NADH:FMN - Институт фундаментальной биологии и

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
Институт фундаментальной биологии и биотехнологии
Кафедра биофизики
Ингибиторный анализ влияния глицерина на
сопряженную ферментную систему NADH:FMNоксидоредуктаза-люцифераза
Кириллова Мария Александровна
Руководитель: к.б.н. Суковатая И. Е.
Новосибирск 2012
Сопряженная ферментная система NADH:FMNоксидоредуктаза-люцифераза
Бактериальная люцифераза
Vibrio harvei (3fgc, http://www.rcsb.org)
NAD(P)H:FMN-оксидоредуктаза
Vibrio fischeri (1vfr, http://www.rcsb.org)
2
Фундаментальная проблема
биофизики
Структурно-динамическая организация белковых
молекул
‘Дизайн среды’ – направленное изменение
физико-химических свойств реакционной среды для
функционирования фермента
3
Цель
Определить природу взаимодействия
альдегидного субстрата сопряженной
ферментной системы NAD(P)H:FMNоксидоредуктаза-люцифераза в
условиях вязкой реакционной среды.
4
Материалы и методы
Реакционная смесь :
• 0,05 М фосфатный буфер
• комплекс ферментов
люцифераза - оксидоредуктаза
• 0,0025% тетрадеканаля
• водный раствор NADH
• водный раствор FMNH2
• органический растворитель –
глицерин 20 ÷ 70 об.%
Измеряемые параметры:
• интенсивность свечения (I)
• константа спада (Kdec)
Люминометр GloMax®-20/20 фирмы
«Turner BioSystems» (Sunnyvale,USA)
5
Интенсианость свечения отн.ед.
Ингибирование люциферазы
глицерином
0.8
1
0.7
0.6
0.5
4
0.4
0.3
3
0.2
2
0.1
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Концентрация глицерина, об. %
Рисунок 2 - Зависимость максимальной интенсивности свечения
сопряженной
биолюминисцентной
системы
от
концентрации
растворителя при разных концентрациях альдегида: 1 - [C14]=4,7·10-7 М;
6
2 - [C14]=4,7·10-8 М; 3- [C14]=4,7·10-9 М; 4 - [C14]=4,7·10-10 М
Формально-кинетический анализ
0.9
0.8
1 – глицерин 20 об. %
2 – глицерин 30 об. %
3 – глицерин 50 об. %
4 – глицерин 70 об. %
0.7
I, отн.ед.
0.6
0.5
0.4
0.3
1
2
0.2
4
0.1
3
0
-0.1
0
10
20
30
40
50
I/[А], М-1
Рисунок 3 - Бесконкурентное ингибирование люциферазы глицерином в
координатах Иди-Хофсти, где I - интенсивность свечения, [A] концентрация альдегида
7
Тип ингибирования –
неполностью бесконкурентный
8
7
6
1/ордината 5
точки 4
пересечени
я
3
2
1
0
0
20
40
60
80
Концентрация глицерина, об. %
Рисунок 4 - График зависимости ординаты точки пересечения
графиков бесконкурентного типа ингибирования с вертикальной осью
от концентрации глицерина
8
Константа спада
0.009
0.008
0.007
0.006
0.005
Kdec
kdec=(ln80-ln20)/t.
0.004
0.003
0.002
0.001
0
0.47
4.7
47
470
[A], нМ
Рисунок 5 - Константа спада при различных
концентрациях альдегида С14 в 30%-глицерине
9
Гидрофобное взаимодействие
0.04
0.035
0.03
0.025
Km, М
0.02
0.015
0.01
0.005
0
0
20
40
60
80
Концентрация глицерина, об. %
Рисунок 6 - График зависимости константы Михаэлиса от концентрации
ингибитора
10
Эффективность реакции
Эффективность реакции, М*с
3
2.5
2
Е= Km/Kdec
1.5
1
0.5
0
0
10
20
30
40
50
60
Концентрация глицерина, об.%
Рисунок 7 – Зависимость эффективности реакции от
концентрации глицерина
11
Выводы
1.
Природа взаимодействий глицерина и
люциферазы по
отношению к альдегидному субстрату в исследуемой системе
определена преимущественно гидрофобной
2.
Тип ингибирования определен как неполностью бесконкурентный
3.
Стабилизация
наблюдается
4.
Сродство
альдегида
к
люциферазе
концентрации глицерина 30 об. %,
5.
Эффективность функционирования биолюминесцентной системы
максимальна в среде с концентрацией глицерина 30 об. %
долгоживущего
интермедиата
реакции
максимально
при
12