Рост и развитие - кафедра физиологии растений

Рост и развитие

Задача 1.

Биотест для определения биологической активности веществ ауксиновой природы.
1
Биотест (биопроба) – это метод обнаружения и определения активности гормонов и фенольных ингибиторов по
реакции целых растений, их органов, тканей и клеток, обладающих повышенной специфической чувствительностью
к этим соединениям. Биотесты используют для 1) качественного обнаружения фитогормона в смесях
неизвестных веществ; 2) оценки количества гормона или фенольного ингибитора в исследуемой смеси; 3)
обнаружения (или изучения) физиологических процессов, в которых участвуют физиологически активные
вещества; 4) анализа свойств новых синтетических регуляторов роста.
Объекты, используемые для биотеста должны удовлетворять следующим требованиям: 1) стандартность
исходного материала и его ответных реакций; 2) легкая воспроизводимость результатов; 3) высокая
чувствительность к данному веществу. Тест-объект должен реагировать на маленькие концентрации
исследуемого вещества, а это возможно при низкой исходной концентрации вещества в клетках; 4)
специфичность (ответные реакции только на определенную группу физиологически активных веществ).
По характеру физиологических реакций, вызываемых гормонами, биотесты делят на группы: ростовые,
пигментные и ферментные. Ростовые: изгибание и удлинение отрезков стеблей или колеоптилей у злаков, рост
каллуса, прорастание семян. Пигментные: синтез хлорофилла (зеленение листьев), накопление каротиноидов.
Ферментные: гормоны могут стимулировать синтез ферментов, например α-амилазы. [1]
Ауксины - гормоны, вырабатываемые в апикальных меристемах побегов. Наиболее чувствительны к ауксинам
корни, затем почки и, наконец, стебли растений. Установлено, что низкие концентрации ускоряют, а высокие
тормозят рост этих частей растений. Ауксины влияют на рост в фазе растяжения, тропизмы, дифференцировку
ксилемы и закладку корней, апикальное доминирование, опадание листьев, цветение, рост пыльцевых трубок,
завязывание и рост плодов, образование клубней и луковиц, прорастание семян. [2]
Кроме природных ауксинов химикам удалось синтезировать вещества, вызывающие такой же физиологический эффект. Поскольку они не
встречаются в растениях, их называют синтетическими аналогами ауксинов. Среди них упомянем лишь 2,4-Дихлорфеноксиуксусную кислоту
(2,4-Д) и -нафтилуксусную кислоту (НУК). Синтетические аналоги эффективно связываются с рецепторами ауксина, однако слабо
взаимодействуют с системой транспорта или окислительной деградации естественных ауксинов.

Цель задачи: изучить влияние ауксинов на прорастание семян капусты.

Объект исследования:

Реактивы и оборудование. Стерильные колбы с агаризованной средой Мурасиге и Скуга
(МS) 300 мл, 70%-ый раствор этилового спирта; диметилсульфоксид (DMSO), раствор
β-индолилуксусной кислоты (ИУК) (4мг в 1000мкл DMSO), 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты
(2,4-D) (5мг в 1500мкл DMSO) либо α-нафтилуксусной кислоты (НУК) (3мг в 1500мкл DMSO);
стерильный раствор 5% Н2О2 на 960 этиловом спирте; автоматические пипетки (5-40мкл и
40-200 мкл) и стерильные наконечники, стерильные пробирки Эппендорф (объемом 1,5 мл),
стерильные стаканчики на 50 мл, стерильные чашки Петри (5 шт. диаметром 9 см и 1шт.
диаметром 6см), стерильные фильтры, ножницы, пинцеты, парафилм или пленка.
Рост и развитие
2
 Ход работы:
1. Плавят на водяной бане агаризованную среду.
2. Подготавливают ламинар-бокс к работе: включают продувку воздуха ламинар-бокса на 5 мин, протирают всю
внутреннюю поверхность ламинар-бокса 70% спиртом. После этого приступают к работе. Продувка ламинара
продолжается в течение всей работы.
3.
Рассчитывают величину вносимого в среду объема гормона для каждого варианта концентрации (на
50мл среды).
ИУК / 2.4D / НУК
Концентрация гормона
[мг/л]
вносимый V исходного р-ра
[мкл]
контроль 0
0,002
0,02
0,2
2
вносимый V разведенного р-ра [мкл]
DMSO
V
[мкл]
Перед работой моют руки и протирают их спиртом.
Все последующие процедуры проводят в стерильных условиях в ламинаре. (Закрывание/открывание
эппендорфов, открывание стаканчиков с помощью предварительно обожженного над горелкой пинцета
и т.д.).
6. (Если необходимо, готовят исходный раствор фитогормона нужной концентрации.)
7. Отливают 50 мл среды в стаканчик. Пробку с колбы снимают в стерильных условиях. Перед тем как
отлить питательную среду, горло колбы обжигают над горелкой.
8. Добавляют концентрированный раствор гормонов в необходимом объеме (для получения следующих
концентраций фитогормона в среде: 0,002 мг/л, 0,02 мг/л, 0,2 мг/л или 2 мг/л) в стаканчик со средой,
контроль не содержит гормона.
9. Добавляют необходимый объем растворителя (DMSO). Перемешивают среду.
10. Переливают среду в чашку Петри в стерильных условиях (перед тем как перелить питательную среду,
горло стакана обжигают над горелкой), накрывают крышкой.
11. Оставляют среду застывать при комнатной температуре.
12. Повторяют все для каждой концентрации гормона (с 5 по 8 пункты).
13. Стерилизуют растительный материал по схеме:
Заранее готовят стерильный раствор 5% Н2О2 на 960 этиловом спирте и хранят в темноте.
Семена раскладывают в один слой в 6см чашку Петри на стерильный бумажный фильтр и с помощью
пипетки наносят раствор по капле на 3 минуты (пока не испарится спирт).
14. Семена сажают в 9см чашку Петри пинцетом, по 25-30 семян (семена можно не промывать после
стерилизации).
15. Герметизируют чашки Петри парафилмом или пленкой. Дальнейшую работу можно проводить в
нестерильных условиях.
16. Надписывают чашки Петри (указывают группу, число посадки, название и концентрацию гормона).
17. Чашки помещают на 16-ти часовой световой день и t=+200С.
18. Через две недели визуально оценивают различия проростков в чашках с различной концентрацией
гормона, если есть фиксируют нарушения геотропизма, проводят измерения гипокотиля и корня
каждого выросшего растения, отмечают, если произошло заражение.
Полученные результаты заносят в таблицу, проводят статистический анализ (подсчет средних
значений и стандартных отклонений для оценки достоверности полученных результатов), строят
графики зависимости длины гипокотиля/корня от концентрации в среде ИУК/2,4D/НУК.
Объясняют результаты.
4.
5.
ЛИТЕРАТУРА к зачету:
Полевой В.В. «Физиология растений»: Учеб. для вузов. М.: "Высш. шк.", 1989.
Бутенко Р.Г Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.
Медведев
«Физиология растений»
Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений // 35—е Тимирязевское чтение. М., 1985.
Гудвин Т., Месер С. Введение в биохимию растений. Т 1,2. М., Мир, 1986.
Гэлстон К., Девис П., Сэттер Р. Жизнь зеленого растения. М., 1983.
Дерфлинг К. Гормоны растений. М., 1985
Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка// 41-е Тимирязевское чтение. М., 1982.
Полевой В.В. Фитогормоны. Л., 1982.
Полевой В.В. Роль ауксина в системах регуляции растений // 44-е Тимирязевское чтение. Л., 1986
Уоринг Ф., Филлипс И. Рост растений и дифференцировка. М., 1984.