Хворилова Н.А. Доклад на тему планируемой диссертации
advertisement
МОДИФИКАЦИЯ МОНОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ АДЕНОЗИНОМ С ЦЕЛЬЮ ПОВЫШЕНИЯ ИХ РЕГЕНЕРАТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА ПРИ АУТОЛОГИЧЕСКОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ м.н.с. ЦНИЛ Хворилова Ксения Актуальность Нейродегенеративные болезни Аутоиммунная патология Клеточная терапия Онкологическая патология Наследственные болезни Сердечно-сосудистая патология Ожоги Актуальность - Клеточная терапия стволовыми клетками способствует восстановлению структуры ткани [Andrade C. et al., 2006; Baraniak P., McDevitt T., 2010]. - Паракринные факторы, обеспечивающие эффект терапии, не являются уникальными для стволовых клеток и вырабатываются, хотя и в меньшей степени, также клетками периферической крови, которые при этом не обладают онкогенной активностью. - Широким спектром секретируемых цитокинов обладают моноциты. Их легко выделить из крови человека в количестве, достаточном для культивации и последующей аутологической трансплантации. - Аденозин (эндогенный нуклеозид), образующийся в повышенных количествах при повреждении ткани, в условиях воспаления и гипоксии, влияет на выработку паракринных факторов различными клетками, в том числе моноцитами. Цель: исследовать механизмы модификации моноцитов периферической крови аденозином и разработать подходы для усиления продукции моноцитами необходимых для регенерации тканей и органов паракринных факторов. Задачи: 1. Определить уровень экспрессии мРНК 4 типов аденозиновых рецепторов в культурах стимулированных и нестимулированных аденозином моноцитов периферической крови для оценки характера ответа клеток на аденозиновую стимуляцию. 2. Определить уровень экспрессии мРНК про- и противовоспалительных паракринных факторов в культурах стимулированных и нестимулированных аденозином моноцитов периферической крови. 3. Определить секрецию про- и противовоспалительных паракринных факторов культурами стимулированных и нестимулированных аденозином моноцитов периферической крови. 4. Осуществить экспериментальную оценку регенеративного модифицированных аденозином клеток в модели in vivo. потенциала Дизайн исследования in vitro Определение титра IgE ИФА Забор крови у 40 здоровых доноров Выделение моноцитарной фракции Стимуляция и культивирование 24 часа NECA 30 мкМ DMSO NECA 100 мкМ Анализ полученных клеток Проточная цитофлюориметрия ИФА Real-time PCR 72 часа DMSO Результаты Иммунофенотип клеток * * * * * * - статистически значимые различия по сравнению с показателями клеток , культивируемых с DMSO (p<0.05) Результаты Экспресиия мРНК аденозиновых рецепторов * * * * * - статистически значимые различия по сравнению с показателями клеток , культивируемых с DMSO (p<0.05) Результаты Экспрессия паракринных факторов 24 часа культивирования * * * * - статистически значимые различия по сравнению с показателями клеток , культивируемых с DMSO (p<0.05) Результаты Экспрессия паракринных факторов 72 часа культивирования * * * * * - статистически значимые различия по сравнению с показателями клеток , культивируемых с DMSO (p<0.05) Результаты Секреция паракринных факторов 24 часа культивирования 72 часа культивирования * * * - статистически значимые различия по сравнению с показателями клеток , культивируемых с DMSO (p<0.05) Дизайн исследования in vivo 36 мышей линии C57Bl/6JY 30 мышей Моделирование термического ожога Введение физиологического раствора 6 мышей Получение суспензии клеток костного мозга + NECA Введение модифицированных клеток Введение немодифицированных клеток Гистологическая оценка образцов (5, 7, 14 сутки) + DMSO Результаты Гистологическая картина препаратов кожи на 5 сутки Физиологический раствор Немодифицированные клетки Модифицированные клетки Результаты Гистологическая картина препаратов кожи на 7 сутки Физиологический раствор Немодифицированные клетки Модифицированные клетки Результаты Гистологическая картина препаратов кожи на 14 сутки Физиологический раствор Немодифицированные клетки Модифицированные клетки Выводы Были обнаружены изменения в профиле аденозиновых рецепторов моноцитов периферической крови при стимуляции аналогом аденозина NECA: значительное повышение уровня экспрессии мРНК А2А и А3 аденозиновых рецепторов. Модификация моноцитов периферической крови аденозином привела к статистически достоверному подъему уровней экспрессии генов IL-8, IL-10, IL-1b, bFGF, IP-10 и VEGF. В ответ на стимуляцию аденозином наблюдалось увеличение уровня секреции моноцитами сосудисто-эндотелиального фактора роста. При анализе функциональных особенностей модифицированных моноцитов было установлено, что наиболее эффективным для модификации моноцитов является режим, характеризующийся добавлением 100 мкм NECA и последующим культивированием в течение 72 часов (по сравнению со стимуляцией 30 мкм NECA с последующим инкубированием в течение 24 часов). В экспериментах in vivo (моделирование ожогового повреждения) модифицированные аденозином клетки костного мозга показали положительный пролиферативный эффект на ангиогенез, фиброгенез и эпителизацию раневой поверхности. Благодарю за внимание! Дизайн исследования in vivo 45 лабораторных животных Контрольная группа Забор крови Опытная группа 1 Забор крови Культивирование клеток + DMSO Введение физ. раствора в область ожога Введение клеток в область ожога Опытная группа 2 Забор крови Культивирование клеток + NECA Введение клеток в область ожога Вывод животных из эксперимента с последующей гистологической оценкой образцов (7, 14, 21 сутки)
