научно-техническое обоснование эксперимента

НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ
ЭКСПЕРИМЕНТА
«ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ФОРМИРОВАНИЯ БИОПЛЕНОК В
УСЛОВИЯХ МИКРОГРАВИТАЦИИ»
Шифр «Биопленка»
1.Сущность исследуемой проблемы. Краткая история и состояние вопроса
К настоящему времени накопилось значительное количество данных о том, что
микроорганизмы в естественных условиях обитания существуют преимущественно в виде
достаточно сложно организованных микробных сообществ, получивших название
биопленки.
Микроорганизмы синтезируют и выделяют предохранительный матрикс, с помощью
которого биопленки присоединяются к живой или неживой поверхности. Биопленки – это
подвижные, непрерывно изменяющиеся гетерогенные сообщества. Они могут состоять из
одного вида бактерий или грибов или, что встречается более часто, могут быть
полимикробными,
например,
содержать
многочисленные
разнообразные
виды
микроорганизмов. В основном биопленки можно охарактеризовать как бактерии,
находящиеся в толстом слизистом слое, состоящем
из сахаров и протеинов. Этот
пленочный барьер защищает микроорганизмы от внешних воздействий.
Биоплёнка – это защитная, вязкая слизь, создаваемая бактериями, объединившимися
вместе в сообщество и пожинающими плоды «массовых усилий» такого подхода.
Биоплёнки могут расти на различных живых и неживых поверхностях, включая
подводные камни, еду, зубы и биомедицинские имплантаты, заменяющие колено или
бедро.
Биоплёнки, по оценке Национального института здоровья, США, вызывают около
90% человеческих инфекций, а по оценке Центра контроля заболеваний биоплёнки
представлены в 65% случаев инфекций, требующих госпитализации. Именно биоплёнки
обычно являются причиной фатальных инфекций, развивающихся после хирургических
операций. Еще чаще они становятся источниками постоянных ушных инфекций у детей.
Клиническое значение имеет высокая устойчивость бактерий в таких сообществах:
биопленки в 20-1000 раз более устойчивы к антимикробным препаратам, чем
микроорганизмы в культуральной среде, поэтому эффективность большинства режимов
санации и дезинфекции в реальных условиях зачастую оказывается недостаточной.
Основным фактором устойчивости микробных пленок является слизистый
биополимерный матрикс (БПМ), вырабатываемый клетками бактерий сразу после
прикрепления к субстрату. БПМ различных биопленок непостоянен по составу, который
меняется в результате адаптации бактерий к условиям внешней среды, но в общем случае
включает экзополисахариды, липополисахариды, гликопротеины и протеогликаны,
аналогичные веществу клеточной стенки, гликокаликса и капсул бактерий. Эти
биополимеры в микробной пленке действуют как молекулярное сито, улавливая и
концентрируя питательные вещества из окружающей среды, а также ограничивая
проникновение антимикробных средств к бактериям в глубине биопленки.
Классическим примером защитных функций биополимеров является выживание
Salmonella в биопленке при хлорировании: БПМ ограничивает диффузию хлора через
поверхность биопленки вглубь, обеспечивая устойчивость микробной пленки к этому
способу дезинфекции.
Биопленки – это основной фенотип почти всех бактерий в естественных условиях
обитания, как во внешней среде, так и в организме человека при патологии. Такая форма
существования предоставляет бактериям массу преимуществ в условиях воздействия
неблагоприятных факторов внешней среды и организма-хозяина. Представления о
биопленках, подтвержденные с помощью современных методов визуализации, изменили
взгляды на инфекционные заболевания. Всё новые данные свидетельствуют о том, что
хронические инфекции принципиально отличаются от острых, а существование
биопленок при хронических инфекциях требует совершенно новых подходов к их
диагностике и лечению. В частности, биопленки оказались способными выдерживать
концентрации антибиотиков в 100-1000 раз больше, чем подавляющие планктонные
клетки. Аналогичным образом, фагоциты макроорганизма неспособны поглощать
биопленки в отличие от отдельных бактериальных клеток. Повышает устойчивость
биопленок к вредным факторам
присущее им генетическое и фенотипическое
разнообразие, которое позволяет им переносить терапевтическое воздействие
Представление о биопленках изменяет подходы к диагностике и лечению
инфекционных поражений в самых различных областях медицины.
Заболевания,
связанные с развитием биопленок, принимают хроническую форму, трудны для лечения,
имеют высокую частоту рецидивов, большинство из них может явиться причиной
летального исхода. Биопленки также обнаруживают в ранах, и предполагается, что они в
некоторых случаях замедляют процесс заживления. Сегодня медики уверены, что более,
чем в 80 % случаев инфекционные поражения организма проходят в форме биопленочной
инфекции.
Биопленки интересуют ученых не только потому, что часто определяют
патогенность микроорганизмов. Помимо клинического, они представляют эволюционный
интерес: биопленки являются высшими формами взаимодействия одноклеточных
организмов, в некотором смысле промежуточными формами между одноклеточными и
многоклеточными организмами.
Этапы формирования биопленки.
Этап 1.Обратимое прикрепление к поверхности. Чаще всего микроорганизмы
существуют в виде свободно плавающих масс или единичных (например, планктонных)
колоний. Однако в нормальных условиях большинство микроорганизмов стремятся
прикрепиться к поверхности и, в конечном счете, образовать биопленку.
Этап 2. Перманентное прилипание к поверхности. По мере размножения бактерий
они более прочно прилипают к поверхности, дифференцируются, обмениваются генами,
что обеспечивает их выживаемость.
Этап 3. Формирование слизистого защитного матрикс / биопленки. Однажды
устойчиво присоединившись, бактерии начинают образовывать экзополисахаридный
окружающий матрикс, известный как внеклеточное полимерное вещество (extracellular
polymeric substance). Это предохранительный матрикс или «слизь» (EPS-matrix). Мелкие
колонии бактерий затем образуют первоначальную биопленку.
Cостав матричной слизи варьирует в соответствии с тем, какие именно
микроорганизмы в нем присутствуют, но в основном в него входят полисахариды, белки,
гликолипиды и бактериальная ДНК .
Экспериментальные лабораторные исследования показали, что планктонные
бактерии, например стафилококки, стрептококки, псевдомонады, кишечная палочка:
1) присоединяются друг к другу в течение нескольких минут;
2) образуют прочно присоединенные микроколонии в течение 2–4 часов;
3) вырабатывают внеклеточные полисахариды и становятся значительно более
толерантными к биоцидам, например, к антибиотикам, антисептикам и
дезинфектантам, в течение 6–12 часов;
4) вовлекаются в полноценные колонии биопленки, которые очень устойчивы к
биоцидам и теряют планктонные бактерии в течение 2–4 дней в зависимости от
видов бактерий и условий роста;
5) быстро
восстанавливаются
после
механического
формируют зрелую биопленку в течение 24 часов.
разрушения
и
вновь
2. Необходимость проведения КЭ в условиях космического полета
Результаты, накопленные при эксплуатации орбитального комплекса «МИР» и
МКС
дают основания
рассматривать
биоповреждения
полимерных материалов,
биокоррозию металлов, возникновение биопомех в работе
аппаратуры, в качестве
основного, постоянно действующего фактора риска,
обусловленного
развитием
микроорганизмов в кабинах космических объектов и формированием биопленок.
Исследования, проводимые российскими и американскими учеными на МКС,
показали, что
под воздействием факторов космического полета
меняются свойства
бактерий. Бактерии сальмонеллы (Salmonella), после возвращения на Землю были изучены
на инфекционную активность микробиологами из Аризонского государственного
университета. Полученные результаты свидетельствуют о мутации штаммов сальмонеллы
на орбите, связанной с возрастанием патогенности клеток. Кроме того, после
космического путешествия бактерии стали более устойчивы к действию антибиотиков.
Патогенность бактерий возросла более чем в три раза. В космосе у сальмонеллы
активизировался участок ДНК, контролирующий работу 160 генов. Кроме того,
сальмонеллы начали объединяться, образуя тонкий слой — биопленку, что делает любые
микроорганизмы чрезвычайно опасными.
Что послужило спусковым механизмом к
ураганной мутации сальмонелл — пока не ясно. Некоторые специалисты винят во всем
невесомость, другие — космическую радиацию.
Исследователи также сообщают об изменении морфологии бактериальной колонии
при образовании биопленки. В условиях невесомости биопленка сальмонелл развивалась
иначе, чем на Земле.
К настоящему времени недостаточно изучены не только механизмы формирования
биоплёнок, но их структура. Исследование методами электронной микроскопии
ультраструктуры
бактериальных
биоплёнок,
полученных
как
в
условиях
микрогравитации, так и в наземных условиях, могли бы выявить ряд недостаточно
исследованных этапов и закономерностей в механизме формировании бактериальных
биоплёнок.
Результаты этих исследований позволят с одной стороны установить методы
эффективной борьбы с патогенными биоплёнками, а с другой сформулировать подходы к
формированию искусственно создаваемых биоплёнок на основе пробиотических бактерий
необходимых для поддержания здоровья человека в период длительных космических
полетов. Если можно будет понять, как формируются биоплёнки, то возможно начать
управлять ими. Уметь создавать биоплёнки там, где это нужно - это очень долгосрочная
цель для биотехнологов.
3. Описание КЭ
Основной целью эксперимента
является исследование влияния факторов
космического полета на формирование бактериальных биоплёнок.
3.1. Порядок проведения КЭ.
Для проведения эксперимента на борт МКС доставляется и используется на первом
этапе укладка «Константа». Для проведения
КЭ на втором этапе реализации КЭ на
станцию доставляется укладка «Биопленка»
В ходе сеанса член экипажа обеспечивает размещение укладки с образцами в
термостате при температуре +(25 – 37)С. По истечении заданного времени укладка
извлекается из термостата и проводится химическая фиксация биоматериала, путём
передавливания жидкостей из рабочих ёмкостей в камеру смешения. После химической
фиксации биоматериала укладки на борту МКС необходимо хранить при температуре +4±
20 С.
Длительность интервала времени от момента доставки экспериментального
материала на борт РС МКС до начала активной части эксперимента – не более 3-х суток.
3.2.Технические особенности НА
Конструкция
дезинфекционной
аппаратуры
«Биопленка»
должна предусматривать возможность
обработки всех внешних поверхностей и отвечать требованиям по
герметичности . Объем камеры смешения должен соответствовать суммарному объему
емкостей и оставаться герметичным при передавливании.
4.Новизна, оценка качественного уровня по сравнению с аналогичными
отечественными и зарубежными исследованиями
Эксперименты, аналогичные предлагаемому
КЭ в условиях
пилотируемого
космического полета ранее не проводились.
Российскими и зарубежными учеными проводятся наземные исследования по
изучению
закономерностей
формирования
микробиологических исследований проводится
биопленок.
Большинство
с микробами в форме планктона
и
поэтому часто имеет место большая разница результатов исследований in vitro и
конечного эффекта in vivo. Характерным примером являются данные о возможной
разнице резистентности микробов к амоксициллину в форме планктона и биопленки в
1000 раз .
В связи с этим исследование ультраструктуры бактериальных биоплёнок,
полученных как в условиях микрогравитации, так и в наземных условиях, методами
электронной микроскопии могли бы выявить ряд недостаточно исследованных этапов и
закономерностей в формировании бактериальных биоплёнок.
5. Ожидаемые результаты и их предполагаемое использование
5.1. Результаты проводимых исследований позволят с одной стороны установить
методы эффективной борьбы с патогенными биоплёнками, а с другой сформулировать
подходы
к
формированию
искусственно
создаваемых
биоплёнок
на
основе
пробиотических бактерий необходимых для поддержания здоровья человека.
5.2. Полученные данные будут положены в основу создания новых антибактериальных
средств и новых дезинфектантов для обработки поверхностей модулей пилотируемого
комплекса.
Терапевтическое воздействие на биопленки может быть направлено на механизмы
первоначальной адгезии бактерий к поверхности, блокирование синтеза или разрушение
полимерного матрикса, нарушение межклеточного обмена информацией, а также оно
может сочетаться с собственно бактерицидными агентами. Подобное воздействие,
действующее на структуру или функции биопленок может оказаться более эффективным
, чем стандартная антибактериальная терапия.
6.
Обоснование
технической
возможности
создания
НА
с
заданными
характеристиками
Техническая возможность создания аппаратуры «Биопленка»
обосновывается
имеющимися образцами оборудования для КЭ «Константа».
7.Характеристики рисков и дискомфорта для экипажа, связанных с КЭ
7.1.Проведение эксперимента на борту МКС не должно создавать опасных ситуаций
для экипажа и МКС. На всю аппаратуру для проведения КЭ, включая биопрепараты,
доставляемую на МКС, должны быть оформлены сертификаты по безопасности.
Список цитируемой литературы
1. Бехало, В.А. Иммунобиологические особенности бактериальных клеток,
входящих в состав «медицинских биопленок» / В.А. Бехало, В.М. Бондаренко,Е.В.
Сысолятина, Е.В. Нагурская // Микробиология. – 2010. – № 4. – С. 97–107.
2. Бондаренко, В.М. Механизмы формирования патогенности оппортунистическими
микроорганизмами / В.М. Бондаренко // Материалы II ЕжегодногоВсероссийского
конгресса по инфекционным болезням. – М., 2010. – С. 42–43.
3. Бондаренко, В.М. Роль условно-патогенных бактерий при хронических
воспалительных процессах различной локализации / В.М. Бондаренко. – Тверь: Триада,
2011. – 88 с.
4. Елинов, Н.П. Структурированные и неструктурированные формы существования
микромицетов в искусственных и естественных условиях / Н.П.Елинов // Проблемы
медицинской микологии. – 2009. – Т. 11, № 3. – С. 3–9.
5. Ерюхин, И.А. Хирургические инфекции: руководство / И.А. Ерюхин, В.А.
Хрупкин, В.М. Бадиков. – СПб. : Питер, 2003. – Гл. 4. Раневая инфекция. –С. 213–262.
6. Ильина, Т.С. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде
и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития /
Т.С. Ильина, Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург // Генетика. – 2004. – № 40. – С. 1–12.
7. Кетлинский, С.А. Цитокины / С.А. Кетлинский, А.С. Симбирцев. – СПб. :
Фолиант, 2008. – 552 с.
8.
Пинчук,
Л.М.
Молекулярная
мимикрия
как
фактор
патогенности
микроорганизмов / Л.М. Пинчук // Успехи современной биологии. – 1992. – Т. 112, № 2. –
С. 225–237.
9. Рыбальченко, О.В. Атлас ультраструктуры микробиоты кишечника человека /
О.В. Рыбальченко, В.М. Бондаренко, В.П. Добрица. – СПб. : ИИЦ ВМА, 2008. – 112 с.
10. Andriessen, A.E. Assessment of a wound cleansing solution in the treatment of
problem wounds / A.E. Andriessen, T. Eberlein // Wounds. – 2008. – Vol. 20, N 6. – P. 171–175.
11. Bester, E. Metabolic differentiation in biofilms as indicated by carbon dioxide
production rates / E. Bester [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2010. – Vol. 76, N 4. – P.
1189–1197.
12. Bjarnsholt, T. Why chronic wounds will not heal: a novel hypothesis / T. Bjarnsholt [et
al.] // Wound Wound Repair Regen. – 2008. – Vol. 16, N 1. – P. 2–10.