью
абсцисс
(рис. 7.2).
Стационарная
концентра­
ция продукта линейно связана
с концентрацией вводимого суб­
страта :
М„
Р„ = Рис. 7.3. Эффект аутостабилизации
концентрации метанола, лимитирую ­
щ его рост популяции псевдом онад
в проточной культуре при D = 0,35 ч ~ ‘
(R. J. M ateles, Е. Battat, 1975):
■ Р ст =
DK,
»m~D
(7.14)
Зави си м ость стац и он арн ой ко ­
нцентрации
продукта о т S 0
_
и D ан алоги чн а зависим ости
о т этих перем енны х стаци он арн ой концентрации клеток.
1 — к о н ц ен тр ац и я би о м ассы ; 2 — к о н ц е н тр а ­
ция м е т ан о л а в среде
7.1.1. Определение параметров роста культуры
из данных по стационарным состояниям
компонентов процесса
О пределение таких п арам етров, как Ys, Y p, \im, K s, н еобхо­
д и м о при описании роста м и кр о о р ган и зм о в в реж им е хем о­
стата. Н аиболее просто м огут б ы ть найдены экономические
коэф ф ициенты Г 5 и Yp из уравнений (1.7), (3.17). Д ля этого
н еобходи м о зн ать стаци он арн ы е концентрации суб страта, б и о­
м ассы и продукта. В рам ках рассм атр и в аем о го приближ ения
п редполагается, что Г 5 и Yр постоянны в течение разви тия
процесса и не зави сят о т скорости п ротока. Э то допущ ение
в больш и н стве случаев оп равдан о, хотя возм ож н ы и сущ ест­
венные отклонения. П роверкой этого п редполож ения является
незави си м ость найденны х п арам етров Ys и Yp от скорости
разбавлен и я.
К р о м е т о го , значение F s такж е м ож ет б ы ть найдено как
тангенс угла наклонена зависим ости М ст от S 0. Н апри м ер,
из данны х, представленны х на рис. 7.3, следует, что Ys для
р о ста изученной культуры в и сследованном диап азон е концен­
траций. равен 1 . 1 2 о п .е д /(г /л ).
Изучение зависимости стационарной концентрации субстрата
от скорости разбавления. В оспользуем ся одной из ан ам орф оз
уравнения (7.10):
164
(7.15)
S c,
K ,D
Ks
или
(7.16)
С огласн о уравнению (7.15), зави си м ость 1 /S CT от l / D
долж на п ред ставл ять п рям ую с тан ген сом угла н акл он а \\.т/ K s\
отрезок, отсекаем ы й на оси орд ин ат, равен — 1/ K s (рис. 7.4).
Значение цт м ож ет б ы ть найдено из длины отрезка, отсекаем ого
п рям ой на оси абсцисс.
И спользовани е уравнения (7.16) такж е п озво л яет графически
найти значения р т и K s. Тангенс угла н аклон а д ает значение
K s', о трезок, отсекаем ы й на оси D ,— ц т .
Д ля определения р т и K s из зави си м ости SCT о т D эксперим е­
н тал ьн о н еобходим о найти S CT (S , и S 2) по крайней мере при
двух значениях скорости разб авлен и я (D t и D 2). В этом случае
п ар ам етр ы р ш и K s м о гу т б ы ть вычислены по ф орм уле
(7.17)
S,
S
Изучение зависимости стационарной концентрации биомассы
от скорости разбавления и вводимой концентрации субстрата.
К ак следует из уравнения (7.12), стац и он арн ая концентрация
биом ассы линейно зави си т от н ачальн ой концентрации суб­
стр а та (рис. 7.6). И з данны х рисунка м ож н о определить Ys
и отрезок, отсекаем ы й на оси абсцисс:
(7.18)
а= —
В т о м случае, если Ys не зависит от скорости п ротока
в ф ерм ентере, тангенсы углов н аклон а прям ы х М ст о т S 0
долж ны б ы ть одинаковы . Если М ст известно, то п ар ам етр ы
р о ста культуры р т и K s м ож н о установи ть используя линейную
ан ам о р ф озу уравнения (7.12):
(7.19)
S0- M J Y .
DKS
К,
Т ак же как и в случае уравнения (7.15), тангенс угл а н аклон а
зависим ости 1 /S 0 —M 5 / T s о т \ \ D д ает значение pim/ATS, отрезок,
отсекаем ы й на оси о р д и н ат,— \ / K s. У равнение (7.20) п олн остью
соответствует уравнению (7.15), поскольку S CT= S 0 —M s/ Ys.
С оверш енно ан алоги чн о п арам етры роста культуры м огут
б ы ть найдены и при и спользовании другой ан ам орф озы
Уравнения (7.12)
165
Рис. 7.5. Данные рис. 7.4 в координа­
тах уравнения (7.16)
Рис. 7.6. Теоретические зависимости
стационарной концентрации биомассы
от начальной концентрации субстрата
при различных скоростях разбавления:
Рис. 7.4. Графический м етод определе­
ния кинетических параметров на осно­
ве уравнения (7.15) (К. И. Гришин
и др., 1983). [Хемостатное культиви­
рование
Thiobacillus
ferrooxidans,
pH 2,3, 30" С (F e 2+)0 = 9 г/д .]
п ар а м е т р ы :
рт = 1 ч -1 , К,= 1 мМ ;
К, =
= 1,0 м г д м л м М ); £>, ч ~ ‘ — ц иф ры на п р я ­
мы х
—------ = ^ ~ —
К*
(7.20)
из зави си м ости D / ( S 0 —М ст/ Ks) о т D.
Если значения М ст (M j и М 2) определены при двух
разли чаю щ и хся скоростях разб авлен и я
и D 2, то п арам етры
цт и K s м о гу т б ы ть вычислены по уравнениям
М2 -М !
r , S o - M
,
T sS
0—
(7.21)
М 2 ’
К = - --------------- ^ --------- .
Y‘
Ys S o - M ,
(7.22)
TsS 0 —М 2
Кинетические п ар ам етр ы ро ста популяции м о гу т б ы ть
установлены такж е и при исследовании стац и он арн ого уровня
пр о ду кта как функции скорости разбавлен и я. И з уравнения
166
(7.14) видно, что стац и он арн ая кон ц ен трац ия п родукта связан а
со стац и он арн ой концентрацией биом ассы . П оэтом у д л я опре­
деления п ар ам етр о в ро ста из данны х по стац и он арн ы м уровням
п родукта п олн остью п рим еним ы м етоды , описанны е при
исследовании систем ы по накоплению биом ассы .
7.2. И Н Г И Б И Р О В А Н И Е С У БСТРАТО М
Р ассм о тр и м законом ерн ости разви тия культуры в хем остате,
если рост м и кр о о р ган и зм а ингибируется и зб ы тко м субстрата.
О сновные диф ф еренциальны е уравнения, описы ваю щ ие кинетику
процесса, и м ею т вид базовы х уравнений типа (7.1), (7.5), (7.6),
тол ьк о удельную скорость роста культуры как функцию
концентрации субстрата надо представить в виде уравнения (4.73).
В стац и о н ар н о м состоянии в условиях d M / d t —0 d S / d t = 0,
d P / d t = 0 кинетику процесса описы вает систем а уравнений
As+ S CT+ S C
2T/A,
Sct) —
(7.23)
=D;
И,А
Mj;
K , + S „ + S 2„ I K ,
Ys
Mc,
K ^+SilK ,
/) P
Л -
(7.24)
(7.25)
Т ак же как и в случае неослож ненного ингибирования
процесса, видно, что скоростью разб авлен и я м ож но зад ав ать
системе удельную скорость роста популяции:
p(S ) = D.
(7.26)
П ри нципиальной особенностью системы с ингибированием
и збы тко м су б стр ата в п роточ ­
н ом реж им е является сущ ество­
вание двух устойчивых, стац и о­
нарны х состояний. Э то следует
из ан ал и за уравнения (7.23).
Р ассм о тр и м его графическое
реш ение (рис. 7.7). П рям ы е, п а­
раллельн ы е оси S, п ред ставля­
ю т собой функции д = const = D.
Пересечения этих прям ы х с гр а­
ф иком p(S) д аю т значения SCT,
представляю щ ие собой корни
уравнения (7.23). И з рисунка
видно, что систем а м ож ет фун­
кц и они ровать в трех принципи­
ал ьн о разли чн ы х реж им ах.
167
Если D > D C, где Dc — н екоторая критическая скорость
р азб авлен и я, то в систем е вообщ е н евозм ож н о об разован и е
стац и о н ар н о го состояния, кривая p(S) и п рям ая \а —[) не
и м ею т общ ей точки пересечения. Э ту ситуацию иллю стрирует
п рям ая
1,
ко то р ая
соответствует
случаю
D = - ~ S° . Т аким
Ks+S0
о б р азо м , в отличие от процесса неослож ненного и н ги б и рова­
нием су б стр ато м критическая скорость разбавлен и я, при ко­
торой возм ож н о стаци он арн ое состояние, для систем ы с ин­
ги бированием су б стратом ниже ( ^ S o / ^ + So).
П ри D = DC систем а м ож ет и м еть одно стаци он арн ое
состояние. Э то и ллю стрируется пересечением p(S) с прям ой
2 в точке м аксим ум а.
Н аконец, если D < Dc, в ф ерм ентере м огут б ы ть р еали зо­
ваны д ва стаци он арн ы х состояния. П р я м ая 3 с кривой p(S)
имеет две точки пересечения, д ва стационарны х состояния,
характеризуем ы х разли чн ы м и значениям и SCT ,, М стл и Sc t 2 ,
7.2.1. Стационарные уровни концентрации субстрата
Р ассм о тр и м аналитическое реш ение уравнения (7.23) с целью
определения зависим остей стаци он арн ы х уровней субстрата,
биом ассы и продукта о т п ар ам етр о в роста культуры и нахож ­
дения Д ..
Э то уравнение м ож н о п редстави ть в виде квадрати чного
уравнения
(7.27)
£ s c2T+ ( Z ) - p m)SCT+ DKs = 0,
реш ение к о то р о го им еет вид
S CT, 1 , 2 —
Ч ^ш -D )
2D^m
—1
2D
2
— К: К .
(7.28)
П о ф и зи ческо м у см ы сл у SCT п р е д с т а в л я е т со б о й п о л о ­
ж и тел ьн у ю д ей ств и те л ьн у ю величину. И з ур ав н ен и я (7.28)
сл ед ует, что д в а п о л о ж и те л ьн ы х к о р н я уравн ен и е (7.20)
м о ж ет и м еть л и ш ь при p m > D. Э т о п ервое огран и чен и е
по ск о р о сти р азб ав л ен и я . Д л я т о го ч то б ы корни уравн ен и я
(7.27) б ы л и д ей ств и те л ь н ы , н е о б х о д и м о вы п ол н ен и е н е р а ­
вен ства
2D
168
Ж , К.
(7.29)
Реш ение (7.29) приводит к вы раж ению
pm ^ Z ) ( l + 2 / В Д )
(7.30)
или
(7.31)
1+2 / а д
Значение
D = D = ------------------------------------------- (7.32)
1+2 У В Д
мож но сч и тать критической скоростью разбавлен и я, при к о то ­
рой и ниже которой возм ож н о наблю дение стаци он арн ого
состояния в ферм ентере.
К это м у же вы воду приводит расчет коорд и н ат м акси м ум а
зави си м ости удельной скорости роста культур м и кр о о р ган и з­
м ов от концентрации субстрата. Д иф ф еренцирование функции
(4.73) и приравнение нулю d\ i (S)j dS п риводит к следую щ ем у
значению концентрации суб страта Sm, при которой функция
|i(S) им еет м аксим ум :
Sm= ^ K j ,
(7.34)
П о д стан о в ка (7.33) в (4.73) д ает значение м акси м ум а функции ц:
и
= ------^ ------.
Цтах 1 + 2у в д
(7.34)
К ак видно из рис. 7.7, это соответствует такой критической
скорости р азб авлен и я, при которой в системе устанавливается
единственное стаци он арн ое состояние по субстрату, биом ассе
и продукту ф ерм ен тати вн ого превращ ения.
# Т аки м о б р азо м , д л я процесса с ингибированием и зб ы т­
ком су б стр ата критическая скорость разбавлен и я сущ ественно
ниже м акси м альн ой скорости роста популяции и зависит от
отнош ения KJ Kj . Если K t очень велика, то D c приближ ается
к цт . Э т о ф о р м ал ьн о соответствует случаю с отсутствием
ингибирования и збы тком суб страта роста популяции м и кр о ­
орган и зм о в.
У равнение (7.28) м ож н о п редстави ть в виде безразм ерн ой
функции SCT j 2
содерж ащ ей лиш ь д ва безразм ерн ы х п ар а­
м етра: [imID й K J K i , т. е.
1 ^ _ ь г§ = 1 ±
/ г
о
р
| .
(7.35,
П редставляет интерес ан ал и з зави си м ости стационарны х
уровней концентрации суб страта от скорости разб авлен и я (или
от отнош ения цт /'Ь ) и от отнош ения K J K , .
169
П ри D —D c в системе имеет
м есто одно стаци он арн ое со сто я­
ние, в ко то р о м SCT>1 = S „ , 2 = s / K J K ,
(рис. 7.7). В о б ласти D < D C стац и ­
он арн ы е состоян ия концентрации
суб страта «расщ епляю тся» на два
уровня. У равнение (7.35) м ож но
п редстави ть в виде
S c , ,i .2 _ H m/ . D - l
. H m /D -1 w
К,
4а д
Рис. 7.8. Стационарные состоя­
ния субстрата в хемостате с ин­
гибированием
процесса
из­
бытком субстрата в зависимос­
ти от скорости разбавления:
V
0*»/л-О 2’
(7.36)
П ри 4 (tfs/ t f ()/(p m/ Z ) - l ) 2 «с 1 и р р а­
циональное вы раж ение в уравнении
р асч ет по у р авн ен и ю (7.29); д
Л.=Л
= 1 мга
(7.36) м ож ет б ы ть разлож ено в бы= 1 ч,
К, = К . =
1 мМ
, „ ч (/
' \
СТР° сходящ ийся ряд отн оси тельно
4 ( а д ) / ( ц т / > - 1 ) . У словие Ц К ' / К , ) / (цт/ Р - 1 ) 2 <g 1 стр о го соо гве I с гвует условию
s> Z)( 1 + 2
Ks К j) или в со о тв етст­
вии с (7.32) условию D < s z D c. С л ед овател ьн о, при ско­
рости разб авлен и я сущ ественно меньш е критической и ррац и ­
о н ал ьн ая функция (7.36) м ож ет б ы ть разлож ена в степенной
ряд. Если в о сп о л ьзоваться первы м членом разлож ени я, то
будем им еть
S Сг л ^ О ( К , 1 К , ) '
к, ~
’
Sct. 2 гу. Пт
а:, = ~ 5 -
(7.37)
(7.38)
Т аки м о б р азо м , при очень м алы х скоростях разбавлен и я
стаци он арн ы е концентрации суб страта д аю тся простейш им и
вы раж ениям и
DK,.
^;
Пт ’
(7.39)
“ СТ.2 - - ДD - .
(7.40)
SCT, 1 =
7 7
Видно, что при данны х значениях рт и D первый стаци он арн ы й
уровень определяется кон стантой срод ства субстрата Ks, вто­
р о й — кон стантой и нгибирования и зб ы тко м суб страта к]. П ри
уменьш ении скорости разб авлен и я увеличивается концентраци­
онны й «зазор» м еж ду стац и он арн ы м и уровням и суб страта
(рис. 7.8), при Z) —> 0 SCT , —> 0, S^ с т , 2
00.
170
7.2.2. Стационарные уровни концентрации биомассы
и продукта ферментации
Н а основе вы раж ения (7.28) для стаци он арн ы х уровней
концентраций су б страта с и сп ользован и ем уравнения (7.12)
м огут б ы ть найдены стаци он арн ы е уровни концентрации
биом ассы :
М с т , 1, 2 — y s ( s 0
(7.41)
SCT 1>2)
или
/Г K ^ - D )
M CT>1 , 2 = r s
j
2D
2
- к . К,
. (7.42)
Р ассм о тр и м зави си м ости стац и он арн ой концентрации б и о­
м ассы о т п ар ам етр о в процесса с и сп ользован и ем известны х
приближ ений. П ри Dc > D стац и он арн ого состояния по концент­
рации биом ассы не сущ ествует. Если D —Dc, то им еет м есто
одно стаци он арн ое состояние, в ко то р о м
KM-n-Dc)
2D,
М„
Y..
(7.43)
В этом реж им е стац и он арн ая концентрация биом ассы линейно
зависит о т н ачальной концентрации ввод и м ого субстрата. Если
в уравнение (7.43) п одстави ть значение Dc в соответствии
с уравнением (7.32), то будем им еть
m ct = [ s 0 - У в д ] г 5.
(7.44)
С тац и о н ар н ая кон ц ен трац ия биом ассы в точке D = D C ум ень­
ш ается с р о сто м кон станты срод ства суб стр ата и кон станты
ингибирования процесса и збы тком субстрата. П ри это м стац и ­
он арн ая концентрация биом ассы не зави си т от м акси м альн ой
скорости р о ста м и кроорган и зм а.
П ри уменьш ении скорости разб авл ен и я в реж им е D < D C
кон ц ен трац ия биом ассы м ож ет и м еть одно из двух стац и о н ар ­
ных значений, ко то р ы е д аю тся и ррац и он ал ьн ы м и функциями
(7.42). О днако в реж им е D < z D c при учете соотнош ений
(7.39) — (7.40) им еем
М стЛ =
S0С
М
ст,2 =
DK,
I у
- д - I г.
(7.45)
(7.46)
П ервы й стаци он арн ы й уровень тем выш е, чем выш е м акси ­
м ал ь н ая удельная скорость роста культуры и чем ниже
скорость
разбавлен и я.
Д ля
в то р о го
уровня
характерно
171
Рис. 7.9. Стационарные состоя­
ния в хемостате для культуры,
ингибируемой избы тком суб­
страта:
Рис. 7.10. Стационарные состояния
в хемостате в случае неосложнен­
ного процесса (SCT) и в случае
ингибирования избытком субстра­
та SCIд и SCI2 в обратных коорди­
натах
M i. 2 = ^ ( S o - S „ , ,.•>); Y = 1 уел. ед.,
S0 = 10 м М ; $ , = 0 ,3 3 4 ч 1
обратное: чем вы ш е скорость разб авл ен и я и чем ниже
м акси м ал ьн ая скорость роста м и кр о о р ган и зм а, тем выш е
значение стац и он арн ой концентрации биом ассы . П ри ум ень­
шении скорости р азб авлен и я D —> 0, М с т 1 -+ y sS0, М ст 2 -> - оо
(при
—— = S 0
стац и он арн ая
кон ц ен трац ия
биом ассы
равн а
нулю ) (рис. 7.9).
К онц ен трац и я п родукта ф ерм ен тац ион н ого превращ ения
в стац и о н ар н о м реж им е линейно связан а с концентрацией
б иом ассы (7.14):
ст, 1 , 2 ~
S0 ^ (йт — •°) + 1
I ' k^ -
1L
d )'
2
- К , К:
• (7.47)
20
В реж им е D = D C имеется одно стаци он арн ое состояние кон­
центрации продукта:
Р с т ^ о - ч /а д .
(7.48)
П ри D
Dc н аб лю д ается д ва стаци он арн ы х состоян ия с кон­
центрациям и:
• Т аки м о б р азо м , наиболее важ ной особенностью развития
процесса в хемостате для микроорганизм а с ингибированием роста
и зб ы тко м су б стр ата является возм ож н ость о б р азо в ы в ать два
различны х стационарны х состояния по концентрациям субстрата,
биом ассы и ф ерм ентативны х продуктов. М нож ественность
стационарны х состояний не ордин арн ое явление в химической
и биологической кинетике. С истемы с ингибированием су б стр а то м .
в откры том режиме — один из классических прим еров такого рода
систем, в ко торы х м о гут и м еть м есто несколько стационарны х
состояний. Д ля ферм ентативны х реакций кинетические законом ер­
ности процессов в откры ты х системах с ингибированием избы тком
суб стр ата д о стато ч н о п одроб н о рассм отрены в л и тературе (см.,
наприм ер, Березин И. В., В арф олом еев С. Д ., 1979). Д л я такого
р о д а систем н аб лю д ается ряд весьм а интересны х особенностей
в кинетическом поведении, наприм ер гистерезисны е зависим ости
скорости реакции от скорости п ротока в реакторе.
С истем а м ож ет о казаться в о д н ом из двух устойчивы х
стаци он арн ы х состояний. О твет на вопрос, в каком из двух таких
состояний окаж ется систем а, д остаточ н о слож ен в теоретическом
плане и зависит о т п реды стории систем ы . Т ол ько эксперим ен­
тал ь н о м ож н о о твети ть на этот вопрос. К ак следует из уравнений
(7.39), (7.40); (7.45), (7.46) и рис. 7.8, 7.9, увеличение скорости
разб авл ен и я д л я систем ы , находящ ейся в состоянии 1, п риводит
к ум еньш ению концентрации суб страта и соответственно к росту
концентрации биом ассы или продукта реакции. В то же врем я
увеличение скорости п ротока д л я систем ы , находящ ейся в со сто я­
нии 2 , д о лж н о п риводить к увеличению стац и он арн ого уровня
суб страта и соответственно к уменьш ению стац и он арн ого уровня
биом ассы или продукта. Э то м ож ет служ ить эксп ери м ен тальн ы м
кри тери ем в вы боре «ветви», на кото р о й н аходится система.
К ак иденти ф и ц ировать эффект инги бирован и я суб стратом
в каж д о м кон кретном случае, отли чи ть д анны й м ехан изм от
м ехан изм а неослож ненного роста? К ачественны м указанием на
то, что в системе им еет м есто ингибирование суб стратом , м ож ет
служ ить гистерезисное поведение системы: при переходе от
одной скорости разб авлен и я к другой и о б р атн о систем а м ож ет
не вернуться к исходны м значениям по концентрации ком понен; тов процесса. О тклонения м о гу т д о сти гать больш их значений.
К оличественны е оценки зави си м ости стационарны х кон­
центраций ком понентов от скорости разб авлен и я д л я случая
ингибирования и зб ы тко м суб страта сущ ественно отли чаю тся
от случая неослож ненного роста (рис. 7.10). К ак следует из
рисунка, д л я неослож ненного роста зави си м ость 1 /S CT от 1/D
п редставляет собой прям ую , отсекаю щ ую на осях значения
1 / ц т и — 1/ Ks. Д ан ны е д л я роста культуры с ингибированием
в процессе реакции не долж н ы л и н еари зоваться в обратн ы х
коорд и натах. П ри это м если систем а функционирует, находясь
173
на первой «ветви» стационарны х концентраций (значения Sct2),
то увеличение скорости разб авл ен и я д олж н о п ри вод и ть к ум ень­
ш ению стаци он арн ой концентрации субстрата. Э то карди н альн о
отли чает д ва обсуж даем ы х м ехан изм а роста.
О пределение кинетических п ар ам етр о в роста культуры из
данны х по непреры вном у культиви рован ию м и кроорган и зм а
в условиях и нгибирования су б стратом в об щ ем виде в силу
м нож ественности стаци он арн ы х состояний и иррац ион альн ости
основны х уравнений п редставляет определенны е слож ности.
В качестве м етодического прием а при определении п арам етров
м ож но р еко м ен д о вать изучение стаци он арн ы х уровней системы
в условиях м алы х скоростей разбавления в реж име D <SiDc. В этих
условиях при использовании уравнений (7.39), (7.40) и (7.45), (7.46)
м огут бы ть найдены числовы е значения п арам етров As/ p m и \хтК {.
Д ля полн ого ан ал и за и определения всех п арам етров
процесса ум естн ы м предствляется изучение кинетических кри­
вых ро ста м и кр о о р ган и зм о в при различны х начальны х концент­
рациях су б стр ата в реж им е периодического культиви рован ия
(см. гл. 2, 4).
7.3. И Н Г И Б И Р О В А Н И Е П Р О Д У К Т О М
Р ассм отри м законом ерн ости культиви рован ия м и к р о о р га­
низм ов в о ткр ы той п роточн ой системе с учетом эффектов
и нгибирования образую щ и хся п родуктов д ля двух основны х
м ехан изм ов ингибирования: конкурентного и неконкурентного.
С истем а уравнений, оп исы ваю щ ая кинетику процесса в ре­
ж им е хем о стата в то м случае, если м и кр о о р ган и зм «чувствует»
присутствие п родукта, им еет вид
^
= рМ -/)М ;
f = D ( S 0 - S ) - » M / Y s;
(7.51)
(7.52)
i i = T ; - D?'
(7 -53)
У дельная скорость р о ста как функция концентрации суб страта
и продукта реакции будет и м еть вид
р = —f ^ р \
(конкурентное ингибирование);
( 7 .5 4 )
*s( , + ^ ) + s
Д=
7
1
- —у
+ — И A.+S
(неконкурентное ингибирование). (7.56)
7.3.1. Конкурентное ингибирование продуктом
В стац и о н ар н о м состоянии в условиях d M / d t = 0, d S / d t = 0,
d P / d t = 0 систем а уравнений (7.51)— (7.53) с учетом (7.54)
м о ж ет бы ть п редставлен а в виде
(7.56)
fl(s 0- s CT)=
цАтМ
(7.57)
СТ•
(7.58)
К ак и во всех рассм отренн ы х ранее случаях, стаци он арн ая
удельная ск орость роста м и кр о о р ган и зм а задается системе
ско р о стью разб авлен и я p (S , P) = D. И з стехиом етрических со о т­
нош ений следует
(7.59)
П о д стан о вка в (7.56) значения Р ст, вы раж енного по урав­
нению (7.59), п риводит к вы раж ению
-D
(7.60)
Э то уравнение м о ж ет б ы ть реш ено отн оси тельн о SCT:
S,СТ
(7.61)
У равнение (7.61) описы вает зави си м ость стаци он арн ой кон ­
центрации су б стр ата о т концентрации ввод и м ого субстра­
та, скорости разбавлен и я, кинетических п ар ам етр о в роста
культуры дт и Ks, константы равновесия ингибирования
п родуктом .
▲ С ледует подчеркнуть важ ную особенность ф ерм ен тац ион ­
н ого процесса с инги бирован и ем п род ук том — стаци он арн ы й
уровень концентрации суб страта является функцией начальной
его концентрации. Э то отли чает процесс с ингибированием
п р о ду к то м от процесса с неослож ненны м р о сто м [см. (7.10)].
175
'■//,У
П о физическому см ы слу стац и он арн ая концентрация субст­
р а т а — величина, л еж ащ ая в д иапазоне о т нуля д о S0: S0 ^
^ S CT^ 0 . С опоставлен ие этого неравенства с уравнением (7.62)
п озволяет вы яви ть некоторы е огран и чи ваю щ и е условия, в р а м ­
ках ко торы х в о зм ож н о образован и е стац и он арн ого состояния
д л я систем ы с конкурентны м инги бирован и ем продуктом .
П оскольку стац и он арн ая концентрация суб страта в ф ерм ен­
тере не м о ж ет п ревы ш ать значения S0 , м ож н о зап и сать
К ( 1+■
S o > Hm4 , , Ду' р
—
1+ D
K,YP
(7-62)
И з этого неравенства следует
(7.63)
л .Л. +
а 0
Т аки м о б р азо м , сущ ествует критическая скорость разбавлен и я,
вы ш е ко то р о й в системе н евозм ож н о стаци он арн ое состояние:
£c = | ^
= H So)-
(7-64)
С л ед о вател ьн о , критическая скорость разб авл ен и я д л я системы
с кон курентн ы м инги бирован и ем п род ук том та же, что и для
н еослож ненного процесса.
▲ Н еобход и м о о тм ети ть одну особенность уравнения (7.61).
П ри D = DC стац и он арн ая концентрация суб страта равн а S0 ;
SCT(D = Z)B) = S 0 вне зави си м ости от остальн ы х п арам етров,
входящ их в это уравнение.
П ри н ци п иальн о важ ную рол ь в уравнении (7.62) играет
б езразм ерн ы й п ар ам етр YsK s/ ( Y pKi) (рис. 7.11). П о физическому
см ы слу
p (S , Р)
определена
в
интервале
S0 ^ S ^ O ,
7
*mSo ^ P(Sy Р) ^ 0-
Л А. + Э 0
На
рисунке
первая
кривая
функции, д л я ко то р о й Г Д 5 / ( Т рЛГ;) = 0. П ри
уравнение (7.54) тран сф орм ируется к виду
соответствует
это м
условии
^(S , Р) = - ^ - ,
'
Ks+ S
т. е. в это м реж им е эф ф ектам и и нгибирования м ож н о п ол ­
н остью пренебречь.
Н а рис. 7.11 п рям ая, п ар ал л ел ьн ая оси, соответствует D =
= 0,2. Точки пересечения этой п рям ой с кри вы м и p (S , Р)
со о тветству ю т реш ениям уравнения (7.11), т. е. при различны х
значениях п ар ам етр а YsKsj { Y рК {) они равны стац и он арн ы м
значениям концентраций субстрата. Видно, что при неизменны х
176
2
ч
е
о
s , mm
0,2
Рис. 7 .П . Зависимость удельной скорости роста микроорганизмов в режиме хемостата от концентрации субстрата для случая с конкурентным
ингибированием
продуктом
при
различных
значениях
параметра
YrK J (Y K ,) (цифры на кривых) (Ks =
= I мМ; S0 = 10 мМ )
0,4
0,6
0,0
11,4'1
Рис. 7.12. Зависимость стационарной
концентрации субстрата от скорости
разбавления для системы с конкурентным ингибированием продуктом при
различных
значениях
параметра
Y,KJ(Y„K,) (цифры на кривых) (К =
= 1 мМ ; Ц „= 1 ч ')
значениях п ар ам етр о в цт и Ks стац и он арн ая концентрация
суб стр ата тем выш е, чем больш е п ар ам етр YsK J ( Y pK i), т. е.
чем сильнее ингибирование п родуктом (рис. 7.12). Высокие
значения Y ^ J i Y p K , ) при д анной скорости разбавлен и я при­
водят к то м у , что Scr -> S0 . Э то соответствует условиям
низкой конверсии су б страта в биом ассу и соответственно
низким стац и о н ар н ы м кон ц ен трац иям биом ассы .
С тац ион арн ы е концентрации биом ассы и п родукта ф ерм ен­
тац и он н ого превращ ения м ож но вы числить на основе SCT по
уравнениям (7.57) и (7.58):
(7.65)
(7.66)
D
УЛ
YpK-i
П олезн о р ассм о тр еть ряд частны х случаев.
177
1. Константа
ингибирования
продуктом
относительно
велика (слабое ингибирование п родуктом ). Э то соответствует
условию Ys KJi YpK; ) «с 1 или YsKs/ ( Y pK i) «с ATs/S 0 . В этом
реж им е имеем
S‘T = l w o ^ f ; M « = ( s o - ^ r ^ ) к»:
P"=S°(‘-J£ tH
<7-67»
У равнения (7.67) характери зую т протекание процесса, не осл ож ­
ненного и нги бирован и ем п родуктом ; в кинетике процесса
ингибирование практически не проявляется.
2. Константа ингибирования продуктом очень мала (сильное
эффективное ингибирование продуктом ), реж им YSK J { Y рК {)
1,
YsK J ( Y pK i)^> K J S 0 . П ри этих условиях стаци он арн ы е концент­
рации ком пон ен тов будут даны уравнениям и
r ,* .S 0
SCT=
YpKi
,
;
М»
Y>*.
D
Y.K:
M CT= Y SSQ( Цт P ~ ‘ );
CT
s ° \ и
Y ,K ) ’
D
Pct = - S 0 ( n J D
Y"
D
Если реж им р аб о ты
v
1
).
Y„
(7.68)
)
YpKi
хем остата так ов, что
YsKsj ( Y pKi ) »
т. е. культиви рован ие ведется при д о стато ч н о высоких ск о р о ­
стях р азб авлен и я, то из уравнений (7.68) следует:
SCT= S0; М ст^ 0 ; Р ст^ 0 .
К у л ьту р а «вы м ы вается» из ф ерм ентера.
В это м реж им е, д л я того чтобы н аб л ю д ать процесс роста,
н еобходи м о р а б о т а т ь при весьм а м алы х скоростях разб авлен и я,
так чтобы член \im/ D вносил зам етн ы й вклад в уравнения роста.
3. Культивирование при критической скорости разбавления:
/ ) = Л = - ^ S°
Ks+ S0
И з уравнений (7.68) следует:
SCT= S0 ; М ст = 0; Рст = 0.
178
Н абл ю д ать рост культуры в этом реж им е практически
невозмож но.
Д ля то го чтобы и денти ф и ц ировать м ехан изм и определить
п арам етры культуры , н еобходи м о провести изучение стац и о ­
нарных уровней субстрата, п родукта или биом ассы в зависи­
м ости о т начальны х концентраций суб страта и вариации
скоростей разбавления.
Стационарная концентрация субстрата. У равнение (7.61) м о ж ­
но п р ео б р азо вать к виду
s
( K + * S o )D
(?69)
YК
где а = - ~ ф — безразм ерн ы й п арам етр, характери зую щ и й относительную эфф ективность ингибирования продуктом .
Из уравнения
(7.69) видно, что SCTлинейно зависит от
S0 и гиперболически от D. Его м ож но зап и сать в ф орм е
S" = ^ T T
-« + ^ T T « S°-(7 '70)
Если процесс исследуется при д анной п остоянной скорости
разбавления, но при различны х значениях S0, т о стаци он арн ая
концентрация су б стр ата как функция S0 характери зуется линей­
ной зави си м остью , при это м п ар ам етр ы п рям ой даны следую ­
щ им и функциями:
а = ----- ^ ----- ;
»JD - 1+а’
tg(p = ------ “------ .
g J D - 1+а
(7.71)
)К
(7.72)
V
7
Если а = 0 (ингибирование п родуктом отсутствует), то стац и о­
н арн ая кон ц ен трац ия суб страта не зависит от So (tg(p = 0). Э то
соответствует кинетике неослож ненного роста. Д ля определения
п ар ам етр о в p m, Ks и а н еобходим о зн ать значения а и tg(p
хотя бы при двух различны х скоростях разбавлен и я. Если
проведено полное исследование и известны а и tgcp при
различны х D, то м ож но восп ол ьзоваться уравнениям и
н О )-1?
= Ь
tgcp
a \D I
а
<7лз)
(7.74)
П арам етры этих прямых позволяю т определить значения a, \xmw Ks.
И сследование стац и он арн ого уровня суб стр ата в хем остате
м ож но
провести
при
различны х
скоростях
разбавлен и я
179
в реж им е двух или нескольких
концентраций в вод и м ого субстрата.
Д л я этого уравнение (7.70) м ож но
п р ео б р азо в ать к виду
f/Ser
1
От
SCT
4
а —1
+ - К , + <xS0 .
Ks + a S 0 D
(7.75)
Э ксп ери м ен тальн ы е данны е при ко­
нкурен тн ом инги бирован и и п родук­
то м долж ны л и н еари зоваться в ко­
орд и н атах это го уравнения, при
это м п ар ам етр ы п рям ой равн ы
Рис. 7.13. Зависимости стацио­
нарной концентрации субстрата
от скорости разбавления в о б ­
ратных координатах для систе­
мы с конкурентным ингибиро­
ванием продуктом при различ­
ных значениях а = Y,KJ( YpK,)
а —1
<7 Л 6 )
<7Л7>
П р я м а я 1/SCT от 1 /D пересекает
ось абсцисс в точке (это п олучается из условия 1/SCT= 0):
1—а
(7.78)
От
П ри эт о м сп раведливы следую щ ие условия (рис. 7.13)
а = 0 ( 1 / / ) ) „ = 1/|!т (кинетика неослож ненного роста);
а = 1 (1 /Z )L = 0 (слабое ингибирование п родуктом );
o c > l ( l/ Z ) j n< 0 (сильное и нгибирование продуктом ).
Т очки пересечений п рям ой 1/SCT о т 1 /D с осью абсцисс не
зави сят от концентрации суб страта S0, что такж е следует из
уравнения (7.78). Т аки м о б р азо м , 1/SCT о т 1 / Д полученные
при различны х значениях S0 , пересекаю тся в одной точке.
И з уравнений (7.76)— (7.77) следует, что тангенсы углов н аклон а
п рям ы х и отрезки, отсекаем ы е п рям ы м и на оси орд ин ат,
связаны с концентрацией в вод и м ого суб страта уравнениям и
a
a — 1 S0
+
к.
(7.79)
а —1’
_L = ^ + л_±
tg<P
0m
(7.80)
11m S0 '
Э ти ан ам о р ф о зы п о зво л я ю т определить иском ы е п арам етры
Ks, цт и а.
Стационарный уровень биомассы. У равнение (7.65) м ож но
зап и сать в виде
М„
180
йт/Д -1 ,
Ф т /^ -1 + a '
Ks
V - J D — 1 + a'
(7.81)
I
Т ак и м
о б р азо м ,
зависи­
м ость стац и о н ар н о го уров­
ня биом ассы от концент­
рации р аство р а ввод и м ого
суб стр ата при д ан ной ско­
рости р азб авл ен и я д олж н а
п ред ставл ять собой прям ую
линию со следую щ им и п а­
рам етр ам и :
а = Y.
t g (p = Y S * J D
1
s pm/7> - i + «
(7.83)
v
7
П р я м ая М ст от S0 пересека­
ет ось абсцисс в точке
» J D - 1’
к о то р ая
не
зависит
от
а и эконом ического коэф ­
ф ициента Ys, а определяется
лиш ь ско р о стью р азб ав л е­
ния и п ар ам етр ам и роста
культуры . Если зави си м ость
М ст о т S0 исследована по
крайней мере при двух р а з­
личных скоростях р азб ав л е­
ния, то по уравнению (7.84) Рис. 7.14. Зависимость стационарной кон­
центрации биом ассы от S0 для системы
м ож н о найти K s и ц т . В б о ­ с конкурентным ингибированием продук­
лее общ ем виде при серии
том при различных ос:
определений S„ при р азл и ч ­ а — а = 0; б — а = 0,5; в-— а = 5 ,0 ; ско р о сти р а з ­
бавл ен и я д а н ы ц и ф р ам и н а п рям ы х
ных скоростях разб авлен и я
ц елесообразно восп о л ьзоваться ан ам орф озой
± = t=
s.
ks D
(7.85)
Ks
И з рис. 7.14 видно, что при а = 0 (кинетика неослож ненного
роста) зави си м ости М ст от S0 при различны х скоростях
разб авл ен и я будут представлены серией п араллельны х прям ы х.
Н еп ар ал л ел ьн о сть прям ы х усиливается при увеличении а (о т­
носи тельном увеличении эфф ективности ингибирования п ро­
дуктом ).
Д л я определения Ys и а при найденны х независим о
п ар ам етр ах р т и Ks м ож но восп ол ьзоваться уравнениям и (7.82)
и (7.83). Н апри м ер, уравнение (7.82) п реобразуется в ф орм у
181
И з о трезка, отсекаем ого на оси орд ин ат, и тангенса
н акл о н а оп ределяю тся п ар ам етр ы Ys и значение а.
7.3.2.
угла
Неконкурентное ингибирование продуктом
О сновная систем а уравнений, оп исы ваю щ ая кинетическое
поведение систем ы с неконкурентны м и нгибированием продук­
т о м в реж им е х ем остата, им еет вид
p (S CT, P CT) = Z);
(7.87)
r s Z)(S0 - S CT) = p (S CT, Р СТ)М СТ;
(7.88)
- p ( S CT,
Р СТ) = / ) Р СТ,
(7.89)
Р
где
p (S CT, Р ет) = /
(7.90)
1+1 ? ) Л +8-
Подстановка значения Рст, выраженного через стационарную кон­
центрацию субстрата (7.59), в уравнение (7.90) приводит к функции
P(SCT, Рст) = г--- F — ^
1+-
урк ,
(s0- s c
------------- •
(^v + Sc
(7 -91)
В соответствии с (7.87) им еем
(7.92)
Э то уравнение м ож ет б ы ть реш ено отн оси тельн о стаци он арн ой
концентрации суб страта. О но п редставляет собой квад ратн ое
уравнение отн оси тельно SCT:
SC
2T+ S„
+ К, - s n -Ks( s o+ M l )
Решение это го уравнения им еет вид
Л г .к ,
= 0.
(7.93)
И з двух корней уравнения (7.93) физический см ы сл им еет
лиш ь корень с п олож ительн ой и ррац и он ал ьн ой частью , п о­
скольку л иш ь в это м случае SCT полож ительно.
Если ввести обозначение YsK J { Y pK i) = а, то уравнение (7.94)
м ож н о п р ео б р азо в ать к виду
с
„ К
1~ \ i J D
i+ h . +
J
So
к.
2
1-P J D
К~
Р ассм о тр и м д ва важ ны х частны х случая.
1. Относительно слабое ингибирование продукт ом: a <s: 1 а-+0.
В это м реж им е (7.95) п ри об ретает вид
2 1
“
а
v
/1 + — ^ —
[» J D -\Y
.
(7.96)
Видно, что при а - > 0 значение 4 a/(p im/Z>— I ) 2 <sc 1, при это м ус­
ловии и р р ац и о н ал ьн ая часть уравнения (7.96) м ож ет б ы ть р а з­
лож ен а в б ы строрасходящ ий ся ряд отн оси тельно 4 a /( p m/ D — I)2:
1+ -
4а
\+
Если в о сп о л ьзо ваться
то имеем
4а
4а
2
2 (ц т Д ) - 1 ) 2 + 4
первы м и
S„=-
двум я
к.
»JD- I
членам и
разлож ения,
(7.97)
Э то уравнение соответствует кинетике неослож ненного роста.
2. Сильное ингибирование продукт ом: а » 1 . В это м реж им е
из (7.96) им еем
с
(7.98)
2
И рр ац и о н ал ьн ая часть этого уравнения равн а 1 + S0/K s, п оэтом у
SCT= S0.
(7.99)
С тац и о н ар н ая концентрация суб страта соответствует н ачальной
концентрации, ввод и м ой в ф ерм ентер, концентрация биом ассы
равн а нулю , стац и о н арн ого ро ста культуры нет.
К ак видно из уравнения (7.95), точное описание кинетики
р о ста культуры м и кр о о р ган и зм о в в хем остате в условиях
неконкурентного и нгибирования п родуктом содерж ит гр о м о зд ­
кую и рр ац и о н ал ьн у ю ф ункцию , в силу чего рассм отрение
183
реш ения и сопоставление с ним эксперим ентальны х данны х
весьм а неудобно. Д л я определения п ар ам етр о в р о ста культуры
воспользуем ся д о статоч н о точ н ы м п риближ енны м реш ением.
Если процесс п ровод и тся в реж им е, когда
у=
Г
----- 4 (So/* .+ !/«)-------
< c i,
(7.100)
[(1 + Цт /ос£>) — (S 0 /ATs -(- 1 /а )]
то и рр ац и о н ал ьн ая часть уравнения (7.89) м ож ет б ы ть разл о ж е­
на в б ы стросходящ ийся ряд отн оси тельно п ар ам етр а у. Н ер а­
венство (7.100) хорош о вы п олн им о в условиях
l + p m/ ( a £ > ) » S 0/tfs- l/o c .
(7.101)
Э то неравенство м ож н о п р ео б р азо в ать к виду
D<z
На.
.
(7.102)
И з (7.102) следует, что чем больш е концентрация субстрата,
тем м еньш е д о л ж н а б ы ть скорость разб авл ен и я, д л я кото р о й
сп раведливо такое неравенство, т. е. y<scl.
В реж им е (7.100) или (7.102) стац и он арн ая концентрация
су б стр ата м ож ет б ы ть представлен а уравнением
S „ s , KAS° * -+ '"‘}
(7.103)
s +1) “ f e H
Э то уравнение следует из (7.95) при разлож ении и р рац и он ал ьн о­
го члена в ряд отн оси тельно у и и сп ользован и я первы х двух
членов разлож ения.
Т ак как уравнение (7.103) справедли во ли ш ь при условии
(7.101), то оно м ож ет б ы ть записано в более простой ф орме:
у
<7 | 0 4 )
• У равнение (7.104) очень похож е на уравнение
(7.69),
описы ваю щ ее кинетику с конкурентны м и нгибированием п р о ­
дуктом . Т аки м о б р азо м , д л я определения п ар ам етр о в роста
культуры м и кр о о р ган и зм а в условиях н еконкурентного ингиби­
рован ия п р о д у к то м м ож но восп ол ьзоваться тем и м ето д ам и
и п одход ам и, которы е
рассм отрены вы ш е д л я м ехан изм а
конкурентного инги бирован и я п родуктом . О дн ако н еобходим о
им еть в виду, что д л я случая неконкурентного ингибирования
уравнение (7.104) им еет приближ енны й характер и тем точнее
описы вает реш ение, чем ниже скорость разб авл ен и я и ниже
концентрация в во д и м ого суб страта [см. (7.101)].
184
7.3.3. Ингибирование ионами водорода
П ри культивировании м и кр о о р ган и зм о в весьм а часто реали ­
зуется ситуация, ко гд а п родуктом ф ерм ен тац ион н ого превращ е­
ния являю тся органические ки слоты , нап рим ер уксусная или
м о л о ч н ая кислоты , которы е см ещ аю т pH в о б ласть низких
значений и тем сам ы м и зм ен яю т скорость роста культуры .
Если ингибирование ионам и в одород а д остаточ н о сильное, то
без специальны х п рием ов вообщ е н евозм ож н о р еали зовать
рост культуры в реж им е хем остата.
П р о и л л ю стр и р у ем это на п ростом примере. Д опустим ,
ск орость ро ста культуры кон троли руется ионогенной группой
с р * ~ 7,0. Э то озн ачает, что кон стан та и нгибирования Н +
ро ста культуры K t = 1 0 “ 7 М. И з преды дущ его р азд ел а следует,
что стаци он арн ы е концентрации суб страта и биом ассы в ре­
ж им е хем о стата оп ределяю тся б езр азм ер н ы м п ар ам етр о м
а = YsKs/^YpKi). Если п рин ять АГ,,~10~3 М (наиболее типичное
значение для л и м и ти рую щ его суб страта — источника углерода)
и Y J Y p K 1, то при S0, сои зм ерим ы х с K s, из уравнения
(7.104) следует, что SCT/S 0 = 0,999. Э то го в о р и т о то м , что
суб стр ат в хем остате практически не конвертируется, роста
культуры не происходит.
Д ля п редотвращ ения ингибированности ки слотн ы м продук­
то м м ож но, н ап рим ер, в ф ерм ентер с постоян н ой скоростью
v0 п о д авать ней трали зую щ и й кислоту раство р щ елочи оп ре­
деленной концентрации. Р ассм отри м стаци он арн ую кинетику
ро ста культуры с учетом этого д оп ол н и тел ьн ого процесса.
К инетику роста культуры описы вает систем а уравнений
^
= p (S , Н + ) М - £ > М ;
(7.105)
~
= D ( SQ—S) —^ S- ” -+-)N1;
(7.106)
н+
(7 1 0 7 )
dt
dt (
Y
0
Д обавоч н ы й член v0 в '(7.107) п редставляет собой м олярн ую
ск орость ввода в ф ерм ентер ней трали зую щ его раствора*
v 0 = dO H
+ /d t.
(7.108)
Зави си м ость удельной скорости роста культуры от кон ц ен тра­
ции и онов в о д о р о д а м ож но п ред стави ть в виде
(I (S, И + ) =
sj (неконкурентное ингибирование),
(7.109)
dР п
Ограничение на v0 накладывается исходя из условия — 5=0.
185
где функция / ( Н + ) д л я различны х случаев м ож ет и м еть
различны й вид. Н апри м ер, если им еет м есто си гм ои д ал ьн ая
зави си м ость скорости р о ста от концентрации и онов во д о р о д а
/(Н +) = 1 + ^ ,
(7.110)
/ ( H +) = l + ^ + | l .
(7.111)
при ко л о ко л о о б р азн о й
В стац и о н ар н о м реж им е при J M /d / = 0, d S /d t —О и dH + /d t =
- 0 имеем
p (S CT, H :T) = D ;
M CT= (S0 —SCT) Ys;
H += —
ъ
(S0 -
S
(7.112)
(7.113)
„
)
-
(7.114)
£
Е сли р ассм о тр еть
простейш ий
случай и предполож и ть,
что п ротон
является конкурентны м
и н ги б и тором
роста
культуры , то
HraSCI
- = D.
(7.115)
я с+Л
П ри подстан овке в это уравнение значения Н + , найденного
по уравнению (7.114), получим
n„SCI
=D,
(7.116)
К*
о тку д а следует
YSKS
Ks+ - ± - ±
Sc t=
v0 K.
S „ —
Y' * K
йт ,
s s
—
DKl.
(7-117)
|
Если п рин ять введенное ранее обозначение а =
ние (7.117) м ож н о зап и сать в виде
то уравне­
' р
Ks +<xS0 —— —
Л
К
S = - --------------------------------------------- (7.118)
ст
p J D - 1+а
В
отличие от рассм отрен н ого ранее уравнения д ля случая
инги бирован и я без процесса н ей трали зац ии уравнение
(7.118)
186
содерж ит в числителе д оп олн и тельн ы й член
jy j-
Э то т
член п риводит к то м у, что при прочих равны х условиях при
н ей трали зац ии кислого п родукта стац и он арн ая концентрация
суб стр ата ниже и соответствен но кон ц ен трац ия б иом ассы выш е,
чем для процесса без нейтрализации.
В реж им е нейтрали зац ии кислоты концентрация биом ассы
будет представлена уравнением
S0 (\lm- D ) - K t D + v0 ^
М
ст
= Y
5
ц+(<х— 1)Z>
—.
(7.119)
^
’
Д ополн ительн ы й прирост биом ассы при нейтрали зац ии ки слот­
ного продукта им еет вид
К
vo —
AM = У
r^— .
(7.120)
И з это го уравнения видно, что прирост биом ассы при
нейтрали зац ии ки слотн ого п родукта тем выш е, чем выш е
скорость подачи ней трали зую щ его агента. П р и р о ст биом ассы
ум еньш ается с р о сто м скорости разбавления.
При проведении процесса с нейтрализацией кислотного компо­
нента накладываю тся дополнительные ограничения на скорость
разбавления. Из уравнения (7.120) следует, что при
> 1, для того
чтобы значение SCT было положительным, т. е. чтобы величина
имела физический смысл, необходимо соблюдение неравенства
K s + clS0 > ^ —.
(7.121)
D Kt
4
*
Э то неравенство будет хорош о вы п олн яться при высоких
концентрациях су б страта или при высоких скоростях п ротока.
К ритическая скорость разб авл ен и я, ко то р ая вы числяется на
основе равен ства нулю числителя уравнения (7.120), им еет вид
В =
"°-
(7.122)
* ‘1 1 + ° Ч
Н иж е этой величины стац и он арн ого ро ста культуры в х ем оста­
те п роисходи ть не будет.
• Т ак и м о б р азо м , в реж им е ингибирования и онам и в о д о р о ­
д а при нейтрали зац ии ки слотн ого п родукта скорость р азб ав л е­
ния им еет ограничение как сверху, так и снизу:
187
л-So > D > _ 4 —
* ’+ s "
(7.123)
* ;(l+ « |
Д л я определения п арам етров ро ста культуры в обсуж даем ом
реж им е н еобходи м о провести исследование стаци он арн ы х уров­
ней су б стр ата и биом ассы при различны х концентрациях
в во д и м о го суб страта и различны х скоростях разбавлен и я.
Зави си м ость стаци он арн ой концентрации суб страта как
функции концентрации ввод и м ого суб страта следую щ ая:
<7' 124>
Т ангенс угла н аклон а этой зави си м ости как функции скорости
разб авлен и я определяется м акси м ал ьн ой скоростью роста о р га­
н и зм а и а:
• "
- д а ?
‘7 |2 5 >
В об р атн ы х коо р д и н атах имеем
i+ ^ z i
tg(p
a
D
(7.126)
а
Э та зави си м ость п о звол яет оп редели ть значения а и цт (или
отнош ение ц т / а при а » 1 ) .
О трезок, отсекаем ы й линейной зави си м остью SCT от S0 на
оси орд ин ат, равен
К D —v0 —
а=
г п ^г.
Ит+(«-1)Я
(7.127)
Если известны значения цт , a, v0, то из зави си м ости а от
D м о гу т б ы ть найдены K s и К{.
А н алогичное рассм отрени е м ож ет б ы ть проведено д ля
определения п ар ам етров роста м и кр о о р ган и зм о в из зави си м ос­
ти стац и о н ар н о го уровня биом ассы о т н ачальной концентрации
су б стр ата и скорости разбавлен и я.
К ул ьти вирован и е м и кр о о р ган и зм о в в п роточн ом реж име
им еет р яд принципиальны х преим ущ еств по сравнению
с периодическим культиви рован ием . Э ти преим ущ ества
обеспечиваю т ш ирокое распростран ен ие м етодов п роточ ­
н ого культиви рован ия д л я реш ения как исследовательских,
так и прикладны х задач. О сновны е преим ущ ества связаны
§
188
. с интенсиф икацией процесса, возм ож н остям и осущ ествить не' преры вное культивирование, автом ати ч ески м кон д и ц и он и рова­
нием среды , стабилизацией разви ти я клеток в определенной
1 ф азе р о ста. П ри н ци п иальн ой особенностью хем остатн ого куль­
ти ви рован и я является управление скоростью роста популяции
с п о м о щ ью скорости разбавлен и я. У величение скорости разб ав! ления автом атически ведет к установлению в систем е новой
удельной скорости ро ста популяции и новы х стационарны х
[ уровней суб страта, биом ассы , п родуктов ф ерм ентации. О днако
следует п ом н ить о прин ц ип и альном ограничении, н акл ад ы в а­
ем ом на скорость разбавлен и я. П ри определенной вводи м ой
в ф ерм ентер концентрации суб страта она не м ож ет б ы ть больш е
м акси м ал ьн о й удельной скорости ро ста м и к р о о р ган и зм а в д ан ­
ных условиях. П ри скорости разб авл ен и я вы ш е критической
культура м и кр о о р ган и зм о в будет «вы м ы ваться» из ф ерм ентера.
У равнения, описываю щ ие рост популяции в реж име хем остата,
наиболее просты . Д л я определения п ар ам етр о в роста, таких, как
удельная м акси м ал ьн ая скорость ро ста и кон станта сродства
к субстрату, н еобходи м о и сследовать поведение системы при
разли чн ы х скоростях разб авл ен и я или различны х начальны х
концентрациях су б стр ата и и сп о л ьзо в ать уравнения, которы е
следую т из излож енной теории хем остатного роста. С оответствие
экспериментальны х данны х уравнениям д л я случая неосложненно­
го р о ста является д о к азател ь ств о м того, что р ост популяции
п ротекает в условиях отсутстви я ослож н яю щ их эф ф ектов. Если
н аб л ю д аю тся сущ ественные отклонения о т уравнений «идеально­
го» роста, то необходимо провести идентификацию осложняю щ его
эффекта. Э то м ож ет б ы ть как ингибирование и збы тком субстрата,
так и ингибирование п род ук том культивации м и кроорган и зм а.
Д ля дискрим инации различны х ослож н яю щ их эффектов
в табл., 7.1 приведены основны е уравнения, описы ваю щ ие
кинетические зако н о м ерн ости ро ста клеточны х популяций в слу­
чае неослож ненного ро ста и при си льн ом ингибировании
су б стр ато м или п родуктом .
И з таб л и ц ы видно, что законом ерн ости ро ста д л я указанны х
случаев сущ ественно р азли чаю тся. Рис. 7.15 и 7.16 схем атично
и лл ю стр и р у ю т м н о го о б р ази е зави си м остей, которы е м огут
н аб л ю д аться эксперим ентально. В случае неослож ненного роста
стац и о н ар н ая концентрация суб страта д олж н а сильно в озрас­
та т ь с р о сто м скорости разб авл ен и я, в то врем я как при
си льн ом ингибировании су б стр ато м она м ож ет как линейно
расти, так и си льн о п ад ать. П ри ингибировании п родуктом
стац и о н ар н ая концентрация суб страта д о л ж н а расти с ростом
скорости р азб авлен и я по гиперболическом у закону. И з таб л. 7.1
и рис. 7 .1 5 ,6 видно, что при неослож ненном росте и при
ингибировании су б стр атом стац и он арн ая концентрация в ф ер­
м ентере не зависит о т вводи м ости в ф ерм ентер его концентра189
Таблица 7.1
Кинетические закономерности роста популяции микроорганизмов
при неосложненном росте и сильном ингибировании
субстратом или продуктом
Механизм
процесса
Неосложненный
рост
Стационарная
концентрация
субстрата
Стационарная кон­
центрация биомассы
Р
S - DK'
ст » m- D
Ингибирование
субстратом
DK,
ст, 1 —
Ит
Стационарная кон­
центрация продукта
У .(0
Р" - у Л
м"
- ' - ( 5° - 7
с
Ь
D K ,\
°
* .-
d)
Р
J s - £ V \ L
—
' Г
* .) г ,
( о « д .)
С
ст. 2
Ингибирование
продуктом
с
СТ
D
ctS0 D
п
M ci. 2 = ( s o ~ ~ ) Y s Р
M CT= n s 0 i ^
-
J
s
у
PCI=
Yp
Y’
D ) Yp
s 0 ^m~ D
p m+ a£)
ции. Н ап роти в, в случае ингибирования п родук том долж на
н аб л ю д аться линейная зави си м ость меж ду стаци он арн ой кон­
центрацией суб страта в ф ерм ентере и в п итаю щ ем его растворе.
С оверш енно разли чн ы закон ом ерн ости изм енения в ферм ентере
биом ассы при изменении скорости разб авлен и я (рис. 7.16). Н а
основании качественного соп оставления эксперим ентальны х
данны х с теоретическим и, представлен н ы м и на рис. 7.15 и 7.16,
м ож н о иденти ф и ц ировать условия ро ста популяции, определить
в п оследую щ ем п ар ам етр ы процесса и найти наиболее о п ти ­
м альн ы е условия его проведения.
Рис. 7.15. Зависимость стационарной кон­
центрации субстрата от скорости разбавле­
ния (а) и начальной концентрации субстрата
(б) в режимах неослож ненного роста (2), при
ингибировании
избытком
субстрата
(I)
и продуктом (3)
Рис. 7.16. Зависимость стацио­
нарного уровня биомассы от
скорости разбавления для неос­
лож ненного роста ( / ) и для
роста в режиме ингибирования
избытком субстрата (2) и про­
дуктом (3)
1 2
3
4
5
6
7
V
1 2
3
4
5
6
7
V
Рис. 8.1. Зависимость от времени концентрации биомассы (а ) и исходного
субстрата (б ) для систем с различным количеством введенного инокулята
(N 0/(M „ —N 0) (цифры на кривых):
кри вы е о т р а ж а ю т численное и н тегр и р о ван и е уравн ен ий (8.3) и (8.4) при значении п а р а м е т р а
K J S0 = 0,5
суб стр ата (т50), зави сят о т этого отнош ения. П ри переходе
от K J S 0 = 2 к ATs/S 0 = 0,1 т 50 меняется от 6,2 д о 2 ед.т.
Расчеты п о казы в аю т, что сущ ествует линейная зави си м ость
меж ду т 50 и K J S0 . Ее м ож но п редстави ть теорети ко-эм п и ри ­
ческим уравнением , ко торое следует из данны х, приведенных
на рис. 8.2:
t50*
1 ,8 +
2 , 3 ( * s / S 0 ).
(8 .5 )
П ри б ольш ой концентрации суб страта, сущ ественно п ревы ш аю ­
щей кон станту Ks (S0 : » К5), врем я полупревращ ения суб страта
вы ходи т на предельны й уровень, п рибли зительн о равны й
1,8 ед.т. Т ак и м о б р азо м , если известна цт , т о предельно
в озм о ж н о е врем я полупревращ ения суб страта г50 в условиях
его насы щ аю щ их концентраций м ож ет б ы ть оценено по
простейш ем у уравнению
Рис. 8.2. Зависимость от времени концентрации исходного субстрата (а )
и биом ассы (б) для систем с различными значениями параметра K J S 0 (цифры
на кривых):
кри вы е с о о т в е тс т в у ю т чи сл ен но м у р еш ени ю у равн ен ий (8.3), (8.4) при
п ар а м е т р а N 0/(M „ —N o) = 0 ,l
7*
и сп ол ьзован и и
195
( 8 .6 )
* 5 0 - Ь 8 / ц т .
Э та оценка сп раведли ва, когд а количество и н окулята около
10%. К ак б ы ло п оказано, т 50 такж е зависит о т количества
и значальн о введенны х в систему клеток (см. рис. 8.1).
8.1.2. М етод двойного зеркального отражения
И з данны х, приведенных на рис. 8.2, следует, что кинети­
ческие кривы е р о ста культуры в условиях K J S Q з> 1 и K J S 0 <^:\
сущ ественно р азл и ч аю тся по ф орм е кинетической кривой. Д ля
определения условий проведения эксперим ента (вы яснения об ­
ласти соотнош ения K J S 0) п редлагается следую щ ая достаточ н о
п р о стая п роцедура. К инетическая кривая роста при т = т 50
р азб и вается с п о м о щ ью осей 1— 1' и 2 — 2' на четы ре квад ран та
(рис. 8.3), и д ву м я п осл ед овател ьн ы м и зерк ал ьн ы м и о тр аж е­
ниями часть кинетической кривой, леж ащ ей в III квадранте,
проецируется в первый квадран т.
Графически двойное зеркальн ое отраж ение м ож н о получить,
если разн о сть единица минус ор д и н ата точек кривой, леж ащ их
в III квад р ан те (заш три хован н ая об ласть), о тл о ж и ть в I квад ­
ран те, взяв за нулевой отсчет времени т = т 50, и д ви гаться
в о б р ат н о м направлении.
К инетическая кри вая р о ста в условиях K s » S0 практически
си м м етри чн а. Д вой н ое зеркальн ое отраж ение верхней части
т
т,1
Рис. 8.3. Графическая иллюстрация
м етода двойного зеркального о т ­
ражения при анализе полной кине­
тической кривой роста популяции
микроорганизмов
Рис. 8.4. Д войное зеркальное
отражение кинетической кривой
роста популяции в режиме
S0 < ^ K S (кривые / ) и в режиме
S0 » K s (кривые 2):
сп л о ш н ы е лин и и — ниж ний участок
кри во й р оста; п ун кти рн ы е — верхний
196
кривой д о лж н о либо совп а­
д ат ь с н ач ал ьн ы м участком
кривой, л и б о л еж ать несколь­
ко вы ш е (рис. 8.4, кривы е 1).
В условиях S0 » Ks отраж ение
верхнего участка кинетической
кривой ляж ет сущ ественно ни­
же н ач альн ого участка (кри­
вые 2).
• Т аки м о б р азо м , м ож но
на основе качественного ан а­
лиза вида кривой определить, Рис. 8.5. Данные рис. 3.5, а в коорди­
натах (8.1) и двойное зеркальное отра­
в како м реж им е протекает жение
верхней
половины
кривой
процесс: в условиях S0 : » Ks
(пунктир)
(реж им м акси м ал ьн ой скорости р о ста) или в условиях S0 <^:Ks (реж им п ервого п орядка
по концентрации субстрата).
П ри ведем п рим ер ан ал и за реж им а протекания процесса,
во сп ользовавш и сь д л я этого д ан н ы м и рис. 3.5 (рис. 8.5). Видно,
что верхняя и ниж няя части кривой практически совп ад аю т,
кри вая почти си м м етри чн а. О чевидно, что рост культуры
ведется в реж им е, когда концентрация суб страта сущ ественно
ниже Ks. Д анны е, приведенны е в § 3.3, блестящ е п одтверж даю т
э то т вы вод.
Д л я практического использован и я об суж даем ого м етода
сущ ественно вы полнение следую щ их условий: 1) при построении
кинетической кривой долж ен б ы ть исклю чен период индукции;
2) вы воды будут однозн ачн ы , если для д анной культуры
п оказано, что м ехан изм роста не вклю чает стадии ингибиро­
вания и збы тко м су б страта или ингибирования продуктом .
В последних двух случаях м ето д д вой н ого зеркальн ого о т ­
раж ения м ож ет п р и вод и ть к бли зким зави си м остям , но другим
качественны м вы водам .
Ингибирование субстратом. У равнение скорости роста куль­
туры с и нгибированием и зб ы тко м суб страта в безразм ерны х
перем енны х им еет вид
dm
(8.7)
dx
И
- *
*
Видно, что в отличие от процесса без ингибирования субстра­
т о м здесь кинетика роста определяется двум я б езразм ерн ы м и
п ар ам етр ам и : K J S 0 и S0/ АГ, (рис. 8.6). И з рисунка видно,
что ингибирование су б стратом п риводит к появлению не­
си м м етри чн ости на кривой ро ста культуры . О собенно это
хорош о обнаруж и вается при исп ользован и и м ето д а двойного
197
О
1
2
3
4
5
6
1
X
1 2
3
4
5
6
1
X
Рис. 8.6. Кинетические кривые роста микроорганизмов (а) и расход лимитирую ­
щ его субстрата (б) для случая с ингибированием избы тком субстрата:
численное решение уравнения (8.7); цифры на кривых параметры SJKt; ЛГ/S0 = 0,5;
N„/(Ma - N o) = 0,l
зер к ал ьн о го отраж ен ия (рис. 8.7). Верхний участок кинетической
кривой д л я случаев инги бирован и я суб стратом , отраж енны й
в I квадран те, расп ол агается сущ ественно ниже, чем нижний
участок, что является характерн ой особен н остью д ан н ого
процесса.
Ингибирование продуктом. У равнения скорости ро ста куль­
туры при инги бирован и и образую щ и м ся п родуктом в б езр аз­
м ерны х перем енны х (8.1) и м ею т вид
$ =
dx
— =
dx
/
]
о.
1
( \ + P a, / K i) ( K J S 0 + s )
-г——
(неконкурентное ингибирование); (8.8)
г—
K s/ S 0 ( l + P x / K , P ) + s
(конкурентное ингибирование), (8.9)
F
V
’
где P — предельное количество п родукта.
Видно, что кинетика роста уп равляется такж е двум я
б езразм ерн ы м и п арам етрам и : K J S0 и P ^ /K j (рис. 8.8). П осле
н еб ольш ого, почти н едетектируем ого п ери ода экспоненциаль­
н ого р о ста р азви ти е культуры переходит в реж им почти
п остоянной скорости, н аб лю д ается длинны й, близкий к линей­
ном у участок н акопления биом ассы или продукта.
Х арактерной особен н остью процесса с и нги бирован и ем
п р о ду к то м является специфический вид кинетической кривой
при д во й н о м зер к ал ьн о м отраж ен ии верхнего участка кривой
(см. рис. 8.7). Видно, что кривая сущ ественно несим м етрична,
при эт о м о тр аж аем ая ветвь леж и т зам етн о выш е н ачальн ого
участка.
• Т ак и м о б р азо м , кинетические кривы е ро ста м и к р о о р га­
н изм ов д л я разли чн ы х м ехан и зм ов протекани я процесса и м ею т
р азли чн ую ф орм у. В изуализацию разли чи й удобн о п ровод и ть
с использован и ем м ето д а д вой н ого зерк ал ьн ого отраж ения.
198
т
v
it
t r
/
^ f t 50
Рис. 8.7.
Графическая иллюстрация
м етода двойного зеркального отраж е­
ния для системы с неосложненным
ростом ( /) , с ингибированием избы т­
ком субстрата (2) и продуктом (2):
сплошные линии — нижний участок кривой
роста; пунктирные — верхний
1
3
h
5
6
7 %
Рис. 8.8. Кинетические кривые роста
популяции при ингибировании про­
дуктом:
численное решение уравнений (8.8) и (8.9);
Р„/К,— цифры на кривых; N0/(M!D- N 0) =
=0,1; KJSo=0,5; а — неосложненный рост,
б конкурентное и в — неконкурентное ин­
гибирование
Д о стато ч н о легко идентиф ицирую тся процессы с инги бирован и ­
ем п р о ду кто м и процессы , п ротекаю щ и е в реж им е п ервого
п оряд ка по л и м ити рую щ ем у субстрату (S0
Ks) (см. рис. 8.4
и 8.7). Кинетические кривы е в условиях S0 ^> Ks и при
ингибировании и зб ы тко м суб страта и м ею т близкие ф орм ы , их
идентиф икация на основе одной кинетической кривой не всегда
м ож ет б ы ть сделана. Д ля дискрим инации этих м ехан изм ов
м огут б ы ть прим енены другие м етоды , нап рим ер исследование
разви ти я культуры в экспоненциальной фазе при различны х
начальны х концентрациях ли м и ти рую щ его суб страта (см. гл. 2).
8.2.
П РИ Н А Л И Ч И И
РО С Т К У Л ЬТУ РЫ
П РО Ц ЕС С А Л И ЗИ С А К Л ЕТО К
У равнение скорости роста культуры
клеток им еет вид
при наличии лизиса
^ = *y.M-s - a / M ,
dt
Ks+ s
где 7.' — кон станта,
гибели, клеток.
характери зую щ ая
(8.10)
ск орость
лизиса,
или
199
Рис. 8.9. Кинетические кривые роста микроорганизмов (т ), накопления
продукта (р) и расхода
субстрата (л) с учетом лизиса клеток при
различных параметрах Х = 0,1 (а), 1,0 (б):
решение уравнений (8.11) при KJSo = 0,5
Если перейти к безразм ерн ы м перем енны м [см.(8.1)] при
условии Ys— Y . = l, то скорости роста культуры , расхода
су б стр ата и о б р азован и я п родукта будут равны
ds _
dr
где
dm
ms
dt
KJSo+s
ms
K J S 0+ s ’
.
— km ;
dp _
dr
ms
KJS0+ s ’
( 8 . 11)
,
Г
k = — .
В отличие о т процесса в отсутствие лизиса клеток в о б ­
суж даем ом случае кинетика роста определяется двум я без­
разм ер н ы м и п ар ам етрам и : ATs/S 0 и к (рис. 8.9). И з рисунка
видно, что лизис клеток приводит к появлению н есим м етрич­
ности на кривых расхода s и о б разован и я р, а такж е, что
очень важ но, к прохож дению через м акси м ум кривой роста
культуры , причем с увеличением к эти процессы усиливаю тся
(кривы е расхода s и о б разован и я р стан овятся все н есим м ет­
ричнее, а м акси м ум ы кривой роста т пониж аю тся). П ри
значениях к , близких или превы ш аю щ их единицу, н аб лю д ается
отм и р ан и е культуры (рис. 8 .9 ,6 ). У словие отм и ран и я культуры
им еет вид
<8 - 12>
• Кинетические кривы е роста культуры с участием стадии
лизиса клеток сравн и тельно легко идентиф ицирую тся из-за
наличия х арактерн ого м акси м ум а или ниспадаю щ ей вет­
ви на кривы х ро ста культуры . В этих же условиях кон­
центрация п родукта д о сти гает насы щ ения и не изм еняется во
времени.
С оверш енно ан алоги чн о кинетическое описание процесса,
ко гд а в популяции п оявл яю тся клетки, не способны е к делению
200
(см. гл. 3, § 5). В это м случае число ж изнеспособны х клеток
п роходи т через м акси м ум , а общ ее число клеток вы ходит на
предельны й уровень с насы щ ением . Т ак о го р о д а м еханизм
м о ж ет б ы ть причиной ограничения роста м икробн ой попу­
ляции.
8.3. К И Н Е Т И Ч Е С К И Е ЗА К О Н О М Е Р Н О С Т И Р Е П Л И К А Ц И И
В РАСТУЩ ЕЙ П О П У Л Я Ц И И Е. C OL 1
П Л А ЗМ И Д
Р азвитие генно-инж енерны х подходов (Т. М аниатис, Э.
Ф рич, Д ж . С эм брук, 1984) подн и м ает ком плекс вопросов,
связанны х с изучением и п рогнози рован ием врем енны х зак о н о ­
м ерностей экспрессии гена. Д ля прим ера рассм о тр и м кинетику
ро ста популяции Е. coli (ш там м PR 13), содерж ащ ей п лазм и ду
рМ М 243 на среде с д обавк ой ан ти би оти ка ам пи ц илли на
(рис. 8.10). П л азм и д а несла ген (3-лактамазы, обеспечиваю щ ей
ро ст бактерий в этой среде. Ранее б ы ло показано, что ш там м
Е. coli без п лазм и ды не о б л ад ает (i-л ак там а зн о й активн остью
и не способен расти в д анной среде.
И з рис. 8.10 видно, что рост общ его числа клеток в по­
пуляции сущ ественно опереж ает рост п лазм и д ы и экспрессию
|3-лактам азы , при этом н орм и рован н ы е кинетические кривые
ро ста п лазм и д ы и ф ерм ен та по ф орм е п рим ерн о совп ад аю т.
Э то опереж ение п роявляется на н ач альн ом периоде (3 5 ч)
р азви ти я процесса в экспоненциальной фазе. В дальн ей ш ем
количество числа п лазм и д и активн ость (3-лактамозы в расчете
на клетку вы ходят на исходны й уровень.
К инетическая кривая ро ста общ его числа клеток имеет
типичны й вид, вклю чаю щ и й экспоненциальную ф азу с зам ед ­
лением роста. С оверш енно по-другом у вы гляди т популяционная
кривая изменения числа ж изнеспособны х клеток, п роходящ ая
через м акси м ум (рис. 8.11).
Л £.
Mm 0т
1,0 -
Рис. 8.10. Кинетические кривые на­
копления клеток М (1) и Д Н К
плазмиды G (2), нормированные
на предельные значения: М т = 0,5= 4 • 109 клеток/мл,
G,„ =
IПН К на клетку
= 8,8 • Ю-10
мгк Д
(а); кинетика изменения числа
плазм ид (!) и активности Р-лактамазы (2) в расчете на клетку
в процессе роста микробной попу>
ляции (6)
201
Н аи б ол ьш и й интерес и воз­
м ож н ость количественной интер­
претации п ред ставляет экспонен­
ц иальн ая ф аза ро ста (первы е 4 —
5 ч) (рис. 8.11). В озм ож н ы м эф­
ф ектом , ослож н яю щ и м интерпре­
тац и ю как в экспоненциальной
фазе роста, так и на следую щ их
этапах разви тия процесса, м ож ет
б ы ть сущ ественное изменение pH
среды в резул ьтате накопления
органических кислот — продуктов
м етаб о л и зм а Е. coli. О днако из
рис. 8.12, а видно, что, в то время
как pH среды в процессе роста
Рис. 8.11. Кинетика изменения ко­
меняется сущ ественно (от 8 до
личества клеток (М а ), способны х
5,5), удельн ая скорость роста
образовы вать колонии на твердой
Е. coli практически не зависит от
среде в нормальных (кривая 1)
и полулогарифмических координа­
pH среды (рис. 8.12, б).
тах (кривая 2)
• И та к , а н а л и з ки н ети ки р о ­
ст а Е. coli в эк сп о н ен ц и ал ь н о й ф азе м о ж н о п р о в о д и т ь , не
о п аса я сь су щ еств ен н о го в л и ян и я pH на ки н ети ку п роцесса
(рис. 8.13). В течение и ссл ед у ем о го врем ен и э к с п е р и м е н т а л ь ­
ные д ан н ы е д о с т а т о ч н о х о р о ш о о п и с ы в аю тс я эк сп о н ен ц и ­
а л ь н о й функцией. Э ф ф екти вн ы е о п р ед ел я е м ы е из эк сп ер и м ен ­
та у д ел ьн ы е ск о р о сти р о с т а по р а зл и ч н ы м п ер ем ен н ы м
м о ж н о о б о зн а ч и т ь как ця (р о с т ж и зн есп особ н ы х к л ето к ),
ц0 (р о с т Д Н К -п л а з м и д ы ), ц£ (р о с т ак ти в н о сти р -л ак там азы 1.
Н ай д ен н ы е зн ач ен и я п а р а м е т р о в : р = 1 , 5 ч - 1 ; цо = 0,8 ч - *;
ц Е = 0,8
ч
-1.
Р о ст ж и зн есп о со б н ы х к л ето к сущ ествен н о о п ер еж ает р о ст
п л а зм и д ы и ф ер м ен та, в р е зу л ь т а т е чего клетки в п р о ­
цессе р о с т а п о п у л яц и и д о о п р ед ел ен н о го п ер и о д а о б е д ­
н яю тся и м и (см . рис. 8.10). В д ал ь н ей ш е м зам ед л е н и е с к о ­
р о сти р о с т а п о п у л яц и и п р о и с х о д и т б ы стрее, чем зам ед л е н и е
ск о р о сти р о с т а п л а зм и д ы , и кри вы е в ы х о д я т н а и сходны й
у р о вен ь.
▲ Т ак и м о б р азо м , поведение систем ы характери зуется д ву­
м я наиболее интересны м и особенностям и.
1. В есьма необы чны м и п ред ставл яю тся обнаруж енны е зак о­
ном ерн ости р азви ти я популяции бактерий. И з данны х рис. 8.10
и 8.11 видно, что н аряду с процессам и роста и деления
клеток н аб лю д ается активны й процесс инактивации клеток.
Э т о т процесс д етал ьн о бы л п роан ал и зи рован в гл. 3 (п ро­
гресси рую щ ая неком петентность).
2. И нтересны м п редставляется д и н ам и к а роста Д Н К п л аз­
м иды . О тставан и е процессов репликации п лазм и ды и «разбав202
Р и с . 8 .1 2 . p H - з а в и с и м о с т и р о с т а Е . c o li:
о
и зм енен ия p H ср ед ы при кул ьти ви р о вани и
Е. coli н а ср ед ах с р а зл и ч н ы м н ач ал ь н ы м зн ач е­
нием pH : / ~ 8,0; 2 — 7,5; 3 — 7,0; 4 — 6,5; 5 - 6,0;
б — 5,5; б — за в и с и м о ст ь удел ьн о й с к о р о с ти р о с т а
о т н ач ал ь н о го значения pH . У д е л ьн у ю ск о р о с ть
р о с т а р о п р ед ел я л и и з л и н еар и зац и и экспон ен ­
ц и а л ьн о го участка кри вой р о с т а популяци и в п о лу ­
логари ф м и чески х ко о р д и н а т а х (см. гл. 2)
Рис. 8.13. Кинетика изменения
числа жизнеспособны х клеток
М а (1), Д Н К плазм ид G в рас­
чете на объем суспензии клеток
(2),
активности
(3-лактамазы
Е (3) в экспоненциальной фазе
роста популяции в полулога­
рифмических координатах
ление» п л азм и д в клетке п ред ставляю тся
ф ен ом еном , тр еб у ю щ и м анализа.
весьм а
важ ны м
8.3.1. Кинетическая модель роста микробной популяции
К ак уже отм ечал ось, ан ал и з роста м и кробной популяции
д етал ьн о проведен в гл. 3 [уравнения (3.88)— (3.102)].
С опоставление уравнений (3.97) и (3.102) с эксп ери м ен таль­
ны м и д ан ны м и п оказы вает, что кинетическая м од ел ь описы вает
их д о стато ч н о хорош о (см. рис. 8.11, кривая 2). Тангенс
угла н аклон а левой ветви кривой д ает значение рна6л,
п равой
кон станты скорости инактивации реплицирую щ ей
способности клеток X. И з данны х рис. 8.11 м ож но найти
р на6л = (1 ,5 ± 0 ,1 ) ч - 1 , Х = (0,4 + 0,1) ч -1 и соответствен но из
уравнения (3.100) ц, = 2 ч
П ро вед ем более подробн ы й ан ал и з кинетической м одели
с п о м о щ ью численного и нтегрирован и я на ЭВМ системы
уравнений (3.88)— (3.90), п реоб разовав ее к безразм ерн ы м
перем енны м (8.1). В резул ьтате получим
203
dma
m„s
dt
K J So+ 5
dm,
■—— m„
M.
X
— = — ma (8.13)
dt
Принципиально важ­
ны м
п ар ам етр о м ,
оп ред ел яю щ и м свой ст­
ва системы (8.13), яв­
ляется \ l \ i m (рис. 8.14).
Видно, что с ростом
кон станты
скорости
инактивации реплици­
рую щ ей
способности
ум еньш ается
м акси ­
м ал ьн ая концентрация
делящ ихся
клеток,
Рис. 8.14. Теоретические кривые роста м икроб­
с увеличением м акси ­
ной популяции с инактивацией реплицирующей
м альн о й удельной ско­
способности клеток. Расчеты сделаны путем
рости
эта
величина
численного интегрирования системы уравнений
увеличивается. С л ед о­
(8.13) при K JS 0 = 2; тиаО= 0 ,0 1 ; w o = 0,05; У, = 0,5
и различных значениях А,/цт :
вательн о, н аб лю д ается
1 — 0,0357; 2 — 0,714; 3 — 0,1071; 4 — 0,1428; 5 — 0,2142;
качественное со о тв ет­
т — общее число клеток; т„ — реплицирующие клетки
ствие
теоретических
кривых эксп ери м ен тальн ы м д ан н ы м (см. рис. 8.10, 8.11, 8,14).
• Т аким о б р азо м рассм отренны й рост Е. coli характеризуется
весьм а важ ной особенностью : п ом и м о деления клеток протекает
достаточн о интенсивная потеря ими способности к делению . Э то т
процесс является, п о-види м ом у, оп ред ел яю щ и м в развитии
популяции и ограничивает рост и предельную плотность культуры.
8.3.2. Кинетические закономерности роста числа плазмид
Важной зак о н ом ерн остью представляется «запазды вание»
репликации п лазм и ды по сравнению с репликацией базовой
Д Н К и р о сто м клеток (см. рис. 8.10). Э го приводит к « р азб ав ­
лению » клеток по п лазм и де и к появлению м и н и м ум а на
кинетической кривой изм енения во времени числа п лазм и д
на клетку. А н али з п оказы вает, что наличие м и н и м ум а об ъяс­
няется разли чи ем в скоростях удвоения клеток и плазм иды .
П р о и л л ю стр и р у ем это кинетическим расчетом .
К ривую ро ста популяции клеток М д о стато ч н о надеж но
м о ж н о ап п р о кси м и ровать уравнением
М
е ц'
м„
М0
, + NTSM
204
(8.14)
Рис. 8.15. Линеаризация данных по
кинетике роста популяции ( / ) и Д Н К
плазмиды ( 2 ) в координатах уравнения (8.15):
в случае роста популяции М — концентрация клеток; М0 и M„ — начальная и предельная концентрации клеток; в случае
роста ДНК плазмиды М концентрация
ДНК плазмиды; М0 и М„ — соответственно
начальная и предельная концентрации ДНК
плазмиды
Рис. 8.16. Теоретический расчет по
уравнению (8.17) кинетики изменения
количества плазм ид в одной клетке:
G„/Mo_=50; Mo/Mm= Go/G„ = 0,l; ц=1 ч"1
Hg> 4
7 0,1; 2 0,5; 3 0,7; 4
1,0
' — 1,2: 8 — 1,5; 7 2,0
Э то уравнение логистической кривой, подробн ы й ан али з
и условия п рим еним ости ко то р о го анализируется в гл. 3.
Д ействительн о, лин еари зац ия данны х рис. 8.10 в коорди натах
уравнения, следуем ого из 3.10, т. е.
pf = ln
М /М 0
(8.15)
1 -М /М „ ’
п о казы вает его ад екватн ость эксп ери м ен тальн ы м д ан н ы м (рис.
8.15, п р ям ая 1).
Р ост концентрации п л азм и д такж е ф о р м ал ьн о описы вается
уравнением (8.14), но с другим п оказател ем p G (рис. 8.15,
п р ям ая 2). Т аки м о б р азо м , м ож н о зап и сать
G =
G oe^1
+ ( G 0/ G j e " o * ’ •
(8.16)
где p G — н аб л ю д аем ая удельная скорость роста п лазм и ды ; G 0,
G m— соответствен но н ачальн ая и предельная концентрация
п лазм и д ы в системе.
К оличество п л азм и д в расчете на клетку (G /М ), как следует
из уравнений (8.14) и (8.16), м ож н о п редстави ть функцией
205
Вид функции зависит о т соотнош ения скоростей ро ста п л аз­
м иды и клетки (рис. 8.16). Видно, что при p G > р кривая
им еет м акси м ум , при p G = р число п л азм и д на клетку не
зависит о т времени, при p G < р н аб лю д ается врем енное обед­
нение клеток п лазм и дой . И м енно последний случай реализуется
в эксперименте, п редставленном на рис. 8.10.
Д ля поним ания основны х законом ерн остей поведения си­
стем ы п олезно р ассм отреть несколько частны х случаев урав­
нения (8.17).
1. Начальный участ ок кривой: при t
>0 —- е мГ <sc 1,
Н а н ач ал ьн о м участке отли чается экспоненциальное ум еньш е­
ние (при p G < р) или увеличение (при pG > р) п л азм и д в клетке.
2. Большие времена процесса:
при t
—
>00
— е мг »
мт
1, ^ е м« ' » 1 .
с,т
(8.19)
П ри это м важ но о тм ети ть , что, поскольку посев культуры
о сущ ествляю т используя «стары е» клетки, инкубированны е
в больш и е периоды времени, справедли во равенство
(8.20)
G 0/ M 0 = G m/ M m.
3.
Скорость рост а плазмиды существенно превышает ско­
рость рост а клеток: p G » р. В это м реж им е им еет место
уравнение
(8 .21 )
Ч исло п л азм и д на. клетку увеличивается
кривой с предельны м значением.
( G / M ) , _ 00= G m/ M 0
по
логистической
(8.22)
4.
Скорость рост а плазмиды существенно меньше скорости
рост а клеток: p G « : p . В этих условиях уравнение (8.17)
тр ан сф орм и руется к виду
G / M = ^ e - “4 G 0/M m,
м0
(8.23)
т. е. количество п л азм и д на клетку экспоненциально п адает,
д ости гая м акси м ал ьн ого уровня G 0/M m.
В пределе м и н и м ал ьн ы м значением отнош ения G 0/M m
является единица — состояние систем ы , при к о то р о м на клетку
приходится одна п лазм и да.
▲ Д л я б актериальн ы х систем с п лазм и д о й характерн ы д ва
реж им а работы : 1) ослабленны й кон трол ь, когда G 0/M 0 » l ;
2) строги й , «жесткий» кон трол ь, когда G 0/M 0 = l. П роведенны й
кинетический ан ал и з п озвол яет д ать количественны й критерий
для этих реж им ов:
p G <sc ц
(строгий кон троль);
(iG > ц
(ослабленны й кон троль).
(8 -24)
С опоставлен ие теоретического уравнения (8.17) с эксперимен­
то м п оказы вает, что об суж д аем ая кинетическая м од ел ь и урав­
нение (8.17) д о стато ч н о хорош о оп исы ваю т эксперим ентальны е
данны е (см. рис. 8.10). В д ан н ом случае имеет м есто соотн ош е­
ние удельны х скоростей роста p G ~ ц, pG < ц, т. е. процесс
характери зуется о слаблен н ы м кон тролем . П о оценкам , на клетку
в зави си м ости от ф азы роста п риходится 10 — 80 плазм ид.
8.3.3. Кинетическая модель репликационных процессов
в системе с плазмидой
К ак следует из преды дущ его разд ел а, при росте м и кробной
популяции н аб лю д ается м ен ьш ая скорость р о ста числа п л азм и д
по сравнению с р о сто м числа клеток. С п ом о щ ью р а зр а б о т а н ­
ной кинетической м одели уд алось количественно описать
поведение такой систем ы во всем интервале времен протекания
процесса.
К инетический ан ал и з роста популяции с п лазм и дн ой Д Н К
полезно д етал и зи р о вать, что возм ож н о осущ ествить путем
вычисления удельны х скоростей роста б азовой и плазм и дн ой
Д Н К . Р ассм о тр и м «микроскопический» подход к ан али зу
кинетики роста популяции с п лазм и дой . С уть этого п одхода
закл ю ч ается в вычислении времен репликации базовой Д Н К
и п лазм и ды с п ереходом на «популяционны й» уровень при
исп ользован и и уравнений
М = М 02,/тв;
G = G 02I/To,
где тв — врем я синтеза Д Н К на м атриц е базовой
т е — су м м ар н о е врем я синтеза Д Н К на п лазм и дн ой
О сновы используем ого подхода излож ены в гл. 1.
(8.25)
ДНК;
ДНК.
207
К инетическую схему процесса м ож н о п редстави ть в виде
01В-13
s-
:
с
(8.26)
где S — лим и ти р у ю щ и й субстрат; S ' — м е таб о л и т — п родукт
ли м и ти р у ю щ его субстрата; В — б азо в ая Д Н К ; G — п лазм и д н ая
Д Н К ; Р-— продукт; Е — лим ити рую щ и й ф ерм ент, характери ­
зуем ы й кинетическими п ар ам етр ам и ккт и Ks; а в и а с — кинети­
ческие п ар ам етр ы , характери зую щ и е скорости репликации б а зо ­
вой и п лазм и дн ой Д Н К . П а р ам етр а описы вает поток
п р ом еж уточн ого м е таб о л и та по неспециф ическому пути, не
связан ном у с репликацией Д Н К ; осв и а с м о гу т бы ть
и нтерпретирован ы как кинетические характери сти ки синтеза
отд ел ьн о й связи в базовой и п лазм и дн ой Д Н К соответственно.
И сходя из дан ной кинетической схемы в каж дой клетке
кинетику р о ста цепи Д Н К оп исы ваю т следую щ ие уравнения:
dAB
n f d AG
- ^ - = а вS ; —
= « a GS
л*
/о
(8.27)
У равнения (8.27) оп и сы ваю т скорости п ри роста Д Н К на
базо во й и п лазм и дн ой м атриц е. П а р ам етр ы а в и a G и м ею т
эф ф ективны й характер, зависящ ий о т свойств реп ли кати вного
ф ерм ен тного ком плекса, при это м репликация б азовой Д Г К
п ротекает «одноточечно», в
случае п л азм и д одноврем ен но
м ож ет п р о х о ди ть п м атри ц . Д и н ам и к а изм енения концентрации
п ром еж уточн ого м е таб о л и та в клетке определяется уравнением
^ =
^ - ( a B + « “ o + a ) s '.
(8.28)
П редп о л агается, что лим и ти рую щ и й ф ерм ент Е и белки
репликационного ком плекса си н тези рую тся бы стро, кон ц ен тра­
ция их в клетке п остоян н а и их синтез не определяет динам ику
репликационны х процессов (последнее условие м ож ет в н екото­
ры х случаях не вы п олн яться, это требует д оп ол н и тел ьн ого
р ассм отрени я, хотя м од ел ь м ож ет б ы ть в принципе тр ан сф о р ­
м и р о в ан а и д л я описания этого случая).
В стац и о н ар н о м реж им е по пром еж уточн ом у м етаб оли ту,
ко гд а скорость его синтеза уравн овеш и вается скоростям и
потребления, имеем
S' = ;----- ------------------г.
(Ks + S) (a B+ и a G+ a)
(8.29)
Т аки м о б р азо м , скорость п ри роста цепи Д Н К в репликационн о м процессе будет оп исы ваться уравнениям и
208
d АВ _
a Bk talES
dt
(aB+ nao + a lf ^ + S)’
4 AG
»gGAr,aiES
dt
(8.30)
(8 31)
( aB+ nctc + a) ( Ks+ S )
Н а н ачальн ом этапе
разви тия процесса
при постоянной
S (небольш ая глубина конверсии
суб страта) интегрирование
уравнений (8.30) и (8.31) при н ач альн ом условии t = 0, ДВ = 0,
AG = 0 приводит к функциям
Д В = ____
-J ;
(8.32)
(а в + n a 0 + a ) ( Ks + S)
AG = __ па° к“1- —------- -1.
(ав+л aG+ a)(Ks+S)
(8.33)
Э ти уравнения п о зво л я ю т найти врем я, в течение кото р о го
заканчивается репликация цепи базовой Д Н К (тв) или с у м м ар ­
ной Д Н К п л азм и д (тс ). Если принять, что репликация базовой
Д Н К заканчивается синтезом цепи длиной т, а репликация
сум м арн ой Д Н К п л а зм и д - -си н тезом цепи сум м арн ой длины
/, то при t = т в, АВ = w ; / = t g , AG = / имеем
(8.34)
т
(a B+ « a 0 + a ) ( A ,+ S )
/ =
wot° ^ - ES
T r.
(8.35)
m (a B+ n a G+ a ) ,
(8.36)
(a„ + и a G + a) (/(, -Г S)
С оответствен н о
K. + S
Xr = i
B k t„ E S
I d=
Ks + S
aB
/ ( a B+ n a G + a)
(8.37)
и a,-G
и v связаны с удельны м и скоростям и роста в системе
базо во й Д Н К и Д Н К п лазм и д [см. (8.75)] следую щ им и
соотнош ениям и:
ра = 1п2/тв ; Но —In 2/ xg .
(8.38)
П редп олагается, что скорость роста клетки л и м и ти рован а
репликационны м процессом , соответствен но уравнение скорости
роста определяется ца. Т аки м о б р азо м , уравнение удельной
скорости р о ста, как следует из разви той м одели, будет
и м еть вид
_ ln2fct„ES
a
Ks+ S
_ ln2/c..TES
Ks + S
«в
.
(8.39)
wj(aB+ n a G + a) ’
пча
(8 4 0 )
/( a B+ /ja G + a)
209
У равнения (8.39), (8.40) о тр аж аю т ф ун дам ен тал ьн ое свойство
кинетики ро ста м и кр о о р ган и зм о в — зависимость удельной скоро­
сти рост а от концентрации субстрата (см. гл. 1). П ри н асы щ а­
ю щ их концентрациях суб страта имеем
т
_ Л я ,Е 1 п 2
“ о .-—
—г^ -— ;
а„ + л а в + а
л а с
—
(8.41)
, 0
<8'42)
т и уравнения за д аю т м акси м ал ьн ую скорость роста данной
культуры и м акси м ал ьн ую скорость репликации плазм и д.
Видно, что величины оп ределяю тся эф ф ективностью действия
л и м и ти рую щ его ф ерм ен та, кинетическими характери сти кам и
реп ли кати вного процесса и базовой и п лазм и дн ой Д Н К .
Э
8.4. К У Л Ь Т И В И Р О В А Н И Е Ф О ТО ТРО Ф Н Ы Х М И К Р О О Р Г А Н И ЗМ О В
Ф о тотроф н ы е м и кроорган и зм ы со став л яю т ш ирокий круг
м икробиологических объектов, культиви рован ие которы х соп ря­
жено с реш ением ряд а специфических задач. О собенностью
ро ста ф отоси н тези рую щ и х культур является зави си м ость ско­
рости р о ста от
интенсивности, сп ектрал ьн ого состава света,
ф о р м ы и геом етри и кул ьти ватора. П р о б л ем ы описания роста
ф отосинтезирую щ их м и кр о о р ган и зм о в , вопросы управления их
биосин тезом излож ены в ряде м он ограф и й и сборников
(В. Н. Б елянин, Ф. Я. С идько, А. П. Треш кенш у, 1980; И. А. Терсков, 1982; В. Н. Белянин, 1984).
8.4.1.
Зависимость скорости фотосинтеза
от интенсивности света в плотностатном режиме
О дним из способов вы ращ и вани я популяции ф отоси н тези ­
рую щ их м и кр о о р ган и зм о в в п роточн ом реж им е состои т в том ,
что в систем е автом атически п оддерж ивается п остоянная
оптическая п ло тн ость суспензии на дли н ах волн светособи ­
р аю щ его п игм ен та, в р езул ьтате чего обеспечивается д о стато ч ­
но эфф ективное поглощ ение светового потока. Э то так н азы ­
ваем ы й плотностатный реж им. Закон ом ерн ости , проявляем ы е
при росте культуры в это м реж им е, ан алоги чн ы н аб л ю д аем ы м
д ля систем в отсутствие роста. Р ассм о тр и м особенности
биохимических превращ ений, п роисходящ их при освещ ении
ф отоси н тези рую щ его ап п ар ата м икроскопических водорослей
и ф о то тр о ф н ы х бактерий.
П ервичны й ф отохим ический ак т ф отоси н теза заклю чается
в разделении зар я д о в в реакционном центре. Э то т процесс
представляет собой окисление ф отовозбуж ден ной м олекулы
210
х л о р о ф и лл а с переносом электрон а на первичный акцептор.
М и грац ия электрон ного возбуж дения в светособи раю щ ей ан тен ­
не с эф ф ективностью , бли зкой к 100% , приводит к возбуж дению
м олекулы п игм ен та реакционного центра, за к о то р ы м следует
первичное разделение зар яд о в в реакционны х центрах ф отоси н ­
теза. К вантовы й вы ход этого процесса бли зок к единице.
Н апри м ер, кван то вая эф ф ективность ф отоокисления бактериохл о р о ф и лл а в реакционны х центрах пурпурной бактерии Rhodospirillum rubrum равн а 1,02 + 0,04. К он стан та скорости разд ел е­
ния зар яд о в весьм а вы сока и п ревы ш ает 10й с - 1 . В то же
врем я процесс реком бин ац и и возникш ей пары э л е к т р о н — ды рка
сравн и тельно м едленны й и характеризуется кон стантой ско­
рости ~ 103 с _ 1. Н епреры вны й циклический характер процесса
в стац и о н ар н о м реж им е обеспечивается д остаточ н о бы стры м
каталитическим восстановлением окисленной ф орм ы пигм ента
реакционного центра, осущ ествляем ого с п ом ощ ью таких
переносчиков электрон ов, как цитохром . У пурпурны х и зеле­
ных бактерий при ф отосинтезе в роли первичных д он оров
электрон ов вы ступаю т разли чн ого р од а неорганические соеди­
нения серы, Н 2 или органические соединения. В р асти тел ьн ом
ф отосинтезе, в ф отосинтезе с участием водорослей и ц ианоб ак­
терий таку ю р о л ь вы п олн яет вода.
Д етал ьн о е эксперим ентальное исследование ф отоси н теза
у высш их растений и водорослей п оказало, что м еханизм
переноса электрон ов от воды вклю чает по крайней мере две
фотохим ические стадии, п роходящ ие в разны х ф отосистем ах.
Д ве ф отоси стем ы (ф отосистем а I и ф отоси стем а II) разл и ч а­
ю тся по сп ектрам действия и м еханизм у ф ункционирования.
К аж д ая ф отоси стем а представляет собой структурно о р ган и зо ­
ванную единицу, вклю чаю щ ую м олекулы п игм ен тов антенны ,
реакционны й центр с фотохим ически акти вн ы м пигм ен том
и необходим ы й н аб ор переносчиков электрон а. Р езул ьтатом
поглощ ения энергии света является окисление пигм ен та реак­
ционного центра и перенос электрон а против терм оди н ам и чес­
кого п отен ци ала на первичный акцептор ф отосистем ы II.
П редп олагается, что окисленная ф о р м а п игм ен та в реак­
ционном центре ф отосистем ы II п редставляет собой д остаточ н о
сильны й окислитель, способны й в резул ьтате ряда к атал и ти ­
ческих превращ ений оки слять воду с об р азо в ан и ем м ол ек ул яр­
ного кислорода.
Т р ан сп о р т электрон ов в ф отосистем е I п риводит к о б р азо в а­
нию соединений, о б ладаю щ и х низким и оки сли тельно-восстан о­
вительны м и п отен ци алам и. В электрон н о-тран сп ортн ую цепь
ф отоси стем ы I входит ф ерредокси н-Н А Д Ф -редуктаза. Функция
ее заклю чается в каталитическом восстановлении Н А Д Ф ,
которы й и спользуется на последую щ их тем повы х стади ях для
восстановления С 0 2 д о углеводов.
21)
Т аки м о б р азо м , согласно излож ен н ы м п редставлениям ,
освещ ение ф отоси н тези рую щ его ап п ар ата, л окал и зован н ого
в биологических м ем бран ах растений и водорослей, п риводит
к возникновению непреры вного п отока электронов. Н а пер­
вичных стади ях ф отоси н теза ф отосинтетический ап п ар ат р а ­
б о тает как двукратн ы й «электронны й» насос, осущ ествляю щ ий
перенос электрон ов о т воды против терм оди н ам и ческого
п отенциала на соединения, близкие по электрохим ическом у
потенциалу к во до р о д н о м у электрону. С огласн о Z -схеме ф о­
тоси н теза, на перенос одного электрон а в ф отоси н тези рую щ ем
ап п ар ате затр ачи вается д ва кван та света.
Р ассм о тр и м п ростейш ую кинетическую м одель, вкл ю чаю ­
щ ую основны е стадии описанны х м олекулярн ы х превращ ений
в о б суж д аем ом м еханизм е (С. Д. В арф олом еев, 1985). В первом ,
д о стато ч н о грубом , приближ ении состояние фотосинтетической
единицы м ож но п редстави ть в виде кинетической схемы
(8.43)
С02
(СН20)
где I — интенсивность поглощ ен ного света.
С остояние А , характеризуется сп особн остью п оглощ ать
квант (кванты ) света с первичны м разделени ем зарядов.
И нтенсивность это го процесса м ож ет б ы ть охарактери зован а
константой скорости, частотой реакции к(1), ко то р ая зависит
от интенсивности света. С остояние с разделенн ы м и зар я д ам и
А 2 п ретерпевает тран сф орм ац и ю с переносом электрон ов в
электрон -тран сп ортн ой цепи. С ам ая м едленная л и м и ти рую щ ая
стади я это го процесса м ож ет б ы ть представлена константой
скорости п ервого порядка ке. Н аконец, цикл электрон ного
тр ан сп о р та заверш ается переносом электрон ов на С 0 2 с вос­
становлен и ем этого акцептора до углевода и (или) других
органических вещ еств. В первом приближ ении это т процесс,
зависящ ий от концентрации С 0 2, долж ен б ы ть охарактери зован
лим ити рую щ ей кон стантой скорости второго порядка к СОп.
В зави си м ости от условий проведения процесса и °от
соотнош ения кон стант скоростей отдельны х стади й кинетика
реакции, п р о и зво д и тел ьн ость систем и эф ф ективность п р ео б р а­
зован ия энергии будут оп ределяться той или иной стадией
из представленны х на схеме (8.43).
К оэф ф ициент п р еоб разован и я энергии при ф отосинтезе м о ж ­
но определи ть как отнош ение скорости (п отока) об разован и я
п родукта (п ри роста запасенной химической энергии) к потоку
поглощ енной энергии:
Л = Л г'Пг'Пз'у >
212
(8.44)
где j p — п оток о б р азован и я п родукта. П ри это м необходим о
учесть, что ф отоси н тези рую щ и й ап п ар ат в силу спектральны х
свойств п игм ен тов способен п о гл о щ ать солнечную энергию
не по всему спектру (коэффициент r|j). Н апри м ер, пигм енты ,
участвую щ ие в ф отосинтезе растений, п о гл о щ аю т окол о п оло­
вины солнечной энергии ( r |j~ 0 ,4 5 ) (JI. Н. Б елл, 1980).
Н еобходи м о принять во внимание двухквантовы й характер
переноса электрон а (коэффициент rj2)- У равнение ф отосинтеза
для процессов с участием двух ф отосистем м ож ет бы ть
представлено в виде
2 Н 20
0 2 + 4ё + 4Н +.
(8.45)
К ван товы й расход д л я реакции (8.45), равны й 8,7 ± 2 ,6 , согласу­
ется с условием переноса электрон а по двухквантовой схеме
и характери зует эф ф ективность первичных стади й ф отосинтеза.
У зелены х растений п о роговая дли н а волны , для которой
энергетическая эф ф ективность м акси м ал ьн а, равн а 780 нм.
М акси м альн ое значение р 2 при освещ ении их светом с такой
дли н ой волны , о б ладаю щ ей энергией в расчете на один квант
171 кД ж , по аккум уляции внутренней энергии равн о 41,8% ,
по аккум уляции свободн ой энергии — 34,7% (использованы
значения терм оди н ам и чески х п ар ам етр о в окисления водорода:
АН° = 568,2 Д ж /м о л ь, AG° = —475,2 кД ж /м ол ь). П оскольку энер­
гия о д н о го кван та в пределах фотосинтетически активной
ради ац ии изм еняется в 1,8 р аза, это м ож ет несколько ум ень­
ш ать значение Г|2.
К оэф ф ициент р 3 характери зует о траж ател ьн ую и светорас­
сеиваю щ ую способность и для больш и н ства ф отоси н тези рую ­
щ их систем равен 0,8 — 0,9.
В соответствии с кинетической схемой (8.43) н аб лю д аем ы й
на опы те п оток об разован и я продукта фотосинтетической
реакции в стац и о н арн ом реж им е долж ен б ы ть представлен
уравнением
j = ____________' ,
, + Н 0 + к(1)
к' ^со2С 02
(8.46)
где А 0 — об щ ая концентрация фотосинтетических единиц на
единицу поверхности.
В отличие от обы чны х химических реакций, скорость
ко торы х представляет собой изменение количества м олей
вещ ества в единице о б ъем а за единицу времени, в д ан н ом
случае удобно о п ер и ровать п отоком вещ ества — изменением
количества вещ ества в единицу времени, отнесенны м к единице
поверхности освещ аем ого реактора.
213
У равнение (8.46) соответствует стац и он арн ой скорости н а­
копления п р о ду кта (наприм ер, биом ассы или м ол екул ярн ого
кислорода) без учета процесса п оддерж ан ия ж изнедеятельности
систем ы , которы й связан с р асход ом аккум ули рованн ой в систе­
ме энергии, н априм ер через ды хание. О чевидно, что в первом
приближ ении скорость этого процесса п роп орц и он ал ьн а общ ем у
количеству биом ассы в систем е (числу клеток, числу реакцион­
ных центров и т. п.). К оэф ф ициент п ропорц и он ал ьн ости зад ан
величиной Р, к о то р ая им еет см ы сл кон стан ты скорости первого
п оряд ка и м ож ет о т р аж ать константу лим ити рую щ ей стадии
поглощ ения энергии, нап рим ер л и м и ти рую щ ую кон станту ско­
рости како го -то элем ен тарн ого процесса в м ехан изм е ды хания:
< 847)
К
*со;с о 2
▲ И з уравнения (8.47) следует весьм а важ ное свойство
ф отосинтезирую щ их систем — зависимость потоков образования
продуктов фотосинтеза (кислорода или биомассы) от интенсив­
ности света или от концентрации конечного акцептора электро­
нов ( С 0 2) представляет собой функцию с «насыщением».
Д ействительн о, при высоких концентрациях С 0 2
со^ =
£ щ
А « - р А »'
(848)
при вы соких интенсивностях п о гл о щ аем о го света
j
/ —
= kkci a C°A А 0 - Р А 0.
СОг
00
2
(8.49)
е
П редп олагается, что к (/) увеличивается с р о сто м интенсивности
п о гло щ аем о го систем ой света. С оответствен н о при и сп о л ьзо в а­
нии «насы щ аю щ их» интенсивностей и концентраций С 0 2
продуктивн ость систем ы определяется р азн о стью меж ду скорос­
тям и лим ити рую щ ей стади и электрон ного тр ан сп о р та ( k j
и л и м ити рую щ ей стадии поглощ ения энергии ((3):
i P =(А:е- Э ) А 0.
/—*00
(8.50)
С О —*оо
2
Б ольш ое число эксперим ентальны х р аб о т, вы полненны х по
исследованию зави си м ости продуктивн ости ф отоси н теза от
интенсивности света и концентрации С 0 2, п о дтверж дает этот
вывод.
Д ругое важ ное свойство, которое следует из рассм отренн ой
кинетической м одели , закл ю ч ается в т о м , что коэффициент
214
преобразования энергии при фотосинтезе являет ся функцией
интенсивности поглощ аемого света и должен существенно
уменьшаться при высоких его интенсивностях. Ф изическая
сущ ность это го эфф екта связана с тем , что при высоких
интенсивностях света начин аю т л и м и ти р о в ать «тем новы е»
стади и процесса, н априм ер белковы й электронны й тран сп орт,
при эт о м дальнейш ее увеличение п отока п одво д и м ой энергии
не увеличивает продуктивности ф отосинтеза.
П ри н асы щ аю щ их концентрациях С 0 2 (&С02С 0 2 » А :(/)) в со ­
ответствии с (8.44) и (8.46) коэф ф ициент полезного действия
систем ы будет со о тв етств о вать уравнению
(8.51)
А 0 м ож н о за д а т ь через оптическую п лотн ость, при которой
д о стато ч н о эф ф ективно п оглощ ается свет. П ри единице оп ти ­
ческой плотности А 0 = (« Е х )- 1 , где п — число м олекул х л о р о ­
ф и лла на один реакционны й центр; Ех — его коэффициент
экстинкции.
Ф ункция к (/) в зависим ости от м ехан и зм а первичных
процессов м ож ет и м еть различны й вид. Р ассм отри м простей­
ш ий случай. Э ф ф ективная кон станта скорости поглощ ения
света систем ой, и м ею щ ая р азм ерн ость об р атн о го времени
(констан та скорости первого п орядка), является линейной
функцией интенсивности п о глощ аем ого света
к (/) = а /,
где а — коэф ф ициент пропорц и ональн ости .
В это м случае кон станта скорости поглощ ения определяется
числом м олекул п игм ен та и его коэф ф ициентом экстинкции:
(8.52)
к(1) = пЕх1,
где к(1) им еет р азм ерн ость об р атн о го времени.
И з соотнош ений (8.51) и (8.52) следует, что зави си м ость
эфф ективности п р еоб разован и я энергии о т интенсивности света
определяется отнош ением к е/пЕх:
П1 П2П3
I
а/
Видно, что зави си м ость эффективности п реоб разован и я энергии
ф отосинтезирую щ ей систем ой определяется д вум я п ар ам ет­
рам и: отнош ением k j ос и б езразм ерн ы м отнош ением k j § .
В зави си м ости от р азм ерн ости представленны х величин значе­
ние k j а имеет характер интенсивности, вы раж енной либо
в энергетических, либо в м олекулярны х единицах.
215
Д л я определения порядка
k j u м ож н о п рин ять число м о ­
лекул п игм ен та на реакцион­
ный центр ~ 1 0 2, «средний»
коэф ф ициент
экстинкции
Ex = 10 4 М • см " \
значение
&е ~ 5 0 с -1 (см. гл. 1). П ослед ­
няя величина получена путем
статистического ан ал и за кон­
100 200 т
400 500 600 1, Вг/г?
стан т скорости л и м и ти р у ю ­
Рис. 8.17. Зависимость коэффициента
щих стади й в ф ерм ен тати вн ом
преобразования энергии от интенсив­
катализе.
Если п рин ять значе­
ности поглощ енного света для хло­
реллы:
ние «среднего» кв ан та ф о то ­
н еп реры вн ая
л и н и я — эксп ер и м ен тальн ы е
синтетически активн ой р ад и ­
дан н ы е (В. Н . Б ел ян ин и др ., 1980); пунк­
ации
~ 210 к Д ж /м о л ь ,
то
ти р н а я лин и я — теорети ческий р асч ет по
уравн ен и ю (8.54) с и сп о л ьзо в ан и ем п а р а ­
k j а = 100 В т /м 2.
м е т р о в k ja i= 120 В т /м 2, к е/р = 6
а С опоставлен ие
уравне­
ния (8.54) с эксп ери м ен тальн ы м и д ан н ы м и п оказы вает, что
об суж д аем ая м о д ел ь д о стато ч н о хорош о описы вает эксперим ен­
тал ьн о н аб лю д аем ы е зави си м ости коэф ф ициента п р ео б р азо в а­
ния энергии ф отоси н тези рую щ и м и си стем ам и от интенсивности
п о гло щ аем о го света (рис. 8.17).
А К инетическое м одели ровани е процесса п озвол яет просле­
д и ть влияние разли чн ы х ф акторов на поведение системы
и н ам ети ть пути повы ш ения эф ф ективности п реоб разован и я
энергии. Зави си м ость ЛДЛ 1 Л 2 П 3 ) о т интенсивности света имеет
две характерн ы е точки.
1.
С ущ ествует п о р о го вая интенсивность света / п, ниже
ко то р о й в системе энергия не зап асается [ л Д Л з Л г Л з ) ^ ] :
/ =л
к _ '
п а * ,/р - г
(8.53)
Значение этой п о р оговой интенсивности такж е определяется
то л ьк о п ар ам етр ам и к / а и k j § (рис. 8.18, а).
2.
Зави си м ость коэф ф ициента п реоб разован и я энергии от
интенсивности света представляет собой функцию с м акси м у­
м о м , к о т о р а я зад ается уравнением (рис. 8.18, б)
[ л / ( Л 1Л 2Пз)]макс =
(*«/Р-1
(8.54)
(МЗ + V^e/P)2’
а значение интенсивности, при кото р о й н аб лю д ается экстрем ум ,
им еет вид (рис. 8.18, в)
^макс
216
1+ у^Тр
М » -1 '
(8.55)
И нтересно о тм ети ть, что
м акси м ал ьн о е значение ко ­
эф фициента п рео б р азован и я
энергии определяется т о л ь ­
ко отн ош ен и ем л и м и ти р у ­
ю щ их кон стант скорости пе­
реноса электр о н а в ф отосинтетический
электронтран сп о р тн о й цепи и в си­
стем е и сп ользован и я энер­
гии.
С ро сто м k j Р сущ ест­
венно увеличивается м акси ­
м альн о е значение коэф ф и­
циента
преобразован ия
энергии и п роисходит сдвиг
м акси м у м а в сторон у более
низкой интенсивности света
(рис. 8.19, а). С истем а ад ап ­
тируется к вы соким интен­
си вностям света с увеличе­
нием
п ар ам етр а
k jа
(рис. 8.19, б). Д ля повы ш е­
ния коэф ф ициента п реоб ра­
зован ия энергии при вы со­
кой интенсивности света не­
обх о ди м о увеличение как
к Jet, так и k j $ (рис. 8.19, в).
П ри условии (8.52) у р а­
внение (8.47) п риобретает
вид
а/А п
JP
а/
____ 1__ j..... ..1
макс 20 40б 60
во
100
1
во
100
k'/j,
0,5
1
и»
■
40
1
SO
1
Кц/р
в
\ \ \
.
j ____1____ 1
__
70
W
SO
750
/ 200
/ / 150
/ / т
У /5 0
1
SO
100 k f / j
Рис. 8.18. Зависимость максимальной эф­
фективности (а), интенсивности макси­
мум а (б) и пороговой энергетической
интенсивности света (в) для ф отосинтези­
рующей системы от отнош ения k e/fi при
различных значениях параметра k j а
(цифры на кривых)
—РА0 (8.56)
а/
1+^ + ^с о С 02
ИЛИ
(8.57)
j p + РА о
а/
кс
кс о С 0 2
Зави си м ость переменной 1/(_/р + РА0) от 1 /С 0 2 при различны х
интенсивностях света д олж н а б ы ть п редставлен а серией п ар ал ­
лельны х непересекаю щ ихся п рям ы х. С оответствен н о серией
п араллельны х
прям ы х
д олж н а
оп исы ваться
зави си м ость
\/Q + р А 0) о т 1/7 при различны х концентрациях субстрата.
Зависим ости ти п а (8.56), (8.57) хорош о оп исы ваю т экспери­
м ен тальн ы е данны е (рис. 8.20).
217
Уравнение (8.57) м о ­
жно представить в виде
1
Jp
+7д.
A 0l + jm +
+ /vГCO2Т
ш 2- (8'58)
/A0^'W
где Лых = РА0; j m= k cА 0
характери зует
м акси ­
м альн ую скорость (по­
ток поглощ ения суб­
стр а та или п оток н а­
копления
продукта)
при насы щ аю щ их ин­
тенсивностях
света
и концентрациях С 0 2.
С оответствен н о о тр ез­
ки, отсекаем ы е п рям ы ­
м и (рис. 8.20, а) на оси
орд ин ат, м огут бы ть
описаны уравнением
1
СО
= «4Аl0/+ 7j m- (8' 59)
Д ан ны е
рис. 8.20, а
в коорд и н атах уравне­
ния (8.59) приведены
на рис. 8.20, б. И з них
следует
j m= 1 0 л
С 0 2/(м сут)
или
~ 300 г /(м 2 •сут) сухой
биомассы. Такая производительность долж на иметь место для
данного ш там м а хлореллы при проведении процесса в условиях
насыщ аю щ их интенсивностей света и концентрации С 0 2. Э та
предельно высокая величина, значение которой лим итировано
скоростями электронного транспорта по фотосинтетической цепи.
▲ Важной особенностью ф отоси н теза является уменьш ение
эф ф ективности п р еоб разован и я энергии при высоких интенсив­
ностях света. С олнечная активн ость по фотосинтетически
активной радиации составл яет окол о 400 В т /м 2. И з рис. 8.17
видно, что ф отоси н тез в этих условиях «раб отает» с пониж ен­
ной эф ф ективностью .
Рис. 8.19. Зависимость коэффициента п реобразо­
вания энергии лД гцгцД з) от интенсивности
поглощ аем ого света /:
а
при различных^ значениях k j (5 (ц иф ры на кривы х),
k j a = 120 В т/м ; б — при разл и ч н ы х значениях k j a
(ц иф ры на кривы х), k j Р = 6; в — при разл и ч н ы х зн аче­
ниях kja. (ц иф р ы на кр и вы х ) и k j р (ц иф ры в скобках)
218
Рис. 8.20.
Зависимость
продуктивности
культуры Chlorella sp. К (30° С)
от
концентрации
С 02
в координатах уравнения
(8.57)
(В. Е. Семененко
и др., 1966):
циф ры на п рям ы х с о о т в е т ­
с тву ю т и нтенсивности п о гл о ­
щ а е м о го света (В т /м 2); а за в и с и м о ст ь ( j p + (ЗА о 1)с о 2_ „
о т и нтенсивности света (б)
fjp+pAeY'-10!,M2/ctjm/(/r С02)
(jP+pAo)'l02,
LI-
м^-сцтр С02
б
I
А И з п роведенного ан ал и за вы текаю т следую щ ие основны е
пути повы ш ения эфф ективности ф отоси н теза при высоких
интенсивностях света.
1. Регуляция фотосинтетической антенны, т. е. количества
светособирающих пигментов. Значение интенсивности света,
при которой эф ф ективность п реоб разован и я энергии падает
в д ва р аза, о б р атн о п ропорц и он ал ьн о числу м олекул пигм ента
в реакц ион н ом центре. П о-ви д и м ом у, с п ом ощ ью м етодов
селекции, генетики и генной инж енерии м ож н о со зд ать системы ,
с одной сторон ы , д о статоч н о эф ф ективно п оглощ аю щ и е свет,
с другой — обогащ енны е реакционны м и цен трам и по отн ош е­
нию к пигменту.
2. Увеличение скорости электрон-транспортных процессов.
Э ф ф ективность ф отоси н теза м ож н о п овы сить, если увеличить
ск орость л и м ити рую щ ей стади и электрон ного тр ан сп о р та (кс).
Н а д анны й п ар ам етр систем ы м ож но влиять косвенны м путем.
Н апри м ер, и спользование м и кроорган и зм ов приводит к п овы ­
ш ению тем п ер ату р ы протекани я процесса, что долж н о за счет
увеличения к с зам етн ы м о б р азо м повы сить эфф ективность
п реоб разован и я световой энергии при высоких интенсивностях
света.
П овы ш ение тем пературы в рам ках д и ап азон а, прием лем ого
д л я м и кр о о р ган и зм а, действительно п ри вод и т к увеличению
К П Д ф отоси н теза или п отока продукта.
П ри ан али зе ро ста ф отосинтезирую щ их м и кроорган и зм ов
эксп ери м ен татор
сталкивается
с п роб л ем ой
определения
энергетической доли света, поглощ ен ного такой системой.
Р азны е ф отоси н тези рую щ и е объекты и м ею т свой характерны й
спектр поглощ ения. К р о м е того, л ю б ой источник света
им еет специфическое распределение энергии излучения по
д л и н ам волн. Д ля определения интенсивности света, по­
гл о щ аем о го систем ой, в качестве п ервого
приближ ения
219
fi.Afs
м ож н о рек ом ен д овать сле­
д ую щ ую
п роцедуру
(Л. Н. Белл, 1980). С н и м а­
ю тся спектр
поглощ ения
исследуем ой культуры А (>.)
и отн оси тельны й (н о р м и ­
рован ны й ) спектр испуска­
ния источника света /* Ш .
В это м случае интенси­
вность п оглощ енной эне­
ргии м ож н о вы числить по
ф орм уле
Рис. 8.21. К определению энергетической
интенсивности светового потока погло­
щ аемого культурой цианобактерий A. nidulans [см. (8.60)]
}A(X)f,(X)dX
/= /„ ~2
> (8.60)
jf'.(X)dX
г
*'
где / 0 — су м м ар н ая интенсивность по всему спектру.
Н а рис. 8.21 приведены найденны е из эксперим ентальны х
данны х значения функций f's (кривая 1) и А ( /( ) (кривая 2)
д л я культуры A. nidulans. Численное и нтегрирование этих
функций д ает значения интенсивности поглощ енной энергии,
приведенны е в качестве перем енной на рис. 8.22. О три ц ательны е
jp-IO1*, мо/?б 0г/(мгс)
6
г
1
о
500
1000
-1
-2
-3
Рис. 8.22. Зависимости потоков обр а­
зования кислорода
цианобактерией
Anacystis nidulans от интенсивности
поглощ аем ого света при различных
температурах (°С; цифры на кривых)
220
Рис. 8.23. Зависимости потока пр о­
дукта от интенсивности поглощ ен­
ного света для A. nidulans в коор­
динатах уравнения (8.57) при раз­
личных температурах (°С; цифры
на прямых)
значения п отоков о б ­
р азо в ан и я
п р о д у к та
л еж ат в о б ласти ин­
тен си вностей
света,
для ко торы х скорость
ф отоси н теза ниже ско­
рости ды хания. Э кспе­
ри м ен тал ьн ы е данны е
рис. 8.21
д о стато ч н о
хорош о лин еари зую тся
в коо р д и н атах уравне­
ния (8.57) (рис. 8.23).
• Коэффициент пре­
о б р азо в ан и я
энергии
(функции
интенсив­ Рис. 8.24. Коэффициент преобразования свето­
ности
п о гло щ ен н о го
вой энергии как функция интенсивности погло­
света), как следует из щ аемого света при различных температурах
и злож енной вы ш е те­ (°С; цифры на кривых) (а); начальный участок
кривых 8 .2 6 ,а (б)
ории, и м еет экстрем альн ы и характер, что прекрасно п одтверж дается на практике
(рис. 8.24). Б олее вы соким коэф ф ициентом полезного действия
при высоких интенсивностях света ф отосинтетическая систем а
о б л ад ает при повы ш енной тем пературе.
В таб л . 8.1 приведены характеристики культуры A. nidulans,
рассчитанны е на основе приведенных эксперим ентальны х зави ­
симостей.
Таблица 8.1
Характеристики продуктивности культуры A . n idulans
при различных температурах
Темпера­
тура, °С
21
32
42
w i o 4,
моль 0 2/(м 2 с)V моль 0 2/(м -с)
2,9
5,9
10,0
1,0
1,5
3,1
Чмакс»
%
Сакс»,
Вт/м
Ь 2
Вт/м
0,6
0,55
0,55
15
50
70
10
15
25
8.4.2. Периодическое культивирование
фотосинтезирующих микроорганизмов
Рост чистых культур ф ототроф н ы х м и кроорган и зм ов в периг одическом реж им е описы вается кинетическими кривы м и, коI торы е по своем у общ ем у виду близки к кривы м роста
I хем отроф ны х м и кр о о р ган и зм ов. С пецифика роста ф ототроф ов
I заклю чается в то м , что основной энергетический ф актор — ин* тенсивность п о глощ аем ой световой энергии
является перемен! ной величиной, изменение во времени которой задается
221
/
изменением оптической плотности. П о м ере разви тия культуры
возр астает степень поглощ ения световой энергии, на конечном
этапе р азви ти я процесса оптическая п лотн ость д ости гает такой
величины, при которой полное поглощ ение света происходит
в то н ко м слое на поверхности сосуда кул ьти ватора; в резуль­
тате основной объем систем ы лиш ается ли м и ти рую щ его ис­
точни ка энергии, вследствие чего р о ст прекращ ается.
У равнение скорости роста, по ан алоги и с уравнением (8.10),
м ож ет б ы ть п редставлено в виде (В. Н. Белянин и др., 1980)
(8.61)
где (im— м акси м ал ьн ая скорость роста; К {— эф ф ективная конс­
тан та; /
интенсивность п оглощ аем ой световой энергии; ц0 —
скорость расхода биом ассы за счет процессов м етаб о л и зм а
(скорость «тем нового» ды хания клеток). П ри этом н еобходи м о
им еть в виду, что в общ ем случае / является функцией времени.
В м он ограф и и В. Н. Б елянина с со а в то р а м и (1980) р ас см о т­
рено реш ение уравнения кинетики ро ста ф отосинтезирую щ ей
популяции с учетом линейного приближ ения, сп раведли вого
при небольш их оптических плотностях систем ы . П олученное
уравнение р о ста им еет вид
(8.62)
1|
где
м О
^0
(8.63)
/ 0 — интенсивность энергии п ад аю щ его светового потока.
У равнение (8.62) п редставляет собой уравнение логистической
кривой, свойства к о то р о го д етал ьн о рассм отрены в гл. 3. В ряде
случаев логистические кривы е д о стато ч н о хорош о оп исы ваю т
дин ам ику р азви тия ф отосинтезирую щ ей популяции клеток.
В общ ем виде ан али з кинетики роста ф отосинтезирую щ ей
культуры при периодическом культивировании требует и нтегри­
рован ия уравнения скорости с и сп ользован и ем Э В М . Р ассм о т­
рим свойства м одели роста, излож енной в р аб оте Ф рёлиха
с сотр. (1984). В процессе роста популяции ф отосинтезирую щ их
м и кр о о р ган и зм о в перем енны м и величинам и являю тся концент­
рация п игм ен та СИ, общ ее количество биом ассы М (, кон ц ен тра­
ция ли м и ти р у ю щ его суб страта S, концентрация углевода Н,
концентрация резервн ого вещ ества R, н акап л и ваем ого клеткам и
в качестве п и тател ьн ого и энергетического резервн ого к о м п о ­
нента (наприм ер, поли м ера углеводн ого характера или другого
п родукта). В качестве перем енной м ож н о такж е вы дели ть
222
«активную » биом ассу М , п ред ставл яю щ ую собой общ ую
биом ассу за вы четом б иом ассы хл ороф и лла, углевода, резерв­
н ого вещ ества R.
С ко р о сть р о ста популяции кон троли руется по крайней мере
тр ем я ф акторам и : 1) концентрацией ли м и ти рую щ его субстрата
S (для фототроф ны х м икроорганизм ов это м ож ет бы ть, например,
С 0 2 или фосфат); 2) интенсивностью поглощ аем ого системой света
/; 3) относительной внутриклеточной концентрацией углевода Н /М .
Н акопление л аб и л ьн о го углевода Н зависит в конечном
и тоге от поглощ ен ного света; образую щ и й ся углевод расходу­
ется в ряде п ар ал л ел ьн о п ротекаю щ и х процессов, вклю чаю щ их
синтез хлороф и лла C h, биом ассы М , резервного вещ ества R,
а такж е п р одуктов Р тем п о в о го ды хания:
сь
s—
(8. 64)
р
~ = 2 (7) C h —OjDc —<*2”м -
l,R -
^оМ ,
( 8 -6 5 )
где Q (I ) — п ар ам етр , характери зую щ и й скорость ф отосинтетической реакции (п редп олагается, что ск орость об разован и я
углевода — первичного стаби л и зи рован н ого п родукта ф отоси н ­
теза —линейно зависит от концентрации хлороф и лла в системе);
r Ch— скорость синтеза хлороф и лла; гм — скорость синтеза б и о­
массы ; vR— ск орость синтеза резервного вещ ества; р0 — удельная
скорость использован и я углевода в энергетическом обеспечении;
а 1, а 2 — соответствую щ ие стехиом етрические коэффициенты .
П а р ам етр Q (I), характери зую щ и й кван товую эф ф ективность
о б разо ван и я Н, зависит о т интенсивности п оглощ аем ого
света, геом етри и реакционного сосуда, эффекта ингибирования
ф отосинтетического процесса п родуктом реакции Н. Величина
Q (/) с учетом п ростран ствен н ого ф ак то р а м ож ет б ы ть
представлен а в виде
V
(8.66)
(8.67)
где Q m— м акси м ал ьн ая скорость ф отосинтетической реакции;
V— объем системы ; K t — кон станта ингибирования ф отосинте223
тического процесса углеводом ; К и — кон стан та ф отои н ги б и ро­
вания. У равнение (8.67) вклю чает член / 2К „, характеризую щ ий
ф отои н ги бировани е процесса вы сокими интенсивностям и света,
т. е. оно аналоги чн о уравнению скорости с ингибированием
и зб ы тк о м субстрата.
О стальн ы е члены, входящ ие в уравнение (8.65) как функции
основны х переменны х, м огут б ы ть записаны в виде
(8 .68)
где p cmh — м акси м ал ьн ая скорость синтеза х л ороф и лл а на еди­
ницу биом ассы ; KCh — кон стан та инги бирован и я синтеза б о л ь ­
ш им и коли чествам и углевода. В уравнении (8.68) учиты ваю тся
эксп ери м ен тальн о н аб лю д аем ы е эф ф екты инги бирован и я син­
теза х л о р о ф и лл а вы соким и кон ц ен трац иям и углевода:
(8.69)
(8.70)
где
м акси м ал ьн ая удельная скорость синтеза биом ассы ;
Лф — су б стр атн ая кон станта по эндогенном у углеводу; Ks — суб­
стр атн ая кон станта по л и м и ти рую щ ем у субстрату. П р ед п о л а­
гается, что р о ст биом ассы является по крайней мере двухсуб­
стр атн ы м процессом , скорость кото р о го определяется концент­
рацией как внутри клеточн ого углевода, так и л и м и ти рую щ его
су б стр ата (это уравнение, п о-вид и м ом у, не совсем адекватно
о тр аж ает р еальн о сть, поскольку Н и S, вероятн о, н ем ул ьти п л и ­
цирую щ ие субстраты , кон верти руем ы е двум я разли чн ы м и ф ер­
м ентн ы м и систем ам и, см. гл. 2; однако эта н еточность не
вносит сущ ественных искаж ений в излож енное ниже):
н/м
^RS+ Н/М
(8.71)
где p RS— м акси м ал ьн ая скорое
,
.
о вещ ества
R; p RD -м а к с и м а л ь н а я скорость его деградации; KRS— суб­
стр атн ая кон станта по внутри клеточн ом у углеводу. П р ед п о л а­
гается, что скорость синтеза R м ож ет и нги бироваться продук­
то м , ск орость д еградац и и — углеводом Н. С оответствую щ и е
кон станты ингибирования задан ы KRI и # RD.
С истем а уравнений (8.63) — (8.71) основана на известных
особенностях биохим ии и ф и зиологии ф ототроф н ы х организ224
О
20
00
ВО во 100 120
0
20 00 60 80 100 120
t,0
i,0
Рис. 8.25. Данные численного интегрирования системы уравнений (8 .6 5 )— (8.73)
в полулогарифмических координатах (В. Т. Frohlich et al., 1983):
при S0 = 0,01 г/л гл у б и н а к у л ь т и в а т о р а 20 см . Д ан н ы е рис. 8.27, а п олуч ены при
10 = 115,4 В т /м 2; рис. 8 .2 7 ,6 — 23,08 В т /м 2
м ов. П а р ам етр ы pJJ, К н, Ks, Q m, а 1; ос2, р 0, p£h, p RD, p RS
и другие оценены из разли чн ы х эксп ери м ен тальн ы х данны х.
В качестве м о д ел ьн ого и л л ю стр ати вн о го расчета в р аб оте
ан ал и зи р у ю тся зак о н о м ерн ости ро ста м и к р о о р ган и зм а в п лос­
ком ф отосинтетическом реакторе с перем еш иванием , глубина
к о то р о го зад ан а перем енной z. В это м случае интенсивность
п о гл о щ аем о го света, входящ ая в уравнения (8.66), (8.67), м ож ет
б ы ть зад ан а в соответствии с зак о н о м Л а м б е р т а — Бера
простей ш и м уравнением
/ = / 0е - “ ,
(8.72)
где е — эф ф ективны й коэф ф ициент поглощ ен ия свето со б и р аю ­
щ им и п и гм ен там и клеток. К оэф ф ициент п оглощ ен ия е линейно
связан с концентрацией в систем е светособи раю щ его п игм ен та
(хлороф илла):
e = k ChC h.
(8.73)
Реш ение системы уравнеий (8.65) — (8.73)
на Э В М д ает
в озм о ж н о сть п ред стави ть разви тие во врем ени всех основны х
переменных
(рис.8.25).
П ри высоких интенсивностях
света
(рис. 8.25, а) культура растет экспоненциально довольно больш ой
период времени (85 ч), затем на ограниченном временном диапа­
8
З а к . 544
225
зоне рост прекращ ается за счет исчерпания субстрата S (например,
фосфата). В течение всего периода экспоненциального роста
состав биом ассы постоянен (прямые участки кривых рис. 8.24, а
параллельны ). В процессе «старения» популяции при переходе
в стационарную фазу долж ен достаточно бы стро изменяться
состав би о м ассы — возм ож но резкое увеличение относительного
содержания лабильного углевода и резервного вещества R.
В случае низких интенсивностей света (рис. 8 .2 5 ,6) зам етн о
ум еньш ается скорость роста, состав биом ассы и зм еняется во
времени, при это м отклон ен и я о т эксп он ен ци ального роста
н аб лю д аю тся сущ ественно раньш е. П о ф орм е кинетическая
кри вая р о ста п риближ ается к логической кривой.
• И так, состав биом ассы , полученной при разн ой плотности
световы х п отоков, д о стато ч н о сильно различается: при низких
интенсивностях света кон ц ен трац ия х л ороф и лл а сущ ественно
выш е, а кон ц ен трац ия углевода и резервн ого вещ ества R су­
щ ественно ниже, чем д л я м и к р о о р ган и зм а, кул ьти ви рован н ого
при высоких п лотн остях энергии света.
8.4.3. Фотосинтезирующая культура в режиме хемостата
Р ассм о тр и м закон ом ерн ости р о ста ф о то тр о ф н о го о р ган и зм а
при неп реры вн ом культиви рован ии в реж им е хем остата. В п р о ­
точной систем е в стац и о н ар н о м реж им е скорости изм енения
ком пон ен тов процесса будут зад ан ы следую щ и м и уравнениям и
[см. б азовы е уравнения (8.65) — (8.73)]:
Ш = Q (/) C h —a t r Ch - a 2vm- vR- ц0М - D H = 0;
dt
(8.74)
f = D (S o - S ) - I p H = 0;
(8.75)
Ch f
4(C h /M )
~dt
^
(
1
v Л,
^ C h _ n.
h /m \
"m
’
/0 , ^
(8-76)
H /M \ ^
~dt
(8-7«)
M , = M + C h i R + H.
(8.79)
С вето зави си м о й стадией процесса является синтез угл ерод а
Н , при это м ф ункцию Q (/) в ы р ази м в виде уравнения (8.67). К ак
и в случае х ем о тр о ф н ой культуры , популяция клеток «вы м ы ва226
Рис. 8.26. Расчетные дан­
ные
зависимости
кон­
центраций активной би о­
массы от относительной
скорости
разбавления
в
проточной
культуре
при различных интенсив­
ностях падаю щ его света
(а) и различной глубине
культивации
(б)
(В. Т. Frohlich
et
al.,
1983):
и нтенсивности
п ад аю щ его
све та и гл уб и н а ку л ьти ваци и
д а н ы ц и ф р ам и на 1ф и в ы х
с о о тве тс тве н н о в В т /м и см;
S0 = 0 ,0 1 г/л ;
/ . = 20 см
(о);
/ 0 = 115,4 В т /м 2 (б)
ется» при приближ ении скорости разб авл ен и я к
(рис. 8.26).
К онц ен трац и я «активной» биом ассы сущ ественно ум еньш ается
при больш их скоростях разб авл ен и я, с ум еньш ением интенсив­
ности п ад аю щ его света и с увеличением глубины культивации.
В отличие от концентрации биом ассы эта зави си м ость
концентрации хл о р о ф и лл а им еет м акси м ум при отн оси тельно
невысоких скоростях разб авлен и я, при это м значение м акси ­
м у м а растет с увеличением глубины культивации (рис. 8.27).
П ри н ци п иальн о важ ной характери сти кой при ф ункциониро­
вании непреры вной систем ы вы ращ и вани я м и кровод орослей
и ф о тотроф н ы х бактерий является продуктивн ость системы
по биом ассе, хлороф иллу, резервн ом у веществу. П род укти в­
н ость систем ы (или п оток вещ ества) в случае ф о тотроф ов
лучш е всего и зм ер ять в количестве вещ ества, п олучаем ого
с единицы освещ аем ой поверхности в единицу времени,
н ап рим ер г/(ч м 2). Д л я п роточн о-п лоского ф ерм ентера продук­
ти вн о сть системы по активн ой биом ассе при низких скоростях
разб авл ен и я линейно увеличивается с р о сто м скорости р а з­
бавления и глубины культивации (рис. 8.28, а). П ри о тн о ­
сительно высоких скоростях разб авл ен и я продуктивн ость
по биом ассе д о сти гает м акси м ал ьн о го значения, ко то р о е очень
227
Ch,г/л
Рис. 8.27. Расчетные данные зависимости концентрации хлорофилла от о т ­
носительной скорости разбавления и глубины культивации (цифры на кривых)
(В. Т. Frohlich et al„ 1983):
So=0,001 г/л; /0= 115,4 Вт/м2
55,
50.
0,5
§*
I *
Оо ;
в
в , <3- ¥
i
g
!0
У
1
10"
&■ 0,1 -
1
£
~?5‘
ь
1■
Рис. 8.28. Расчетные данные зависимости продуктивности системы по биом ассе
(а) и резервному веществу (б) от относительной скорости разбавления
и глубины культивации (цифры на кривых, см) (В. Т. Frohlich et al
1983V
S„ = 0,1 г/л; / 0= 115,4 Вт/м2
I часто поддерж ивается на п остоян н ом уровне в б ольш ом
интервале глубин и скоростей разбавлен и я.
С оверш енно д р у гая карти н а н аб лю д ается для продуктив) ности
по резервн ом у
вещ еству (продукту ф ерм ентации)
) (рис. 8.28, б). П ро д у кти вн ость системы низка при высоких
£ скоростях разб авл ен и я и м алы х глубинах ф ерм ентера. М аксиI м ум продуктивности системы по R приходится на д и апазон
I (0,1 — 0,2) D/p^J, при это м он такж е сильно зави си т от глубины
I культивации. П ри небольш их глубинах (1 — 20 см ) эта зависи­
м о сть практически линейна.
• Ч исленны й р о ст кинетики р о ста ф ото тр о ф н о го м и кроорI ган и зм а в реж им е периодического и непреры вного культивиро! вания д ает в о зм о ж н о сть объясни ть м н оги е аспекты его физио| логического поведения, а такж е п озвол яет д ать полезны е
реком ендации по о п тим изаци и его ро ста и м етаб о л и зм а.
8.5. С И М Б И О Т И Ч Е С К И Е А С С О Ц И А Ц И И
М И К Р О О Р Г А Н И ЗМ О В
И нтересны е и слож ны е закон ом ерн ости характери зую т рост
i м и кр о о р ган и зм о в в см еш анны х культурах и м и кробн ы х ассоf циациях. Э та о б ласть в последнее врем я привлекает б ольш ое
( вним ание, поскольку природны е популяции м и кроорган и зм ов
в п о давл яю щ ем больш и н стве случаев п ред ставл яю т собой
; симбиотические ассоциации, см еш анны е культуры или культуры
м и кр о о р ган и зм о в , находящ ихся в конкурентной борьбе за
какой -либо ф актор, огран и чи ваю щ и й рост популяций. Решение
I р яд а вопросов п ром ы ш лен ной м и кроб и ологи и такж е связано
I с изучением и и сп ользован и ем не м он окультур, а ассоциаций
| м и кр о о р ган и зм о в.
О бщ ие вопросы ан ал и за ро ста популяций в см еш анны х
культурах рассм отрены в м он ограф и и Н. С. П ечуркина (1978),
I где основное вним ание об ращ ено на классиф икацию взаим одейI ствий популяций и описание их ро ста в п роточны х системах.
( Изучены законом ерн ости роста культур, конкурирую щ их за
I один субстрат, типы взаим одействий м и кробн ы х культур друг
I с дру го м , р азви тие смеси популяций на слож ны х субстратах.
1 В ы деляю т
по крайней мере ш есть типов взаим одействия
I м и кр о о р ган и зм о в — от си м б и оза м утали сти ческого типа, при
[ к о то р о м рост каж дой из культур стим улируется р о сто м другой
| культуры , и до стр о го ан тагонистического взаим одействия,
I при ко то р о м разви тие одной культуры блокирует развитие
f другой. В м о н о гр аф и и расстотрен ы такж е законом ерн ости
I разви ти я популяций разн ы х трофических уровней, вклю чая
I «классическую »
систем у
«хищ ник — ж ертва»
(см.
такж е
В. В ольтерра, 1931) и систему «п арази т — хозяин».
Н иж е с и сп ользован и ем ЭВ М ан али зи рую тся законом ерI ности
р азви ти я
сим биотических
ассоциаций
в
реж им е
8в
З а к . 544
229
периодического культиви рован ия. С им биотические ассоциации,
п о-види м ом у, п р ед ставл яю т собой наиболее распространенны й
и «отш лиф ованны й» эволю цией тип взаи м од ей ствия м икробны х
популяций. Н аиболее классическим п ри м ером в этом плане
м ож ет служ ить м и кроб н ая ассоциация о б разован и я м етана
ан аэр о б н ы м и бактериям и . М етаногенез углевода (Н ) в уп ро­
щ енном варианте м ож но п редстави ть в виде двухстадийного
процесса:
ацетогены
Н
___
метаногены
> С Н 3С О О Н
♦ - С Н 4+ С 0 2
(8.80)
Развитие второй популяции н евозм ож н о в отсутствие первой
стади и процесса, поскольку ац етат является одни м из л и м и ти ­
рую щ их суб стратов д ля м етаногенны х бактерий. В то же
врем я ацетогенны е м и кр о о р ган и зм ы и нгибирую тся ац етато м
за счет изм енения pH среды . Т ак и м о б р азо м , развитие
м етаногенной популяции, в свою очередь, п олож и тел ьн о влияет
на рост бактерий, осущ ествляю щ их первую стади ю процесса.
Р ассм о тр и м закон ом ерн ости сим биотических процессов на
прим ере некоторы х м одельны х систем.
8.5.1. Ассоциация двух микроорганизмов
П редстави м себе м и кробн ую ассоциацию , состоящ ую из
двух м и кр о о р ган и зм о в M j и М 2, исп ользую щ ую для своего
р о ста некий су б стр ат S ,, причем рост о р ган и зм а М , происходит
с п отреблением суб страта S, и о б р азо в ан и ем п родукта S2.
П р о д у кт S2, в свою очередь, служ ит су б стратом д ля роста
о р ган и зм а М 2. В резул ьтате ро ста о р ган и зм а М 2 об разуется
конечный продукт Р. О бсуж даем ы й процесс м о ж н о ’ представить
в виде систем ы диф ф еренциальны х уравнений:
t / M j _ fx1S 1M j
~dt
(8.81)
£ ,+ 5 , ’
J M 2 __ n 2S 2M
И Г ~ K2 + S 2'
dSt _
~df~
</S2 _
1
~di
dP _
h
I
1
^
lijSjM ,.
K{+ S
1
Ki+ s, ~ T tl
,’
n 2S 2M 2
k 2+ s 2 ’
n 2S 2M ,
7+ s?
где К j и K 2 — кон станты срод ства суб стратов S, и S2
к м и к р о о р ган и зм ам M t и М 2 соответственно; Ц! и р 2 — м акси ­
м альн ы е скорости ро ста м и к р о о р ган и зм о в М х и М 2; Ys
230
и YPi— экономические коэф ф ициенты , п озволяю щ и е вы раж ать
концентрации S ,, S2 и М 1; а
и YPi — концентрации S 2,
Р и М 2 в одних единицах.
Д л я ан ал и за кинетики процесса полезно систему уравнений
привести к б езр азм ер н ы м отн оси тел ьн ы м переменны м:
5Х_
S i
; s2- — ; р ~ —
а 1,0
^ 1 ,0
а
(8.82)
М,
т =
■
т х=т.
1 Г -; w 2 = :
M 2 i. - N
2i0’
где М 1>х, М 2>00, Р * — предельное количество биом ассы М ,,
М 2 и продукта Р, образую щ и хся при бесконечно б ольш ом
времени процесса.
П ерем енны е (8.82) п о зво л я ю т ан ал и зи р о вать кинетику п ро­
цесса в б езразм ерн ы х величинах, при этом значения s v s 2,
1
А
р л еж ат в диап азон е от 0 до I, значения т , — от
Л\ о
М |. « - \ о
О П О П Т Ш
1+т т —N [ . О
з„ Пначения
т 2 — АотТ ■■■^2,0
■
д о 11 +I - ^2,0
.
^1.оо~^1.0
^2,00 ^2,0
^2.00 ^2.0
В ремя в указанны х б езразм ерн ы х перем енны х изм еряется
отр езк о м , на протяж ении к о то р о го в реж им е м акси м ал ьн ой
скорости концентрация биом ассы M t увеличивается в е раз.
С истем а диф ф еренциальны х уравнений (8.81) в безразм ерн ы х
коорд и н атах вы гляди т следую щ и м о б р азо м (для упрощ ения
ан ал и за все эконом ические коэф ф ициенты приняты равн ы м и
единице):
Д°
dmt _
dx
s 1m 1
_ dm2 _
K J S u0+ s l ’
*2
dx
dx
.
K 2/ S li0 + i 2 ’
= M
K 2/Si_0 + s 2 '
&i_
dx
s \m \
KJSyg+s^
d p _ \i2/(\ils 2m 2)
dx
(8.83)
K 2/ S l 0 + s 2 '
И з этих уравнений видно, что процессом у п р ав л яю т и оп ределя­
ю т вид кинетических кривы х три б езразм ерн ы х парам етра:
K J S U0, K 2/S l 0 и Р г/ц ,. П ервы е два п ар ам етр а, характери зу­
ю щ ие отнош ения кон стант срод ства м и кр о о р ган и зм а с л и м и ­
ти рую щ и м и су б стр атам и к н ач альн ы м кон ц ен трац иям л и м и ­
тирую щ их су б стратов, о к азы в аю т сущ ественное влияние на
ход процесса. О ни и зм ен яю т как ф орм у кинетической кривой,
так и время, в течение кото р о го конвертируется 50% л и м и ти ­
рую щ его су б стр ата (см. гл. 8, § 1).
Н а влиянии третьего п ар ам етр а — отнош ения м акси м альн ы х
скоростей роста м и кр о о р ган и зм о в
и М 2 -о с т а н о в и м с я
более подробн о (рис. 8.29). И з рисунка видно, что н аб лю д аю тся
закон о м ер н о е падение концентрации исходного суб страта S l5
рост культур М , и М 2, накопление конечного продукта
Р и характерны й кинетический м акси м ум д ля п ром еж уточного
8в*
231
продукта S2. Н аличие этого
м акси м ум а при росте м и к­
робны х ассоциаций является
весьм а строги м сви детель­
ством в п ользу того, что
д л я исследуем ой культуры
характерен симбиотический
тип взаи м одей ствий м и к р о ­
о р ган и зм ов (рис. 8.29, а).
П ри уменьш ении м акси ­
м альн ой
скорости
роста
второго
м и кроорган и зм а
(увеличение
отнош ения
Н1 /И 2 ) происходит отн оси ­
тельное зам едление роста
М 2 и соответствен но п овы ­
ш ение м акси м ум а на кине­
тической кривой д л я S2
(рис. 8.29, б). Весь процесс
распадается практически на
две
независим ы е стадии:
сн ачала бы стры й р о ст М 2
и бы строе накопление S2,
а затем м едленное расхо­
д овани е S2 и такой же м ед ­
ленны й рост М 2 и Р. П р о ­
цесс об р азо в ан и я продукта
л и м и ти рует низкая скорость
второй стадии.
П ри отн оси тел ьн ом уве­
Рис. 8.29. Численное интегрирование сис­
личении
м акси м ал ьн ой
темы (8.82) при щ /ц ,, равном 1 (а); 2,5
удельной
скорости
роста
(б); 0,2 (в):
второго
м и кр о о р ган и зм а
/$ 1 ,о = K2IS1 .о~0,5; Wjio==W2 iO= 0,l
н аб лю д ается
зам едление
р асх о да и ро ста М 15 понижение м акси м ум а по S2 (рис. 8.29, в).
П ри ц, « ; р 2 су б стр ат S2 практически не детектируется в системе
и н аб лю д ается слияние кривы х роста м и кр о о р ган и зм о в М ,
и М 2, при это м в то р ая стади я процесса станови тся слаб о
зам етн о й , весь процесс лим ити руется скоростью первой стадии.
В таких ситуациях часто оказы вается н евозм ож н ы м определение
кинетических п ар ам етр о в второй стадии.
• Т ак и м о б р азо м , при изучении симбиотических ассоциаций,
состоящ их из двух м и кр о о р ган и зм о в , в зависим ости от со о тн о ­
ш ения м акси м ал ьн ы х удельны х скоростей ро ста возм ож н ы
три предельны х случая протекания процесса.
1.
Ц х ~ ц 2 — р о ст обоих м и кр о о р ган и зм о в происходи т п осле­
д о в а т е л ь н о — обе стадии процесса п роявл яю тся д остаточ н о
232
четко, что дает во зм ож н ость оп редели ть все кинетические
п ар ам етр ы системы .
2. р 1» р 2 — процесс распадается как бы на две независим ы е
стадии: б ы строе р азви тие м и кр о о р ган и зм а М 3 и медленное
и д ли тельн о е разви тие м и кр о о р ган и зм а М 2, которы й и л и м и ти ­
рует о б разован ие конечного продукта Р. Здесь такж е возм ож н о
определить все кинетические характеристики процесса.
3. р , « ; р 2 — процесс как бы сж им ается в одну стади ю ,
кривы е ро ста м и кр о о рган и зм ов М , и М 2 практически совп а­
д аю т , почти отсутствует пром еж уточны й продукт S2, скорость
о б разо ван и я Р лим ити руется скоростью первой стадии. М ож но
определить то л ьк о кинетические характеристики м едленной
первой стадии. К инетика накопления п родукта, н есм отря на
то что он об разуется в р езул ьтате ро ста в то р о го м и к р о о р ­
ган и зм а, определяется кинетикой ро ста первой культуры .
8.5.2. Ассоциация трех микроорганизмов
П редстави м себе сим биотическую ассоциацию , вклю чаю щ ую
три м и кро о р ган и зм а. П ри это м троф ические связи меж ду
этим и о р ган и зм ам и следую щ ие: исходны й субстрат Sj является
суб стр ато м д л я о р ган и зм а М ,, в резул ьтате роста которого
об разуется вещ ество S2, являю щ ееся исходны м суб стратом
д л я ор ган и зм а М 2. Растущ ий орган и зм М 2 вы деляет вещ ество
S 3, ко торое п отребляется при росте орган и зм а М 3, и в резуль­
тате об разуется конечный п родукт Р. Э ти процессы м ож но
оп исать систем ой диф ф еренциальны х уравнений:
</Mt
dt
p 1S 1M l i d M 2 _ Ц25 2М 2 .
K j+S ^
dt
К2
1
d M 3 _йз^зМ 3 . d S 3
dt
dS2
dt
dS3
dt
K 3+ S3 ’
dt
1 H ^M ,
YPl ^ + S >
1
S2
r tl A , + S.
1 n3S 2M 2 _
YH ^2 + S 2 ’
H2S2M 2
1 й з$ зМ 3 .
г Р2 K 2 + s 2
v S3 K 3 + s 3 ’
dP_
dt
_ J _
f e S 3M 3
/g
g 4 )
YP3 K 3 + S 3 '
П о ан алоги и с преды дущ им р азд ел ом , р ,, ц2, р 3 — м ак си м ал ь ­
ные удельны е скорости роста: К 2, К 2,
— кон станты сродства
субстратов; YSi, YS2, YS], YPl, Ypi,Y P}~ экономические коэф ф и­
циенты для вы раж ения в одних единицах концентраций суб стра­
тов, п родуктов и м и кроорган и зм ов. П риведем систему (8.84)
к б езр азм ер н ы м перем енны м:
233
1
s,
s2
*i = ^ — ;
^1.0
= ^ - ; -« 3 = ^ ;
a l,0
^1,0
mi
~ M1VI1,00- NAM,0;
p
M,
= FQO;
p
m + „ - n 20
m -), =
—
s,
*2
5
4>
/Q oc4
( 8 -8 5 )
, rmr i -ii —
■
.
2
3
M , . . - N 3i0
В это м случае систем а уравнений в б езразм ерн ы х перем ен­
ных будет им еть следую щ ий вид (для упрощ ения ан ал и за все
экономические коэф ф ициенты такж е приняты равн ы м и единице):
dm 1 _
s tm 1
_ </ш2 _ ц 2/(щ з 2т 2).
dx
dx
K 2/ S ^оЧ- з 2
dsx _
dx
Л 2_
dx
K 3/Si
q + s3
л2/?i,
( 8 . 86 )
ATj/S | ,0 + s 1
з ,т х
с/х
Щ /Ф л^з).
A:2/ S li0 + i 2
^3 _ Из/Ф^У^з)
Вз/фУз"Ъ).
dx
K'3/ S l 0 + s 3
K'2/ S u 0 + s 2
d m 3 _ Из/(Ц1^ з
dp/dx- ^
3^ ^ 3
К'з/ Si 0 + s 3
К ак видно, этой системой уп равляю т пять парам етров: K ,/S , 0;
K 2/S li0; K 3/S 1<0; р 2/В б Рз/Oi- П ервы е три п ар ам етр а, как и в ранее
разо б р ан н ы х вари ан тах, о тр а ж а ю т влияние концентраций л и м и ­
тирую щ их суб стратов, а д ва последних — соотн ош ени я удельны х
скоростей роста культур. П роварьи руем последние два парам етра
и проследим за изменением вида кинетических кривых (рис. 8.30).
1- Р 2 / Р 1 = М-з/н 1 = 1- Э то случай, когда м акси м альн ы е удель­
ные скорости роста всех трех м и кр о о р ган и зм о в прим ерно
со в п ад аю т (рис. 8.30, а). Видно, что разви тие всех трех м и кр о ­
о р ган и зм о в идет п ослед овательн о, кривы е р о ста похожи друг
на друга, за исклю чением н ачальной ф азы процесса. Н а б л ю д а­
ется д о во л ьн о бы строе падение концентрации S, и сущ ествую т
характерн ы е м акси м ум ы по пром еж уточн ы м п родуктам S2 и S3.
2. |i2/p j = l, |л3/|Д! == 5 (или ц 3 » ц , = ц 2) - условия отн оси ­
тел ьн о б ы строй последней стади и (рис. 8.30, б). Видно, что
в условиях бы строй третьей стадии практически исчезает
м акси м ум по S 3, а кривые роста м и кр о о р ган и зм о в М 2 и М 3
практически со в п ад аю т, в то р ая стади я процесса как бы сли ва­
ется с третьей, хотя и определяет накопление п родукта Р.
3. п 2/ ц 1 = 5; п 3/п , = 1 ( и л и ц 2
= ц 3) - условия отн оси ­
тельн о бы строй второй стади и (рис. 8.30, в). Здесь ситуация
другая: практически исчезает пром еж уточны й субстрат S2,
кривы е р о ста т 1 и т 2 близки, при этом б ы страя вторая
234
Рис. 8.30. Численное интегриро­
вание
системы
(8.86)
при
Pi/P2 = P2/P3 = 1 («): Pi/P2=1>
РзМ1=5 ^ Pi/P2 = 0.2, Pi/P3= l
(в); р 1/р 2 = р 1/р 3 = 5 (г); щ /ц 2 =
= щ / р 3 = 0 ,2
(0 )
стади я как бы р аство р яется в м едленной первой и определение
ее кинетических п ар ам етр о в станови тся затруд н ительн ы м .
4.
p 2/Pi = 0 ,2 , Р з/щ = 0,2 (или |д1» р 2 = р 3) — условия отн оси ­
тельн о бы строй первой стади и (рис. 8.30, г). Вид кинетических
кривы х нап ом и нает картин у п ервого случая, за исклю чением
более бы стр о го р о ста п ервого орган и зм а. П о истечении
н еко то р о го времени систем а р аб о тает как ассоциация двух
м и кр о о р ган и зм о в.
5- ц2/П 1 = П3 /П 1 = 5 (или 0 1 ^ 0 2 = ^ 3 ) — условие зам едленной
первой стади и (рис. 8.30, д). О б р ащ ает на себя внимание
практически полное отсутствие S2 и S 3, а такж е слияние трех
кинетических кривы х роста орган и зм ов: т , , т 2, т г . К инетика
ро ста т 2 и т 3 практически не п роявляется — все лим ити рует
первая стадия. И з такого вида кинетических кривы х возм ож н о
определение кинетических п ар ам етр о в то л ьк о лим итирую щ ей
стади и , т. е. первой.
• Т аки м о б р азо м , если эксп ери м ен тальн о д остаточ н о п о д ­
роб но исследованы зависим ости от времени концентраций
235
исходных, пром еж уточны х субстратов и п родуктов ф ерм ентации,
получены кинетические кривые роста отдельны х м икроорганизмов,
т о мож но на основе качественного совпадения экспериментальных
зависим остей с одной из теоретических, представленны х на
рис. 8.29 — 8.30, идентифицировать лим итирую щ ую стадию разви ­
тия сим биотической ассоциации. Б олее строги й количественны й
п одход основан на м од ели рован и и ро ста м и кроб н ой ассоциации
с п о м о щ ью реш ения п рям ой задачи и определении кинетических
парам етров роста при решении обратной. Рассмотрим особенности
и возм ож н ости этого п одход а на прим ере ан ал и за зак о н о м ер н о ­
стей р о ста м етангенерирую щ ей м и кроб н ой ассоциации.
8.5.3. Симбиотическая метагенерирующая ассоциация
А н аэробн ы й процесс о б р азо в ан и я м етан а из разли чн ого
р о д а органических м атер и ал о в п ред ставляет собой слож ны й
м н огоступ ен чаты й процесс, на разн ы х этап ах к о то р о го прини­
м а ю т участие м и кроорган и зм ы разли чн ой п рироды . П ервы й
этап биодеградаци и часто бы вает связан с ги д р о л и зо м вы соко­
м олекулярн ы х соединений (полисахаридов, белков, ж иров
и т. д.) до соответствую щ их олиго- и м он ом еров, которы е
на последую щ их этап ах кон верти рую тся в органические кис­
л о ты и спирты , м олекулярн ы й в о д о р о д и диоксид углерода.
Затем органические кислоты и спирты п ревращ аю тся в ацетат,
в о д о р о д и С 0 2, из которы х в д альн ей ш ем и образуется
м етан. М и кробиологическое образован и е м етан а — ш и роко р ас­
пространенны й, устойчиво п ротекаю щ и й в анаэробны х условиях
процесс, им ею щ ий в настоящ ее врем я п ром ы ш лен ное значение.
З адача количественного описания м етан оген еза ослож няется
тем , что пока и м ею тся весьм а ограниченны е сведения о природе
и свойствах м и кр о о р ган и зм о в , входящ их в состав м етангенерирую щ его консорциум а. В обсуж даем ом случае количественная
кар ти н а м етан о ген еза реконструировалась на основе и сследова­
ния динам ики о б разован и я и расхода исходного субстрата,
п ром еж уточны х и конечных п родуктов процесса (С. В. К ал ю ж ­
ный, С. Д. В арф олом еев и др., 1985, 1986).
Н а рис. 8.31, а приведена типичная картин а, н аб лю д аем ая
при ан аэроб н ой конверсии гл ю козы под действием м и кробн ой
ассоциации, известной как Methanobacillus kuzneceovii. Видно,
что в реакционной среде п ом и м о конечных п р о д у к то в — д и о к­
сида углерода и м етан а — н акапли вается ещ е целы й ряд
пром еж уточны х соединений - м олекулярн ы й водород , уксусная
ки слота, этан ол. В незначительны х количествах в смеси
о б н аруж и ваю тся такж е пропи ловы й спирт, п роп и он овая и м а с­
л ян ая кислоты . О дн ако накопление этих ком пон ен тов п роходи т
в н езначительной степени, не вносящ ей зам етн о го вклада
в м атер и ал ьн ы й балан с по углероду.
236
У стан о ви м , как соб5, Р, мМ
лю дается в процессе р о ­
с т а ассоциации балан с по
углероду и сущ ествую т
ли в зам етн ы х количест­
вах другие продукты ре­
акции, не детектируем ы е
в условиях проведения
эксперим ента
(рис.
8.31,6). И з рисунка вид­
но, что в течение всего
времени р азви ти я процес­
са отнош ение сум м арн ой
концентрации детектируе­
м ы х продуктов к н ач ал ь­
ной концентрации глю ко- Рис- 8.31. Динамика анаэробного разложения
о ,.
Г П ...о™
г
оттнииттр
глюкозы метаногенной ассоциацией
бактеЗЫ
ОЛИЗКО
К
единице
~ (рН=7 0. 16 5 м глюкозы; 60 С) (а)
И сл аб о сниж ается В ходе
и зависимость от времени отнош ения сумпроцесса. Д еф ицит угле- марной концентрации детектируемых
продур од н о го бал ан са К концу ктов к начальной концентрации глюкозы (б)
процесса ( /~ 2 0 0 ч) составляет 6% . Э то т деф ицит образуется
за счет накопления биом ассы ; при это м м ож н о утверж дать,
что в пределах точности м и кроби ологи ческого эксперим ента
( ~ 1 0 % ) в м етаб о л и зм е ассоциации отсутствую т другие, не­
детектируем ы е углеродны е соединения, вы деляем ы е м и к р о о р ­
ган и зм ам и в культуральную среду или в газовую фазу.
Д ля изучения нем етаногенной стадии процесса бы ло и сп оль­
зован о то свойство системы , что при низких значениях pH (pH < 5,5)
м етангенерирую щ ие бактерии ассоциации не разви ваю тся, в то
врем я как конверсия гл ю козы п роходи т весьм а активно (рис. 8.32).
В течение первых 80 ч процесса н аб лю д ается хорош о вы раж енное
экспоненциальное накопление продуктов предм етаногенн ого
разлож ени я гл ю ко зы — этан ола, ац етата, С 0 2, Н 2. П ри этом
отли чается си м б атн о сть в накоплении ац етата и эти л ового спирта,
а такж е во д о р о д а и С 0 2. Э ти м етаб о ли ты и являю тся первичным и
п родуктам и ан аэробной конверсии глю козы дан ной ассоциацией.
Исследование стехиометрических соотнош ений образования
этанола и ацетата, Н 2 и С 0 2 показывает, что мольны е количества
образую щ ихся веществ примерно находятся в отношении 1 :1 : 2 :2 ,
т. е. этанол и ацетат образую тся в эквивалентном количестве,
в два раза меньш ем, чем Н 2 и С 0 2. Э то следует как из
данных по м атериальном у балансу (рис. 8.33), так и из данных
по кинетике накопления продуктов в экспоненциальной фазе
роста культуры (рис. 8.34). Найденные удельные скорости ро­
ста (метаболические коэффициенты) по различны м продуктам
им ею т
значения:
qHi = (0,045 + 0,007)ч
^СО2= + 0 ,0 0 3 ч ;
</с2щ он=(0,032 ± 0,003) ч - 1; 9 cHiCooh =(0,028 ± 0,003) ч " 1.
237
Рис. 8.32. Динамика анаэробного р аз­
ложения глюкозы метаногенной ассо­
циацией бактерий (pH 5,3; 16,5 мМ
глюкозы; 60° С)
Рис. 8.33. Зависимости от времени от­
ношений количеств образовавш ихся
продуктов к количеству прореагиро­
вавшей глюкозы при культивировании
метаногенной ассоциации бактерий
в режиме низких значений pH (усло­
вия те же, что и на рис. 8.32)
И сходя из вы ш еизлож енного, м ож н о утверж д ать, что р а зл о ­
жение гл ю ко зы под действием исследуем ой ассоциации проис­
ходит в соответствии с уравнением
С6Н , 20 6 + Н 20 -------- ►С2Н 5ОН + CHjCOOH + 2COz + 2Н2 (8.87)
козы метаногенной ассоциации бакте­
рий при низких значениях pH в экс­
поненциальной фазе в полулогариф ­
мических координатах (условия те же,
что и на рис. 8.32)
238
П роцесс
осущ ествляется,
п о-види м ом у, одни м м и к р о о р ­
ган и зм ом . Реакция (8.87) явл я­
ется одной из базовы х хим и­
ческих реакций д л я д анной
систем ы , она известна как путь
Э м бд ен а — М ай ергоф а и ш и ­
р о ко представлен а в м е таб о л и ­
зм е ан аэроб ны х м и к р о о р ган и ­
зм о в (Г. Г о ттш ал к , 1982).
К ак видно из рис. 8.31, н а­
копление в среде эти л ового
сп и рта и уксусной кислоты
проходи т через м аксим ум . Э то
характерн ы й признак действия
сим биотической
ассоциации,
в кото р о й п родукт м е таб о л и з­
м а одной культуры является
су б стратом
для
другой
i (см. рис. 8.29, 8.30). Д ля подs>
тверж дения наличия в данда
ной ассоциации м и кр о о рга)■' н и зм о в, способны х погреб; л ять ац етат, этан о л и С 0 2,
бы ли проведены оп ы ты по
вы ращ и вани ю исследуем ой
; ассоциации на этих п родук­
т а х в качестве субстратов.
! Д ей ствительн о, м и кроб н ая
I ассоциация способна конверI ти р о в а ть в м етан этан ол
и уксусную кислоту, а такж е
! диоксид углерода в присутСТВИИ м олекулярн ого водо- Рис. 8.35. Динамика анаэробного разлорода. Н а рис. 8.35 приведены жения этанола метаногенной ассоциацией
кинетические кривые конвер- бактерий (pH 7,0; 30 мМ этанола; 60 С)
сии этан о л а в м етан и С 0 2, при это м в качестве пром еж уточного
п родукта вы ступает уксусная ки сл ота и в очень небольш их
количествах об разуется м олекулярн ы й водород . Э то п озволяет
зап и сать б азовую химическую реакцию
C 2H s0 H + H 20 --------► С Н 3С О О Н + 2 Н 2
(8.88)
за которой следует стадия м етан ообразован и я. Т ер м о д и н ам и ­
ческие условия протекания процесса обеспечиваю тся последу­
ю щ и м и реакц иям и утилизации во д о р о д а и уксусной кислоты .
Процесс м етан образовани я из уксусной кислоты проходит еще
менее интенсивно (рис. 8.36, а), чем в случае с этиловы м спиртом .
П ри это м н аб лю д ается образован и е С 0 2, а такж е небольш их
количеств этан о л а и водород а. Э ти ловы й спирт синтезируется,
по-видим ом у, в ходе обратн ой реакции (8.88). К онверсию ац етата
с образован ием С 0 2 и Н 2 м ож но объяснить протеканием реакции
С Н 3С 0 0 Н + Н 20 --------- > С 0 2 + 4 Н 2
(8.89)
<--------Э тот
процесс
термодинамически
невыгоден
(А 6 ’рн 7 ,о==
= 94,9 кД ж /моль), равновесие смещ ено влево, реакция мож ет
проходить лиш ь при низких парциальных давлениях водорода
(< 1 0 0 Па). Протекание процесса (8.89) в симбиотической мик­
робной ассоциации было показано м етодом изотопного анализа.
К онверсия ац етата в м етан м ож ет осущ ествляться в со о т ­
ветствии с простейш ей базовой реакцией
С Н 3С О О Н
►С Н 4 4 - С 0 2
(8.90)
П ри это м С 0 2, С Н 4 долж ны о б р азо в ы в аться в стехиом етричес­
ких количествах. О дн ако образован и е д иоксида углерода
239
Рис. 8.37.
Динамика
конверсии
диоксида углерода п од действием
метаногенной ассоциации бактерий
(pH 7,0; 60° С)
сущ ественно опереж ает о б р а зо ­
вание м етан а (рис. 8.36, а). Повиди м ом у, в д ан н ом случае ки­
нетически более бы стры м явл я­
ется процесс по стади и (8.89)
с д ал ьн ей ш и м восстановлением
Рис. 8.36. Динамика анаэробного
С 0 2 д о м етан а вод о р о д о м .
разложения уксусной кислоты м е­
О б разован и е м етан а из аце­
таногенной ассоциацией бактерий
т а т а в атм осф ере в о д о р о д а су­
в атмосфере аргона (а) и молеку­
лярного водорода (б) (pH 7,0; аце­
щ ественно
интенсиф ицируется,
тат 21,0 мМ; 60° С)
и не н аб лю д ается накопление
детектируем ы х количеств д иоксида углерода, так как происхо­
д и т его б ы строе восстановление в о д о р о д о м (рис. 8.36, б):
С О , + 4Н -
-> С Н д + 2 Н , 0
(8.91)
П ротекан и е этого процесса б ы ло подтверж дено непосредствен­
ной конверсией С 0 2 в м етан в атм осф ере во д о р о д а под
д ействием д анной м и кробн ой ассоциации. В систем е н аб л ю д ае т­
ся такж е п ром еж уточное о б разован и е ац етата и этан о ла по
реакции (8.88) и (8.89) (рис. 8.37).
Р езультаты проведенного количественного ан ал и за сум м и ­
рует так ая схема:
м
С 6Н 120 6 + Н 20 ------ U C 2H 50 H + C H 3C 0 0 H + 2 H 2 + 2 C 0 2
С .Н Д Э Н + НДЭ^
С Н 3С О О Н
С 0 2+ 4 Н 2
240
М,
м,
м,
U С Н Х О О Н + 2Н ,
-+сн4+со2
-►СН4 + 2 Н 20
(8.92)
Н а первой стади и процесса п роисходит разлож ение глю козы
по пути Э м бд ен а — М ай ергоф а, соп ровож д аем ое р о сто м не­
м етан оген н ого м и к р о о р ган и зм а М х; в то р ая реакция осущ еств­
ляется ф ерм ен тны м и си стем ам и м и к р о о р ган и зм а М 3; две
последую щ ие реакции являю тся м етан ген ери рую щ им и, причем
осущ ествляю тся д ву м я н езави си м ы м и м етан оген ны м и б актери ­
ям и М 2 и М 3 (М 2 — ац етатиспользую щ и й м етан оген с м ед ­
ленной м етангенерацией; М 3 — водород , использую щ ий о р ­
ган и зм с бы строй м етангенерацией). Э т о т вы вод согласуется
с д ан н ы м числом м и кроби ологи ческого эксперимента.
Р еакцию типа (8.89) при конверсии гл ю козы м ож н о и склю ­
чить из р ассм отрени я на основе терм одинам ических сооб ­
раж ений.
Бы ли проведены исследования зависим остей скорости метаноб разо ван и я от p H и концентрации гл ю козы как исходного
суб страта. П олученны е данны е п озвол и л и количественно опи­
сать р азви ти е м етан оген н ого процесса во всем диапазоне
времен, во всей совокупности перем енны х. В процессе эволю ции
м етан оген ной ассоциации при периодическом культивировании
изменение во времени претерп еваю т по крайней мере десять
переменных: концентрации клю чевы х суб стратов, м етаб о л и то в
и п родуктов (гл ю ко за — G , этан о л — Et, ац етат — Ас, С 0 2, Н 2,
С Н 4), концентрации клю чевы х м и кр о о р ган и зм о в (M ls М 2,
М 3), концентрации ионов во д о р о д а Н +. С оответствен н о ки­
нетику процесса в ц елом д олж н а оп исы вать систем а десяти
диф ф еренциальны х (алгебраических) уравнений. К инетической
схеме (8.92) м ож но соп остави ть единственную систему урав­
нений.
Р о ст м и к р о о р ган и зм о в происходит в соответствии с б азо в ы ­
ми химическими реакциям и (8.87), (8.80) и (8.81), поэтом у
для м и кр о о р ган и зм о в М ,, М 2 и М 3 м ож н о зап и сать уравнения
роста:
= У2 W3; a-^ ± = Y 3 WA,
(8.93)
где Y x, Y2, Y3 — соответствую щ ие эконом ические коэф ф ици­
енты; W x, W 3, WA задан ы уравнениям и
W -
9lGM
(8.94)
{qx = \ixI Y x— удельн ая м акси м ал ьн ая скорость потреблен ия гл ю ­
козы ; К х— кон станта срод ства к глю козе; КаХ, К в Х - кон стан ­
ты ионизации ионогенны х групп, определяю щ их p H -зависи­
м ость скорости ро ста первого м и кроорган и зм а);
241
+
а
\
(8 9 5 )
(*3+Ас,( 1+] ^ + # )
(^/з= 0 2 / ^ 2 — удельная м акси м ал ьн ая ск орость потребления ац е­
та т а при росте м етан ген ери рую щ его м и кр о о р ган и зм а М , на
ацетате; ЛГ3 — со о тветствую щ ая кон станта сродства; Ка 2, К ~2 —
кон станта ионизации ионогенны х групп, определяю щ их рН -зависим ость скорости роста м и кр о о р ган и зм а М 2);
\у _
9 4 Н 2 СО2 М3
4 (*4+ * 5н 2+ к6с о 2+ н ,с о 2)(I + н +//с, 3+
н *)
(рост м и кр о о р ган и зм а М 3 им еет б исубстратн ы й характер;
p H -зави си м ость — к о л окол ооб разн а; с/4 = р 3/У 3 — удельная м а к ­
си м альн ая скорость потребления С 0 2 и Н 2 при их н асы щ аю щ их
концентрациях; КА, К ъ, Кь
соответствую щ ие константы
сродства; К.л 3, К в 3 — константы ионизации). [Более строго,
по-види м ом у, для уравнения ро ста необходи м о и сп ол ьзовать
уравнение с н ем ультип ли ци рован ны м и суб стратам и (см. гл. 2),
однако это не вносит сущ ественных искажений в кинетическое
описание процесса.]
С оответствен н о д л я основны х ком пон ен тов процесса м ож но
записать:
dG
...
-d7t 7 = - ^ ;
d Ft
dt
(8.97)
= И/1( ! - Г , ) - Б /2,
(8.98)
где
w
2
ЧгEtM.
(899
A:, + Ft
y
’
(конверсия эти л о вого спирта осущ ествляется ф ерм ентны м и
си стем ам и м и кр о о р ган и зм а М ,; q 2 и / ^ — соответствую щ ие
кинетические п арам етры );
/7 Д р
dt =
dC о
dt
= 2 И М 1 - У 1) + И '3 ( 1 - У 2) - И ' 4 ;
dt
dCW
dt
(8.101)
A,
(8.102)
= ц/3( 1 _ Г 2)+И/4( 1 - Г 3).
(8.103)
dJ h = 2 W
242
(8.Ю0)
l ( \ - Y l )+ 2 W 2 - 4 W
I
’
I
Г
Н аи б о л ьш и е слож ности п редставляет количественная оценка
изменения во времени концентрации ионов водород а, поскольку
процесс п ротекает в буф ерной среде (в эксперим ентах использовал ся ф осф атны й буфер 0,1 М). И зм енения концентрации
ионов во д о р о д а связаны с изм енением концентрации уксусной
; кислоты , а такж е с содерж анием в среде буф ерного ком понента.
М ож но п о казать, что изменение Н + во времени происходит
в соответствии с уравнением
Н + (г) = / [А с (0 ] = А /2 + J А 2/4 + В,
|
ГДе
(8.104)
л _ * Ас(Сф + А с - С Ме) + К Ф( 2 С ф - С Ме) .
Сме-Сф
^ _ л:Ас
(2СФ- с Ме+ с Лс)
С'ме—Сф
'{ (К Ас — кон станта диссоциации уксусной кислоты ;
— кон станта
диссоциации иона Н 2Р О ф ; Сф— об щ ая концентрация ф осф ата
в растворе; С Ме- о б щ ая концентрация п ротивои она в буф ерном
растворе). У равнение (8.104) д о стато ч н о надеж но описы вает
‘ эксп ери м ен тальн ы е данны е по изм енению pH в буферных
р аство р ах при различны х концентрациях уксусной кислоты .
С истем а уравнений (8.93)— (8.104) б ы ла реш ена отн оси тел ь­
но всех переменны х, и б ы ло п оказано, что полученные реш ения
о п и сы ваю т характерн ы е особенности конверсии глю козы м е т а ­
ногенной ассоциацией: эксперим ентальны е зави си м ости во вре­
мени изм енения концентраций Ac, Et, Н 2, опереж аю щ ий рост
в системе С 0 2, периоды индукции в о б разован и и продуктов.
Реш ение систем ы п роводи ли при нескольких наборах значений
кон стант, о б ласть ко торы х оценивали из н езависим ого экспе­
р и м ен та или п р ин и м али ап ри ори. Т аки м о б р азо м , б ы ла
д о к аза н а ад екватн о сть м одели (8.93)— (8.104) реальн ом у экспе­
рименту.
Н аконец, д л я то го чтобы получить п олную и нф орм ац ию
об исследуем ом процессе, н еобходи м о реш ить об ратн ую з а ­
д а ч у — на основании проведенны х кинетических измерений
оп редели ть числовы е значения независим ы х п арам етров, опи­
сы ваю щ их кинетические кривы е в пределах точности их
измерений. С лож ность задачи состоит в наличии б ольш ого
числа неизвестны х п арам етров процесса (в случае конверсии
гл ю ко зы их 19) и в неопределенности н ачальны х условий по
кон ц ен трац иям м и кр о о рган и зм ов. П ри поиске так о го количест­
ва п ар ам етр о в неизбеж но п риходится стал ки ваться с их
внутренней кор р ели р о ван н остью , что приводит к н еоднознач­
ности реш ения о б р атн ой задачи (С. И. С пивак, 1980). П р ед ­
стоял о найти не то л ьк о н абор п ар ам етр о в , хорош о описы ва­
ю щ их эксперим ентальны е кривые, но и п опы таться оценить
чувствительность м одели к каж дой из констант.
243
П оиск
п арам етров
проводился на ЭВМ путем
м иним изации критерия со ­
ответстви я расчета экспе­
рим енту по всему пулу
эксперим ентальны х д ан ­
ных. В качестве критерия
и сп ользовалась функция
п т
f = I £ ( х ? - х ? ) 2,(8.105)
j= ii= i
где п — число эксперим ен­
тов; т
число измерений
в каж д ом эксперименте;
Х Р — расчетны е значения
концентрации
вещ ества
X,; X- -э к с п е р и м е н т а л ь ­
ная концентрация вещ е­
ства X,-.
В резул ьтате расчета
бы ли найдены значения
констант, уд овл етвори те­
льно описы ваю щ ие экс­
п ерим ентальны е изм ене­
ния концентраций гл ю к о ­
зы ,
этан ола,
ац етата,
С 0 2, Н 2 и С Н 4 при
Рис. 8.38. Сравнение расчета с эксперимен­
различны х значениях н а­
том при кинетическом моделировании ана­
чальной
концентрации
эробн ого разложения глюкозы метаногенной
глю
козы
и
pH
(рис. 8.38).
ассоциацией бактерий (сплошные л и н и и Значения п ар ам етр о в , со ­
. теоретические кривые; точки— эксперимен­
тальные данные; условия те же, что и на
ответствую щ и е теорети ­
рис. 8 . 3 9 ) (а) и теоретические кривые роста
ческим
кри вы м
рис.
микроорганизмов М ,, М 2 и М , метаноген­
8.38,
а,
приведены
в
табл.
ной ассоциации бактерий (б)
8.2. Н е все константы ,
пом ещ енны е в табли цу, и м ею т ф ункциональную значим ость.
Ч увстви тельн ость м одели к п арам етру определяли путем
исклю чения его из м од ели , приравн и вая п ар ам етр к нулю.
Затем находили реш ение системы с определением функции
качества (8.105). Э та процедура п о зво л и л а установи ть, какой
из п ар ам етр о в вносит сущ ественный вкл ад в качество описания
эксперим ента, а каки м п ар ам етр о м м ож н о пренебречь.
О казал о сь, что каж дая из констант, характери зую щ ая
м а к с и м а л ь н у ю •удельную скорость потребления суб стратов
<7г> 4з>
о казы вает сущ ественное влияние на качество
описания эксперим ента и исклю чение из них приводит к рез244
Таблица 8.2
Параметры роста микроорганизмов симбиотической ассоциации, наиболее ка­
чественно описывающие динамику процесса
Параметр
q 2,
q3,
<?4,
Ки
К 2,
А'з,
К4,
K s,
К 6,
мМ
мМ
мМ
мМ
мМ
мМ
мМ
мМ
мМ
Числовые
значения
Параметр
0,713
0,178
0,332
2,05
49,4
36,6
16,3
19,9
РКа, 1
РКь. 1
РК а,2
Р^Ь, 2
РКа,3
рК ь, 3
г/г
У2,
Г /Г
>^3 - г/г
Числовые
значения
5,03
8,3
5,8
7,4
5,0
8,2
0,064
0,149
0,074
12,4
к ом у увели чен и ю к в а д р а т а су м м ы о тк л о н ен и й теорети ч ески х
зн ачен ий о т эксп ер и м ен тал ь н ы х . А н ал о ги ч н о , б о л ь ш о й в к л ад
в кач еств о о п и сан и я вн о сят к о н ста н ты и о н и зац и и и он оген н ы х
груп п, о п р ед ел яю щ и е p H -за в и с и м о с ть п роц есса К л 1 , К ь<1,
К Я2 , Кь 2 , А/а, з , ЛГЬ, з- В т о же в р ем я к о н с т а н т а ср о д ств а
к су б ст р а т у К 5 в н о си т зн ач и те л ь н о м ен ьш и й в к л а д в оп исан ие
п р о ц есса по ср авн ен и ю с к о н с т а н т а м и K t , К 2, К±, К 6. Т ак,
и зм ен ен и е к о н ста н ты К 5 д о н уля п р о в о д и т к р азл и ч и ю
в к р и тер и и F в 0 ,2 % . П р и э т о м оп исан ие н ах о д и тся
в п р ед ел ах п о гр еш н о сти эксп ер и м ен та ( ^ 1 0 % ) . С л е д о в а т е л ь ­
но, к о н ст а н т у К 5, по и м ею щ и м с я д ан н ы м , и д е н ти ф и ц и р о в ать
н ел ьзя и п ри п о стр о ен и и м о д ел и ею м о ж н о п рен ебречь.
В п р о т и в о п о л о ж н о с т ь э т о м у и зм ен ен и е к о н ста н т К г , К 2,
К 3,
и К 6 д о н уля п р и в о д и т к и зм ен ен и ю в кри тери и
на 2 0 — 3 0 % , что п р ев ы ш ает ош и б ку эксп ер и м ен та и у к а зы ­
в ает на о п р ед ел ен н ую р о л ь этих к о н ста н т в оп исан ии
э к сп ер и м ен тал ь н ы х д ан н ы х.
Т ак и м о б р азо м , без ущ ерба д л я качества описания уравнение
(8.96) м ож н о зап и сать в виде
W -
<74 М 3 Н 2 ■СО
(8.106)
П р едставляет интерес сравнение кинетических п арам етров
роста, полученных из данны х кинетического поведения си м би ­
отической ассоциации, с дан ны м и по п ар ам етр ам роста ряда
чистых культур, найденны х в н езависим ом эксперименте. Такое
сравнение д ан о в таб л. 8.3. Н айденны е п арам етры роста
м етаногенны х м и кр о о р ган и зм о в в исследуем ой ассоциации
близки к п ар ам етр ам роста некоторы х чистых м етангенерирую щих культур.
245
Таблица 8.3
Кинетические параметры роста некоторых меганотенных культур (Калюжный
С. В. и др., 1986)
Субстрат
Я»,
ч
'
К„ мМ, %
г клеток
'’
M ethanobacillus barkeri (ш тамм 227)
CHjCOOH
0 ,0 2 1
5
Methanosarcina sp.
TM
CH3COOH
0,058
4,5
M 2 симбиотичес­
кой ассоциации
Methanobacterium
thermoautotrophicum
CH3COOH
0,049
16,3
н 2/с о 2
н 2/с о 2
0 ,4 9 - 0 ,5 9
0,14 —
- 0 ,2 3
0,1 % Н 2
1 ,5 % С 0 2
н 2/с о 2
0,16
1,25% Н 2
12 ,4 % С 0 2
М 3 симбиотичес­
кой ассоциации
г СН4
Литература
0 ,2 1
Taylor,
1982
0 , 1 — 0 ,1 2
Taylor,
1982
0 ,1 2
0,149
0,1
0,04
Калюжный,
1985
0,19 Schonheit,
1980
0 ,1
Taylor, 1982
0,074
Калюжный,
1985
П р и м е ч а н и е . При составлении таблицы для некоторых значений К ,
и Y сделан перерасчет в универсальные единицы измерения.
П олн ое кинетическое м од ел и рован и е процесса с и сп оль­
зован ием ЭВ М д ает весьм а интересную д ополн и тельн ую
и нф орм ац ию . Т ак, наприм ер, м ож н о рассчитать динам ику
р о ста отдельн ы х м и кр о о р ган и зм о в , входящ их в м етаногенную
ассоциацию , опираясь на эксперим ентальное исследование
динам ики о б р азо ван и я п родуктов или расхода субстратов.
Реш ение системы уравнений (8.93)— (8.104) при использовании
п ар ам етр о в процессов, наиболее качественно описы ваю щ их
эксперим ентальны е данны е, д ает кинетические кривы е роста
м и кр о о р ган и зм о в М 15 М 2, М 3 (рис. 8 .3 8 ,б). Т ак и м о б р азо м ,
кинетическое м од ели ровани е д ает и н ф орм ац и ю , которую тр у д ­
но или н евозм ож н о получить с п о м о щ ь ю других м етодов.
_
1
^
Н а нескольких п рим ерах бы ли рассм отрены возм ож н ости
и особенности исследования процессов роста м и кроорган изм ов с п о м о щ ью кинетических м оделей, анализируем ы х
с прим енением соврем енной ком п ью терн ой техники. П ост­
роение и ан ал и з так о го род а м оделей стан овятся все более
и более ак туальн ы м и . Рост популяций м и кр о о р ган и зм о в
сопряж ен с изм енением в системе м ногих перем енны х, что
п риводит и сследователя к необходи м ости ан ал и зи р о вать си­
стем ы диф ф еренциальны х уравнений б ольш ой разм ерн ости .
А декватны й ан ал и з так о го род а зад ач м ож ет б ы ть сделан
л иш ь с и сп ользован и ем соврем енной вы числительной техники.
А налитические реш ения задач ро ста м икробны х популяций
являю тся зачастую лиш ь грубы м и приближ ениям и. Ч ем ближ е
246
кинетическая м о д ел ь к реальн ом у процессу, тем более необ­
ходим ком пью терн ы й уровень ее анализа,
t
При изучении законом ерн остей роста клеточны х популяций
на основе численного и нтегрирован и я уравнений скорости
ро ста м ож но получить в явн ом виде связь м еж ду количеством
клеток, концентрацией суб страта или продукта с временем
протекания процесса при различны х реж им ах. П ервичную
диагностику условий роста культуры (неослож ненны й рост,
рост с и нгибированием п родуктом или субстратом ) м ож но
привести на основе ан ал и за ф орм ы кинетической кривой;
изменение во времени количества биом ассы или низком оле­
кулярны х п родуктов — с п ом ощ ью , н ап рим ер, м етода «двой ­
ного зер кал ьн о го отраж ения».
П ри нципиально важны и интересны кинетические задачи
с учетом лизиса клеток или инактивации их ряд а клю чевых
систем в процессе р о ста м и кроорган и зм ов. П роцессы этого
рода ведут к ограничению роста клеточной популяции. Такие
случаи очень часты в м и кробн ой кинетике и составл яю т
специфический предм ет исследования в кинетике роста ж и вот­
ных клеток в культуре ткани.
Б о л ьш ая группа вопросов м ож ет б ы ть реш ена с п ом ощ ью
ком п ью терн о го ан ал и за при изучении процессов культиви ро­
вания ф о тотроф н ы х м и кроорган и зм ов. В этом случае пом и м о
«классических» перем енны х м и кроб н ого роста, таких, как
число клеток, концентрация суб стратов, продуктов, pH , не­
обходи м о учиты вать изменение во времени интенсивности
погло щ аем о го света как основного «п итаю щ его» систему
реагента. К о м п ью тер н ы е м одели в ряде случаев роста д о ­
статочн о адекватно оп исы ваю т поведение популяций ф о­
тотр о ф н ы х м и кр о о р ган и зм ов.
Б о л ьш о й вклад в поним ание процессов, происходящ их
в м и кробн ы х ассоциациях, вносят м етоды кинетического
м од ел и р о ван и я на ЭВ М .
В дан ной главе рассм отрены законом ерн ости роста сим биотроф ны х м и кробн ы х ассоциаций на прим ере ассоциаций,
состоящ их из двух и трех м и кроорган и зм ов. В зависим ости
от то го , какой из м и кр о о р ган и зм о в лим и ти рует процесс,
кинетическая кар ти н а разви ти я ассоциации м ож ет бы ть р а з­
личной. Если какой-либо из м и кроорган и зм ов в п ослед ователь­
ности их ро ста является строго л и м и ти рую щ и м , то кинетика
роста последую щ их м и кр о о р ган и зм о в почти строго оп ределя­
ется кинетикой р азви тия л им ити рую щ его. П одходы и м етоды
ан али за, характерн ы е д л я исследования м и кробн ы х ассоциаций,
п роил л ю стр и р о ван ы изучением м етангенерирую щ ей м икробной
ассоциации. Важно подчеркнуть, что кинетическое м од ел и ­
рование с использован и ем ЭВМ п озвол яет р а б о та ть с весьма
инф орм ац ион н о ем ким и зад ач ам и , реш ение которы х трудно
247
или н евозм ож н о осущ ествить д ругим и средствам и. В качестве
прим ера рассм отрен подход, п озволяю щ и й «реконструировать»
дин ам ику роста отдельны х м и кр о о р ган и зм о в в ассоциации на
основе изучения дин ам ики об разован и я п родуктов и расхода
суб стратов без д етал ьн о го м икроби ологи ческого изучения
и характеристики м и кроорган и зм ов. И з реш ения кинетической
задачи м ож но получить и числовы е п арам етры отдельны х
м и кр о о р ган и зм о в ассоциации.
В связи с р о сто м возм ож н остей и д оступ ностью ЭВМ
в исследовательской практике, соверш енствованием м етодов
общ ения исследователя с ком п ью тер о м м ож но д у м ать, что
использование ЭВ М в м икробиологических исследованиях
получит все больш ее распространение.
ГЛАВА 9
О БРА БО ТК А РЕЗУЛЬТАТО В И ЗМ ЕРЕН И Й
В М И К Р О Б И О Л О Г И Ч Е С К И Х И ССЛ ЕДО ВАН И ЯХ
Изучение кинетики м икробиологических процессов п ред полагает
и сп ользован и е количественны х м ето д о в изм ерения ряд а и зм е­
няю щ ихся во времени переменны х. Важно отм ети ть, что
никакое изм ерение не м ож ет б ы ть вы полнено аб сол ю тн о
точно, его р езу л ьтат всегда содерж ит н екоторую погреш ность.
В задачу изм ерений входит не тол ьк о нахож дение сам ой
величины , но такж е и оценка допущ енной при измерении
погреш ности. Ч асто стар аю тся произвести изм ерения с н аи ­
больш ей то ч н о стью , т. е. сд елать п огреш н ость изм ерения по
возм о ж н о сти м ало й . О днако н адо и м еть в виду, что чем
точнее м ы хоти м и зм ери ть, тем труднее это сделать, поэтом у
не следует п ревы ш ать ту точность, ко то р ая н еоб ходи м а для
реш ения п оставленной задачи.
• Т ак и м о б р азо м , м ож н о сд ел ать важ ны й вы вод: м а л о
п олучить т о т или иной р езу л ьтат — необходи м о правильн о
оценить точность и н адеж н ость эксперим ентальны х данны х.
9.1. ТИ П Ы
П О ГРЕШ Н О С ТЕЙ
И ЗМ ЕРЕН И Й
П огреш ности изм ерений п рин ято п од разд ел ять на си стем а­
тические, случайны е и грубы е (или пром ахи).
Систематические погрешности вы зы ваю тся ф ак то р ам и , дей ­
ствую щ и м и о д и н ако вы м о б р азо м при выполнении измерений
одни м и тем же м ето д о м с п о м о щ ью одного и того же
и зм ер и тел ьн о го п риб ора. Во всех таких изм ерениях си стем а­
тические п огреш ности одинаковы . В некоторы х случаях они
м о гу т соверш енно и сказить р езул ьтат измерений, однако всегда
сущ ествует принципиальная в озм ож н ость изучить систем атиче­
ские погреш ности и п олн остью исклю чить их влияние путем
изм енения условий эксперим ента л и б о введения соответствую ­
щих п оправок.
В зави си м ости о т наличия априорны х сведений о природе
в р азм ер е систематических погреш ностей их м ож н о разд ели ть
на следую щ ие группы.
1. П огреш ности известного происхож дения, которы е м огут
б ы ть точно определены.
2. П огреш ности, п рирод а которы х известна, но точное
значение не установлено. К их числу относится, наприм ер,
п огреш н ость изм ери тельны х п риборов, когд а известно не
249
точное
значение
погреш ности
прибора,
а
м акси м альн о
возм ож ное.
3.
П огреш ности, о сущ ествовании которы х и сследователь
не п одозревает, хотя величина их м ож ет б ы ть очень зн ач и тель­
на. Э то сам ы й опасны й тип систем атических погреш ностей,
и чащ е всего он п роявляется при слож ны х изм ерениях. О ш ибка
в измерениях м ож ет возни кать, наприм ер, при определении
концентрации клеток м и кр о о р ган и зм а в растворе по оптической
п лотности р аство р а, изм еряем ой при 540 нм, если это т раствор
кром е клеток сод ерж ал нераствори м ы е тверды е вещ ества,
такж е п о гло щ аю щ и е свет при 540 нм.
О дин из наиболее надежны х способов убедиться в о т ­
сутствии таких погреш ностей состои т в проведении изм ерений
разн ы м и м ето д ам и и при разны х условиях. С овпадение
полученных р езу л ьтато в служ ит известной, но не аб солю тн ой
гарантией их правильности.
Случайные погрешности обусловлены влиянием р яд а причин,
действие которы х н еодинаково в каж д ом опы те и не м ож ет
бы ть учтено. В изм ерениях, вы полненны х од и н ак овы м о б р азо м ,
случайны е погреш ности п ри н и м аю т разли чн ы е значения. Ч тобы
п роверить, о к азы в аю т ли случайны е погреш ности зам етн ое
влияние на р езу л ьтаты изм ерений, нужно несколько раз
п о вто р и ть изм ерения при одинаковы х условиях опы та. Если
каж дый раз будут получаться несколько отли чаю щ иеся резуль­
таты , то м ож н о сд ел ать вы вод, что данны е отягощ ены
случайны м и п огреш ностям и. Х арактерн ы м п ри м ером является
измерение оптической плотности культуральн ой ж идкости при
540 нм. Если измерение провести один раз, то погреш ность
за счет н еоднородн ости ж идкости следует р ассм атр и в ать как
систем атическую . Н о если провести несколько измерений
од ного и то го же раство р а, каж ды й раз перем еш ивая его
и о тб и р ая новую пробу, то п огреш н ость станови тся случайной.
В резу л ьтате измерений м огут вкрасться и такие п огреш ­
ности, которы е обусловлены лиш ь н евн и м ательн остью экспе­
р и м ен тато р а (неверная запись показаний п рибора, отход от
общ еп ри нятой м етоди ки проведения эксперим ента и т. д.). Э то
так н азы ваем ы е грубы е погрешности, или пром ахи. Д ля
устранения их н еобходи м о со б л ю д ать ак куратн ость и тщ а тел ь ­
ность в р аб о те и оф орм лен и и резул ьтатов. Во избеж ание
таких погреш ностей следует п о вто р я ть изм ерения в несколько
отли чаю щ ихся условиях.
9.2. СВЯЗЬ С И С Т Е М А Т И Ч Е С К О Й
И СЛУЧАЙНОЙ
П О ГРЕШ Н О СТЕЙ
К ак уже известно, си стем атическую п огреш н ость м ож но
перевести в случайную , орган и зовав изм ерения так и м о б р азо м ,
что постоянны й ф актор, влияю щ ий на резу л ьтат измерений,
250
в каж д ом из них будет д ей ствовать п о-разн ом у, а сл ед ователь­
но, р езу л ьтат его действия будет носить случайны й характер.
Э то т прием превращ ения систем атической п огреш ности в слу­
чайную н азы вается рандомизацией. О н п озвол яет практически
исклю чить м ногие неизвестные систем атические погреш ности
и улучш ить точность получаем ы х результатов.
Н ап р и м ер , если при определении количества клеток в кул ьт­
уральной ж идкости будем п одсчи ты вать количество клеток
в к ако м -то н еб о льш ом объем е ж идкости, а затем п ом н ож и м
р езу л ьтат на отнош ение объем ов культуральной ж идкости
и вы б ран н ого объем а, то полученны й общ ий урож ай клеток
м ож ет б ы ть искажен систем атической п огреш н остью , связанной
с н еод н ород н остью о тб о р а пробы . Ч т о б ы этого и збеж ать,
нужно о т о б р а т ь несколько проб случайны м о б р азо м и взять
среднее этих проб. Т аки м путем систем атическая погреш ность,
обусловленная н еод нород н остью о тб о р а пробы , будет пере­
ведена в случайную .
Д опустим , что все систематические погреш ности учтены
и есть уверенность в отсутствии каких-либо сущ ественных
и неизвестны х источников систематических погреш ностей.
В это м случае р езультаты измерений все же не будут свободны
от случайны х погреш ностей, правила вычисления которы х
будут дан ы ниже. Если случайная п огреш н ость окаж ется
м еньш е систем атической, то нет см ы сла ещ е ум еньш ать
случайную п о г р е ш н о с т ь - все равн о результаты измерений не
станут от это го точнее. Д л я получения больш ей точности
нужно искать пути к ум еньш ению систем атической п огреш ­
ности. Н а о б о р о т , если случайная п огреш н ость б ольш е систе­
м атической, то именно ее нужно ум еньш и ть в первую очередь.
Э то м ож н о сд елать путем проведения не одного, а ряда
изм ерений и взять среднее ариф м етическое из этого ряда;
то гд а случайная погреш ность этого среднего будет меньш е,
чем ош и б ка единичного измерения.
9.3. С Л У Ч А Й Н Ы Е П О ГРЕШ Н О С ТИ .
Н О Р М А Л Ь Н Ы Й ЗА КО Н РА С П РЕДЕЛ ЕН И Я
П ри изм ерениях физических величин в тех случаях, когда
основную р о л ь и гр аю т случайны е п огреш ности, все оценки
точности изм ерения м ож н о сд ел ать тол ьк о с н екоторой
вер о ятн о стью , так как случайны е погреш ности образую тся
в р езультате совокупности ряда мелких неучиты ваем ы х причин,
каж д ая из которы х вносит незначительны й в кл ад в общ ую
п огреш н ость, причем часть из них полож ительн а, часть — о тр и ­
цательн а. П о это м у об щ ая погреш ность, о б разую щ аяся в ре­
зул ьтате слож ения таких элем ентарны х погреш ностей, м ож ет
251
им еть различны е значения, каж д ом у из которы х соответствует
разн ая вероятность.
Д л я то го чтобы вы яви ть случайную п огреш н ость, н еоб­
ходим о изм ерение п о вто р и ть несколько раз. Если каж дое
измерение д ает несколько отличны е от других изм ерений
р езу л ьтаты , то случайная погреш н ость играет сущ ественную
роль. Д опустим , что истинное значение и зм еряем ой величины
есть а, а х = а + А х — резу л ьтат изм ерения, отягощ ен ны й случай ­
ной п огреш н остью Ах, т. е. такж е н екоторая случайная величина.
О бы чно п р и н и м аю т, что р езул ьтаты изм ерений подчиняю тся
нормальному закону распределения, или распределению Гаусса.
Э то т закон основан на следую щ их предполож ениях: 1. С л у­
чайны е погреш н ости Ах вы зы ваю тся действием б о льш о го
числа причин, каж дая из которы х п ри вод и т к м а л о м у по
аб со л ю тн о м у значению элем ен тарн ом у отклон ен и ю + е или
—е. 2. О динаковы е по аб со л ю тн о м у значению элем ен тарн ы е
отклонения р авн овероятн ы . 3. П ричины , вы зы ваю щ и е элем ен ­
тарн ы е отклонения, д ей ствую т независим о.
Э ти д о во л ь н о естественны е п редполож ения п ри вод ят к з а ­
кону распределения ош ибок, которы й м ож н о сф о рм ули ровать
так: вероятность т ого, что случайная величина (наприм ер,
р езу л ьтат изм ерения, отягченны й случайной погреш н остью )
примет значение в пределах бесконечно малого интервала м еж ду
х и x + dx, определяется как ср (х) dx, где (р(х) — некоторая
функция, называемая плотностью вероятности. П л отн ость
вероятности н о р м ал ьн о го распределения вы раж ается следую ­
щ и м о б р азо м :
j
X—а2
ф ( * ) т — 7==е 1 ? \
-
0 0
<х< +
0 0
,
(9.1)
где а и с т 2 п ар ам етры распределения. П а р ам етр а — истинное
значение и зм ер яем ой величины , он определяет располож ение
центра распределения на числовой оси. П а р ам етр ст2 н азы ваю т
дисперсией, он служ ит м ерой рассеяния случайной величины.
П о лож и тельное значение кв ад р атн о го корня из дисперсии
ст н азы ваю т средним квадратическим отклонением.
П л о тн о сть вероятн ости н о р м ал ь н о го распределения д о сти ­
гает м акси м у м а в точке а (рис. 9.1, а). Н аиболее вероятны
значения х, близкие к а: по мере удаления от а значения
х стан овятся все менее вероятн ы м и , иначе говоря, вероятн ость
п оявления случайны х погреш ностей х — а есть у б ы ваю щ ая
функция их величины. О ди наковы е по аб со л ю тн о м у значению ,
но п р оти воп олож н ы е по знаку отклон ен и я х от а р ав н о ­
вероятны . С ум еньш ением среднего квад рати ч н ого отклонения
кривы е н о р м ал ь н о го распределения стан овятся более круты м и ,
т. е. чем м еньш е т, тем м еньш е вероятн ость появления больш их
252
1
з
5
7
S
tl
л
- 6 - 4 - 2
0 и1 иг 2
4
6
z
Рис. 9.1. Г рафики плотности вероятности нормального распределения при
различных значениях а (цифры на кривых) при а = 5,0 (а) и плотности
вероятности распределения нормированной случайной величины z (б )
по аб со л ю тн о м у значению случайны х погреш ностей (выш е
точность измерений).
Т ак как функция фЬс) зависит о т двух п арам етров (а
и а 2), то каж дой ком бинации а и с т соответствует своя
кривая. Ч т о б ы м ож н о б ы ло стр о и ть функции н орм ал ьн ого
распределения д ля л ю бы х значений а и ст2, вм есто случайной
величины х вводят н орм и рован н ую случайную величину z:
(9.2)
z = (x —а)/ст.
Т акое преобразован ие эквивалентно переносу н ач ал а ко­
ор д и н ат в точку а и переходу к м асш табу, вы раж енном у
в д о лях ст, поэтом у н орм и рован н ая случайная величина z имеет
a z = 0 и ст2= 1. П л о тн ость вероятности н орм и рован н ой случай­
ной величины , распределенной по н о р м ал ьн о м у закону, равна
В ероятн ость то го , что случайная
в интервал ( и х , и 2 ), определяется как
величина
z
п опадает
(9.3)
Э та вероятн ость численно р авн а площ ади, к о то р ая о гр а­
ничена кривой распределения и п рям ы м и , п роходящ и м и через
точки н17 и2 п ар ал л ел ьн о оси орд и н ат (рис. 9 .1 ,6 ). Естественно,
что вся п ло щ ад ь м еж ду гауссовой кривой и осью абсцисс равн а
единице, ибо появление какого угодно значения случайной
величины в и нтервале о г — сю до + оо есть достоверн ое собы тие,
в ероятн ость ко торого р — 1. А налитически это вы гляди т так:
253
+ оо
p i — оо < z < + оо)=
cp(z)dz = - —
J
V2*
e 2 d z = 1.
(9.4)
Т аки м о б р азо м , с п о м о щ ью (9.4) м ож н о легко рассчитать
вероятн ость у то го, что случайная величина z не вы йдет за
пределы и нтервала ( —иу, + и у). Такие вычисления были
п роделан ы , и их р езул ьтаты сведены в табл. 9.1.
Таблица 9.1
Вероятность того,
распределенная но
у=
1
ч/2я .
е
2
что нормированная случайная
нормальному закону, попадает
величина (at. = 0, о 2 = 1).
в интервал ( — иу, + и у)
rfz
и,
У
"у
У
"у
0
0,05
0.1
0,15
0,2
0,3
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
0
0,04
0,08
0,12
0,16
0,24
0,383
0,45
0,51
0,57
0,63
0,683
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,8
1,9
2,0
2,1
2,2
2,3
0,73
0,77
0,80
0,84
0,87
0,89
1,93
0,94
0,95
0,964
0,972
0,978
2,4
2,5
2,6
2,7
2,8
2,9
3,2
3,4
3,6
3,8 .
4,0
У
0,984
0.988
0,990
0,993
0,995
0,996
0,9986
0,9993
0,9997
0,99986
0,99993
К ак видно из таб л. 9.1, вероятн ость того, что случай­
ная величина х п опадает в интервал (а —а , а + ст), со ­
ставл яет 68,3% . Э то озн ачает, что при д о стато ч н о б о л ьш о м
числе измерений почти 2/3 р езу л ьтато в будут л еж ать в
это м интервале. В ероятность п опадания случайной величины
в интервал (а —2 а , а + 2 ст) равн а 95% , ины м и словам и ,
п рим ерно 5% р езу л ьтато в измерений вы ходит за пределы
а ± 2 а и т. д.
П риведем ещ е один прим ер и сп ользован и я таб л . 9.1. П усть
истинное значение оптической плотности культуральн ой ж идко­
сти при 540 нм Z)54O = 0 ,5 3 (a = 0,53), а среднее квадратичное
отклонение a = 0,03. О п редели м границы так о го си м м етри чн ого
и нтервала, чтобы при указанны х значениях а и а вероятн ость
попадани я р езу л ьтата изм ерения в это т и нтервал б ы л а равн а
у = 0,95. И з табли цы находим , что м0,95 = 2,0. П од ставл яя
в (9.4) значения a, а , и7 и у, получим:
р (0,53 - 2 • 0,03 < х < 0,53 + 2 • 0,03) = 0,95;
р (0,47 < х < 0,59) = 0,95.
254
И так, хотя н ельзя заранее п редсказать значение отд ельн ого
резу л ьтата, отягощ ен ного случайной погреш н остью , но в д ан ­
ном случае м ож но утверж д ать, что с вероятн остью 95%
р езу л ьтат о тд ел ьн о го изм ерения долж ен попасть в интервал
0,53 ± 0 ,0 6 .
9.4. ГЕН ЕРАЛ ЬН АЯ И ВЫ Б О РО Ч Н А Я С О В О К У П Н О С Т Ь .
РАСЧ ЕТ С Р Е Д Н Е Г О И Д И С П Е Р С И И П О В Ы Б О Р О Ч Н Ы М Д А Н Н Ы М
В р азо б р ан н о м выш е прим ере п ар ам етр ы а и с т пред­
п олагали сь известны м и, однако и сследователь обы чно не знает
их истинны х значений. Е го зад ач а как раз и состоит в том ,
чтобы по р езу л ь татам вы полненны х изм ерений оценить зн а­
чения а и ст2.
П редстави м , что при данны х условиях вы полнено беско­
нечно б о льш о е число изм ерений одной и той же величины.
П олученную бесконечную гипотетическую совокупность резуль­
т ат о в н азы ваю т генеральной совокупностью, а и ст2 — п арам етры
генеральной совокупности, их точное значение м ож но бы ло
бы найти, зн ая ли ш ь все элем енты генеральной совокупности.
И стинное значение изм еряем ой величины а, н азы ваем ое гене­
ральным средним, равн о
00
(9.5)
i= 1
где p(jc;)
вероятн ость появления р езул ьтата х ;. П ар ам етр ст2
п редставляет собой генеральную дисперсию, к о то р ая оп ред еляет­
ся равен ством
(9.6)
ст2 = X ( х , - а ) 2 р(х,).
1= 1
Л ю б у ю совокупность р езу л ьтато в изм ерений, вы полненную
при данны х условиях оп ы та, п рин ято р ассм атр и в ать как
случайную вы борку из ген еральн ой совокупности, т. е. как
вы борочную совокупность. (В эксперим ентальной практике
оп ы ты , р езу л ьтаты которы х со ставл яю т вы борочную совокуп­
н ость, н азы ваю т обы чно параллельными.) В ы борочная совокуп­
ность характеризуется значениям и вы борочны х п арам етров,
которы е являю тся функциями величин, составляю щ и х в ы б о р ­
очную совокупность. Ч то б ы четко разгран и ч и вать генеральны е
и вы борочны е п ар ам етры , для обозначения генеральны х
п ар ам етр о в исп ользую т греческие буквы, а вы борочны х
латинские. В ы борочное среднее оп ред ел яю т как среднее ари ф ­
м етическое величины г из я резул ьтатов измерений:
(9.7)
255
В ы борочную дисперсию вы чи сляю т по ф орм уле
п
(9.8)
З н ам ен атель в вы раж ении (9.8) характери зует число степеней
свободы д л я вы борочной дисперсии. Ч и сло степеней свободы
/ равн о числу независим ы х изм ерений минус число д о ­
полнительны х
связей,
н алагаем ы х
на эксперим ентальны й
м атер и ал в процессе его об раб отки . Т ак, на п независим ы х
р езу л ьтато в изм ерений при расчете среднего ариф м етического
н аклад ы вается
одна
связь
вида
(9.7),
п оэтом у
число
степеней свободы при определении вы борочной дисперсии
f = n - 1.
Н ередко д л я характеристики р азб р о са (расстояния) данны х
у к азы ваю т относительную погрешность, к о то р а я определяется
как отнош ение соответствую щ ей аб сол ю тн ой погреш ности
к среднем у значению изм еряем ой величины . О тносительное
вы борочное квадрати чное отклонение равн о wx~ S x-/xт Величина
wx~, вы раж енная в процентах, носит название коэффициента
вариации.
Д ля н агляд н ости приведем прим ер вычисления различны х
вы борочны х п ар ам етров. В резул ьтате семи измерений концен­
трац и и м е таб о л и т а в р астворе получены следую щ ие значения
(м М ): 108, 120, 106, 117, 121, 110, 109. П рои звед ем вычисления:
х=
1 0 8 + 1 2 0 + 1 0 6 + 1 1 7 + 1 2 1 + 110+109
7
= 113;
s 2 _ ( 1 0 8 — 1 1 3 ) 4 ( 1 2 0 - 113)2 + ( 1 0 6 - 1 1 3 ) 2 + (1 1 7 - 1 1 3 ) 4 ( 1 2 1 - 1 1 3 ) 4
+ ( 1 1 0 - 1 1 3 ) 2 + (1 0 9 - 1 1 3 ) 2
7 -1
(25 + 49 + 4 9 + 1 6 + 64 + 9 + 1 6 )
---------------- — -----------------------------------------7 -1
£*— 6,2; wx = 0,055,
6
= Зо‘
= 5,5% .
9.5. ЗА К О Н С Л О Ж ЕН И Я С Л У Ч А Й Н Ы Х
П О ГРЕШ Н О С ТЕЙ
П усть и зм еряем ая величина А является сум м ой (или
разн о стью ) двух величин В и С, р езул ьтаты изм ерений которы х
независим ы . Т о гд а если 5 ^ ,
S c — дисперсии величин А,
В, С, то м ож н о д о к азать, что S A= S l + S c или S A = s/ rS j+ ^ S ]:Если А является сум м ой не двух, а б ольш его числа
слагаем ы х, то закон слож ения погреш ностей будет так и м же,
т. е. средняя квадратичная погрешность суммы (или разност и)
нескольких величин равна корню квадратному из суммы дисперсий
отдельных слагаемых.
256
• И з закона слож ения погреш ностей следует д ва ч резвы ­
чайно важ ны х вы вода. П ервы й из них относится к роли
каж дой из погреш ностей в общ ей погреш ности резул ьтата.
Он состоит в то м , что значение отдельных погрешностей
очень быстро падает по мере их уменьшения. П усть В и С — два
слагаем ы х, определенны х со средними квад рати ч н ы м и п огреш ­
н остям и S B и Sc , причем известно, что Sc в д ва р аза меньш е,
чем S B. Т о гд а погреш ность сум м ы (А = В + С ) равн а
S \ = S l + S$ = S l + №
J = 5~ s l
(9.9)
откуда SA& \ , \ S B.
И наче говоря, о б щ ая п огреш н ость возросл а за счет меньш ей
погреш ности всего на 10%, что обы чно играет очень м алую
р ол ь. Т ак и м о б р азо м , если н еобходим о повы сить точность
изм ерений величины А, то нужно в первую очередь стрем и ться
ум еньш и ть ту п огреш н ость изм ерения, ко то р ая больш е, т. е.
погреш н ость изм ерения величины В.
С ледую щ ий вы вод, вы текаю щ ий из закона слож ения п о­
греш ностей, относится к определению погреш ности вы б о­
рочного среднего. П усть х 1( х 2, х 3, ..., х „ — результаты
отдельн ы х измерений, причем каж дое из них характеризуется
одной и той же дисперсией S 2. О б разуем величину у , равную
п
п
п
п
.
(9.10)
Д исперсия этой величины Sy в соответствии с зак он ом слож ения
погреш ностей определяется как
5 ? = ^ + ^ + ...+ ^ = ^ = - .
п
п
п
п
п
(9-11)
Н о у , по определению ,— это среднее ариф м етическое х из всех
значений х, или вы борочное среднее, п оэтом у м ож н о написать
Sy—Sx— S /^ /n .
Т ак и м о б р азо м , средняя квадратичная погрешность выборо­
чного среднего равна квадратичной погрешности отдельного
результ ат а, деленной на корень квадратный из числа измерений.
• Э то ф ун дам ен тальн ы й закон возрастани я точности при
росте числа измерений (разум еется, если точность резул ьтата
п олн остью определяется случайной погреш ностью ). И з него
следует, что при ж елании повы сить точность измерений в два
раза н еобходим о сд елать вместо од ного четы ре измерения,
а чтобы повы сить точность в 10 раз, нужно увеличить число
изм ерений в 100 р аз и т. д.
257
П ри практической раб о те очень важ но стр о го разгран и ч и вать
прим енение средней квад рати чной п огреш ности (вы борочной
дисперсии) отд ел ьн ого изм ерения Sx и вы борочной дисперсии
среднего ариф м етического Sx. П оследняя прим еняется всегда,
ко гд а нужно оценить погреш н ость то го числа, которое бы ло
получено в резу л ьтате всех произведенны х измерений. В тех
случаях, ко гд а нужно о х ар актер и зо в ать точность п рим ен яем ого
способа изм ерений, следует п рим ен ять величину Sx.
П оясним сказанное прим ером , которы й бы л приведен
в преды дущ ем подразделе. Речь идет о резу л ьтатах изм ерения
концентрации н екоторого м етаб о л и та. Н ап о м н и м , что в этом
случае .v = 113, Sx = 6,2, и’х = 5,5% . Т огда
2,3; w . = ? l , 100% = 2% .
Jn
J l
2,65
*
Т аким о б р азо м , если описы вается м етод, ко то р ы м п р ои зво­
дилось изм ерение, то у казы ваю т п огреш н ость Sx, т. е. 5.5% ,
но если описы вается точность полученного р езу л ьтата, то
х арактеристикой этой точности будет величина Sx, т. е. 2% .
9.6. О Ц Е Н К А П А Р А М Е Т РО В ГЕН Е Р А Л Ь Н О Й С О В О К У П Н О С Т И
НА О С Н О В А Н И И ВЫ Б О РО Ч Н Ы Х Д А Н Н Ы Х .
М ЕТО Д Ы И Н Т Е Р В А Л Ь Н О Г О О Ц Е Н И В А Н И Я
П ри о б р аб о тке р езу л ьтато в эксперим ента н еобходи м о всегда
п о м н и ть о различии м еж ду ген еральн ы м и и вы борочны м и
п ар ам етр ам и . Генеральные параметры являются постоянными,
характеризующими закон распределения результ ат ов измерений,
отягощенных случайными погрешностями, в то время как
выборочные параметры суть случайные величины. П оэтом у
и м ею т м есто л иш ь приближ енны е равен ства
а х х , a 2 & S 2,
(9.12)
ко то р ы е вы п олн яю тся тем точнее, чем больш е число прове­
денны х измерений.
Величины х и S 2 п ред ставл яю т собой точные оценки
генеральны х п ар ам етр о в , од н ако приближ енны е равен ства (9.12)
не д а ю т п редставления о точности, с кото р о й установлены
значения а и а 2. П оэтом у при об раб отке эксперим ентальны х
данны х обы чно и сп ользую тся м етоды интервального оцени­
вания, п о зво л яю щ и е рассчиты вать границы интервала, внутри
ко то р о го с зад ан н ой вероятн остью м ож ет н аходиться значение
ген еральн ого п ар ам етра. Ш ирина так о го и нтервала (или п о л о ­
вина его ш ирины ) определяется точ н остью р езу л ь тата и зм ере­
ний, а вероятн ость того, что оцениваем ы й п ар ам етр будет
л еж ать в пределах этого и нтервала, характери зует надеж ность
оценки.
258
Введем основны е понятия теории и нтервальн ого оценивания.
Доверительным интервалом неизвестного п ар ам етр а 0 назы ­
ваю т тако й числовой и нтервал (Г„, Т„), внутри которого
с заранее установленной вероятн остью у (которую иногда
н азы ваю т доверительн ой вероятн остью или коэф ф ициентом
надеж ности) м ож ет н аходиться истинное значение 0 , так что
р (Т я< 0 < Т „ ) = у.
(9.13)
Н иж ню ю Т„ и верхню ю Т„ границы д оверительн ого
и н тер вал а н азы ваю т доверительными границами. Величину
р = 1 —у н азы ваю т уровнем значимости, которы й показы вает,
н асколько часто при повторении вы борки наш е суждение
о п ар ам етр е 0 будет оказы ваться ош ибочны м .
Задача нахож дения д оверительны х и нтервалов р ассм атр и в а­
л ась в 9.3, правда, с той разницей, что т а м рассчиты вали
си м м етри чн ы й и нтервал, в которы й с вероятн остью у м ож ет
п опасть р езу л ьтат о тд ел ьн ого изм ерения х, если известны
значения а и а , а теперь речь идет о построении и нтервала,
ко то р ы й м о ж ет н акры ть значение а, если в результате
и зм ерения получена величина х и известно значение а .
Д оверительн ы е границы оп ределяю тся как функции о т ре­
зу л ь тато в п измерений, составляю щ и х вы борочную совокуп­
н ость, и вследствие случайного х арактера вы борки являю тся
случайны м и величинами. П о это м у при м н о го к р атн о м п о в то ­
рении серии изм ерений и полож ение, и ш ирина д оверительны х
и н тервалов будут изм еняться, однако в 100у% случаев
д оверительн ы е интервалы будут н акры вать истинное значение
оц ен иваем ого п арам етра.
П ри ведем прим ер построения доверительн ы х интервалов.
В резу л ьтате измерения концентрации м етаб о л и та в растворе
получено значение 108 м М . И з независим ы х данны х известно,
что п огреш н ость используем ого м е то д а изм ерений определяется
генеральной дисперсии а = 6. Н айдем доверительн ы е интервалы
д ля и стинного значения концентрации м етаб о л и та в растворе,
соответствую щ ие наиболее об щ еуп отреб и м ы м 95% -ной и 99% ной д о верительн ы м вероятностям .
Реш ая неравенства в (9.13) отн оси тельно а (см. таб л. 9.1),
получим у = р ( х - и уа < а < х + иуа). О тсю да д оверительн ы е гр а­
ницы равны
Т„ = х —иуа, Тп= х + и уа.
П од ставл яя сю д а значение и0у95 = 2 из таб л и ц ы , имеем
Тп= 1 0 8 - 2 - 6 = 96; Т = 108 + 2 - 6 = 120.
С л ед о вател ьн о , 96 < а < 120 (у = 0,95).
С оответствен н о «0 9 9 —2,58 и Т = 108 —2,58 -6 = 92,52;
= 108 + 2,58 • 6 = 123,48;' 92,52 < а < 123,48 (у = 0,99).
Т„ =
259
И так, чем больш е у, тем вы ш е н адеж н ость оценки, но тем
больш е и ш ирина довери тел ьн ого и нтервала, характери зую щ ая
погреш ность оценивания. Т аки м о б р азо м , д ля характеристики
величины случайной п огреш ности н еобходи м о у казать ш ирину
д овер и тел ьн о го и нтервала и доверительн ую вероятность. У ка­
зание одного то л ьк о довери тел ьн ого и н тервал а лиш ено см ы сла,
так как при это м неизвестно, сколь надеж ны полученные данны е.
П ри построении довери тел ьн ого и нтервала для а на
основании о тд ел ьн ого изм ерения исходили из того, что
р езу л ьтат это го измерения взят из генеральной совокупности
с н о р м ал ьн ы м зак он ом распределения. В ообщ е говоря, чтобы
найти д оверительн ы й и нтервал для ген еральн ого п ар ам етр а
исходя из какой-либо вы борочной характеристики, нужно зн ать
закон распределения этой характеристики.
Р ассм отри м м етоды нахож дения доверительн ы х интервалов
д л я ген еральн ого среднего на основании вы бороч н ого среднего.
Ч то бы п о стр о и ть д оверительн ы й и нтервал для а исходя из
х, необходи м о зн ать закон распределения средних ари ф м ети ­
ческих. В зави си м ости о т то го , р асп ол агает ли исследователь
знанием ген еральн ой дисперсии а или ем у известна л иш ь ее
вы борочная оценка S 2, распределение значений х подчиняется
р азли чн ы м законам . Э ти законы изучены д л я вы борок из
н о р м ал ьн ы х совокупностей, с которы м и чащ е всего приходится
им еть дело на практике. С редние ариф м етические х для
вы борок, содерж ащ их п элем ентов, взяты х из н о рм ал ьн ой
совокупности с п ар ам етр ам и а и а , такж е подчиняю тся
н о р м ал ьн о м у распределению с тем же сам ы м значением
генерального среднего и генеральной дисперсии ст|, равной,
как следует из преды дущ его п араграф а,
(9.14)
В водим вм есто случайной
случайную величину
величины
х
н орм и рован н ую
П ользуясь таб л . 9.1 н о р м ал ьн о го распределения, м ож но
найти два таких ч и с л а - иу и + н у, д л я которы х вы полняется
условие
(9.16)
откуда
ст
_,
ст
х —иу— < а < х + и у—
260
(9.17)
Таблица 9.2
Величины (, для различных значений доверительной вероятности у
Доверительная вероятность
Число
степеней
свободы
/
0,9
0,95
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
6,314
2,920
2,353
2,132
2,015
1,943
1,895
1,860
1,833
1,812
1,796
1,782
1,771
12,706
4,303
3,182
2,776
2,571
2,447
2,365
2,306
2,262
2,228
2,201
2,179
2,160
0,99
63,657
9,925
5,841
4,604
4,032
3,707
3,499
3,355
3,250
3,169
3,106
3,055
3,012
0,999
636,619
31,598
12,941
8,610
6,859
5,959
5,405
5,041
4,781
4,578
4,437
4,318
4,221
Число
степе­
ней сво­
боды /
0,9
0,95
0,99
0.999
14
15
16
17
18
19
20
30
40
60
120
00
1,761
1,753
1,746
1,740
1,734
1,729
1,725
1,697
1,684
1,671
1,658
1,645
2,145
2,131
2,120
2,110
2,101
2,093
2,086
2,042
2,021
2,000
1,980
1,960
2,977
2,947
2,921
2,898
2,878
2,861
2,845
2,750
2,704
2,660
2,617
2,576
4,140
4,073
4,015
3,965
3,922
3,883
3,850
3,646
3,551
3,460
3,373
3,291
Доверительная вероятность
Т ак п рои звод и тся и н тервальн ое оценивание ген еральн ого
среднего в т о м случае, ко гд а известно значение генеральной
дисперсии а 2. Н а п ракти ке это реализуется, когд а изм ерения
п р о во д ятся с п о м о щ ь ю уже хорош о и сследованного м етода,
погреш н ость ко то р о го , а след овательн о, и величина сг2
известны . Н о часто погреш н ость м е то д а п риходи тся оп ределять
в процессе изм ерений. П ри это м м ож н о оп редели ть тол ьк о
величину вы б ороч н ой дисперсии S 2, соответствую щ ую то м у
или ином у, но обы чно н еб ольш ом у числу изм ерений п. В это м
случае распределение среднего ари ф м етического отли чается от
н о р м ал ь н о го особенно сильно, когд а число изм ерений п м ало .
Э то об условлено п оявлен ием д оп о л н и тел ьн о го и сточника не­
определенности, связан н ого с н етож дественн остью величин а 2
и S 2. П ри построении доверительн ы х и н тервалов исходят из
так н азы ваем о го распределения Стьюдента или /-распределения.
Э то распределение им еет случайная величина
/= -^ = .
S J yfi
(9.18)
Р аспределение С тью д ен та зави си т то л ьк о о т числа степеней
своб о ды f —n — 1, связан н ого с вы б ороч н ой дисперсией S 2.
К ривы е распределения С тью д ен та н ап о м и н аю т по ф орм е
кривы е н о р м ал ь н о го распределения, но д л я м алы х значений
/ они зн ачительн о м едленнее сб л и ж аю тся с осью абсцисс при
| / | - ю о . П ри / = о о /-распределение совп ад ает с н орм ал ьн ы м .
В ероятн ость то го , что при д овери тел ьн ой вероятн ости
у случайная величина (9.18) п оп адает в си м м етри чн ы й интервал
с доверительны ми границами ( —/у, + /у), определяется выражением
261
В таб л . 9.2. д л я разли чн ы х у приведены t y, которы е при
д ан н о м / у д о вл етво р яю т соотн ош ени ю (9.19).
Д л я и н тер вал ьн ого оценивания ген еральн ого среднего об ы ч ­
но п о льзу ю тся следую щ и м вы раж ением , полученны м из (9.19):
p l x - t y^= < a < x + t y- ^ )= у .
V
V”
V й/
(9.20)
s
s
Величины ty —~z и ty —jz н азы ваю т доверительными погрешу/п
Jn
ностями среднего ари ф м етического и о б о зн а ч а ю т си м вол ом
Ау. Т ак и м о б р азо м , р езу л ь тат изм ерений следует зап и сать
в виде
х ± Ду,
указы вая при это м п риняты й уровень д овери тел ьн ой в ер о ят­
ности у. О тн оси тельны е п огреш ности х обы чно о б о зн а ч а ю т о у.
Д л я и лл ю стр ац и и рассм отрен н ого м а тер и ал а приведем
п рим ер. Т ри последовательны х изм ерения х оптической п л о т н о ­
сти ку л ьту р ал ьн ой ж идкости д ал и резу л ьтаты 0,53, 0,49, 0,60.
О п редели м погреш н ость среднего ари ф м етического при 95% ной д овери тельн ой вероятности:
_ _ 0,53 + 0,49 + 0,60 _ 1,62 _ п
х
-
-
J
3
К Л '
U, jT,
с 2 _ (0,53 - 0,54)2 + (0,49 - 0,54)2 + (0,60 - 0,54)2 _
2
_ 1 1 0 - 4+ 25
1 0 -4
36 10~4 _ _ j
10_4.
2~
2
S « 5 , 6 1 0 ~ 2.
И з таб л . 9.2 н аходим д л я у = 0,95 / = 2, гО 95 = 4,30. Т огд а
5
а
0,95
0,95
_ 4,3 • 5,6 1 0 - 2 _ 24,08 1 0 - 2 _ п , „
----------- 3
Д л я сравнения вы числим
распределения (и0 95 = 1,96):
ГТЗ
р езу л ь тат
U’ 14-
для
н о р м ал ьн о го
А о,95= 1,96' 5’36 ' 10~2 « 0 ,0 6 .
Видно, ч то р езу л ь тат в случае прим енения н о р м ал ь н о го
распределения получился бы заниж енны м .
9.7. Н Е О Б Х О Д И М О Е Ч И С Л О И ЗМ Е Р Е Н И Й
Д л я ум еньш ения случайной п огреш ности р езу л ь тата м огут
б ы ть и сп ользован ы д ва пути: улучш ение точности изм ерений,
т. е. уменьш ение величины Sx, и увеличение числа измерений,
т. е. и сп ользование соотнош ения
■5; = 4 = .
(9-21)
V й
Остановимся на последнем приеме. Будем считать, что все воз­
мож ности соверш енствования техники измерений уже использова­
ны, при это м систематическая погреш ность измерений равна 8.
Ранее бы ло отмечено, что уменьш ать случайную погреш ность це­
лесообразно только до тех пор, пока общ ая погреш ность измере­
ний не будет полностью определяться систематической погреш ­
ностью . Д ля этого необходимо, чтобы доверительны й интервал,
определенный с выбранной доверительной вероятностью , был
существенно меньше систематической погреш ности, т. е.
Ду ^ 8.
(9.22)
К акое соотнош ение величин Ду и 8 м ож но считать удовлет­
воряю щ им условию (9.22)? В кинетических исследованиях выраже­
нию «много больш е» соответствует отнош ение сравниваемых
g
величин 10 и больш е, т. е. в то м случае, когда Ду ^ —, условие
(9.22) мож но считать
И ногда мож но удовлет8
вориться гораздо менее жестким требованием Ду < - или даже
3
8
Ду ^ .
2'
выполненным.
Д оверительная вероятность у, с какой в данном случае
определяю т доверительную погреш ность х, практически не
превыш ает 0,95. Д ля оценки необходимого числа измерений
было проведено множество вычислений при различных у и раз­
личных соотнош ениях между Ду и а . Результаты суммированы
в табл. 9.3, в которой Ду выражено в долях выборочной
дисперсии Sx. П риведем пример пользования этой таблицей.
К оэф ф ициент вариации
W д л я н екоторого изм ерения
со ставл яет 2,5 % ; систем атическая ош и бка изм ерений 8 = 2% .
С колько изм ерений нужно п роделать, чтобы случайная ош ибка
практически не и гр ал а роли?
g
Задади м ся м и н и м ал ьн ы м условием Ду < - и д оверительн ой
вероятн о стью 95% . Т ак как
в отн оси тельны х единицах, то
Д
= 5 = 1% ;
2
’
все
погреш ности
е= ^ =
S
вы раж ены
= — = 0,4.
W
2,5
263
Таблица 9.3
Необходимое число измерений для получения случайной погрешности s с д о­
верительной вероятностью
У
* 4s x
0,5
0,7
0,9
0,95
0,99
0,999
1,0
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,05
0,01
2
3
4
6
13
47
180
450
3
6
8
13
29
110
430
1100
5
13
19
32
70
270
1 100
27000
7
18
27
46
100
390
1500
38000
11
31
46
78
170
700
2700
66000
17
50
74
130
280
1 100
4 300
110000
И з таб л . 9.3 н аходим , что д л я 7 = 0,95 и е = 0,4 необходи м ое
число изм ерений /1 = 27.
И нтересно зн ать, сколько нуж но сд ел ать изм ерений, если
н ал о ж и ть ещ е менее ж есткое требован ие, а именно: чтобы
систем атическая и случайная погреш н ости бы ли п рим ерн о
равны . В это м прим ере е = 0,8 и при у = 0,95 из той же
таб л и ц ы экстраполяцией н аход и м п к \ 2 .
И з этих п рим еров м ож н о сд ел ать заклю чение, что увели­
чением числа изм ерений м ож н о устран и ть влияние случайной
п огреш н ости на резу л ьтат то л ьк о в т о м случае, если вы ­
бо р о чн ая дисперсия не более чем в несколько раз превосходит
си стем атическую погреш ность. Р еально это в озм ож н о, если
^ 5 5 . П ри больш и х значениях S(x) д л я сущ ественного
ум еньш ения роли случайной ош ибки уже треб ую тся сотни
и ты сячи измерений* как это видно из таб л . 9.3. В таких
случаях д л я ум еньш ения п огреш ности р езу л ь тата н еобходи м о
р ад и кал ьн о м енять м етоди ку изм ерений, с тем чтобы ум ень­
ш и ть случайную погреш ность.
9.8. О Б Н А Р У Ж Е Н И Е П Р О М А Х О В
П ри проведении р яд а один аковы х изм ерений, подверж енны х
случайны м
п о греш н остям ,
м о гу т
встрети ться
изм ерения
и с очень б о льш и м и случайны м и погреш н остям и . О днако,
как известно, больш и е погреш ности и м ею т м алую вероятн ость,
и если среди р езу л ь тато в изм ерений встрети тся одно, им ею щ ее
резко отли чн ое о т других значение, т о м ож ет п оявиться
со б л азн квал и ф и ц и ровать его как п ром ах и не уч и ты вать его
как зав ед о м о неверный. В такой операции всегда присутствует
известная д о л я субъекти ви зм а. Д ля объективи зац ии о тб р асы ­
вания непонравивш егося изм ерения н еоб ходи м о ввести опреде­
ленны й количественны й критерий, осн ован ны й на законах
теории вероятности.
264
Если известно точное значение генеральной дисперсии а ,
то вероятн ость появления значения, о ткл он яю щ егося о т сред­
него ариф м етического х более чем на З а , равн а 0,003 и все
изм ерения, отличаю щ иеся от х на эту или б ольш ую величину,
м огут б ы ть классиф ицированы как пром ахи и отброш ен ы как
очень м аловероятн ы е. П ри это м нужно пом нить: сущ ествует
очень м а л а я вер о ятн о сть того, что отброш ен н ое число является
не п р о м ах о м , а естественны м статистическим отклонением .
О днако если тако й м ал о в ер о ятн ы й случай и п роизойдет, т. е.
будет н еправильно отб рош ен один из резу л ьтато в измерений,
то это практически не приведет к сущ ественном у ухудш ению
оценки р езу л ьтато в измерений.
С ледует и м еть в виду, что для совокупности измерений
вероятн ость проявления изм ерения, отли чаю щ егося более чем на
З а о т среднего значения, всегда больш е 0,003, а вероятность Р того,
что ни один из р езу л ьтато в п измерений не будет отл и чаться от
среднего более чем на З а , не 0,997, а равна Р = (1 —0,003)". Если п не
сли ш ком больш ое, то Р = (1 —0,003)"» 1 —0,003л.
П ри 100 изм ерениях вероятн ость того, что хотя бы одно
будет случайно о тл и чаться от среднего более чем на З а ,
составит о ко л о 30% . О бы чно число п роизводим ы х измерений
не очень в е л и к о — сравн и тельно редко оно п ревы ш ает 10 — 20.
П ри это м точное значение неизвестно, поэтом у отб р асы в ать
изм ерения, отли чаю щ иеся от среднего более чем на З а , нельзя.
Д л я оценки вероятностей Р случайного появления вы скаки­
ваю щ их значений в ряду п изм ерений (для п < 25) на основании
р езу л ьтато в , д аваем ы х теорией вероятн ости, б ы л а составлена
табл. 9.4. Д л я п ользован и я этой таблицей необходи м о вы ­
числить х из всех изм ерений, вклю чая п одозреваем ое х к, которое
каж ется недопустим о б ольш и м или м ал ы м . Д алее вы числяем
отн оси тельное отклонение этого изм ерения о т среднего ари ф м е­
тического, вы раж енное в д олях вы борочной дисперсии:
(9.23)
V—
Таблица 9.4
Оценка выскакивающих измерений в ряду измерений для вероятности
Р
и
3
4
5
6
7
8
9
З а к 544
Р
п
0,1
0,05
0,025
0,01
1,41
1,65
1,79
1,89
1,97
2,04
1,41
1,69
1,87
2,00
2,09
2,17
1,41
1,71
1,92
2,07
2,18
2,27
1.41
1,72
1,96
2,13
2,27
2,37
9
10
11
12
13
14
0,1
0,05
0,025
0,01
2,10
2,15
2,19
2,23
2,26
2,30
2,24
2,29
2,34
2,39
2,43
2,46
2,35
2,41
2,47
2,52
2,56
2,60
2,46
2,54
2,61
2,66
2,71
2,76
265
Продолжение табл. 9.4
Р
п
15
16
17
18
19
20
Р
п
0,1
0,05
0,025
0,01
2,33
2,35
2,38
2,40
2,43
2,45
2,49
2,52
2,55
2,58
2,60
2,62
2,64
2,67
2,70
2,73
2,75
2,78
2,80
2,84
2,87
2,90
2,93
2,96
21
22
23
24
25
0,1
0,05
0,025
0,01
2,47
2,49
2,50
2,52
2,54
2,64
2,66
2,68
2,70
2,72
2,80
2,82
2,84
2,86
2,88
2,98
3,01
3,03
3,05
3,07
П о таб л . 9.4 н аходим , какой вероятн ости Р соответствует
полученное значение v. Если вероятн ость р п одозреваем ого
изм ерения < 0 ,0 1 , то его следует отб роси ть; соответствен но если
Р > 0,1, то п одо зреваем ое измерение следует непременно о ста­
вить. П ри пром еж уточны х значениях ( 0 ,1 > Р > 0 ,0 1 ) п ред ставл я­
ется о дин аково п рави л ьн ы м л ю бое из этих действий. П р о и л ­
л ю стр и р у ем сказанное п рим ером . П ри проведении 10 изм ерений
оптической плотности при 540 нм культуральн ой ж идкости
получены следую щ ие значения: 0,62, 0,64, 0,59, 0,59, 0,63, 0,61,
0,49, 0,60, 0,63, 0,60. В ряду н аблю дений вы зы вает подозрение
седьм ой р езу л ьтат. М ож н о ли его сч и тать п ром ахом ? И так,
* = 0,60; S l o = 1 0 ~ 2
)
,--: = 10 “ 2 ^ /1 8 = 0,0324.
Д ля седьм ого резу л ьтата
0 ,6 0 -0 ,4 9
-
.
< ш г =Ъ А
И з таб л. 9.4 следует, что д л я г = 3,4 и п = 10 р < 0 ,0 1 . Т аки м
образцом, седьм ой резул ьтат, наверняка, является п р о м ах о м
и его м ож н о отб роси ть. И з оставш ихся девяти изм ерений
проведем п одобн ую проверку д л я в то р о го результата:
Jc = 0,61;
S 9 = 1 0 ~ 2 / - = 1 0 - 2 У з ^ 5 = 0,019;
г=
0 ,6 4 -0 ,6 1
0,019
= 1,58.
И з таб л. 9.4 видно, что д ля г = 1 ,5 8 и п = 9 Р > 0,1 и второй
резу л ьтат следует непрем енно оставить.
9.9.
О Ц Е Н К А Т О Ч Н О С Т И РЕЗУ Л ЬТА ТО В К О С ВЕН Н Ы Х И ЗМ Е Р Е Н И Й
Д о сих пор речь ш л а о резул ьтатах непосредственных,
или прямы х, измерений, т. е. таких изм ерений, при которы х
непосредственно определяется интересую щ ая величина. Н о
266
, в эксп ери м ен тальн ой р аб о те редко удается огран и чи ваться
вы полнением п рям ы х изм ерений, чащ е п ровод ятся косвенные
I изм ерения, при которы х п одлеж ащ ая определению величина
I п ред ставляет собой некоторую функцию от непосредственно
I и зм еряем ы х величин, отягощ ен ны х случайны м и погреш ностям и.
Н ап р и м ер , при определении количества вы деливш егося газооб | разн о го п р о ду кта непосредственно и зм ер я ю т его концентрацию
в газо во й ф азе и об ъем газовой фазы . Д л я определения
оптической плотности (при 540 нм культуральн ой ж идкости)
в определенной фазе ро ста непосредственно и зм ер я ю т / ) 540
исходного р аство р а с нерастущ ей культурой (холостой опы т,
ф он) и сум м арн ую D 540 культуральн ой ж идкости, растущ ей
культуры и ф она. В подобны х случаях возникает задача
оценки погреш ностей косвенны х измерений.
С реднее ариф м етическое и погреш ность резу л ьтата косвен­
ных изм ерений м ож н о вы числить двояко. Во-первых, м ож но
в о сп о л ьзо ваться м ето д ам и , прим ен яем ы м и д л я оценки п огреш ­
ностей непосредственны х изм ерений. П редп ол ож и м , н еобходи­
м о найти значение у , связан ное ф ункциональной зави си м остью
с лу, х 2, ..., х„, ко торое определяется в результате прям ы х
измерений:
y = f { x u х 2, ..., х к).
(9.24)
П усть процедура изм ерений о р ган и зо ван а так, что каж дом у
оп р ед еляем ом у значению у { отвечает совокупность изм ерений
х и , x 2 i , —» х к г Т огд а д л я каж дого г-го изм ерения м ож но
рассчитать y = f [ x l i, x 2 i, ..., х к *) и обы чны м и м ето д ам и найти
среднее ариф м етическое и п огреш н ость р езу л ь тата косвенны х
и зм ерений (9.7) — (9.8), а такж е рассчитать доверительн ы е
и нтервалы (9.17).
Д ругой путь расчета основан на исп ользован и и закона
накопления погрешностей. В соответствии с эти м зак он ом
среднее значение и вы борочную дисперсию м ож но ап п рокси м и ­
р о в ать вы раж ениям и
y = f { x 1 , х 2, ..., x k) = g ( x 1, х 2,
I
х к);
(9.25)
<9'26)
где S * , S l , ..., S i — вы борочны е дисперсии случайны х значений
| A'j, x 2! ... x k. С оотнош ен ие (9.26) сохраняет силу в тех случаях,
когд а вм есто вы борочны х дисперсий в него п одставл яю тся
генеральны е дисперсии ст*, или к вад раты погреш ностей, вычисI ленны х при в ы б р ан н ом уровне д оверительн ой вероятн ости
I Д у 2 (х(). П р о и л л ю стр и руем закон н акопления погреш ностей:
I
1.
П усть у = Лх + В, где А и В
" 5
у = А х + В\ S j =
п арам етры , то гд а
12
S l = A Si .
r J A x+B)
2.
(9.27)
Если y = x l —x 2, то y = x 1—x 2;
л
"12
Sl +
s y2
dx
( x l - x 2)
S 2X = S X
2 +SX
2
(9.28)
3. Если y==xi / x 2, то y = x l / x 2',
.2
s 2= 1 7 . дх1 Vx2 .
4. ЕСЛИ
55 + (i ^d x-2( \ x—2 11 S l =
c2
v2
xj
x\
•*j
1 o2
J
(9.29)
= ATi, x 2, t o y = x l x 2,
S 2= x l S 2 + x \ S 2 .
(9.30)
М ож но п о казать, что если погреш ности изм ерений м алы по
сравнению с и зм еряем ой величиной, то об а сп особа д аю т
практически тож дественны е резу л ьтаты и п оэтом у безразлично,
каким из них п ользоваться. Здесь реком ендуется руковод ство­
ваться практическим и уд обствам и расчета, а с этой точки зрения
второй способ представляется менее труд оем ким . К р о м е того,
если результаты измерений распределены по н орм ал ьн ом у закону,
то закон распределения значений у, вообщ е говоря, м ож ет бы ть
отличен от н о р м ал ьн о го . П о это м у д л я определения д о вери тел ь­
ных и н тервалов лучш е п о л ьзо в аться в то р ы м способом .
В заклю чение д л я и ллю страц и и об суж д аем ого м атер и ал а
воспользуем ся п рим ером из преды дущ его раздела. П ри прове­
дении девяти измерений Z)540 культуральн ой ж идкости получе­
ны следую щ ие значения: 0,62, 0,64, 0,59, 0,59, 0,63, 0,61, 0,60,
0,63, 0,60. О ценим погреш н ость часто и сп ользуем ой в м и кр о ­
б иологи и величины lnZ>.
И так,
^
0,62 + 0,64 + 0,59 + 0,59 + 0,63 + 0 ,6 1 + 0 ,6 0 + 0,63 + 0,60
и = -------------------------------
= 0,612;
0,019
50 = 0,019; 5 5 = - ^ = 0,006; 1п/) = 1п0,6 1 2 = -0 ,4 9 1 ;
v "
0 0 6 = 0 ’0 1 °
9.10. О Ц Е Н К А П А Р А М Е Т РО В Л И Н Е Й Н О Й ЗА ВИ С И М О С ТИ
М Е Т О Д А М И Р Е Г Р Е С С И О Н Н О Г О АН АЛ И ЗА
Н ередко во зни каю т задачи , когда исследуем ая величина
меняется с изменением условий оп ы та и зад ач а измерений
со сто и т в нахож дении п ар ам етр о в ф ункциональной зависим ос268
ти, которы е наилучш им о б р азо м оп исы ваю т закон изменения
интересую щ ей величины. Д л я реш ения подобны х задач н аи бо­
лее часто исп ользую т специальны й вы числительны й прием,
н азы ваем ы й методом наименьших квадратов (М Н К ) (при этом
п редполагается, что вид ф ункциональной зави си м ости известен).
О днако, как б ы ло показано ранее, м а л о определи ть какую -либо
физическую величину, н еобходи м о ещ е оценить погреш ность
полученного значения. С очетание М Н К с м атем ати к о -стати сти ­
ческими м ето дам и оценки получило название регрессионного
анализа. В это м разделе будет рассм отрен простейш ий случай
регрессионного ан ал и за — построение линейного уравнения для
одной независим ой переменной.
П усть им еется совокупность эксперим ентальны х значений
; величины у в зави си м ости о т х:
причем известно, что связь м еж ду у и х вы раж ается линейны м
уравнением
у = а + Ьх,
(9.31)
где а и b — постоянны е п арам етры , или коэффициенты р е г­
рессии.
П ри п одстан овке эксперим ентальны х значений х и у в урав­
нение (9.31) п р авая часть практически всегда будет отличаться:
y l —a —b x i = e t ;
у 2 —а —Ьх2 = г 2,
(9.32)
y n- a - b x = E,
Значения отклонений е,- зави сят как о т случайны х п огреш н ос­
тей измерений, так и от вы бора определенны х значений
п ар ам етр о в а и Ь. Н аиболее вероятны е значения коэффициентов
регрессии п олучаю тся при условии, что сум м а квад ратов
отклонений будет наим еньш ей, т. е.
п
n
(9.33)
i= 1
i= 1
П оскольку условиям м и н и м ум а (9.33) отвеч аю т
н ы м о б р азо м вы бранны е значения п ар ам етр о в а и
взять соответствую щ ие п роизводны е и п риравн ять
(используется известная м атем ати ч еская теорем а, что
м ум е функции п роизвод ная всегда равн а нулю):
сп ециаль­
Ь, м ож но
их нулю
в экстре­
269
д_
Е
да .1 = 1
д_
дь
В ы п о л н яя
ходим
(yi~a - b x f ] = Е 2(у| - о - 6 д с ,) ( - 1 ) = 0;
(9.34)
i= 1
Е ( t t - e - * * i ) 2] = E 2 ( y , - a - b x , ) ( - x , ) = 0.
(9.35)
i —1
i = 1
н есл ож н ы е
п р е о б р а зо в а н и я и у п р о щ ен и я,
п
на­
п
Е
У г - п а - Ь Е *г = 0;
‘V
„ i=1
„
Е x , y t - a Е x , - b Е x f —0.
i=1
i=1
(9.36)
i=l
О тсю да м ож н о оп редели ть наилучш ие значения а и Ь.
Реш ая систему уравнений (9.36) отн оси тельн о а и Ь, приходим
к следую щ и м соотнош ениям :
Z у> Z
.__<= !
*=1
х ‘ ~
Z
«=1
x i
Z ад
i=l
Z ад.- - Z Z л
^ = ^ ----- т Ч - т Ь
и Z ад I Z *<
п
(9.37)
x i
(9-38)
где п — число эксп ери м ен тальн ы х точек, каж дой из которы х
соответствует эмпирическое значение у ,= /( * ;) .
Т еория д ает возм ож н ость вы числить такж е дисперсии
уклонения точек от п рям ой и дисперсию коэф ф ициентов а и Ь.
Если п о дстави ть значения а и Ь, рассчитанны е из (9.37)
и (9.38), в (9.31), то м ож н о найти значение у, п редсказы ваем ое
линейны м уравнением , полученны м по м етод у наим еньш их
квад р ато в. Д исперсия, характери зую щ ая рассеяние эксперим ен­
тал ьн ы х значений y t отн оси тельн о соответствую щ их точек на
п р ям о й
определяется вы раж ением
Z 0'i - л )2
S 2o = ‘~-l n_ 2
,
а дисперсии коэф ф ициентов регрессии — вы раж ен и ям и
270
(9.39)
Зная S„ и Sb, м ож н о оценить п огреш н ость значений а и b при
д овери тельн ой вероятн ости у:
Л УИ = ' А ;
Л > Н А ,
(9-42)
(9.43)
где ty — доверительн ы е границы распределения С тью д ен та при
числе степеней своб оды f —m —2 (см. таб л . 9.2).
9 К ак видно, вычисления по м етоду наим еньш их к в ад р ато в
д остато ч н о гром озд ки . Б о л ь ш и м п одспорьем в это м
деле
является реали заци я описанной вы числительной процедуры на
электрон но-вы числи тельн ой м аш ине. В н астоящ ее врем я су­
щ ествую т стан д ар тн ы е п р о гр ам м ы , п озволяю щ и е провести
оценки п ар ам етр о в линейной регрессии по М Н К в очень
короткие сроки и с вы сокой степенью точности. П рави л а
п ользо ван и я этим и п р о гр ам м а м и просты и не м огут п ред ста­
вить особы х трудностей д л я исследователей.
ЗА К Л Ю Ч Е Н И Е
О сновная цель книги состои т в д ем он страци и того ф акта,
что, несмотря на каж ущ ую ся сложность протекающих процес­
сов, рост микробных популяций мож ет быть интерпретирован
на молекулярном уровне, экспериментально изучен и найдены
уравнения, количественно описывающие рост микробных клеток.
Ч и тател ь, у ко то р о го хвати ло упорства довести изучение этого
п ред м ета д о конца, долж ен б ы ть уже убежден в эф ф ективности
и п ло д о тво р н о сти р азви того в книге биокинетического подхода.
Г л авн ое преим ущ ество количественного подхода зак л ю ч ает­
ся в сущ ественном расш ирении инф орм ац ии о свойствах
систем ы при условии, что вы явлены и записаны в виде
уравнений основны е законом ерн ости , описы ваю щ ие поведение
системы . Если известны числовы е значения п арам етров, входя­
щих в уравнения, то м ож н о количественно определить х аракте­
ристики систем ы при л ю б о м п р ои звол ьн ом времени процесса,
значении p H , концентрации суб страта, инги битора и т. п.
Уравнения в свернутой форме несут в высшей степени богат ую
информацию о свойствах системы. И м енн о п оэтом у л ю б ая
о тр асл ь науки стрем и тся вы йти на уровень м атем атических
обобщ ений. В м и кроби ологи и п роделан ы определенны е ш аги
в это м направлении.
Д р у гая важ ная особенность р азви того в книге подхода — ис­
пользование биокинетики для изучения механизмов процессов.
Л о ги к а кинетического и сследования вклю чает стади ю экспери­
м ен тальн о го изучения поведения систем ы во времени, стади ю
построения гипотез о м еханизм е процесса и тран сф орм ац и и
гипотез в кинетические схемы . О собенностью кинетики является
однозн ачн ы й переход о т кинетической схемы к системе
д иф ф еренциальны х уравнений, описы ваю щ их дин ам ику процес­
са. П остроен ная таки м о б р азо м систем а диф ф еренциальны х
уравнений имеет, как п равило, единственное реш ение, которое
и сследователь м ож ет соп остави ть с полученны м и эксперимен­
тал ьн ы м и дан ны м и . В руках и сследователя оказы вается м етод,
д аю щ и й критерий справедливости той или иной гипотезы
о м еханизм е процесса. С оответстви е количественного реш ения
с эксперим ентом является кри тери ем истинности используем ы х
представлений.
М олекулярно-биологические м еханизм ы оп ределяю т н ап рав­
ление и скорость роста м и кробн ы х популяций. В данной
книге сделана п опы тка связать кинетику молекулярно-биоло­
гических процессов с макроскопической кинетикой рост а и эво­
люции микробной популяции. Ч и тател ю долж н о б ы ть ясно,
что в этой о б ласти главны е реш ения ещ е впереди. Р азвити е
исследований связан о с создан и ем кинетических основ эксп­
рессии гена — н овой области , привлекаю щ ей в настоящ ее врем я
активное вним ание исследователей. Кинетические исследования
п о м о гу т реш ить м ногие п робл ем ы генетической и клеточной
инженерии.
И спользуем ы е и разви ты е в книге п одходы наиболее
прим ен им ы к ан али зу ро ста м и кробн ы х популяций. В последние
год ы активное р азви тие п олучаю т эксперим ентальны е и теоре­
тические исследования в об ласти культиви рован ия клеток
ж ивотны х и человека. М ногие уравнения, п роан али зи рован н ы е
выш е, п ригодны и д л я ан ал и за кинетики ро ста клеточны х
популяций в культуре ткани человека и ж ивотны х. О днако
как эксп ери м ен тальн ая техника культиви рован ия, так и кине­
тическое описание процесса в это м случае сущ ественно сложнее,
чем при м и кр о б н ом росте. У правление клеточн ы м и популяци­
ям и в культуре ткани осущ ествляется как на уровне влияния
су б стратов, так и на уровне рецепторно-ф ерм ентны х систем,
связанны х с участием специфических ф акторов ро ста различной
п рироды . П о-ви д им ом у, ближ айш ие годы будут хар актер и зо ­
ваться б о льш и м прогрессом в этом направлении.
ЗА ДАЧ И
Глава I
1.1. В ходе исследования процесса клеточного деления удалось вычленить
и количественно описать несколько стадий:
S + N ^ X , -Xi X 2 ^
2N ,
(1)
Р
где Tj, т 2, т3— характеристические времена соответствую щ их стадий. О преде­
лить р. рт и К,, если при S 0 = 10 г/л Т! = 1ч, т2 = 1 ,2 5 ч , т 3 = 1,25 ч.
1.2. Вывести выражение для зависимости концентрации продукта, обр азую ­
щ егося на третьей стадии процесса ( 1 ), от времени и определить его
концентрацию через 10 ч, если Р 0 = 0 , a N o/ y p= 0 ,l г/л.
1.3. В результате определения зависимости удельной скорости роста трех
различных культур от концентрации лимитирующ его субстрата были получены
следую щ ие экспериментальные данные:
р, ч 1
So,
м
2 - 10 “ 4
5- К Г 4
8 10 "4
КГ3
2 -10 “ 3
4' К Г 3
8 10 3
КГ2
2 10 2
4- К Г 2
культура № 1
культура № 2
культура № 3
0,058
0,116
0,163
0,173
0,231
0,277
0,308
0,315
0,330
0,338
0,076
0,194
0,290
0,311
0,427
0,519
0,581
0,595
0,625
0.641
0,170
0.345
0,435
0,479
0,586
0,658
0,700
0,709
0,727
0,737
Определить для каждой из трех культур, оказывает ли старение клеток
влияние на механизм микробиологического роста, и найти количественные
значения р т , К, и 1,
1.4. Воспользовавшись экспериментальными данными предыдущ ей задачи,
определить пороговые минимальные концентрации субстрата, ниже которых
рост всех трех культур невозможен.
1.5. Определить параметры уравнения Тейсиера исходя из данных,
представленных ниже:
S0, мМ
1
2
3
5
...............
р, ч
..........0,048
.................... ..........0,091
............... ..........0,130
.................... .......... 0,197
1
S0, мМ
7
10
20
00
Ц> ч
1
.................. ........... 0,248
................. ........... 0.316
................. ........... 0,432
.................. ........... 0,5
1.6. При исследовании удельной скорости роста культуры от концентрации
лимитирующ его субстрата были получены следую щ ие данные:
273
S0 м М
Ц, ч - 1 .........
0,1
0,0125
0,5
0,0416
1,0
0,0588
2,0
0,0741
5,0
0,0877
10,0
0,0935
И з дополнительных исследований известно, что период развития клеток данной
культуры состоит из двух фаз: индукционного периода та и периода клеточного
деления (репликационного процесса) т„. О пределить р,„, K s, а также коэффициент
распределения потоков ключевого м етаболита, если та = 2 ч , кт Е / В = \ ч ~ 1.
17
Вывести выражение для удельной скорости роста исходя из кинетичес­
кой схемы, где ДН К -зависим ой является стадия образования продукта
..
oiADNA
j------------------►D N A
о»
учитывая, что в начальный м ом ент времени Д D N A = 0 .
Глава 2
..
2 1
При исследовании роста термофильной водородообр азую щ ей культуры
были получены следую щ ие экспериментальные данные (В. И. Скляр и др., 1986):
1, ч
2
2,5
3
3,5
^540
1, ч
............. ............... 0,113
............ ...............0.142
......... ...............0.190
............ ...............0,262
4
4.5
5
^540
............ ........... 0.330
............ ............... 0.449
............. ............... 0,58
Определить удельную скорость роста.
22
О пределить р т и K s для роста термофильной водородообр азую щ ей
культуры на глю козе исходя из следую щ их данных (В. И. Скляр и др., 1986):
..
Концентрация
глюкозы, мМ
1
3
5
7
М. ч
...................
...................
....
....
............................ ....
............................ ....
0,23
0,38
0,43
0.47
1
Концентрация
глюкозы, мМ
........................
........................
........................
........................
10
12
14
17
р, ч
....
....
....
....
1
0,49
0,5
0,51
0,54
2.3.
О пределить цт и K s для роста дрож ж ей Candida utilis на среде
с этанолом и уксусной кислотой исходя из данных (Е. С. Никонова, 1984),
представленных ниже:
Концентрация
этанола, мМ
1
0 ,2
3
5
7
9
0,3
0,333
0,37
0,383
0,4
0.4
11
14
..
р, ч
1
Концентрация
уксусной кис­
лоты, мМ
1
2
4
7
10
14
р, ч "
1
0,14
0,217
0,283
0,3
0.31
0,31
24
При исследовании pH -зависимости роста термофильной водородобр азую щ ей бактерии получены данные, приведенные ниже (В. И. Скляр и др., 1986):
У\
274
pH
5,0
5,25
5,5
5,75
6,0
6,25
Ц, ч
1
ц, ч
pH
........... ............... 0,02
......... ...............0,09
........... ............... 0,24
........... ...............0,35
........... ...............0,5
........... ...............0,53
6,5
6,75
7,0
7,25
7,5
1
........................... 0,55
........................... 0,54
........................... 0,38
........................... 0,1
........................... 0,02
Определить цт, р К а, р К 0, tg a и igfi, если S0 » Ks.
2.5.
Определить константу неконкурентного ингибирования этанолом роста
термофильной водородобразую щ ей бактерии в условиях S 0 з> Ks, используя
исходящ ие данные (В. И. Скляр и др., 1986):
Концентрация этанола, мМ
О
15
31
46
126
ц, ч "
1
.......................................................... 0,55
.......................................................... 0,46
.......................................................... 0,38
.......................................................... 0,27
.......................................................... 0,14
2.6.
Определить тип ингибирования роста g m, Ks, a, Р, K it воспользовавшись
следую щ ими данными:
Удельная скорость роста, ч
1
Концентрация
субстрата, мМ
Концентрация ингибитора, мМ
1
2
3
5
10
15
25
0
10
20
30
0,091
0,167
0,231
0,333
0,500
0,600
0,714
0,058
0.109
0,153
0,227
0.385
0.441
0,543
0,047
0,088
0,125
0,188
0,300
0,375
0,469
0,041
0,078
0 ,1 1 1
0,167
0,269
0,339
0,427
2.7. Двухсуб стратный рост микробной кут[ьтуры осущ есп зляется в соответствии с уравнением
П
Х , + 2 Х 2 + М - 2 М + £ Р-
i= 1
Пользуясь табличными данными, определить механизм роста и параметры
К2:
Удельная скорость, ч- 1
Концентрация
X ,, мМ
Концентрация X ;, мМ
1
2
3
5
10
15
20
30
0,043
0,077
0,109
0,083
0,143
0,188
0 .1 2 0
0,154
0,250
0,316
0,214
0,333
0,409
0,300
0,257
275
П родолж ение
Концентрация
X ,, мМ
Удельная скорость, ч 1
Концентрация X
5
10
20
30
ММ
5
10
15
20
30
0,143
0,200
0,250
0,273
0,250
0,333
0.400
0,429
0,333
0,429
0,500
0,529
0.400
0,500
0,571
0,600
0,500
0,600
0,667
0,692
Глава 3
..
3 1
Определить несколькими
Candida utilis на этаноле, если*:
1, ч
Концентрация Концентрация
клеток, г/л
этанола, мМ
0
0,5
1
1.5
2
2,5
3
3.5
4
0,058
0,058
0,078
0,100
0,127
0,143
0,169
0,192
0,214
16,3
16,0
15,5
15,0
14,2
13,4
12,5
11,4
10,1
способам и
Ks и
р„, для
роста
дрож ж ей
Концентрация Концентрация
этанола, мМ
клеток, г/л
1, Ч
4,5
5
5,5
6
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
7,2
5,0
2,6
0,3
0,1
0,0
0,0
0,253
0,299
0,331
0,403
0,474
0,503
0,513
0,513
3.2 О пределить экономический коэффициент для роста дрож ж ей Candida
utilis на среде с этанолом и на среде с уксусной кислотой по данным
прироста биомассы и потребления субстратов (Е. С. Никонова и др., 1984):
Этанол
Уксусная кислота
М —N0, гАСВ
S0 —S, мМ
M - N 0, гАСВ
S0 —S, мМ
0,02
0,05
0,08
0,10
0,15
0,18
0,21
0,25
0,29
0,30
0,34
0,37
0,40
0,8
1,8
2,7
2,6
3,7
4,9
6,0
6,9
8,5
10,0
9,8
11,6
13,4
0,02
0,03
0,04
0,08
0,09
0,11
0,13
0,18
0,25
0.26
0,33
1,5
2,9
3,6
4,6
5,4
7,3
8,7
11,6
13.5
15,8
17,7
3.3. Скорость роста микроорганизма подчиняется уравнению Ф ерхюльста.
О пределить р, если M m/ N o = 100, а время, при котором концентрация биомассы
достигает половины максимальной, т = 3 0 ч .
* Данные приводятся по Е. С. Никоновой и др.,
276
1984.
3.4. Определить предельное накопление биомассы , если N „ = 0 ,0 1 г/л,
У5 = 0,1, S 0 = 10 г/л.
3.5. Определить pm, Ks и Ys для роста дрож ж ей Candida diddenzii на
среде с глю козой, используя следую щ ие данные (А. Н. Шкидченко и др., 1985):
и Ч
Концентрация Концентрация
глюкозы, г/л
клеток, г/л
0,25
0,26
0,28
0,30
0,39
0,79
0
2
4
6
8
10
Концентрация Концентрация
клеток, г/л
глюкозы, г/л
1, ч
14
16
18
19,9
19,6
19,2
18,9
18,4
16,6
9,2
1,3
0,3
1,32
3,42
5,85
10,52
12,62
12
2 0 ,0
2 0 ,0
20
Глава 4
4.1.
Определить рт , А:, 1фф и K L эфф исходя из данных Никонова Е. С.
и др., приведенных в таблице для роста дрож ж ей Candida utilis на среде
с этанолом и на среде с уксусной кислотой для случая ингибирования роста
избытком субстрата:
Концентрация эта­
нола, мМ
ц, ч
1
ц, ч
Концентрация уксус­
ной кислоты, мМ
1
0 ,2
1
0,14
3
5
7
9
0,3
0,33
0,37
0,39
0,40
0,40
0,38
0,39
0,34
0,33
0,30
0,28
0,18
0,14
3
5
0 ,2 2
11
14
22
30
100
187
260
353
610
780
1
0,28
0,30
0,31
0,30
0.31
0,31
0,28
0,25
8
11
15
20
26
60
100
200
0 ,2 1
0 ,1 0
400
4.2. При исследовании роста культуры получены следую щ ие эксперимен­
тальные данные при различных начальных концентрациях лимитирующ его
субстрата:
S0 =
1, ч
s0=
г/л
М, г/л
U ч
0 ,0 0
0 ,0 1
0 ,0 0
0,85
1,33
2,30
3,74
4,85
5,79
7,48
0,013
0,015
1,28
2,03
3,00
3,41
4,37
4,75
0 ,0 2
0.03
0,04
0,05
0,07
S0 —5 г/л
г/л
М, г/л
0 ,0 1
0 ,0 2
0,03
0,05
0.08
0 ,1 0
0 ,1 2
t, ч
0 ,0 0
1,15
2,30
3,24
3,83
4,53
5,03
5,46
М, г/л
0 ,0 1
0 ,0 2
0,04
0,07
0 ,1 0
0.15
0 ,2 0
0,25
277
S0= 10 г/л
S„ = 20 г/л
So = 50 г/л
Л ч
М, г/л
1, Ч
М, г/л
1, ч
М, г/л
0,00
1,18
2,35
3,89
4,56
5,04
5,41
5,70
0,01
0,02
0,04
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,00
1,45
2,90
4,80
6,21
7,01
7,57
0,01
0,02
0,04
0,10
0,20
0,30
0,40
0,00
1,43
4,89
8,11
10,51
11,90
13,63
15,84
17,04
17,81
0,010
0.015
0,040
0,100
0,200
0,300
0,500
1.00
1,500
2,000
избытком
субстрата.
Видно, что рост данной культуры
О пределить цт , K s , K h если У ,= 0 ,1 .
ингибируется
Глава 5
5.1. При исследовании роста трех культур микроорганизмов получены
следующие экспериментальные данные по ингибированию продуктом ферментации:
ц, ч 1
Р, мМ
Sо=20 мМ
S„=10 мМ
S„ = 5 мМ
культу­ культу­ культу­ культу­ культу­ культу­ культу­ культу­ культу­
ра № 1 ра № 2 ра № 3 ра № 1 ра № 2 ра № 3 ра № 1 ра № 2 ра № 3
0
1
3
5
7
10
15
20
0,667
0.625
0,556
0,500
0,455
0,400
0,333
0,286
1.000
0,834
0,626
0,500
0,417
0,333
0,250
0,200
0,800
0,706
0,571
0,480
0,414
0,343
0,266
0,218
0,500
0,455
0,385
0,333
0,294
0,250
0,200
0,167
0,750
0,626
0.470
0,375
0,312
0,250
0,188
0,150
0.600
0,546
0,462
0,400
0,353
0.300
0,240
0,200
0,333
0,294
0,238
0,200
0,172
0.143
0,111
0,091
0,500
0,417
0,312
0,250
0,209
0,167
0,125
0,100
0,400
0,376
0,334
0,300
0,272
0.240
0,200
0,172
Определить тип ингибирования продуктом, а также ц„, Ks и Кр для каждой
из культур.
5.2.
При исследовании роста двух культур микроорганизмов, механизм
роста которых включает ингибирование продуктом, были получены следую щ ие
экспериментальные данные при различных начальных концентрациях субстрата:
S0 = l г/л
S0 = 5 г/л
Культура № 1
Культура № 2
Л ч
М, г/л
U ч
М, г/л
6 ч
М, г/л
1. ч
М, г/л
0,00
2,98
5,30
7,30
9,13
10,89
12,48
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0,035
0,040
0,00
3,69
6,56
9,03
11,29
13,45
15,63
0,010
0,015
0,02
0,025
0,03
0,035
0,040
0,00
2,95
4,75
6,10
7.19
9,79
11,12
12,41
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,08
0,10
0,12
0,00
3,56
5,69
7,25
8,49
11,29
12,78
14,14
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,08
0,10
0,12
278
Культура № 1
Культура № 2
S0 = 10 г/л
Культура № 1
1, ч
0 ,0 0
2,15
4,37
6,28
7,59
9,25
10,62
S0 = 25 г/л
Культура № 2
Культура № 1
Культура № 2
М, г/л
U ч
М, г/л
1, ч
М, г/л
/, ч
0 ,0 1
0 ,0 2
0 ,0 0
0 ,0 1
0 ,0 2
0 ,0 0
0 ,0 1
0 ,0 2
0 ,0 0
2,56
5,09
7,10
8,36
9,81
10,9
11,85
1,69
3,96
5,74
6,84
7,66
9,93
10,82
М, г/л
0 ,0 1
1,98
0 .0 2
0,04
0,04
0,05
4,45
0,05
0,07
0,07
0 ,1 0
6,05
0 ,1 0
0 ,1 0
0 ,1 0
0,15
6,80
0,15
0,15
0 ,2 0
0,15
7,20
0 ,2 0
0 ,2 0
0 ,2 0
0,40
7,54
0,40
1 1 ,8 8
0,25
0,25
0,50
7,43
0,25
Определить тип ингибирования продуктом, а также pm. Ks и Кр для
каждой из культур, если К; = К, = 0 ,0 5 , а У р = Р р = 0,1.
5.3.
При исследовании роста четырех культур получены следующ ие
экспериментальные данные при различных начальных концентрациях лими­
тирую щ его субстрата:
S0 = I г/л, Р„ = 0
Культура № 1
1, ч
0 ,0 0
2,67
4,64
7,60
9,91
11,92
15,62
24,02
00
М, г/л
0 ,0 1
0,015
0 ,0 2
0,03
0,04
0,05
0,07
0 ,1 0
0 ,1 1
Культура № 2
U ч
0 ,0 0
3,56
6,18
10,08
13,11
15,71
20,43
32,37
■ 00
Культура № 3
М, г/л
0 ,0 1
М, г/л
1, ч
0 ,0 0
0,015
0 ,0 2
0,03
0,04
0,05
0,07
0 ,1 0
0 ,1 1
1,71
3,00
4,96
6,53
7,92
10,58
00
Р .-
0 ,0 1
0,015
0 ,0 2
0.03
0,04
0,05
0,07
0 ,1 1
2
г/л
Культура № 4
1, ч
М, г/л
0 ,0 0
0 ,0 1
7,30
16,98
24,16
31,18
38,38
46,04
00
Р х, = 0,5
0,015
0 ,0 2
0,025
0,03
0,035
0,04
0,06
г/л
S 0 = 5 г/л, Ро = 0
Культура № 1
Культура № 2
Культура № 3
Культура № 4
1. ч
М, г/л
1, ч
М, г/л
1, ч
М, г/л
U ч
0 ,0 0
0 ,0 1
0 ,0 0
0 ,0 1
0 ,0 0
0 ,0 1
0 ,0 0
М, г/л
0 ,0 1
0 ,0 2
0 ,0 2
3,56
1,41
0 ,0 2
2,58
0 ,0 2
1,26
0,04
0,04
0,04
5,69
0,03
2,83
5,17
2,56
0,04
0,07
7,25
4,02
0,07
7,29
0,07
3,68
0 ,1 0
8,51
0,05
4,80
0 ,1 0
8 ,6 6
0 ,1 0
4.45
12,98
0 ,1 0
5,74
0 ,2 0
6,25
0 ,2 0
0,15
11,45
0,30
16,81
0,15
6,46
0 ,2 0
13,30
0,30
7,77
0,26
0,51
00
7,64
0,30
0,51
00
00
0,51
Рос = 1 0 г/л
Роо = 2 ,5 г/л
00
Выяснить механизм роста и определить соответствую щ ие кинетические
параметры для каждой из культур.
Глава б
..
6 1
Определить период индукции т и удельную скорость роста исходя
из следую щ их экспериментальных данных:
279
I, ч ..................
М, г/л ..........
О
0,020
4
0,022
2
0,021
6
8
0,033
0,090
10
0,244
12
0,662
..
62
При исследовании зависимости роста трех культур микроорганизмов
от концентрации лимитирующ его субстрата получены следую щ ие данные:
Культура № 3
Культура № 2
Культура № 1
S0, мМ
г, ч
р, ч 1
S0, мМ
г, ч
р. ч-1
S0, мМ
т, ч
р, ч ' 1
1
5
9
15
25
100
700
9,5
8,1
7.1
6,1
5,0
2,4
1,5
0,045
0,167
0.237
0,300
0,357
0,454
0,476
1
5
9
15
25
100
200
3,6
2.5
2,2
2,1
2,0
1,8
1,8
0.167
0,500
0,643
0,750
0,833
0,952
0,976
1
5
10
15
50
100
8
8
8
8
8
8
0,038
0.160
0,267
0,343
0,571
0,667
Определить природу периода
параметров, определяю щ их т.
индукции
Г лава
и
найти
числовые
значения
7
..
7 1
При хем остатном культивировании микробной популяции получены
следую щ ие экспериментальные данные по стационарным концентрациям
субстрата и биом ассы при различных скоростях разбавления и различных
концентрациях вводим ого в ферментер раствора субстрата:
Sо = 5 г/л
S0 = 1 г/л
А ч * 1 SCT, г/л Мст,г/л D, ч_| S c г/л МС1,г/л А ч '
0 ,0 1
0,03
0.07
0 ,1 0
0,15
0,16
0,051
1,155
0,376
0,556
0,882
0,952
0,475
0,423
0,312
0 ,2 1 2
0,059
0,024
0,05
0 .1 0
0 ,2 0
0,30
0,40
0,45
0,263 0,368 0 .1 0
0,556 2 ,2 2 2 0 ,2 0
1,250 1,875 0,30
2,143 1,429 0,50
3,333 0,833 0,60
4,091 0,455 0,65
S , = 20 т/л
S ,= 10 Г/ л
1
S c г/л М„,г/л А ч”
0,556
1.250
2,143
5,000
7,500
9,286
4,722
4,375
3,929
2,500
1,250
0,358
0 ,1 0
0.30
0,50
0,60
0,70
0,75
1
SCT, г/л
М„,г/л
0,556
2,143
5,000
7,500
11,667
15,000
9,722
8,929
7,500
6,250
4,167
2.500
Найти Ks, K s и pm.
72
Х ем остатное культивирование популяции микроорганизмов при кон
центрации вводим ого в ферментер раствора субстрата, равной 25 г /л ,
проводили д о достижения стационарных состояний при различных скоростях
разбавления. Полученные данные приведены в таблице:
..
А ч’
0 ,0 1
0 ,0 2
0,03
0,04
0.05
0 ,1 0
0,15
0 ,2 0
0,25
280
1
Sct. г/л
М „,г/л
А ч” 1
0,041
0,083
0,128
0,174
0,223
0,504
0,875
1,407
2,292
4,992
4,983
4,974
4,965
4,955
4,899
4,825
4,719
4,542
0,29
0,30
0,31
0,30
0,29
0,25
0,23
0 ,2 1
S„. г/л
М„, г/л
4,205
3,800
Стационарное состояние
не наблю дается
3,800
6 ,0 0 0
3,188
9.061
1,858
15.708
1,148
19,261
0,337
23,313
Вымывание культуры
3,973
6 ,0 0 0
Выяснить механизм роста и определить кинетические параметры.
7.3.
Выяснить механизм роста микробной популяции и определить
кинетические параметры исходя из данных по стационарным концентрациям
субстрата, биомассы и продукта при хем остатном культивировании.
S0= 1 г/л
£>, ч'
1
0 ,0 2
0,05
0.08
0 ,1 0
0,13
0,16
SCT, г/л
Мст, г/л
0,124
0.309
0,490
0.690
0,787
0,962
0,088
0,069
0,051
0,031
0 ,0 2 1
0,004
S„ = 5 г/л
Рст>
г/л
0,438
0.346
0.255
0,155
0,107
0,019
D, ч "
0 ,0 2
0.05
0 ,1 0
0 ,2 0
0,40
0,45
1
0 ,0 2
0,05
0 ,1 0
0,30
0,50
0,60
0,65
s„, г/л
М„,г/л
Р„, г/л
0.348
0,864
1,707
4,884
7,778
9,130
9,785
0.965
0,914
0.829
0,512
4.826
4,586
4,146
2,558
0 ,2 2 2
1,111
0.087
0,435
0,108
0 ,0 2 2
S„, Г/л
МС1,г/л
0,224
0,556
1.098
2,143
4,091
4.551
0.478
0,444
0,390
0,286
0,091
0,045
Р„. г/л
2,389
2 ,2 2 2
1.951
1.429
0,455
0,285
S0 = 25 г/л
S0= 10 г/л
D, ч'
1
D, ч '
1
0 ,0 2
0,05
0 ,1 0
0.30
0.50
0,70
0,80
SCT, г/л
М „,г/л
Р„> г/л
0.721
1,790
3,537
10.116
16,111
21,596
24,167
2,428
2,321
2,146
1.488
0.889
0,340
0,083
12,139
11,665
10,732
7.442
7.444
1,702
0,417
7.4.
Выяснить механизм роста микробной популяции и оценить кинетические
параметры, воспользовавшись приведенными ниже данными по стационарным
концентрациям субстрата, биомассы и продукта при хемостатном культивировании:
S0 =
1
О, ч“ '
SCT, г/л
Мст,г/л
0 ,0 2
0,124
0,188
0,254
0,322
0,533
0,679
0,828
0,978
0,175
0,162
0,149
0,136
0,093
0,064
0,034
0,004
0,03
0,04
0,05
0,08
0 ,1 0
0 ,1 2
0,14
S 0 —5 г/л
г/л
Р=„
г/л
0,438
0,406
0,373
0,339
0,234
0,161
0,086
0 ,0 1 1
D, ч 0 ,0 2
0,03
0,04
0,05
0 .1 0
0,14
0 ,2 0
0,15
Sct. г/л
М„, г/л
0 ,0 2
0,542
0,864
1,224
1,620
4,000
1,892
1.828
1,755
1,676
0,03
0.04
0,05
0 ,1 0
1 ,2 0 0
s„, г/л
Мст, г/л
0,300
0,466
0,642
0,828
1,882
2,781
4,000
4,815
0,940
0,907
0,872
0,834
0,624
0,444
0 ,2 0 0
0,037
Р„.
г/л
2,350
2,267
2,179
2,086
1,559
1,109
0,500
0,092
S0 = 25 г/л
S0= 10 г/л
D, ч- 1
1
Per.
г/л
4.729
4.568
4.388
4.190
3,000
D, ч * 1
S„, г/л
МС1, г/л
Р„. г/л
0 ,0 2
1,451
2,558
4,000
5,758
14,466
4,710
4.488
4,200
3,848
2,107
11,775
0,03
0,04
0,05
0 ,1 0
1 1 ,2 2 1
10,500
9,621
5,267
281
Продолж ение
S0 =10 г/л
D, ч~‘
S0 = 25 г/л
SCT, г/л
М„,г/л
Р„, г/л
Д ч '1
S„„ г/л
М„„г/л
Рс. г/л
0,14
5,879
0,14
8 ,0 0
1 ,0 0 0
0 ,2 0
0,25
9,211
0,824
0,400
0,157
2,061
0 ,2 0
0,394
0,25
18,539
21,926
23,580
1,292
0,615
0,284
3,230
1,537
0,710
7.5.
П ри хем остатном культивировании одной из сахаролитических культур
для нейтрализации образую щ ейся кислоты в ферментер с постоянной скоростью
0,01 м М /ч подавали раствор щелочи. Найти кинетические параметры роста,
если Y ,/ Y p = 1. Экспериментальные данные приведены ниже:
S0 =
мМ
D, ч- *
SCI, мМ
0 ,0 1
0,09
0,250
0,526
0,750
0,865
0,935
0,04
0 ,1 0
0 ,2 0
0,30
0,40
s „ = . мМ
S0 = 10 мМ
s„= 25 мМ
£>, ч ~1
Scr, мМ
D, ч~ 1
S„, мМ
£>, ч ~ 1
§„, мМ
0 ,0 1
0 ,0 1
0 ,0 1
2 ,2 1 1
0 ,1 0
0,835
2,897
5,263
0,04
0 ,1 0
0,376
1,426
2,632
0 ,1 0
7,309
13,158
0,30
4,108
0,30
8,162
0,30
20,324
0,50
0.70
4,618
4,877
0,50
0,70
9,164
9,671
0,50
0,70
22,800
24,055
0,09
0,04
Глава 8
..
8 1
Определитель, в каком из реж имов (максимальной скорости роста
или первого порядка по концентрации субстрата) протекает процесс роста
микробных популяций, исходя из экспериментальных данных по измерению
оптической плотности культуральной среды:
Культура № 1
6
ч
0 ,0 0
8 ,6 8
14,32
18,82
22,81
26,64
30,57
34,91
40,26
48,35
..
..
£>540 , опт. ед.
Культура № 2
(, ч
0 ,2
0 ,0 0
0,4
7,70
12,30
15,60
18,21
20,40
22,32
24,08
25,78
27,63
0 ,6
0 ,8
1 ,0
1 ,2
1,4
1 ,6
1,8
2 ,0
£>540, ОПТ.
0 ,2
0.4
0 ,6
0 ,8
1 ,0
1 .2
1,4
1 ,6
1,8
2 ,0
8 2 И спользуя м ето д двойного зеркального отражения, определить меха­
низм роста четырех культур (экспериментальные данные примера 5.3).
8 3 При исследовании роста микробной популяции получены следую щ ие
данные по общ ей концентрации клеток М и по количеству клеток М а,
способны х к делению:
282
С
1, Ч
М, г/л
М., г/л
6 ч
М, г/л
М., г/л
0
2
5
7
10
15
0,05
0,08
0,13
0,24
0,32
0,47
0,005
0,02
0,06
0,125
0,23
0,25
20
25
30
35
40
0,54
0,55
0,55
0,54
0,54
0,18
0,125
0,08
0,055
0,03
'
Определить ра и X.
Глава 9
9.1. И звестно, что концентрация кислорода в воздухе составляет 20,9%
по объему. О пределить интервал, в который с 99% -ной вероятностью попадет
результат единичного измерения концентрации кислорода в воздухе при
использовании газохроматографического м етода, погрешность измерения кото­
рого в данном случае определяется генеральной дисперсией т = 1 .
9.2. Рассчитать
S S у-чw x и w - для подсчета числа клеток культуры
Anabaena variabilis в камере Горяева, если при подсчете в 20 отдельных
квадратиках были зафиксированы следую щ ие результаты: 6 , 1 0 , 18, 6 , 6 , 8 ,
11, 9, 17, 16, 4, 5, 13, 6 , 19, 9, 5, 8 , 13, 11.
9.3. И нтересующ ая концентрация С представляет собой разность двух
измеряемых величин А и F. Вычислить дисперсию измерения этой концентра­
ции, если 5 .4 = 4 , a S F= 3.
9.4. В результате измерения концентраций С Н 2 и С 0 2 в газовой фазе
реактора получены значения 70 и 25% по объем у соответственно. Из
независимых данных известно, что погрешности газохроматографического
м етода измерений определяю тся генеральными дисперсиями 3,5 и 1,25
соответственно. Определить доверительные интервалы для истиных значений
концентраций С Н 4 и С 0 2, соответствую щ ие 93% -ной доверительной вероят­
ности.
9.5. Определить абсолю тную и относительную погрешность S x для
примера 9.2. при 95% -ной доверительной вероятности.
9.6. Сколько нужно провести подсчетов числа клеток на отдельных
квадратиках в камере Горяева, чтобы погреш ность S x с доверительной
вероятностью 95% не превышала 5%, если и>= 25%?
9.7. В результате измерения концентрации метанола в культуральной
жидкости был получен ряд значений (мМ ): 61, 57, 62, 51, 59, 58. Оценить,
нет ли здесь «выскакивающих» измерений.
9.8. Количество образовавш егося метана за определенное время работы
биогазового реактора определяю т по ф ормуле Г сн 4 = Г ,ф Q :h 4> где VCHt
ко­
личество образовавш егося С Н 4; Гг ф объем газовой фазы; CCHi
концентра­
ция С Н 4 в газовой фазе. Пять параллельных измерений дали следую щ ие
результаты:
Гг ф, мл,
510
505
518
521
503
Сс н „ %,
.................
51,3
50,2
49,9
52,5
51,6
Определить выборочную дисперсию Уси и погреш ность KCHi при 95% -ной
доверительной вероятности.
9.9. Определить р, In D 0, S 0, дисперсию р и In D 0, а также погрешность
определения р и 1п/ ) 0 при 95% -ной доверительной вероятности исходя из
экспериментальных данных по росту водородообр азую щ ей культуры на
глю козе (В. И. Скляр и др., 1986):
t, ч .....................................
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
£>540 ..................................
0,135
0,170
0,223
0,300
0,415
0,533
0,705
283
V
ОТВЕТЫ И РЕШ ЕНИЯ
Глава 1
1.1. Число выделенных промежуточных состояний клетки п —2. Для нахождения
интересующ их параметров н еобходим о применить формулы (1 .9 3 )— (1.95),
учитывая уравнения связи меж ду
1п 2
In 2
fc, и т,: A:,S0 = — ; к г = —
г 1
1п 2
к 3= — ;
Т2
Т3
р = 0 . 1 9 8 ч - ‘ ; рт = 0,277 ч - 1 ; К, = 4,0 г/л .
1.2. Зависимость
выражением
концентрации
продукта
d?
от
времени
описывается
к 3Х 2
T t~ ~ Y
И з этого уравнения при Ро = 0 следует
Р ( 0 = ^ ( е и' - 1 ) ;
1р
так как р уже
продукта будет
определено
в
примере
1.1,
то
через
10
ч
концентрация
Р ,о = 0,624 г /л .
1.3. Для дискриминации механизма роста необходим о прежде всего
экспериментальные данные представить в обратных координатах. В результате
такой процедуры увидим, что зависимость 1 /р от 1 /S 0 для культуры № 1
линейна, для культур № 2 и № 3 нелинейна; это означает, что старение
клеток оказывает влияние на механизм роста только культур № 2 и № 3.
Из линеаризации в обратных координатах экспериментальных данных для
культуры № 1 находим р^, = 0,347 ч " 1, К ,1 = 10~ 3 м.
Для культур № 2 и № 3 после представления экспериментальных данных
в
обратных координатах мож ет быть сделана оценка Ks и рт на основе
использования асимптотической прямой, описываемой уравнением (1.196),
которая является касательной к точке 1/ц„. Оценка на основе этой прямой
К , позволяет перейти от S 0 к Ф [уравнение (1.197)]. Значения рт
и X определяю тся из уравнения (1.198):
рт = 0,693 ч - 1 ; K l = 10 "
цт = 0,8 ч ~ 1;
3
М;
Х2 = 0 ,1 ч " 1;
A:s2 = 5 1 0 ' 4 М; Х.3 = 0 , 1 5 ч ' 1.
1.4. Для нахождения SKP необходим о воспользоваться ф ормулой (1.193)
k F
с учетом того, что —— = |im/ l n 2 ;
В
S [p= 0; S,2p = l , 1 1 1 0 -
4
М; S 3P= 7 , 5 1 0 -5 М.
1.5. Так как при S - > o o p - > p m. то
(1.131) удобн о представить в виде
м™= 0,5 ч -
1
и уравнение Тейсиера
1—^ = e * s.
Логарифмируя правую и левую часть этого уравнения, получаем
ln ( 1— — ) = —kS;
284
-In I 1—— ) = AS.
Pm
Так
—In (
\
как
1 ——
I
pm уже
известно,
то
м ож но
построить
график
зависимости
от S, по тангенсу наклона этого графика определить к:
IV
А: = 0,1 мМ
..
16
Сначала из экспериментальных данных одним из м етодов линеаризации
н еобходим о определить р„ и
6,„ которые соответственно равны 0 ,1 ч 1
и 0,7 мМ . Далее из выражения (1.154) получаем
= 0,203.
а + «к
* , а т £ / [ В ( 1 п 2 - р т та)]
И з выражения (1.155) находим
AKaTEocR
а В(а+а„)
Ks Ла>набл 1
..
17
= 0,984 мМ .
d b DNA
dt
>п>
kS
- = А (S 0 ) - ( a R+ aA D N A ), где /f ( S 0) =
0
dt
' 07 V R
7’
'
* s + S0
d S' „
При условии ~^г = 0
с,
^ (S p )
,
ocR+ a A D N A ’
</ADNA
a RA (S0)
dt
aR +aA D N A ’
(aR+ a A D N A )rfA D N A = a R/l (S0)d t.
Интегрирование этого уравнения при условии 1 = 0 , A D N A = 0 дает
^ A D N A 2 + a RA D N A —a R/l (So) l = 0.
Решая квадратическое алгебраическое уравнение и отбрасывая отрицатель­
ный корень, получаем
aB
/a2R 2а^
A D N A =— -+
а
/—
-у or
На основании этого уравнения
условии, что A D N A = B при 1 = т:
+
S 0 l.
а
рассчитываем
время
репликации
при
В 2ос
т=
В
г+2 a R/4(S0) A (S0)
In 2
21n 2aR/l (S0)
т
В ( В а + 2 ок)
Если a R<K(xADNA, то
В 2(х
'2otR^ (S0)’ ^
2 \n 2 a RA (S0)
"
f i 2a
285
Глава 2
..
..
2 1 П остроив зависимость In D от t, по тангенсу наклона прямой
определяю т р: р = 0 ,5 4 ч - 1 .
2 2 Воспользовавшись одной из линейных анам орф оз уравнения М оно
(2.6) — (2.9), (2.12), находим
рт = 0,55 ч - 1 , /Гя= 1 ,4 м М .
2.3. Для
этанола
рт = 0,5 ч ' 1, Л(. = 2 ,6 м М ;
для
уксусной
кислоты
рт = 0,36 ч - 1 , А:,= 1,8 м М .
2 4 Так как исследования pH -зависимости проводились в условиях S0 » K s,
то удобн о воспользоваться выражением (2.67). П остроив график зависимости
lgp от pH , находим: рт = 0 , 5 5 ч ~ \ рА а = 5,65, рА 0 = 6,95, tg a = 2,2, t g р = —2,6.
2 5 Воспользовавш ись выражением (2.49) и представив экспериментальные
данные в координатах Диксона (1 /р , 1), находим
= 79 мМ .
2 6 Воспользовавш ись одной из линейных анам орф оз уравнения М оно
(2.6)— (2.9), (2.18), из экспериментальных данных в отсутствие ингибирования
найдем рт = 1 ч ~ ‘, / ( , = 10 мМ . Для определения типа ингибирования табличные
данные представили в виде графиков в обратных координатах (1 /р , 1/S).
Тип ингибирования смешанный: а = 2; (3=0,5; А ^ Ю м М .
2 7 Представление табличных данных в координатах (1 /р , 1 /jcx) при
фиксированном х 2 и ( 1 /р , 1 / х 2) при фиксированном л:, позволяет сделать
вывод, что наблю дается случай механизма с мультиплицирующими субстрата­
ми х { и х 2. В то же время две молекулы х г вступают во взаимодействие
с несвязными ф ормам и ферментных систем растущ его микроорганизма;
рт = 1 ч - 1 , /^ = 10 м М , А 2 = Ю м М .
..
..
..
..
Глава 3
3.1. Для решения задачи м ож но воспользоваться построением графиков
в координатах уравнений (3.56), (3.57), (3.66), (3.72), (3.76), (3.83), используя
данные по росту биомассы , либо в координатах уравнения (3.84), используя
данные по истощению субстрата; рт = 0,5 ч '; A s = 2 , 6 m M.
3 2 П остроив график зависимости (М —N 0) от S 0 —S, по тангенсу угла
наклона прямых определяю т
..
гА С В
гА С В
Уг н он —0 ,2 8 ----- ----------- ; Угн с о о н —0 ,6 9 ------- ---------- .
2 5
г субстрата
3
г субстрата
3.3. Для решения задачи воспользуемся соотнош ением (3.12):
р = 0,154 ч ~ 1.
..
..
3 4 Воспользовавшись уравнением (3.41), находим М т = 1,01
3 5 Экономический коэффициент определяю т аналогично
в примере 3.2; рт и Ks определяю т построением графиков в
уравнений
(3.56), (3.57), (3.66), (3.72), (3.77), (3.83), (3.84); pm=
гА С В
As= 12,5 г/л ; К, = 0 ,5 7 ---------------- .
г глюкозы
г /л .
описанному
координатах
0,86
4 _1;
Глава 4
..
4 1 В данном случае зависимость р от S описывается уравнением (4.57).
Для нахождения параметров pm, K s ,(M, и AT, )фф удобн о воспользоваться
уравнениями (4.59) для низких концентраций субстратов и (4.60) для высоких
концентраций субстратов. Для этанола рт = 0 , 5 ч - 1 , /Г, ,фф= 2,6 м М , АГ, .,ф,, =
= 290, мМ ; для уксусной кислоты рт = 0 ,3 6 ч \ //,,эфф=1,8 мМ , /ч г.,фф= 220 мМ .
4 2 Для нахождения интересующ их параметров экспериментальные данные
необходим о представить в координатах уравнения (4.79) (при этом М т =
= y ,S 0 + N 0). Э та процедура позволяет найти параметры р и Ф в зависимости
от S0. Далее, используя уравнения (4.81) — (4.87), находят искомые параметры:
р т = 1 ч - 1 , K s = 2 r / n , А — 2 0 г/л .
..
286
Глава 5
5.1. Представив экспериментальные данные в обратных координатах (1 /р ,
1 /S 0), определяем, что тип ингибирования для культур № 1 , № 2 и № 3
соответственно - конкурентный, неконкурентный и бесконкурентный. И з экспе­
риментальных данных при Р = 0, находим:
рш= 1 ч ' 1; Л[,= 1 0 м М (культура № 1),
рт = 1 , 5 ч - 1 ; К 5 = 1 0 м М (культура № 2 ),
рм= 1 , 2 ч - 1 , A s = 1 0 m M (культура № 3 ).
Константы ингибирования продуктом м ож но вычислить несколькими
способам и, например представлением экспериментальных данных в координа­
тах Диксона (1 /р , Р), откуда К \ = К 2р = к 1 = 5 мМ .
5.2. П режде всего н еобходим о экспериментальные данные представить
в координатах уравнения (5.119) с учетом того, что M m= KsS 0 + N 0, Э та
процедура позволяет найти параметры р и Ф при различных начальных
концентрациях S0.
Для определения рш и Ks полученные значения
зависимости параметров
р для обеих
культур от S 0 н еобходим о представить в координатах уравнения
(2 .6 ), откуда
рт = 0,5 ч - 1 ; K s = 5 r /л
рт = 0 , 4 ч -1 , А 5 = 5 г / л
(культура № 1),
(культура № 2 ).
Для установления типа ингибирования экспериментальные данные н еобхо­
ди м о представить в координатах уравнения (5.122). При этом для культуры
№ 1 наблю дается линейная зависимость, что говорит о конкурентном
ингибировании продуктом, для культуры № 2 подобная линеаризация не
наблю дается, что указывает на неконкурентный тип ингибирования продуктом.
Константы ингибирования определяю тся с пом ощ ью представления экспеK s + S0
риментальных данных в координатах Ф от S 0 [уравнение (5.122)] для
К
культуры № 1
№ 2.
Из
и Ф
К + S
тангенса
0
от S0 (I + S0 /K s) [уравнение (5.123)] для культуры
угла
наклона соответствую щ их
прямых
находим
К } = К ? = 2 г/л.
..
5 3 Как и в предыдущ ем примере, экспериментальные данные необходим о
представить в координатах уравнения (5.119) и определить р и Ф при
различных начальных концентрациях S0. Анализ зависимости Ф от S 0 для
культуры № 1 показывает, что механизм роста этой культуры не осложнен
какими-либо ингибирующ ими эффектами, а параметры Ks и рт определяется
из уравнений (3.86) и (3.87).
Для культуры № 2 Ф с увеличением S 0 падает от положительных значений
д о отрицательных, а р проходит через максимум, что указывает на механизм
роста этой культуры с ингибированным избы тком субстрата. Параметры рш,
Ks и К, определяю тся из уравнений (4.81) — (4.87).
Для культуры № 3 Ф постоянно имеет положительное значение, а с увеличе­
нием
S 0 имеет тенденцию к слабом у росту, при этом экспериментальные
данные линеаризуются в координатах уравнения (5.123), что указывает на
конкурентное ингибирование роста продуктом. Для определения экономических
коэффициентов воспользуемся соотнош ениями
—N „ , у
У
5
с
’
Мд - N0
Р
р
г оо
П араметры р,„ и K s находят из зависимости р от S 0 с пом ощ ью уравнения
(2.6), а К, — из уравнения (5.122).
Для культуры № 4 Ф с увеличением S0, так же как и в случае культуры
287
№ 3, слабо возрастает, но экспериментальные данные не линеаризуются
в координатах уравнения (5.123), что указывает на неконкурентный характер
ингибирования роста продуктом. П араметры Y„ Yp, Ks и pm определяю тся
так же, как и в случае культуры № 3 , а £ , — из уравнения (5.123). Таким
о бр азом , рт = 1 ч - 1 ; K s = 5 г/л ; К, = 0,1 (неосложненный рост, культура № 1),
|1га= 0,5 ч
Кг = 3 г/л; Ys = 0,1; K t = 20 г /л (ингибирование избы тком субстрата,
культура № 2), рт = 0,8 ч - 1 ; K s = 2 г/л; У, = 0,1; Ур = 0,05; Ki = 3 г /л (конкурентное
ингибирование продуктом, культура № 3 ), р„ = 0 , 4 ч - 1 ; £ я= 5 г /л ; Ts = 0,05;
= 0 ,1 ; K t = 1 г /л (неконкурентное ингибирование продуктом, культура № 4 ).
Глава 6
6.1.
Экспериментальные данные н еобходи м о представить в координатах
1пМ, г. И з тангенса угла наклона прямой находят р., из пересечения этой
прямой с прямой lnM = ln N 0 находят т:
р = 0 ,5 ч *,
т = 5 ч.
6.2.
И з зависимости т от S 0 видно, что для культуры № 1 природа лаг-периода
связана с конверсией пресубстрата, для культуры № 2 — с адаптационными
процессами в клетке, для культуры № 3 — с р асходом ингибитора роста.
Д ля культуры № 1 к 0 определяется из уравнения (6.18), при этом Ks
легко найти из зависимости ц от S0 :
Д ля культуры № 2 к 0 находится линеаризацией экспериментальных данных
в координатах уравнения (6.60):
к 0 = 0,2 ч ' 1, при этом ra(S 0 - » о о ) = 1,79 ч.
Д ля культуры № 3 из уравнения (6.51) м ож но вычислить только комплекс
параметров:
Глава 7
7.1.
Ys м ож ет быть найдено как тангенс угла зависимости М С1 от S 0
(7.12) при одной и той же скорости разбавления, цт и Ks — линеаризацией
экспериментальных данных в координатах уравнений (7.15) — (7.16):
рт = 1 ч \
..
Ks = 5 г/л;
Ks = 0,5.
7 2 Представив экспериментальные данные в координатах 1/SCI от 1/7),
м ож но увидеть, что они не линеаризуются в этих координатах. Э то говорит
о том , что механизм роста включает ингибирование избы тком субстрата.
К, определяется из уравнения (7.42). При малых скоростях разбавления
( < 0 ,1 ч ~ 1) м ож но пренебречь ингибированием избы тком субстрата и найти
рт и Ks с пом ощ ью уравнений (7.15) — (7.16). Для нахождения К, наиболее
простой способ заключается в использовании уравнения (7.33), при этом,
как показывает анализ экспериментальных данных, Dc= 0,3 ч . Таким образом ,
рт = 0,5 ч ~ ’ ; K s = 2 г/л; £ , = 18 r /л; Ts = 0,2.
7 3 Так как стационарный уровень концентрации субстрата линейно
зарисит от начальной его концентрации, вводимой в ферментер даж е при
больш их скоростях разбавления, то это указывает, что механизм роста
микробной популяции включает конкурентное ингибирование продуктом.
Для определения кинетических параметров необходи м о данные по зави­
симости SCI от S 0 при различных скоростях разбавления представить
в координатах уравнения (7.71) и найти параметры а и tgcp. Далее из
зависимостей 1/а от 1/D [уравнение (7.74)] и l/tg(p от 1/ D [уравнение (7.34)]
..
288
найти ц,„, K s и а. Экономические коэффициенты У, и Ур вычисляются из
соотнош ения (7.60), и, наконец, K t определяется из уравнения (7.70).
Таким образом , цт = 1 ч - 1 ; Ks = 5 г/л; А , = 2 г/л; У5 = 0,1; Ур= 0 ,2 .
Д ругой вариант нахождения кинетических параметров заключается в ис­
следовании зависимостей (7.76) — (7.81) или (7 .8 2 )— (7.87).
74
Так как стационарный уровень концентрации субстрата зависит от
начальной его концентрации, вводимой в ферментер, и эта зависимость при
больш их скоростях разбавления отклоняется от линейной, то это означает,
что механизм роста данной микробной популяции включает неконкурентное
ингибирование продуктом.
Для оценки кинетических параметров воспользуемся уравнением (7.108), которое
справедливо при низких скоростях разбавления. Оно м ож ет быть записано в виде
..
1
SCt
u_
1
-тс + -
K s+ a S 0 D
а
Ks+ a S 0
При постоянном значении S 0 это уравнение прямой с параметрами
a
As + otSo
и tgq> =
u_
As + a S 0
Если эти параметры определить при нескольких концентрациях S0 , то
получим следую щ ие линейные зависимости:
1 Ks „
1 Ks
a
- = — bS0; -— —------1---- S0 .
a
a
tgcp pffl
pm
П араметры этих двух прямых позволяю т вычислить ц,„. K s и а. У, и Yp
находим, как и в предыдущ ем примере, из соотнош ений (7.60), и, наконец,
К, определяется из соотнош ения (7.70).
Таким обр азом , цт = 1 ч - 1 ; К , = 4 г/л; К ,- 2 г/л; У ,= 0 ,2 ; У,, = 0,4.
75
Для нахождения кинетических параметров н еобходим о при нескольких
скоростях разбавления построить зависимости S,.T от S 0 [уравнение (7.125)]
и при каж дом D определить а и tgcp. Далее, построив зависимости l/tgcp
от 1/Л [уравнение (7.127)], вычислить а и цт . Так как Y J Y p = 1, то КJ К -= а
и с пом ощ ью уравнения (7.128) м ож но найти K s и K t . Таким образом ,
рт = 1 ч - 1 ; As = l мМ ; А, = 0,1 мМ .
..
Глава 8
..
8 1
и № 2
Для диагностики режима протекания процесса роста культур № 1
нужно построить кинетические кривые роста и провести двойное
зеркальное отражение верхней половины кривой относительно точки
М „ - N„\
2
-
.. ,
, в результате получим, что рост культуры №
1
протекает в режиме
As » S 0/ a культуры № 2 — в режиме S 0 » A s.
8 2 Культура № 1 — неосложненный рост;
культура № 2
ингибирование избытком субстрата;
культуры № 3 и № 4 — ингибирование продуктом.
8 3 Представив экспериментальные данные по концентрации клеток,
способны х к делению в полулогарифмических координатах, из левой ветви
кривой найдем цнабл, из правой
'к. Соответственно
..
..
йп = И„а«л+ Ь = 0 , 5 5 ч - \
А,=0,1 ч ” 1.
Глава 9
и
..
9 1
Так как известны истинное значение концентрации кислорода в воздухе
генеральная дисперсия, то для расчета воспользуемся табл. 9.1 для
289
нормального распределения. Из этой таблицы иодд = 2,6;
Р(ц —и0 дда < х < ц + и 0
99о)
= 0,99;
Р( 18,3 < .V < 23,5) = 0,99.
Таким образом , с 99% -ной вероятностью результат единичного измерения
попадает в интервал 18,3— 23,5% по объему.
9 2 Воспользовавшись формулами (9.7), (9.8), (9.21), находим:
* = 1 0 ; S x = 4 ,6 5 ; ,5*= 1,04; в’х = 46,5% ; и’х-= 1 0 ,4 % .
9.3. В соответствии с законом сложения погреш ностей
..
s r = y s l + s ) = 5.
..
9 4 Для у = 0,93 ит= 1 ,8 ; следовательно,
x ~ u 0,9 i cs < ц < х + ц
0 9 3 ст;
63,7 < р С1)4 < 76,3;
22,75 < рСо 2 < 27,25.
..
9 5 Так как неизвестна генеральная дисперсия, то для решения задачи
н еобходим о воспользоваться распределением Стью дента (см. табл. 9.2). Для
7 = 0,95 и / = 1 9 / = 2,093.
И сходя из (9.20) имеем
Sx
4,65
Д = / —^ = 2,093 - ^ = = 2,177.
у /п
ч/2 0
Таким обр азом , абсолю тная погрешность равна 2,177, относительная равна
А
- 100 = 21,77% .
х
9.6. £ =
'°’н = —
= 0 ,2 . И з таблицы для £ = 0,2 и у = 0,95 находим л = 1 0 0 .
W
25%
9 7 Вызывает подозрение четвертый результат. Определим для него v по
уравнению (9.23): г = 1,795. При /7 = 6 Р > 0,1.
Таким обр азом , четвертый результат следует безусловно оставить, впрочем,
как и все остальные.
9 8 F r ф = 511,4 мл; 5 3гф = 7,8 9 м л ; 5 ^ гф = 3,5 3 м л ;
..
..
С
= 5 1 ,1 % ; Sc
= 1 ,0 9 % ; S -
'%
= 0 ,4 9 % .
оК4
В соответствии с (9.29)
^сн4 =
К .ф С с„4 - 511.4 •0.511 мл = 261,3 (мл);
= V S K .t С К + S L 4 ^
= ч /3 ,5 3 2 • 0,5112 + 0.00492 • 511,42 = 3,09 мл.
Так как Рсщ вряд ли подчиняется нормальному распределению , для
нахождения погрешности воспользуемся распределением С тью дента (табл. 92).
Для 7 = 0,95 и / = 4 / = 2,776, Д ^ = 2,776 • 3,09 мл = 8,56 мл.
9 9 Приведенные данные по4 кинетике роста бактерии описываются
зависимостью 1п7) = 1п7) 0 + р/. Определение всех интересующ их величин мож но
сделать по формулам (9 .3 5 )— (9.41) вручную или с использованием ЭВМ .
П реобразуем экспериментальные данные к виду
..
>(1п /))
х (/)
........
- 2 .0 0 2
0
- 1 ,7 7 2
0,5
-1 ,5 0 1
1,0
- 1 ,2 0 4
1,5
- 0 ,8 5 9
2,0
- 0 ,6 2 9
2,52, 5
и по указанным формулам определяем:
In 7)0 = - 2 ,0 3 3 ;
S M= 0,010;
290
ц = 0,562;
S 0 = 0,026;
Д 0.95 (In£>о) = 0,045; Д о,95(р )= 0 ,2 5 .
SlnCo = 0,18;
- 0 ,3 5 0
3,0
Л И Т Е РА Т У РА
Ашмарин И. П ., Ключарев Л . А. Ингибиторы синтеза белка.— Л.: М едицина,
1975. 207 с.
Белл Л . Н. Энергетика ф отосинтезирую щ ей растительной клетки.— М.:
Наука, 1980. 334 с.
Белянин В. Н. Светозависимый рост низших ф отот р оф ов .- Новосибирск:
Наука, 1984. 95 с.
Белянин В. Н., Сидько Ф. Я ., Тренкеншу А. П. Энергетика ф отосинтезиру­
ющей культуры м и кроводорослей.- Новосибирск: Наука, 1980. 134 с.
Березин И. В., Варфоломеев С. Д Биокинетика. М.: Наука, 1979. 310 с.
Бирюков В. В. , Кант ере М . В. Оптимизация периодических процессов куль­
тивирования микроорганизмов.
М.: Наука, 1985. 215 с.
Варфоломеев С. Д . Кинетические модели фотокаталитических процессов //
Пути повышения эффективности преобразования солнечной энергии в природ­
ном фотосинтезе.
В кн.: Фотокаталитическое преобразование солнечной
энергии. Новосибирск: Наука, 1985. 4 . 1 . С. 119
143.
Варфоломеев С. Д ., Зайцев С. В. Кинетические м етоды в биохимических
исследованиях.— М.: М ГУ , 1982. 344 с.
Вольтер В. М атематическая теория борьбы за существование.— М.: Наука,
1978. 286 с.
Сб.: Вопросы управления биосинтезом
низших растений. П од ред.
И. А. Терскова.— Новосибирск: Наука, 1982. 153 с.
Готтшалк Г. М етаболизм бактерий.
М.: Мир, 1982. 310 с.
Диксон М ., У эбб Э. Ферменты.— М.: Мир, 1986. 816 с.
Заварзин Г. А. Водородны е бактерии и карбоксидобактерии.— М.: Наука,
1978. 205 с.
Зейдель А. Н. Элементарные оценки ош ибок измерений.— Л.: Наука, 1968. 96 с.
Иерусалимский Н. Д . Принципы регулирования скорости роста микро­
организмов.— В кн.: Управляемый биосинтез.— М.: Наука, 1966. С. 5— 19.
Калюж ный С. В. Кинетические закономерности образования метана биокаталитическими си стем ам и / / Дисс. на соискание уч. ст. канд. хим. наук. М.:
М ГУ , 1985. 205 с.
Калюж ный С. В., Варфоломеев С. Д . Биотехнология. 1986. Т. 2. № 1.
С. 9 4 - 1 0 0 ; № 3 . С. 70— 77.
Калюж ный С. В., Спивак С. И., Варфоломеев С. Д . Биотехнология, 1986.
Т. 2. № 5 . С. 94
100.
Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики.— М.: Мир, 1979. 280 с.
Малашенко Ю . Р., Мучник Ф. В., Романовская В. А., Садовников Ю . С. М а­
тематические модели и ЭВМ в микробиологической практике.— Киев: Наукова
думка, 1980. 195 с.
М аниатис Т., Фрич Э.. С эм брук Д ж . М олекулярное клонирование.— М.:
М ир, 1984. С. 332— 337.
Параметрическое управление биосинтезом микроводорослей / П од ред.
И. А . Терскова.— Новосибирск: Наука, 1980. 120 с.
Печуркин Н. С. Популяционная микробиология.
Новосибирск: Наука,
1978. 277 с.
Печуркин Н. С., Терское И. А. Анализ кинетики роста и эволюции микроб­
ных популяций.— Новосибирск: Наука, 1975. 215 с.
Пёрт С. Д ж . Основы культивирования микроорганизмов и клеток — М.:
Мир, 1978. 331 с.
Полторак О. М ., Чухрай Е. С., Пряхин А. Новые методы кинетического
анализа трехпараметрических уравнений ферментативного катали за//В естн .
М оск. ун-та. Сер. Химия. 1976. № 2 . С. 152— 160.
291
Работ нова И. J1., П озм огова И. Н. Х ем остатное культивирование и ингиби­
рование роста микроорганизмов.
М.: Наука, 1979. 207 с.
Семенепко В. Е., Владимирова М . Г., Цылин Л . Н., П опова Н. А. Зависи­
мость продуктивности роста и интенсивности ф отосинтеза от концентрации
двуокиси углерода в газовой смеси и аэрации культуры.— В кн.: Управляемый
биосин тез.- М.: Наука, 1966. С. 128— 137.
Спивак С. И. О неединственности решения задач восстановления констант
химической кинетики и констант химических равновесий.— В кн.: М атемати­
ческие проблемы химической термодинамики. Новосибирск: Наука, 1980.
С. 6 3 — 82.
Химическая и биологическая кинетика:
М.: М ГУ , 1983. 295 с.
Чернавский Д . С., Иерусалимский Н. Д . О принципе минимума в кинетике
ферментативных реакций
В кн.: Управляемый биосинтез.- М.: Наука, 1966.
С. 19— 24.
Яблонский Г. С., Спивак С. И. М атематические модели химической ки­
нетики.— М.: Знание, 1977. 64 с.
Frohlich В. Т.,
W ebster I. A., A taai М . М . Shuler М . L. Photobioreactors:
m odels for interaction o f light intensity, Reactor Design, and Algal Physiology. / / B io­
technology and Bioengineering Sym p., 1984. N 13. P. 331— 350.
M onod J. Recherches sur la croissance des cultures bacteriennes. Paris:
Hermann and Cie, 1942. 241 p.
M onod J. The growth o f bacterial cultures// Ann. Rev. o f M icrobiol., 1949.
V. 111. P. 371
394.
П РЕ Д М Е Т Н Ы Й УК АЗА ТЕЛ Ь
Автокаталитический(ая) процесс 9, 30,
50, 52, 57, 110, 112, 128, 153
— реакция 9, 107
— рост 12, 147
Автоселекция 191
Активация роста 6 6 , 6 8
Амплификации коэффициент 102, 105,
106
А н ам орф оза 54, 87, 93, 116, 120,
165, 180
Аутостабилизация роста 162, 164
Базовая реакция 57, 167, 238, 239
Базовый определитель 62
Биокинетика 5, 272
Биосинтез 5, 32, 44, 115, 210
Вариации коэффициент 256, 263
Время
удвоения
клеток
31,
49, 50, 51
48,
Гистерезисные явления 173
Дисперсия 252, 257, 270
— выборочная 256, 258, 261, 264, 267
— генеральная 255, 265, 267
Доверительная(ый,е) вероятность 259,
260, 261, 262, 263, 267
— границы 259, 261
— интервал 259, 260
— погрешности 262
Инактивация 39, 51, 102, 106, 202,
Ингибирование роста 6 6 , 6 8
— бесконкурентное 128, 130
— неконкурентное 69, 70, 129,
132,
138, 139, 142,
143, 144,
174, 182, 183, 184, 185, 198
— конкурентное 69,
125, 129,
132,
136, 137, 138,
139, 142,
144,
145, 174, 175,
176, 177,
181, 184, 185, 198
247
130,
145,
130,
143,
180,
продуктом 6 8 , 81, 89, 98, 120, 122,
123, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 132,
133, 134. 136, 137, 138, 140, 141. 142,
143, 144, 145, 146, 174, 175, 177, 178,
179, 182, 183, 189, 190, 193, 197, 198,
199, 247
— смеш анное 71, 132
— субстратом 6 8 , 81, 107, 113, 114,
115,
116, 117, 118, 119, 120, 121,
136,
140, 141, 142, 143, 144, 145,
146,
167, 168, 169, 170, 171, 172,
173,
174, 189, 190, 193, 197, 198,
199, 224, 247
Ингибиторы необратимые 67
— обратимы е 67, 123
по кинетическому механизму 6 6 , 67
— по «мишени» 6 6 , 67
Каталитический центр 9
Квантовый расход 213
Квантовая эффективность 223
К онстанта диссоциации (ионизации)
6 8 , 73, 74, 77, 108, 112, 130, 131,
132, 2421, 242, 243, 245
— ингибирования 69, 70, 77, 118, 120,
125, 138, 143, 170, 171, 178, 185,
223, 224
— каталитическая 26, 51
равновесия 67, 108, 123, 134, 175
скорости 124, 147. 211, 212, 216, 217
второго порядка 26, 2 1 2
инактивации 42, 99, 102
первого порядка 11, 62, 214, 215
сродства субстрата к микроорга­
низму 8 , 35, 39, 49, 51, 54, 58,
59, 73. 74, 77, 87, 94, 138, 162,
170, 171, 189, 230, 231, 233, 241,
242
К онтроль ослабленный 207
— строгий 207
К оординаты Диксона 70
— Лайнуивера - Бёрка (двойные о б ­
ратные) 70, 71
— полулогарифмические 52, 92, 147,
152, 157, 202, 203, 225
Коэффициент преобразования энергии
212, 215, 216, 217, 218, 219, 221
293
Ливис 8 , 199, 247
Лимитирую щ ий(ая) источник энергии
222
-
стадия 9, 50, 212, 214, 216, 217,
219, 235, 236
- субстрат 8 , 9, 25, 30, 31, 32, 33, 44, 47,
48, 50, 61, 77, 81, 8 6 , 98, 100, 103, 158,
185, 199, 208, 222, 223, 224, 230, 231, 234
- фермент 25, 26, 33, 36, 39, 44, 51,
53, 67, 73, 74, 115, 208, 210
Логистическая(ое) кривая 79, 80, 81,
84, 85, 8 6 , 205, 206, 222
уравнение 79
П срмеаза 37
П лазмиды 201, 202, 203, 204, 205,
206, 207, 208, 209, 210
П лотностатный режим 210
П лотность распределения 48
П огрешности измерений 249
- грубые (промахи) 249, 250, 264, 265
— систематические 249, 250,
251,
263, 264
случайные 249, 250, 251, 252, 255,
257, 260, 263, 264, 269
П ороговая длина волны 213
П ороговая интенсивность света 216
П ороговая минимальная концентра­
ция субстрата 42, 51
М етаболические коэффициенты 237
М етаногенная ассоциация микроорга­
низмов 230, 236, 237, 238, 239, 240,
241, 244, 245, 246
М етод двойного зеркального отраж е­
ния 196, 197, 198, 199, 247
— двойных обратных координат 54,
64, 65, 69
— Диксона 69, 70
интервального оценивания 258
Корниш — Боуден 55
— м алого параметра 19, 22, 28, 50,
124, 128, 131, 134
наименьших квадратов 269, 270, 271
разностный 52, 77, 91, 94, 95, 106,
116, 117, 141
регрессионного анализа 268, 269
М ех а н и зм -за п р о г р а м м и р о в а н н ы й
отказ 99, 101, 103, 104, 105, 106
пинг-понг 58, 59, 60, 64, 65, 77
прогрессирующая
некомпетент­
ность 99, 103, 104, 105, 106, 202
с
немультиплицирующими
суб­
стратами 58, 59
с мультиплицирующими субстра­
тами 58, 59, 60, 61
— тройного комплекса 57, 60
М икроводоросли 57, 210, 211, 212, 227
М итов 36
М ихаэлиса комплекс 12
константа 26, 30, 33, 34, 49, 51
М ихаэлиса
М ентен уравнение 9, 26,
32, 37, 50, 53, 55
М оно 5, 9, 47
уравнение 9, 11, 12, 18, 21, 30,
35, 41, 50, 51, 55, 77, 100, 116, 148,
152, 162
— интегральное 83
Светособираю щ ая антенна 211
Симбиотические ассоциации 229, 230,
232, 233, 236, 239, 246, 247
Скалярная связность 63, 64
Скорость разбавления 161, 162, 163,
164,
165, 166, 167, 168, 169, 170,
171,
172, 173, 174, 178, 179, 180,
181,
184, 187, 188, 189, 190, 227,
228, 229
критическая 163, 168, 169, 170,
175,
176, 177, 178, 187
— роста удельная 8 , 10, 25, 30, 31,
33,
37, 38, 41, 42, 46, 47, 50, 51,
53,
54, 55, 58, 62, 63, 64, 65, 69,
77,
80, 99, 107, 108, 110, 111, 113,
114,
115, 116, 118, 119, 120, 125,
126,
127, 129, 149. 152, 154, 156,
157,
158, 162, 167, 174, 175, 177,
189, 207, 209, 210
максимальная 12, 24, 25, 30,
33,
36, 39, 46, 47, 49, 51, 54,
59,
6 6 , 6 8 , 73, 77,87,
162, 169,
171,
173, 189, 204, 230, 232, 233,
234
Среднее квадратическое отклонение
252
П ериод индукции (лаг-фаза) 7, 16, 35,
91, 92, 95, 147, 148, 150, 152, 153,
154, 155, 156, 157, 158, 159, 197, 243
Тейсиера уравнение 30
Теория графов 62
Транскрипция(и) 25, 26
294
Рандомизация 251
Распределение Гаусса 252, 253
С тью дента 261, 271
Реакционный центр 210, 211, 219
Регрессии коэффициенты 269, 270
Репликация(и) 25, 26, 31, 32, 35, 39,
47, 48, 201
— скорость 27, 34, 35, 47, 203
скорость 27
Трансляция(и) 25, 26
- скорость 27
Экономический коэффициент 81, 181,
231, 233, 241
Экспоненциальное приближение 90
Уровень значимости 259
AIcaligenes eutrophus 91, 94, 95
A nacystis nidulans 220. 221
Фаза замедления роста 7, 78
— линейного роста 7, 78, 126, 145
— отмирания культуры 8
— стационарная 8 , 1 2 2
— экспоненциального роста 7, 52, 53,
57, 61, 69, 76, 77, 78, 121, 126,
145, 147, 193, 199, 201, 202, 203,
226
Ферментативный катализ 5, 6 , 216
Ф ерхюльста уравнение 78, 85, 94
Ф отосинтез
210,
211,
212,
213,
214, 215, 216, 218, 219, 221, 222,
223
Ф отосинтезирую щ ие микроорганизмы
2 1 0 , 2 2 1 , 226
Фотосинтетически активная радиация
213, 216, 218
Ф отосистемы I и II 83, 84, 99, 100,
118, 119, 120, 211, 213
Х емостат 160, 162, 163, 167, 173, 174,
178, 179, 182, 183, 185, 189, 226
Хлорелла 216, 218, 219
Хлорофилл 211, 215, 222, 224, 225,
226, 2 2 7 ,-2 2 8
Bacillus megalerium 76
— sub til is 6 6
— thuringiensis 143, 144
Candida utilis 75, 76
Escherichia coli 6 6 , 70, 98,
201, 202, 203, 204
Hypom i crobium neptunium
105,
106,
66
M ethanobacillus barkeri 246
M ethanobacillus kuzneceovii 236
M ethanobacterium therm oautotrophi cum
53, 64, 65, 76, 143, 144, 246
Methanococcus maripaludis 76
Methanolobus tindaris 52
Methanosarcina vacuolata 96, 97
Propionibacterium shermanii 144
Pseudomonas aeroginosa 157
Phodospirillum rubrum 211
Цианобактерии 57, 211, 220
Число оборотов фермента 49
T hermoanaerobium lactoethylicum
Thiobacillus ferrooxidans 166
158
ОГЛАВЛЕНИЕ
П редисловие
..............................................................................................................................
3
Введение
.......................................................................................................................................
5
Г л а в а 1.
Кинетические модели роста культур микроорганизмов ..........
7
Г л а в а 2.
Экспоненциальная фаза роста культур микроорганизмов ............
52
0 Г л а в а 3.
t
Ин тегральная форма уравнения роста микробной популяции ......
78
Г л а в а 4.
Ингибирование роста популяции микроорганизмов избытком
субстрата ..............................................................................................................
107
Г л а в а 5.
Ингибирование роста популяции микроорганизмов продуктами
ферментации ........................................................................................................
122
Г л а в а 6.
Периоды индукции на
организмов .......................
147
Г л а в а 7.
Культивирование микроорганизмов в режиме хемостата ......
160
Г л а в а 8.
Исследование кинетики роста микробных популяций с исполь­
зованием Э ВМ .................................................................................................
191
Г л а в а 9.
О бработка результатов измерений в микробиологических иссле­
дованиях ...............................................................................................................
249
кинетических
кривых
роста
микро­
Заключение ..................................................................................................................................
271
Задачи
............................................................................................................................................
273
Ответы и решения .................................................................................................................
284
Л итература ..................................................................................................................................
291
П редметны й указатель
293
........................................................................................................
Учебное издание
Варфоломеев Сергей Дмитриевич
Калюжный Сергей Владимирович
Б И О Т Е Х Н О Л О ГИ Я
К И Н Е Т И Ч Е С К И Е О С Н О ВЫ
М И К Р О Б И О Л О Г И Ч Е С К И Х П РО Ц Е С С О В
Редактор М. М. Пенкина. М ладшие редакторы Е. В. Бурова, Е. И.Попова.
Художник В. Н. Хомяков. Художественный редактор Т. А. Коленкова. Техни­
ческий редактор Н. А . Битюкова. К орректор Г. И. К острикова
ИБ № 8180
№ И зд. № Е — 575. Сдано в набор 24.08.89. Подп. в печать 26.07.90. Т-12604. Ф ормат
6 0 Х 8 8 '/|б - Бум. офс. № 2. Гарнитура тайме. Печать оф сетная. Объем 18,13 уел.печ. л.
18,13 уел. кр.-отт. 16,87 уч.-изд. л. Т ираж 11 ООО экз. Зак. № 544. Цена 90 коп.
Издательство «Высшая школа», 101430, Москва, ГСП-4, Неглинная ул., д. 29/14.
Отпечатано с диапозитивов Ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового Красного
Знамени МПО «Первая О бразцовая типография» Государственного комитета СССР по
печати. 113054, Москва, Валовая, 28 в Московской типографии № 4 Госкомпечати СССР.
129041, Москва, Б. П ереяславская ул., 46.
