ГОУ ВПО НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ КАФЕДРА ФИЛОСОФИИ Методология исследования получения дендритных клеток, инициирующих различный иммунный ответ Выполнил: Куликова Е.В. Научный руководитель: д.м.н., профессор Сенников С.В. Проверил: д.ф.н., профессор Барбашина Э.В. Новосибирск 2011 Содержание Список сокращений……………………………………………………………………………...3 Введение………………………………………………………………………………………….4 Общая методология исследования……………………………………………………………...6 Конкретизация методов, применяемых в диссертационном исследовании………………..10 Применение общенаучных методов в рамках диссертационного исследования…………..16 Заключение……………………………………………………………………………………...19 Список литературы……………………………………………………………………………..20 2 Список сокращений FCS – эмбриональная телячья сыворотка IL – интерлейкин MATra – магнитная трансфекция ДК – дендритные клетки МНК – мононуклеарные клетки нф – неприлипающая фракция ПК – периферическая кровь РНК – рибонуклеиновая кислота рчIL – рекомбинантный человеческий интерлейкин 3 Введение Дендритные клетки (ДК) являются наиболее активными антиген- презентирующими клетками в живом организме. При взаимодействии с антигенными паттернами они продуцируют различные наборы цитокинов, что в последующем определяет направление дифференцировки Т-клеток, распознавших антиген, и тип иммунного ответа (Тх1 - клеточный, Тх2 - гуморальный, Т регуляторные - отсутствие ответа или толерантность). Показано, что манипуляции с дендритными клетками для индукции того или иного иммунного ответа и дальнейшее их введение человеку или лабораторным животным в виде вакцины могут являться хорошим способом лечения различных заболеваний, таких как опухолевые, инфекционные и аутоиммунные (Pulendran et al., 2010). В настоящее время существует очень много протоколов получения дендритных клеток, стимулирующих различный иммунный ответ. К ним относятся методы in vitro: трансфекция генами или мРНК антигенов, генами цитокинов, в том числе хемокинов, сайленсинг генов цитокинов, рецепторов дендритных клеток, факторов транскрипции путем РНК-интерференции, факторов транскрипции путем введения антисмысловых олигодезоксирибонуклеотидов. Однако все они не лишены недостатков, поэтому вопрос о разработке новых и оптимизации известных методов получения дендритных клеток, индуцирующих различный иммунный ответ, остается актуальным (Hilkens et al., 2010). Перспективным способом модификации дендритных клеток может служить метод трансфекции транскрипционными факторами, активация которых приводит к развитию того или иного иммунного ответа посредством увеличения секреции про- или противоспалительных цитокинов. Однако в настоящее время не существует работ, посвященных влиянию данной трансфекции на способность дендритных клеток, в частности, продуцировать различные цитокины и, следовательно, инициировать соответствующий иммунный ответ. Целью данной работы является охарактеризовать методологию исследования по получению дендритных клеток, инициирующих различный иммунный ответ. Задачи: 1. Описать общую методологию исследования. 4 2. Конкретизировать методы, применяемые в диссертационной работе. 3. Проиллюстрировать применение общенаучных методов в рамках диссертационного исследования. Таким образом, в качестве объекта исследования выступают дендритные клетки, а предметом являются методы исследования получения дендритных клеток. 5 Общая методология исследования Основные отличия научных знаний как продукта научной деятельности от знаний, получаемых в сфере обыденного, стихийно-эмпирического познания объясняются спецификой объектов систематизированы; это, научного скорее, исследования. конгломерат Обыденные сведений, чаще предписаний, всего не рецептур деятельности и поведения, накопленных на протяжении исторического развития обыденного опыта. Их достоверность устанавливается благодаря непосредственному применению в наличных ситуациях производственной и повседневной практики. Что же касается научных знаний, то их достоверность уже не может быть обоснована только таким способом, поскольку в науке преимущественно исследуются объекты, еще не освоенные в производстве. Поэтому нужны специфические способы обоснования истинности знания. Ими являются экспериментальный контроль за получаемым знанием и выводимость одних знаний из других, истинность которых уже доказана. В свою очередь, процедуры выводимости обеспечивают перенос истинности с одних фрагментов знания на другие, благодаря чему они становятся связанными между собой, организованными в систему. Таким образом, мы получаем характеристики системности и обоснованности научного знания, отличающие его от продуктов обыденной познавательной деятельности людей. Из главной характеристики научного исследования можно вывести также и такой отличительный признак науки при ее сравнении с обыденным познанием, как особенность метода познавательной деятельности. Объекты, на которые направлено обыденное познание, формируются в повседневной практике. Приемы, посредством которых каждый такой объект выделяется и фиксируется в качестве предмета познания, вплетены в обыденный опыт. Совокупность таких приемов, как правило, не осознается субъектом в качестве метода познания. Иначе обстоит дело в научном исследовании. Здесь уже самообнаружение объекта, свойства которого подлежат дальнейшему изучению, составляет весьма трудоемкую задачу. Чтобы зафиксировать объект, ученый должен знать метод такой фиксации. Поэтому в науке изучение объектов, выявление их свойств и связей всегда сопровождается осознанием метода, посредством которого исследуется объект. Объекты всегда даны человеку в системе определенных приемов и методов его деятельности. Но эти приемы в науке уже не очевидны, не являются многократно повторяемыми в повседневной практике приемами. И чем дальше наука отходит от привычных вещей повседневного опыта, углубляясь в исследование ≪необычных≫ объектов, тем яснее и отчетливее проявляется необходимость в создании и разработке 6 особых методов, в системе которых наука может изучать объекты. Наряду со знаниями об объектах наука формирует знания о методах. Потребность в развертывании и систематизации знаний второго типа приводит на высших стадиях развития науки к формированию методологии как особой отрасли научного исследования, призванной целенаправленно вести научный поиск (Степин, 2006). Таким образом, одна из важных особенностей научного познания в сравнении с обыденным состоит в его организованности и использовании целого ряда методов исследования. Под методом при этом понимается совокупность приемов, способов, правил познавательной, теоретической и практической, преобразующей деятельности людей. Эти приемы, правила в конечном счете устанавливаются не произвольно, а разрабатываются исходя из закономерностей самих изучаемых объектов. Поэтому методы познания столь же многообразны, как и сама действительность. Исследование методов познания и практической деятельности является задачей методологии. Методология - применение к процессу познания принципов мировоззрения, т.е. соотнесение полученных данных с другими фундаментальными науками и в первую очередь с философией. В зависимости от роли и места в процессе научного познания можно выделить методы формальные и содержательные, эмпирические и теоретические, фундаментальные и прикладные, методы исследования и изложения. Содержание изучаемых наукой объектов служит критерием для различия методов естествознания и методов социально-гуманитарных наук. Методы естественных наук могут быть подразделены на методы изучения неживой природы и методы изучения живой природы. Выделяют также качественные и количественные методы, однозначно-детерменистские и вероятностные, методы непосредственного и опосредованного познания, оригинальные и производные. В современной науке достаточно успешно работает многоуровневая концепция методологического знания. В этом плане все методы могут быть разделены на несколько основных групп: 1. Всеобщие, философские методы, сфера применения которых наиболее широка. Наиболее древними из них являются диалектический и метафизический. К их числу также относятся диалектико-материалистический метод, аналитический (характерный для современной аналитической философии), 7 интутитивный, феноменологический, герменевтический (понимание). Философские методы задают лишь самые общие регулятивы исследования, его генеральную стратегию, но не заменяют специальные методы и не определяют окончательный результат познания прямо и непосредственно. 2. Общенаучные методы, находящие применение во всех или почти во всех науках. И своеобразие, и отличие от всеобщих методов в том, что они находят применение не на всех, а лишь на определенных этапах процесса познания. Например, индукция играет ведущую роль на эмпирическом, а дедукция - на теоретическом уровне познания, анализ преобладает на начальной стадии исследования, а синтез – на заключительной и т.д. При этом в самих общенаучных методах находят, как правило, свое проявление и преломление требования всеобщих методов. 3. Частные, или специальные, методы, характерные для отдельных наук или областей практической деятельности. Это методы химии или физики, биологии или математики, методы металлообработки или строительного дела. 4. Наконец, особую группу методов образуют методики, представляющие собой приемы и способы, вырабатываемые для решения какой-то особенной, частной проблемы (дисциплинарные). Выбор верной методики – важное условие успеха исследования (Кохановский, 2006). Методы и средства исследовательской деятельности также можно разделить исходя из того, к какому типу относится познание - эмпирическому или теоретическому. На эмпирическом уровне в качестве основных методов применяются реальный эксперимент и реальное наблюдение. Важную роль также играют методы эмпирического описания, ориентированные на максимально очищенную от субъективных наслоений объективную характеристику изучаемых явлений. Что же касается теоретического исследования, то здесь применяются особые методы: идеализация (метод построения идеализированного объекта); мысленный эксперимент с идеализированными объектами, который как бы замещает реальный эксперимент с реальными объектами; особые методы построения теории (восхождение от абстрактного к конкретному, аксиоматический и гипотетико-дедуктивный методы); методы логического и исторического исследования и др. Эмпирическое исследование в основе своей ориентировано на изучение явлений и зависимостей между ними. На этом уровне познания сущностные связи не выделяются 8 еще в чистом виде, но они как бы высвечиваются в явлениях, проступают через их конкретную оболочку. На уровне же теоретического познания происходит выделение сущностных связей в чистом виде. Сущность объекта представляет собой взаимодействие ряда законов, которым подчиняется данный объект. Задача теории как раз и заключается в том, чтобы, расчленив эту сложную сеть законов на компоненты, затем воссоздать шаг за шагом их взаимодействие и таким образом раскрыть сущность объекта. Изучая явления и связи между ними, эмпирическое познание способно обнаружить действие объективного закона. Но оно фиксирует это действие, как правило, в форме эмпирических зависимостей, которые следует отличать от теоретического закона как особого знания, получаемого в результате теоретического исследования объектов. Эмпирическая зависимость является результатом индуктивного обобщения опыта и представляет собой вероятностно-истинное знание. Выделив эмпирическое и теоретическое познание как два особых типа исследовательской деятельности, можно сказать, что предмет их разный, т.е. теория и эмпирическое исследование имеют дело с разными срезами одной и той же действительности. Эмпирическое исследование изучает явления и их корреляции; в этих корреляциях, в отношениях между явлениями оно может уловить действие закона. Но в чистом виде он выявляется только в результате теоретического исследования. Следует подчеркнуть, что увеличение количества опытов само по себе не делает эмпирическую зависимость достоверным фактом, потому что индукция всегда имеет дело с незаконченным, неполным опытом. Сколько бы мы ни проделывали опытов и ни обобщали их, простое индуктивное обобщение опытных результатов не ведет к теоретическому знанию. Теория не строится путем индуктивного обобщения опыта. Это обстоятельство во всей его глубине было осознано в науке сравнительно поздно, когда она достигла достаточно высоких ступеней теоретизации. Эмпирический и теоретический уровни познания отличаются по предмету, средствам и методам исследования. Однако выделение и самостоятельное рассмотрение каждого из них представляют собой абстракцию. В реальности эти два слоя познания всегда взаимодействуют (Степин, 2006). 9 Конкретизация методов, применяемых в диссертационном исследовании Остановимся подробнее на характеристике некоторых общенаучных методов исследования, которые находят применение на эмпирическом уровне научного познания – к наблюдению, измерению и эксперименту. Научным наблюдением называется восприятие предметов и явлений действительности, осуществляемое с целью их познания. В акте научного наблюдения всегда присутствуют: 1) объект наблюдения; 2) субъект; 3) средства; 4) условия наблюдения; 5) система знания, исходя из которой задают цель наблюдения и интерпретируют его результаты. Все эти компоненты акта наблюдения следует учитывать при сообщении результатов наблюдения, для того чтобы его мог повторить любой другой наблюдатель. Наблюдения разделяются на непосредственные и косвенные. При непосредственном наблюдении ученый наблюдает сам избранный объект. Косвенное наблюдение опирается на предположение об определенной закономерной связи между свойствами ненаблюдаемых объектов и наблюдаемыми проявлениями этих свойств и содержит логический вывод о свойствах ненаблюдаемого объекта на основе наблюдаемого эффекта его действия. В современной науке косвенные наблюдения получают все большее распространение по мере того, как увеличивается число приборов, используемых при наблюдении, и расширяется сфера изучаемых объектов. Наблюдаемый предмет воздействует на прибор, а ученый непосредственно наблюдает лишь результат взаимодействия предмета с прибором (Никифоров). Научное наблюдение, в отличие от простого созерцания, предполагает замысел, цель и средства, с помощью которых субъект переходит от предмета деятельности (наблюдаемого явления) к ее продукту (отчету о наблюдаемом). В реальной научной практике наблюдение представляет собой активный познавательный процесс, опирающийся не только на работу органов чувств, но и на выработанные наукой средства и методы истолкования чувственных данных. К научному наблюдению предъявляются жесткие требования: четкая постановка цели наблюдения; выбор методики и разработка плана; систематичность; контроль за корректностью и надежностью результатов наблюдения; обработка, осмысление и истолкование полученного массива данных (Лебедев, 2005). 10 Измерением называют процесс представления свойств реальных объектов в виде числовой величины. В самом общем виде величиной можно назвать все то, что бывает больше или меньше, что может быть присуще объекту в большей или меньшей степени; числовая величина – такая, которая может быть выражена числом. Таким образом, измерение есть установление числового соотношения между свойствами объектов. В процессе измерения, т.е. в процессе приписывания чисел свойствам объектов, нужно соблюдать определенные правила, для того чтобы результат измерения мог претендовать на интерсубъективную значимость. Эти правила называются правилами измерения: 1. Правило эквивалентности: если физические значения измеряемых величин равны, то должны быть равны и их числовые выражения. 2. Если физическое значение одной величины меньше (больше) физического значения другой величины, то числовое выражение первой должно быть меньше (больше) числового выражения второй. 3. Правило аддитивности: числовое значение суммы двух физических значений некоторой величины должно быть равно сумме числовых значений этой величины. 4. Правило единицы измерения. Хотя единицы измерения выбираются произвольно, однако на их выбор накладываются определенные ограничения. Тело или процесс, избранные в качестве единиц измерения, должны сохранять неизменными свои размеры, форму, периодичность. Поэтому в качестве реальных эталонов измерения выбирают как можно более устойчивые к внешним воздействиям тела и процессы. (Никифоров). Измерение предполагает наличие в средствах деятельности помимо некоторого масштаба (единицы измерения) и алгоритма (правил) процесса измерения также измерительного устройства. Измерение есть процедуpa установления одной величины с помощью другой, принятой за эталон. Первая из указанных величин называется измеряемой величиной, вторая — единицей измерения. Отсюда под измерением можно понимать также процедуру сравнения двух величин, в результате которой экспериментально устанавливается отношение между величиной измеряемой и принятой за единицу. 11 Результат измерения — численное значение величины. Если измерения величины дают одно и то же значение, то такая величина называется постоянной. Величина, которая принимает различные численные значения (в некоторой ситуации), называется переменной. Из определения измерения следует, что измерение есть процедура экспериментальная. Последняя предполагает определенную экспериментальную ситуацию и соответствующий способ, с помощью которого осуществляется операция измерения. Рассмотрим теперь вопрос о способе измерения как неотъемлемой стороне всякой измерительной процедуры. Способ измерения включает в себя три главных момента: 1) выбор единицы измерения и получение набора соответствующих мер; 2) установление правила сравнения измеряемой величины с мерой и правило сложения мер; 3) описание процедуры сравнения. До сих пор мы все время рассматривали так называемое прямое измерение. Однако с развитием науки все большее практическое и теоретическое значение приобретает метод косвенного измерения. При прямом измерении результат получается путем непосредственного сравнения измеряемой величины с эталоном, а также с помощью измерительных приборов, позволяющих непосредственно получать значение измеряемой величины (например амперметр). При косвенном измерении искомая величина определяется на основании прямых измерений других величин, связанных с первой математически выраженной зависимостью. Возможность косвенного измерения как особой познавательной процедуры, ведущей к получению объективного знания, вытекает из того, что в объективном мире одни явления, свойства, качества связаны с другими. Взаимозависимость различных процессов, свойств, сторон может, в частности, выражаться в том, что изменение какой-либо одной исследуемой величины обусловливает изменение другой (Лебедев, 2005). Важнейшим методом эмпирического познания является эксперимент, включающий в себя все другие эмпирические процедуры. Эксперимент есть непосредственное материальное воздействие на реальный объект или окружающие его условия, осуществляемое с целью познания этого объекта. В эксперименте выделяют следующие элементы: 1) цель эксперимента; 2) объект экспериментирования; 3) условия, в которых находится или в которые помещается объект; 4) средства эксперимента; 5) материальное воздействие на объект или условия его 12 существования. Каждый из этих элементов может быть положен в основу классификации экспериментов. Например, эксперименты можно разделять на физические, химические, биологические и т.п. в зависимости от различия объектов экспериментирования. Одна из наиболее простых классификаций основывается на различиях в целях эксперимента. Целью эксперимента может быть установление каких-либо закономерностей или обнаружение фактов. Эксперименты, производимые с такой целью, называются поисковыми. Результатом поискового эксперимента является новая информация об изучаемой области. Однако чаще эксперимент проводится с целью проверки некоторой гипотезы или теории. Такой эксперимент называется проверочным. Ясно, что нельзя провести резкую границу между этими двумя видами экспериментов. Один и тот же эксперимент может быть поставлен для проверки гипотезы и в то же время дать неожиданную информацию об изучаемых объектах. Точно так же и результат поискового эксперимента может заставить нас отказаться от принятой гипотезы или, напротив, даст эмпирическое обоснование нашим теоретическим рассуждениям. В современной науке один и тот же эксперимент все чаще обслуживает разные цели (Никифоров). Воздействуя на предмет в специально подобранных условиях, исследователь целенаправленно вызывает к жизни нужное ему состояние, а затем изучает его. В сравнении с наблюдением структура эксперимента как бы удваивается: один из его этапов представляет собой деятельность, цель которой— достижение нужного состояния предмета, другой связан с собственно наблюдением. Чтобы превратить эксперимент в познавательное средство, необходимы операции, позволяющие перевести логику вещей в логику понятий, материальную зависимость в логическую. Для этого нужно располагать следующим рядом: 1) принципами теории и логически выводимыми из них следствиями; 2) идеализированной картиной поведения объектов; 3) практическим отождествлением (в заданном интервале абстракции) идеализированной модели с некоторой материальной конструкцией. То есть получение экспериментального вывода (нового знания) и, следовательно, реализация познавательной функции эксперимента не является простой задачей, вывод не вытекает непосредственно из опыта. Он свидетельствует о том, что только при определенных предпосылках и условиях исследователь может получить истинное утверждение, наблюдая организованное им материальное взаимодействие. Всякому эксперименту предшествует подготовительная стадия. В основе предварительной деятельности лежит замысел эксперимента, представляющий собой некоторое предположение о тех связях, которые должны быть вскрыты в процессе его и 13 которые уже предварительно выражены с помощью научных понятий, абстракций. В эксперименте, как правило, используются приборы — искусственные или естественные материальные системы, принципы работы которых нам хорошо известны, ибо в противном случае их применение обесценивается, так как показания их не были бы для нас понятными. Таким образом, в рамках нашего эксперимента уже фигурирует в ≪материализованной≫ форме наше знание, некоторые теоретические представления. Всякая попытка отделить эксперимент от теоретических знаний делает невозможным понимание его природы, познавательной сущности. Она перечеркивает по существу всю ту целесообразную деятельность, которая предшествует эксперименту и результатом которой он является. Вне ее эксперимент есть обычное материальное взаимодействие, взаимодействие, в принципе не отличающееся от тех, которые совершаются на наших глазах повсеместно, ежеминутно. Только тогда, когда последнее, будучи формой практической деятельности и, следовательно, деятельности целесообразной, превращается нами в познавательное средство, оно выступает как эксперимент. Типы экспериментальных вопросов, как уже было отмечено, можно в известном смысле разделить на два рода. Одни из них побуждают ученого к решению задачи нахождения зависимостей между рядом параметров объекта, причем предварительно невозможно сформулировать с надлежащей точностью их характер. Иногда можно с большой степенью уверенности перечислить все логически возможные варианты этих зависимостей и, следовательно, выразить их в системе утверждений, каждое из которых может быть проверено. Все возможности, строго говоря, в этом случае равновероятны. Исходя из чисто теоретических соображений, ученый не имеет оснований предпочесть какую-либо одну из них. Это не меняет в принципе поискового характера эксперимента, того обстоятельства, что с его помощью требуется найти зависимость, характерную для объекта исследования и никаким образом не вытекающую из уже имеющегося знания. Такой тип эксперимента называется исследовательским. Другой тип экспериментального исследования связан с проверкой уже полученного научного утверждения. В связи с этим в эксперименте ставится задача — проверка того целостного теоретического построения, из которого было выведено данное утверждение. Эксперимент, задачей которого является подтверждение истинности отдельного научного утверждения, сформулированного в рамках теории, называется проверочным. Различие между проверочным и исследовательским экспериментом достаточно ясно проявляется уже на стадии их планирования. В одном случае мы отыскиваем 14 зависимость тех или иных параметров объекта, предварительно не зная ее характера. Это свидетельство того, что мы не располагаем теорией данной предметной области и наши знания носят преимущественно эмпирический характер. Представляется очень трудной на этой ступени оценка тех или иных найденных зависимостей в качестве существенных или второстепенных для понимания сущности объектов изучения. Когда же мы заняты экспериментальным подтверждением истинности некоторых научных утверждений(следствий принятой нами теории), дело обстоит иначе. Наши эксперименты менее хаотичны, мы имеем точную программу исследования. Планирование эксперимента опирается в этом случае прежде всего на знание о предполагаемых сущностных связях объекта. В этих условиях та или иная зависимость между фиксируемыми параметрами приобретает глубокий смысл и, следовательно, ее экспериментальное изучение становится более плодотворным. Если контуры вопроса в исследовательском эксперименте носят в значительной степени расплывчатый, общий характер, то в проверочном они имеют четкую, определенную форму (Лебедев, 2005). Следует подчеркнуть, что наблюдение, измерение и эксперимент, хотя и тесно связаны с теоретическими допущениями, являются разновидностями практической деятельности. Осуществляя рассмотренные эмпирические процедуры, мы выходим за рамки чисто логических рассуждений и обращаемся к материальному взаимодействию с реальными вещами. В конечном итоге только через посредство такого взаимодействия получают подтверждение или опровержение наши представления о действительности. В эмпирических познавательных процедурах наука вступает в непосредственный контакт с описываемой ею реальностью – именно в этом заключается громадное значение наблюдения, измерения и эксперимента для научного познания (Никифоров). 15 Применение общенаучных методов в рамках диссертационного исследования Выделение мононуклеарных клеток периферической крови и получение прилипающей фракции мононуклеаров. Данный метод можно рассматривать как подготовительный, в его ходе изучаемый объект изолируется от влияния побочных, затемняющих его сущность обстоятельств и представляется в "чистом виде". Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли путем центрифугирования цельной крови в градиенте плотности фиколл-урографина (ρ=1,082 г/л). Для этого 6 мл цельной крови наслаивали на 3 мл фиколл-урографина и центрифугировали 30 мин. при 1500 об/мин. Клетки интерфазного кольца собирали, дважды отмывали в среде RPMI-1640 (ГНЦ ВБ «Вектор»), после чего ресуспендировали в 5 мл полной среды RPMI-1640, содержащей 10% FCS (PAA, Австрия), 2 мМ L-глютамина (ГНЦ ВБ «Вектор»), 10 мМ HEPES буфера (Sigma), 5*10-4 М 2-меркаптоэтанола (Sigma), 80 мкг/мл гентамицина (АО «Самсон» Санкт-Петербург), 100 мкг/мл ампициллина (ЗАО «Синтез» Курган), переносили в чашку Петри (90 мм, Nunc, Дания) и инкубировали 2 ч. в атмосфере, содержащей 5% СО2 при 370С. Среду с неприлипшими клетками удаляли, клетки осаждали путем центрифугирования и сохраняли для дальнейшего использования в атмосфере, содержащей 5% СО2 при 370С, поверхность чашки Петри ополаскивали средой 2 раза и собирали клетки в растворе Версена с помощью скребка для клеточных культур (BD). Анализ фенотипических и функциональных показателей дендритных клеток. В данном методе мы начинаем анализ полученных результатов путём наблюдений и измерений, в отличие от обычного наблюдения в ходе данного эксперимента мы активно вмешиваемся в протекание изучаемого процесса с целью получить о нем определенные знания или информацию для дальнейшего применения этих знаний в эксперименте. Для анализа фенотипических характеристик дендритных клеток мы использовали соответствующие меченые флюорохромом моноклональные антитела anti-CD 83 PE (BD Pharmingen), anti-CD 86 FITC (BD Pharmingen), anti-HLA FITC («Сорбент», Москва) с последующим анализом на проточном 16 цитометре FACSCalibur (BD). Клетки инкубировали с антителами в течение 1 часа при 370С, затем отмывали и фиксировали в растворе формалина. Для оценки способности полученных дендритных клеток к захвату антигена мы определяли их эффективность рецептор-опосредованного эндоцитоза с помощью FITC-декстрана (Sigma). Для этого проводилась инкубация клеток с FITCдекстраном (1 мкг/мл) в полной среде при +4С и при +37С. При +4С происходит связывание декстрана с поверхностными рецепторами, а при +37С связный декстран проникает в клетку (непосредственно эндоцитоз). Результаты представлены в виде разности интенсивностей флюорисценции клеток, захватывающих декстран при при +4С и при +37С (delta MFI). Для анализа клеточного цикла анализируемые клетки однократно отмывали PBS, содержащим 0,02% ЭДТА и 1% азида натрия (раствор 1) и фиксировали в течение 10 минут холодным 1% раствором параформальдегида. Фиксированные клетки центрифугировали, осадок ресуспендировали в растворе 1, содержащем 0,2% Tween 20 и инкубировали для проведения пермеабилизации в течение 10 минут. Затем клетки центрифугировали, осадок ресуспендировали в растворе 1, содержащем РНКазу в конечной концентрации 25 мкг/мл и инкубировали в темноте 30 минут. После этого клетки центрифугировали, осадок ресуспендировали в 500 мкл раствора 1, содержащего 7AAD (Sigma) в конечной концентрации 1 мкг/мл. Анализ клеточного цикла и уровня апоптоза проводили на основании измерения содержания ДНК методом проточной цитометрии. Процентное содержание апоптотических клеток и клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла, рассчитывалось по одномерной гистограмме флуорисценции клеток, которые формировали пики в соответствии с плоидностью ДНК. Магнитная трансфекция дендритных клеток. Плазмиды транскрипционных факторов разводили питательной средой и добавляли к соответствующему количеству MATra-A реагента (PromoKine), тщательно перемешивали и инкубировали 20 минут при комнатной температуре. Далее смесь добавляли к прилипшим дендритным клеткам в лунках 48-луночного иммунного планшета и сразу перемешивали. Планшет помещали на магнитную пластину и инкубировали в течение 15 минут, после чего магнитную пластину убирали. Клетки продолжали культивировать в течение 48 часов, затем оценивали эффективность трансфекции с помощью флуоресцентной микроскопии. 17 Совместное культивирование трансфецированных дендритных клеток и мононуклеарных клеток Полученные дендритные клетки подвергались совместному культивированию с мононуклеарными клетками неприлипшей фракции (нфМНК) (0,5-1 млн/лунку) в течение 48 часов для праймирования специфического антигена (в соотношении ДК:МНК=1:10) с добавлением 40 нг/мл рекомбинантного человеческого IL-18 (рчIL-18) (ООО «Центр инженерной иммунологии», г. Новосибирск) или без него (группы нфМНК+ДК (с антигеном) +IL-18 и нфМНК+ДК(с антигеном), соответственно). В качестве контроля использовались мононуклеарные клетки неприлипшей фракции, культивированные в тех же условиях (группы нфМНК и нфМНК+IL-18), а также клетки, культивированные в присутствии ДК, которым не представлялся антиген ESAT-6 (группа нфМНК+ДК (без антигена)). Определение перфорин-позитивных клеток После совместного культивирования МНК неприлипшей фракции и ДК в присутствии или отсутствии IL-18, а также культивирования клеток контрольных групп мы отмывали клеточную суспензию, а затем культивировали полученные клетки в объеме 500 мкл с концентрацией клеток 1 млн/мл со специфическим антигеном ESAT-6 (1 мкг/мл) в течение 72 часов в лунках 48-луночного планшета, после чего определяли содержание мононуклеарных клеток, экспрессирующих внутриклеточный белок перфорин. Анализируемые клетки однократно отмывали PBS, содержащим 0,02% ЭДТА и 1% азида натрия (раствор 1), после чего центрифугировали, осадок ресуспендировали в растворе 1, содержащем 0,2% Tween 20 и инкубировали для проведения пермеабилизации в течение 10 минут. Затем клетки отмывали путем центрифугирования и инкубировали с антителами к внутриклеточному белку перфорину (BD Pharmihgen) в течение 1 часа, после чего отмывали в растворе 1, фиксировали в растворе формалина и анализировали на проточном цитометре. 18 Заключение Целью данной работы была характеристика методологии исследования получения дендритных клеток, инициирующих различный иммунный ответ. Для рассмотрения этого вопроса были освещены следующие пункты: 1. Описана общая методология исследования. В науке изучение объектов, выявление их свойств и связей всегда сопровождается осознанием метода, посредством которого исследуется объект. Объекты всегда даны человеку в системе определенных приемов и методов его деятельности. Наряду со знаниями об объектах наука формирует знания о методах. Потребность в развертывании и систематизации знаний второго типа приводит на высших стадиях развития науки к формированию методологии как особой отрасли научного исследования, призванной целенаправленно вести научный поиск. Методология - применение к процессу познания принципов мировоззрения, т.е. соотнесение полученных данных с другими фундаментальными науками и в первую очередь с философией. В современной науке достаточно успешно работает многоуровневая концепция методологического знания, в рамках которой все методы могут быть разделены на всеобщие или философские, общенаучные, частные или специальные, дисциплинарные. Также методы можно классифицировать на основании применения к различным типам познания – эмпирическому и теоретическому. Эмпирическое исследование в основе своей ориентировано на изучение явлений и зависимостей между ними. К методам этого типа относятся наблюдение, измерение, эксперимент. На уровне же теоретического познания происходит выделение сущностных связей в чистом виде. Сюда относят методы идеализации, мысленного эксперимента, методы построения теории. 2. Конкретизированы методы, применяемые в диссертационном исследовании. Научным наблюдением называется восприятие предметов и явлений действительности, осуществляемое с целью их познания. В акте научного наблюдения всегда присутствуют: 1) объект наблюдения; 2) субъект; 3) средства; 4) условия наблюдения; 5) система знания, исходя из которой задают цель наблюдения и интерпретируют его результаты. Наблюдения разделяются на непосредственные и косвенные. При непосредственном наблюдении ученый наблюдает сам избранный объект. Косвенное наблюдение опирается на предположение об определенной закономерной связи между свойствами ненаблюдаемых объектов и наблюдаемыми 19 проявлениями этих свойств и содержит логический вывод о свойствах ненаблюдаемого объекта на основе наблюдаемого эффекта его действия. Измерением называют процесс представления свойств реальных объектов в виде числовой величины. В процессе измерения нужно соблюдать определенные правила, для того чтобы результат измерения мог претендовать на интерсубъективную значимость: правило эквивалентности, аддитивности, единицы измерения. Эксперимент есть непосредственное материальное воздействие на реальный объект или окружающие его условия, осуществляемое с целью познания этого объекта. В эксперименте выделяют следующие элементы: 1) цель эксперимента; 2) объект экспериментирования; 3) условия, в которых находится или в которые помещается объект; 4) средства эксперимента; 5) материальное воздействие на объект или условия его существования. Одна из наиболее простых классификаций основывается на различиях в целях эксперимента. Целью эксперимента может быть установление каких-либо закономерностей, обнаружение фактов (поисковый) или проверка некоторой гипотезы или теории (проверочный эксперимент). 3. Проиллюстрировано применение общенаучных методов в рамках диссертационного исследования. Описаны основные методы диссертационной работы: выделение мононуклеарных клеток периферической крови и получение прилипающей фракции мононуклеаров, анализ фенотипических и функциональных показателей дендритных клеток, магнитная трансфекция дендритных клеток, совместное культивирование трансфецированных дендритных клеток и мононуклеарных клеток, определение перфорин-позитивных клеток. 20 Список литературы 1. Кохановский, В. П. Философия науки в вопросах и ответах: учебное пособие для аспирантов. – Ростов н/Д: Феникс, 2006. – 352 с. 2. Лебедев, С .А. Основы философии науки: Учебное пособие для вузов. – М.: Академический Проект, 2005. – 544 с. 3. Никифоров, А. Л. Философия: учебно-методическое пособие для аспирантов. Институт философии РАН. 4. Степин, В. С. Философия науки. Общие проблемы : учебник для аспирантов и соискателей ученой степени кандидата наук. – М.: Гардарики, 2006. – 384 с. 5. Hilkens, C. M., Isaacs, J. D. Development of dendritic cell-based immunotherapy for autoimmunity / Int Rev Immunol. – 2010. – Vol. 29. – P. 156-83. 6. Pulendran, B., Tang, H., Manicassamy, S. Programming dendritic cells to induce T(H)2 and tolerogenic responses / Nat Immunol. – 2010. – Vol. 11. – P. 647-55. 21
