2 | 13

Роль масс-спектрометрии
высокого разрешения в
идентификации метаболитов
синтетических каннабиноидов
Тимофей Соболевский, к.х.н.
ФГУП «Антидопинговый центр»
2 | 13
ФГУП АДЦ
Аккредитация
• ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025
• одна из 32 антидопинговых лабораторий в мире,
аккредитованных ВАДА
Производительность
• одно из первых мест в мире среди антидопинговых лабораторий
по количеству проанализированных проб (18600 в 2013 году)
• скрининговый анализ включает более 400 соединений
(анаболические стероиды, β2-агонисты, антиэстрогены,
диуретики, стимуляторы, наркотики, каннабиноиды,
кортикостероиды, β-блокаторы) в трех аналитических процедурах
Методы анализа
• GC-MS, GC-MS/MS, GC-C-IRMS, UPLC-MS/MS, UPLC-OrbitrapMS
3 | 13
ФГУП АДЦ
Оборудование
приборный парк – один из самых больших в РФ, что позволяет
разрабатывать методики и выполнять анализы не только для
национального антидопингового агентства (РУСАДА), но и ряда других
антидопинговых организаций, а также выполнять иные потоковые
анализы (научные исследования, тестирование персонала и т.д.)
4 | 13
Синтетические каннабиноиды в ФГУП АДЦ
JWH-018, начало работы, 2009 год
Forensic Sci Int. 2010, 200(1-3), 141
Sobolevsky T, Prasolov I, Rodchenkov G. Detection of JWH-018 metabolites in
smoking mixture post-administration urine.
JWH-210, AM-2233, UR-144, AM-2201, 2012 год
Drug Test Anal. 2012, 4, 745
Sobolevsky T, Prasolov I, Rodchenkov G. Detection of urinary metabolites of AM-2201
and UR-144, two novel synthetic cannabinoids.
APICA, STS-135, 2014 год
Drug Test Anal. (в печати)
Sobolevsky T, Prasolov I, Rodchenkov G. Study on the phase I metabolism of novel
synthetic cannabinoids, APICA and its fluorinated analog.
AB-PINACA, 5F-AB-PINACA, PB-22F, AB-CHMINACA, MDMBCHMINACA, MMB2201, 2014 год
…
5 | 13
Методология
Детектируемые соединения
все синтетические каннабиноиды полностью метаболизируют в организме!
Выделение активного компонента
из курительных смесей с использованием препаративной ВЭЖХ
Проведение ферментативных реакций
in vitro метаболизм с помощью микросомальной фракции печени человека
(первая фаза метаболизма)
Идентификация метаболитов
•
•
высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании массспектрометрией высокого разрешения – поиск метаболитов
высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с тандемной
масс-спектрометрией низкого разрешения – изучение фрагментации, выбор
характеристичных SRM-переходов
Анализ образцов мочи
выбор диагностически значимых метаболитов
6 | 13
Масс-спектрометрия
Орбитальная ионная ловушка
Тройной квадруполь
(Q) Exactive, Thermo Fisher Scientific
TSQ Vantage, Thermo Fisher Scientific
разрешение 100,000 @ 200 Да,
точность масс < 5 ppm
изучение фрагментации, выбор
характеристичных SRM-переходов
поиск метаболитов
внедрение в методику скринингового
анализа
7 | 13
Пробоподготовка и типовые условия анализа
Пробоподготовка образца мочи
•
•
•
•
•
ферментативный гидролиз β-глюкуронидазой (Escherichia Coli) в фосфатном
буфере
создание слабощелочной среды карбонатным буфером
жидкостно-жидкостная экстракция диэтиловым эфиром
упаривание органического экстракта
перерастворение в смеси метанол/вода
Условия инструментального анализа
•
•
•
•
•
•
хроматографическая колонка Waters Acquity C18 BEH (100 мм x 2.1 мм, 1.7 мкм)
градиентное элюирование
элюенты: вода/метанол с добавлением муравьиной кислоты
электрораспылительная ионизация
методика включает 120 соединений различных классов
длительность анализа 10 мин
8 | 13
Поиск метаболитов
STS-135
расчетное значение [MH]+ = 383.2493 Да
F
F
O
+
гидроксилирование моно/ди/три
дезалкилирование
окислительное дефторирование
… и их комбинации
•
•
•
•
COOH
HN
O
NH
N
O
OH
N
NH
OH
NH
415.2392
395.2329
F
F
O
OH
O
HN
N
O
OH
399.2442
O
N
NH
NH
HN
OH
OH
NH
NH
OH
431.2341
295.1805
311.1754
9 | 13
Профиль метаболитов STS-135 ВЭЖХ-МСВР
6.07
30000000
6.07
m/z 399.2442
m/z 399.2442
20000000
20000000
10000000
6.43 6.54
0
20000000
in vitro
0
5.80
m/z 415.2392
15000000
10000000
10000000
5.52
3000000
5.26
m/z 431.2341
5.19
2000000
5.04
1000000
5.65
0
in vivo
5.40
0
5.28
m/z 431.2341
200000
5.54
5000000
5.41
0
400000
5.79
m/z 415.2392
4.88
4.97
5.51
5.0
5.5
0
4.5
5.0
5.5
Time (min)
6.0
6.5
7.0
4.5
6.0
6.5
7.0
Time (min)
6.63
6.61
m/z 381.2537
m/z 381.2537
600000
6.51
100000
400000
50000
200000
6.52
0
1000000
6.77
4.95
0
5.69
m/z 397.2486
1000000
500000
5.67
m/z 397.2486
500000
6.14 6.35
6.15
0
150000
0
5.36
3000000
m/z 413.2435
5.31
m/z 413.2435
2000000
100000
1000000
50000
4.99
5.94
6.10
0
0
6.47
m/z 295.1805
300000
4000000
6.47
m/z 295.1805
200000
2000000
100000
4.35
0
4000000
m/z 311.1754
30000000
10000000
5.42
0
6.00
5.51
0
4.85
m/z 327.1703
400000
5.98
4.85
m/z 327.1703
6000000
4000000
200000
2000000
300000
5.60
5.32
m/z 311.1754
20000000
2000000
0
4.86
0
5.32
4.57
4.57
0
6.55
150000
m/z 395.2329
200000
100000
100000
50000
5.60
m/z 395.2329
6.54
5.73
4.51
5.78
0
0
4.5
5.0
5.5
Time (min)
6.0
6.5
7.0
4.5
5.0
5.5
Time (min)
6.0
6.5
7.0
10 | 13
Масс-спектры метаболитов STS-135 ВЭЖХ-МС/МС
133.1
100
F
90
232
90
O
80
Relative Abundance
N
60
91.2
NH
232.1
OH
50
40
151
151.2
30
Relativ e Abundance
206
80
70
232.1
100
F
70
O
N
OH
60
NH
50
131.1
OH
40
206.1
30
167
105.2
20
206.1
10
118.2 144.1 155.2
399.3
10
249.2
0
415.4
149.2
20
93.2
121.1
144.2
167.2
249.2
0
100
150
200
250
300
350
400
100
150
200
250
m/z
m/z
248.2
100
90
222
70
O
N
60
OH
NH
50
OH
40
30
149.1
20
222.1
244
NH
50
40
135
395.3
30
218.1
200.1
93.0 107.2
244.2
317.2
226.2
0
0
150
60
10
321.2
O
N
70
20
204.1
91.2 105.1131.1
144.2
100
431.4
400
218
80
Relative Abundance
Relative Abundance
90
248
350
COOH
OH
80
10
135.0
100
F
300
200
250
m/z
300
350
400
100
150
200
250
300
m/z
выбор характеристичных и селективных SRM-переходов
350
400
11 | 13
STS-135 в образце спортсмена
12 | 13
Газовая хроматография
Основные сложности
•
структура малопригодна для
анализа методом ГХ
•
низкая летучесть метаболитов
•
малопредсказуемые спектры ЭИ
•
низкая концентрация в образце
•
интерференция с эндогенными
соединениями (кортикостероиды)
CH 3
CH3
N
O
Масс-хроматограмма моногидроксилированных
метаболитов JWH-018, полученная методом
ГХ-МС/МС после триметилсилилирования
Si
H3C
O
CH3
13 | 13
Заключение
• использование микросомальной фракции ферментов печени человека
для реакций in vitro позволяет получить широкий спектр
потенциальных метаболитов синтетических каннабиноидов
• принимая во внимание особенности структуры этого класса
соединений, метод высокоэффективной жидкостной хроматографии
является предпочтительным
• масс-спектрометрия высокого разрешения позволяет однозначно
идентифицировать метаболиты на фоне биологической матрицы
• используя данные, полученные методом ВЭЖХ-МСВР, возможно
охарактеризовать потенциальные метаболиты методом тандемной
масс-спектрометрии, установив характеристичные SRM-переходы для
каждого из них
• анализ образцов, полученных в условиях in vivo, позволит установить,
какие из метаболитов являются диагностически значимыми
14 | 13
Спасибо за внимание
Тимофей Соболевский
tim.sobolevsky@gmail.com
+7 (916) 624-4389