Белорусский государственный медицинский университет Инфекции, ассоциированные с биопленками Доцент кафедры Н.В.Соловей 2017 Две принципиально различные формы жизни бактерий и грибов Планктонные = свободные, изолированные МО Биопленки = живущие вместе, объединенные МО Биопленка скопление микроорганизмов и их внеклеточных продуктов, формирующих структурное сообщество на поверхности ткани, инородных телах или медицинских приспособлениях Hoiby N. et al. CMI 2015; 21 (suppl. 1): S1-S25 Этапы формирования биопленок Р.С.Козлов, НИИАХ Биопленка – структурированное сообщество микроорганизмов! • Два состояния (фазы): 1. Сессильная (неподвижная) – метаболически малоактивная, требующая минимума питательных веществ для выживания, «спящая» (основание биопленки) 2. Планктонная (свободно взвешенная) – метаболически наиболее активная, нуждающаяся в питательных веществах, «активная» (верхушка биопленки) • Физиологический и биохимический градиенты (питательные вещества, кислород, скорость роста, экспрессия генов) – Четко отличаются в направлении от верхушки биопленки к ее основанию Hoiby N. et al. CMI 2015; 21 (suppl. 1): S1-S25 Роль биопленок в природе • Биопленки – самая распространенная форма жизни микроорганизмов на земле (~ 99% всех МО) • Биопленки обеспечивают: – Защиту от неблагоприятных факторов внешней среды (высушивание, антибиотики и дезинфектанты, клеточные и гуморальные механизмы защиты макроорганизма) – Регуляцию численности популяции (высокая микробная плотность может быть губительна для всей популяции) – Межвидовой синергизм (биопленки часто полиэтиологичны) – Оптимальное использование питательных веществ при их ограниченном количестве Andrew McBain Biofilm Research Group, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Manchester Примеры биопленок в окружающей среде Биопленки не следует искать при любой инфекции! Спектр ассоциированных с ними патологических состояний у человека четко предопределен! Классические инфекции, ассоциированные с биопленками Hoiby N. et al. CMI 2015; 21 (suppl. 1): S1-S25 Пример биопленки на поверхности эндотрахеального катетера Yanagihara K. et al. J Antimicrob Chemother 2002; 49:867 Распространенность хронических инфекций, ассоциированных с биопленками • Из 60.000 пациентов с муковисцидозом в западных странах, ~ 80% разовьют хроническую легочную инфекцию и инфекцию параназальных синусов, ассоциированную с биопленками • Более 60% пациентов с хронической раневой инфекцией имеют биопленки • У 0,5-2,0% пациентов с имплантированными суставами инфекция, связанная с биопленками, разовьется в течение первых 2 лет после операции • 5 на 1000 катетер-дней у пациентов с ЦВК в ОРИТ развивают биопленко-ассоциированные инфекции • 9-27% интубированных пациентов имеют биопленки на поверхности эндотрахеальных трубок • На каждом втором мочевом катетере формируются биопленки в первые 10-14 дней их стояния Hoiby N. et al. CMI 2015; 21 (suppl. 1): S1-S25 Проблема инфекций, ассоциированных с биопленками • Биопленки вызывают ХРОНИЧЕСКИЕ инфекции = инфекция сохраняется, несмотря на вроде бы адекватную антибактериальную терапию и работающие механизмы иммунной защиты макроорганизма • Хроническая инфекция не только сохраняется в организме, но и прогрессирует, что связано, прежде всего, с продолжающимся воспалительным ответом и, иногда, с нарушением функции вовлеченной системы • Воздействие обычных АБ элиминирует «планктонную» часть биопленки, практически не воздействуя на «сессильную» ⇒ рецидив инфекции после отмены АБ на фоне первоначального улучшения • При формировании биопленок на имплантах в большинстве случаев придется удалять имплант • Трудно диагностировать Hoiby N. et al. CMI 2015; 21 (suppl. 1): S1-S25 Исследование в 1956 году Инъекция 7.500.000 КОЕ S.aureus в кожу здоровых добровольцев = только 50% развили инфекцию, у всех инфекция разрешилась Менее 100 КОЕ S.aureus на импланте, используемом у человека, = 100% развили инфекцию, ни у одного инфекция не разрешилась Импланты или погибшие ткани увеличивают вирулентность более, чем в 75.000 раз Elek S. et al. Ann N Y Acad Sci 1956; 65:85 Чувствительность к АБ в разных фазах биопленки отличается Возбудитель Антибактериальный препарат Ципрофлоксацин Тобрамицин Ванкомицин Линезолид Enterococcus spp. - - МКИБ = МПК Х 1000 МКИБ = МПК Х 1000 Pseudomonas aeruginosa КЭБ = МПК Х 10 КЭБ = МПК Х 10 - - МКИБ – минимальная концентрация, ингибирующая микроорганизмы биопленки КЭБ – концентрация, элиминирующая биопленки Sandoe J. et al. JAC 2006; 57:767 Preston C. et al. Int J Antimicrob Agents 1996; 7:251 Чувствительность бактерий к АБ в биопленках Концентрация АБ, необходимая для гибели МО в биопленках Концентрация АБ, необходимая для гибели планктонных МО МКИБ (MBIC) – минимальная концентрация, ингибирующая микроорганизмы биопленки КЭБ (MBEC) – концентрация, элиминирующая биопленки Bjarnsholt T. et al. Nature Reviews 2013; 12:791 При использовании классических методов микробиологии мы определяем чувствительность к антибиотикам у «планктонных» микроорганизмов, даже при выделении их из состава биопленки!!! Соответственно, реальные значения МПК и чувствительность микроорганизмов «сессильной» фазы биопленки могут быть заниженными в разы! ⇒ клиническая неэффективность терапии, рецидивы инфекции Микробиологическая диагностика биопленок • Цель: установить наличие признаков воспаления в образце (например, лейкоцитов) и совокупности микроорганизмов, упакованных в самопродуцируемый матрикс, отличный от окружающих тканей или секрета • Основной метод – микроскопия с окраской по Граму (визуализация бактерий, лейкоцитов, матрикса биопленки, окружающих тканей и их секретов), альтернатива – конфокальная лазерная сканирующая микроскопия, сканирующая электронная микроскопия (малодоступны в практических лабораториях) • Специфическая идентификация патогенов в биопленках – видоспецифическая гибридизация с флуоресценцией in situ (FISH) • Традиционные культуральные методы и ПЦР-методики не позволяют отличить планктонные и ассоциированные с биопленками микроорганизмы Hoiby N. et al. CMI 2015; 21 (suppl. 1): S1-S25 Биопленки, образованные P.aeruginosa, в дыхательных путях пациентов с муковисцидозом: окраска по Граму Hoiby N. et al. CMI 2015; 21 (suppl. 1): S1-S25 Электронно-эмиссионная микроскопия: полимикробная биопленка на катетере Фолея у пациента с катетерассоциированной инфекцией мочевыводящих путей (A.baumannii + E.faecalis + E.coli) Конфокальная лазерная микроскопия: биопленка, образованная Candida albicans Hoiby N. et al. CMI 2015; 21 (suppl. 1): S1-S25 У кого следует предполагать биопленки? • Факторы, предрасполагающие к биопленкам (муковисцидоз, хронические инфекции респираторного тракта, инвазивные устройства и т.д.) • Неэффективность АБТ и рецидив инфекции при первоначальном клиническом улучшении состояния и многократном выделении одного и того же возбудителя идентичной локализации • Персистирующая инфекция более 7 дней антибактериальной терапии при условии исключения других причин (например, неэффективной АБТ из-за резистентности возбудителя) Hoiby N. et al. CMI 2015; 21 (suppl. 1): S1-S25 Профилактика образования биопленок при отсутствии предшествующей колонизации (1) • Системная антибиотикопрофилактика: – только для периоперационной профилактики инфекции имплантированных устройств в ортопедии – не показана: • • • • • • в случае постановки мочевых катетеров и стентов, в случае постановки ЦВК при использовании тканевых имплантов при лечении хронических ран при интубации при муковисцидозе без колонизации респираторного тракта P.aeruginosa Hoiby N. et al. CMI 2015; 21 (suppl. 1): S1-S25 Профилактика образования биопленок при отсутствии предшествующей колонизации(2) • Топическая антибиотикопрофилактика (имеющая доказательную базу): – ортопедические импланты, импрегнированные антибиотиками (гентамицин, реже тобрамицин, ванкомицин) – импрегнированные нитрофуралом мочевые катетеры (при их кратковременном стоянии) – импрегнированные серебром эндотрахеальные трубки, Mucus Shaver (предотвращает контаминацию просвета ЭТТ слизью, позволяет механически удалять биопленку) – импрегнированные серебром, хлорогексидином, антибиотиками или их сочетаниями ЦВК, введение АБ в просвет ЦВК – методика антибактериального «замка» (при их кратковременном стоянии) Hoiby N. et al. CMI 2015; 21 (suppl. 1): S1-S25 Профилактика образования биопленок при наличии колонизации микроорганизмами • Эффективность доказана только у пациентов с муковисцидозом при непостоянной колонизации респираторного тракта P.aeruginosa (системная ± ингаляционная АБТ) • Пациенты с колонизированными ЦВК, вентиляторассоциированной пневмонией, мочевыми катетерами и стентами, имплантами молочных желез, хроническими раневыми инфекциями – доказательных данных о пользе от применения антибиотиков и других методов для профилактики развития биопленок нет Hoiby N. et al. CMI 2015; 21 (suppl. 1): S1-S25 Показания для АБТ при инфекциях, ассоциированных с биопленками (1) • Хроническая легочная инфекция, вызванная P.aeruginosa, у пациентов с муковисцидозом (цель: стабилизация дыхательной функции, % пациентов с успешной эрадикацией P.aeruginosa крайне мал) – ингаляционные АБ (колистин, тобрамицин, ципрофлоксацин) + системные АБ каждые 3 мес или при обострениях – длительно (вплоть до пожизненного применения, если нет успешной эрадикации патогена) • Инфекции искусственных суставов без их удаления (условия: длительность симптомов менее 3 недель или время от момента имплантации менее 4 недель, стабильность импланта, микроорганизмы чувствительны к АБ, проникающих в биопленки – рифампицин, ФХ) – хирургическая ревизия, сохранение импланта и длительная комбинированная АБТ (рифампицин для Гр+, ФХ для Гр- + какой-либо другой активный АБ) Hoiby N. et al. CMI 2015; 21 (suppl. 1): S1-S25 Показания для АБТ при инфекциях, ассоциированных с биопленками (2) • Катетер-ассоциированные инфекции кровотока, вызванные КНС, энтеробактериями, возможно, P.aeruginosa: – Только при неосложненных КАИК, вызванных КНС, энтеробактериями, возможно, P.aeruginosa – может быть сохранен ЦВК и начато введение АБ в просвет катетера (метод антибактериального «замка»): • Концентрация АБ должна в 100-1000 раз превышать МПК для МО, время контакта с поверхностью катетера 12-24 ч; добавление гепарина не увеличивает эффективность • Длительность терапии по методу антибактериального «замка» 7-14 дней • Показан в том числе при решении начать системную АБТ – При КАИК, вызванные S.aureus и C.albicans – удаление ЦВК и системная этиотропная терапия обязательны! Hoiby N. et al. CMI 2015; 21 (suppl. 1): S1-S25 Показания для АБТ при инфекциях, ассоциированных с биопленками (3) • Хронические раневые инфекции: – Обязателен комплексный подход: хирургическая обработка, вакуумная терапия, терапия отрицательным давлением с ирригациями, местные антибиотики и антисептики + комбинированная системная АБТ – Показания для системной АБТ, средства выбора, методы оценки эффективности терапии неясны – Хирургическая обработка раны перед топической и/или системной АБТ может увеличивать ее эффективность, предотвращая повторное образование биопленок • Мочевые катетеры и стенты: – Назначение АБ, экскретируемых почками, при ОБЯЗАТЕЛЬНОМ удалении катетера или стента в течение 7-14 дней – Если стент удалить невозможно - длительная АБТ может уменьшить клинические проявления инфекции и снизить бактериурию, но не способна эрадицировать биопленки Hoiby N. et al. CMI 2015; 21 (suppl. 1): S1-S25 Общие принципы терапии биопленкоассоциированных инфекций • На ранней стадии формирования биопленки - агрессивная антибактериальная терапия: ü Комбинированная терапия (с различными механизмами действия) ü Высокие дозы антибиотиков (увеличенные значения МПК) ü В первые дни не использовать антибиотики, к которым легко формируется резистентность (повышенная мутабельность микроорганизмов) ü Пролонгированная антибактериальная терапия • На поздней стадии биопленки крайне трудно (если возможно) эрадицировать: ü Уменьшение биомассы биопленки с помощью подходов как на ранних стадиях (уменьшает воспаление и развитие резистентности микроорганизмов биопленки) ü Постоянная супрессивная антибактериальная терапия Направления разработки средств для терапии биопленко-ассоциированных инфекций • Новые системные АБ, высоко активные в отношении биопленок, в том числе в комбинации со средствами, вызывающими деградацию компонентов биопленок • Средства, нарушающие формирование и функционирования биопленок (ингибиторы системы кворум-сенсинга, компоненты, подавляющие воспаление вокруг биопленок и вызывающие деградацию матрикса биопленок) • Новые режимы топической антимикробной терапии • Комбинация АБ с воздействием физических факторов (ультразвук, электрический ток, УФО) • Устройства для механического удаления биопленок • Вакцины и т.д. Hoiby N. et al. CMI 2015; 21 (suppl. 1): S1-S25 Новые подходы к терапии биопленкоассоциированных инфекций (БАИ) Четыре новых подхода к терапии БАИ • IgY • Гипотеза трех компартментов • Гипербарическая оксигенация • LeucoPatch IgY для профилактики и упреждающей терапии БАИ • • • • • Длиннее тяжелая цепь и короче легкие цепи Менее гибкие Не связываются с FC рецептором Не активируют комплемент Специфические IgY могут быть получены из яичного желтка от вакцинированных цыплят • При муковисцидозе изучаются IgY, полученные от цыплят, вакцинированных жгутиковыми антигенами от шести различных по О-антигенам штаммов P.aeruginosa (ImmunSystem I.M.S.) Куриные IgY IgG млекопитающих IgY при муковисцидозе В настоящее время идут исследования III фазы • Пролонгируется период между колонизациями респираторного тракта P.aeruginosa (Kollberg H. et al. Ped Pulm 2003) • Уменьшается колонизация синегнойной палочкой пациентов с муковисцидозом (Nilsson E. et al. Ped Pulm 2008) • Уточнено, что наиболее вероятным первичным очагом синегнойной инфекции при муковисцидозе являются синусы (Aanes K. JCF 2013) • Предполагаемый механизм действия: нарушение адгезии P.aeruginosa к эпителию дыхательных путей (точный механизм не установлен) IgY усиливают респираторный взрыв, опосредованный полиморфноядерными нейтрофилами, и последующий бактериальный киллинг Пероральная профилактика антисинегнойными IgY может быть эффективной стратегией для предотвращения колонизации P.aeruginosa Гипотеза трех компартментов • Биопленки с внеклеточным матриксом могут быть рассмотрены как независимый компартмент с отличной фармакокинетикой Кровь с АБ (conc1) Ткань / очаг инфекции с АБ (conc2 – меньше, накапливается дольше) Плактонные бактерии быстро уничтожаются • Роль третьего компартмента в нарушенной ФД АБ? Кровь с АБ (conc1) Ткань / очаг инфекции с АБ (conc2 – меньше, накапливается дольше) БАИ с концентрацией АБ conc3 (еще меньше и накапливается еще дольше) Аккумуляция тобрамицина в матриксе биопленок Тобрамицин в эксперименте быстро накапливался в высокой концентрации в альгинатном матриксе биопленок (терапевтическая концентрация указана стрелкой) Связь тобрамицина в множественных участках внеклеточного полисахаридного матрикса может способствовать задержке диффузии антибиотика в бактериальные клетки биопленки, существенно ограничивая его эффективность Cao B. J Antimicrob Chemother 2015 Cao B. et al. PLoS One 2016; DOI:10.1371/journal.pone.0153616 Oligo CF-5/20 Oligo CF-5/20 обладал значительным дозозависимым эффектом на синегнойную БАИ, существенно уменьшая число КОЕ в модели на мышах in vivo • Альгинатный олигомер, состоящий из α-Lглюкуроновой кислоты (85%) и β-Dмануроновой кислоты (<15%) • Способен разрушать структуру биопленок, способствуя снижению толерантности к антибиотикам • Фаза IIb клинических исследований у пациентов с муковисцидозом Hengzhuang W. et al. AAC 2016 Oligo CF-5/20 MBEC (минимальная концентрация, эрадицирующая биопленки) при комбинировании Oligo CF-5/20 с колистином для БАИ, вызванной P.aeruginosa (модель in vitro), существенно снижалась с 512 мкг/мл до 4 мкг/мл уже через 12 ч Hengzhuang W. et al. AAC 2016 Гипербарическая оксигенация (адъювантная к антибактериальной терапия) Анаэробные / гипоксические зоны биопленки Zhang T. et al. PLoS ONE 2013 Гибель бактериальных клеток под действием бактерицидных АБ частично обусловлено генерацией цитотоксических радикалов кислорода Kohanski M. et al . Cell 2007; 130:797 Гипербарическая оксигенация может увеличивать бактерицидный эффект фторхинолонов на P.aeruginosa биопленки LeucoPatch для терапии хронических ран (клеточно-опосредованная терапия) Устройство LeucoPatch –клеточный минипроцессор, который способен разделять и концентрировать клетки крови, факторы роста и сигнальные вещества Центрифуга LeucoPatch – работает вместе с устройством LeucoPatch для создания пластыря Трехслойный пластырь, создаваемый индивидуально для каждого пациента из компонентов его крови: - Фибриновый слой (удержание жидкости, опора для других слоев) Слой тромбоцитов (высвобождают факторы роста) Слой лейкоцитов (заживление ран, борьба с инфекцией) Принципы создания пластыря LeucoPatch Londahl M. et al. Journal of Wound Care 2015; 24:172 • • • • Проспективное пилотное исследование, 6 недель 15 пациентов с хроническими ранами различной этиологии, не отвечающими на другую терапию Медиана длительности ран 24 месяца, медиана размера 2,3 см2 Полное заживление у 31%, у остальных уменьшение размеров ран • 39 пациентов с трудно заживающими язвами вследствие диабетической стопы • Длительность язв более 6 недель, максимальная площадь 10 см2 • Использование пластыря 1 раз в неделю до 19 раз максимально (или до полной эпителизации язвы) • Полная эпителизация у 34% к 12 неделе терапии и у 52% к 20 неделе терапии LeucoPatch • У пациентов с длительностью язв менее 6 месяцев 73% язв полностью зажили в течение 20 недель Инфекции, ассоциированные с биопленками ü Не нужно искать их везде – строго определенные нозологии и предрасполагающие факторы ü Часто трудно диагностировать и еще труднее лечить ü Терапия часто зависит от комбинации нескольких стратегий ü Часто используются методы терапии off label ü Молодые (незрелые) биопленки иногда можно эрадицировать, поздние биопленки – можно только супрессировать, если невозможно их удалить радикально ü Доступны клинические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике биопленок
