•Репарация мтДНК Лекция 4: 1

Лекция 4:
•Репарация мтДНК
1
Репарация мт ДНК
•За день в каждой клетке человека происходит
103-106 повреждений ДНК.
•В человеческом организме около ~1013 клеток.
•За сутки каждый из нас получает ~1017
повреждений ДНК.
2
МтДНК мутирует быстрее ядерной
Почему?
•в митохондриях повышенное содержание ROS
• в митохондриях
репарации
более
слабый
аппарат
•в митохондриях
репликации
менее
точный
аппарат
3
С возрастом
частота
мутаций
в
мтДНК
увеличивается
примерно в 5
раз к 80-ти
годам.
PMID: 24086148
4
Наиболее распространенные
продукты окислительного стресса:
8охоG и 8охоА
В нормальной человеческой клетке: 0.3-4.2 8oxoG/106 G, что
соответствует 7.7х104 – 1х105 8oxoG в одной клетке
5
Вместо канонической пары G-C 8oxoG
образует пару с А.
Это приводит к трансверсиям G ->T и С ->А
6
Частота разных типов
мутаций в мтДНК
PMID: 24086148
Частота трансверсии G->T
практически
не
увеличивается с возрастом
также как и все остальные
трансверсий, в отличии от
транзиций.
•Транзиция
—
одно
пуриновое
основание замещается на другое
пуриновое (аденин на гуанин или
наоборот),
либо
происходит
аналогичная
перестановка
пиримидиновых оснований (тимин с
цитозином).
•Трансверсия — пуриновое основание
замещается
на
пиримидиновое
основание или наоборот.
7
Количество мутаций в мтДНК
увеличивается с возрастом не за счет
образования 8охоG под действием
окислительного стресса.
1. G→A/C→T:
 Ошибка DNA polymerase γ
 Дезаминирование цитозина с образованием урацила
2. T→C/A→G:
 Ошибка DNA polymerase γ
 Дезаминирование аденозина
инозина
с
образованием
8
Как распределены
мутации по мт
геному?
В области D-loop мутаций
больше, чем в остальном геноме.
Но относительное количество
каждого типа мутаций одинаково
по всему мт геному и не меняется
с возрастом.
Видимо, уже при рождении
мутаций в D-loop больше.
9
Как распределяются мутации по цепям мт ДНК?
Замены
G ->A и Т ->С
чаще
происходят в
L-цепи, чем в
Н-цепи
по всему
мт-геному,
но не D-loop.
10
Это можно объяснить асинхронной репликацией
мтДНК: материнская Н-цепь остается в оц
состоянии, когда с oriH идет синтез Н-цепи на
матрице L-цепи.
В одноцепочечном состоянии в
Н-цепи происходит спонтанное
дезаминирование цитозина с
образованием
тимина
и
аденина
с
образованием
гуанина.
11
За счет чего растет частота
мутаций в митохондриях?
•Возникает спонатнное дезаминирование С и А
особенно в одноцепочеченых участках ДНК в
ходе репликации
•ДНК полимераза γ ошибается в репликации
Возможно, 8охоG удаляется до репликации или
12
его репарация усиливается с возрастом
Виды репарации
Изменение в одной цепи ДНК:
1. BER – base excision repair: замена измененного в результате
окисления, алкилирования, гидролиза или дезаминирования
азотистого основания
2. MMR – mismatch repair: удаление неспаренных нуклеотидов
3. NER – nucleotide excision repair: исправление нарушений
правильной двуцепочечной структуры ДНК (например,
пиримидиновых димеров)
13
Изменения в обеих цепях ДНК
(Double-strand break repair):
1. NHEJ – nonhomologous end joining:
DNA ligase IV использует
ближайшие выступающие
концы ДНК для
присоединения к месту
разрыва и его сшивания.
Этот процесс приводит к
серьезным нарушениям в
геноме
2. HR – homologous
recombination: для
восстановления структуры
ДНК в качестве матрицы
используются
гомологичные хромосомы
14
PMID:20950654
15
Репарация митохондриальной ДНК.
•BER – base
excision repair
•MMR – mismatch
repair
•NER – nucleotide
excision repair
• NHEJ – nonhomologous end
joining
•HR – homologous
recombination
PMID: 22138376
16
Основные пути репарации в ядре
PMID:23050036
17
Основные пути репарации в
митохондриях
18
Base excision repair (BER) в
митохондриях:
• SN (single nucleotide) or SP (short patch) BER
– заменяется 1 нуклеотид
• LP (long patch) BER
– заменяется 2-6 нуклеотидов
19
Base excision repair (BER) в митохондриях:
PMID:20950654
1. Специфичная ДНКгликозилаза перемещает
поврежденное основание
ДНК
2. АP-эндонуклеаза (от
apurinic or apyrimidinic
site) расщепляет цепь
ДНК, оставляя
единичный разрыв,
содержащий 5’-dRPгруппу.
3. Вместо удаленного
нуклеотида ДНКполимераза вставляет
новый (ые).
4. Лигаза зашивает цепь
ДНК.
20
•SN BER: 5’-dRP- группа
удаляется, а gap заполняет
DNA pol γ, затем сшивает
DNA ligase III
Скорость dRP-лиазной
реакции у DNA pol γ ниже,
чем у DNA pol β,
осуществляющей BER в
ядре.
PMID:22992591
•LP BER проходит в
экстрактах митохондрий в
присутствии белков:
•Хеликаза DNA2
процессирует
расширяющуюся flapструктуру
•Flap endonuclease FEN1
удаляет flap-структуру,
замененную DNA pol γ
21
•Ligase III сшивает разрыв
Основные виды повреждений
азотистых оснований:
•Окисление
•Алкилирование
•Дезаминирование
22
Base excision repair (BER) в
митохондриях:
Поврежденные азотистые основания удаляются
специфичными гликозилазами
23
Основные продукты окисления азотистых
оснований
24
Наиболее распространенные продукты
окислительного стресса: 8охоG и 8охоА
25
Репарацию 8oxoG осуществляет гликозилаза
OGG1 (MutM у бактерий).
Альтернативный сплайсинг мРНК hOGG1 дает несколько изоформ
фермента, в том числе и митохондриальную.
В ядре есть другие ферменты для репарации 8oxoG, а в митохондрии
их, видимо, меньше:
•В экстрактах митохондрий из ogg1-/- мышей in vitro не вырезается
8oxoG
• У ogg1-/- мышей в ядре содержание 8oxoG увеличивается не сильно,
в митохондриях гораздо сильнее
•В клетках мышей csb-/csb- ogg1-/ogg1- уровень 8oxoG не меняется
Предполагается, что NEIL1 может компенсировать потерю OGG1
MYH (MutY у бактерий) перемещает аденин или гуанин, ошибочно
вставленные при репликации во вторую цепь ДНК напротив 8oxoG.
Альтернативный
изоформы MYH.
сплайсинг
дает
ядерную
и
митохондриальную
26
Репарацию окисленных азотистых оснований
могут осуществлять гликозилазы NEIL1 и NEIL 2
В ядерной репарации они
вырезают
повреждения
в
структурах «Bubble»:
PMID:22992591
•NEIL1 экспрессируется в Sфазе => участвует в репликации
•NEIL2
экспрессируется
независимо от фазы клеточного
цикла
=>
участвует
в
транскрипции
Этим ферментам требуется polynucleotide kinase 3′phosphatase (PNKP)
27
У нокаутных по NEIL1 мышей в печени
накапливаются мтДНК с делециями, что
вызывает
симптомы
типичные
для
митохондриальных болезней.
28
NEIL2 и polynucleotide kinase 3′-phosphatase
(PNKP) колокализованы с MT-COХ2
PMID:22130663
29
•NEIL2 и polynucleotide kinase 3′-phosphatase
(PNKP) обнаружены в экстрактах митохондрий
•NEIL2 и polynucleotide kinase 3′-phosphatase
(PNKP) колокализованы с DNA polymerase γ.
•В отсутствии NEIL2 или PNKP в клетках линии
HEK293 повышается содержание окисленных
азотистых оснований
30
Образование тимингликоля из тимина
под действием окислительного стресса
блокирует работу РНК- и ДНКполимеразы
31
Тимингликоль удаляется тимингликольгликозилазой.
У дрожжей её кодируют два гена: NTG1 и NTG2. У NTG1
двойная локализация – в ядре и в митохондриях, а NTG2
образует ядерную изоформу.
PMID:10207101
32
Совместно с NTG1 в дрожжевых
митохондриях
при
BERрепарации работает хеликаза
PIF1.
Совместное потеря генов NTG1,
PIF1
и
SOD
(супероксиддисмутаза) приводит
к потере мтДНК.
Это
доказывает,
что
повреждения от окислительного
стресса
вносят
вклад
в
геномную
нестабильность
митохондриального
генома
дрожжей.
PMID:15923634
33
Для
тимингликоль-гликозилазы
Млекопитающих
hNTHL1
данные
противоречивы:
•по одним данным она локализована в ядре и
митохондриях, по другим – только в ядре.
•Непонятно, происходит ли удаление тимингликоля в
митохондриях
из
клеток
мышей
nth-/(противоречивые данные у разных групп).
34
Продукты дезаминирования
35
Удаление урацила, образованного при
дезаминировании цитозина,
осуществляет урацил-ДНК-гликозилаза
Сущестуют ядерная и митохондриальная формы урацил-ДНКгликозилазы. Они образуются с двух разных промоторов одного
гена и в результате альтернативного сплайсинга.
У дрожжей одна изоформа этого фермента, в нем есть сигналы
как ядерной, так и митохондриальной локализации.
GFP-control
UNG2
UNG1
PMID:9016624
36
Наиболее распространенные продукты
алкилирования: О-4-alkylT О-6-alkylG
37
Алкилированные основания удаляет
N-methylpurine-DNA-glycosylase (MPG или
AAG – от alkyladenine-DNA-glycosylase или 3methyladenine-DNA-glycosylase).
Этот фермент не обнаружен в митохондриях, но в
митохондриях репарируются повреждения, обычно служащие
субстратами этого фермента.
38
Митохондриальные гликозилазы
PMID:22992591
39
Base excision repair (BER) в митохондриях:
АР эндонуклеазы
Основная АР эндонуклеаза Млекопитающих АРЕХ1 локализована
как в ядре, так и в митохондриях. Митохондриальная форма короче
ядерной. Есть и другая АР эндонуклеаза
АРЕ2, частично
транспортируемая в митохондрии, но её каталитическая активность
низка, функции требуют дальнейшего изучения.
У дрожжей основная эндонуклеаза Apn1 на N-конце имеет
митохондриальную адресную последовательность и сигнал ядерной
локализации на C-конце. Apn1 транспортируется в митохондрии,
взаимодействуя с Pir1 – белком клеточной стенки дрожжей. Pir1
конкурирует с
ядерными белками за связывание с сигналом
ядерной организации, что позволяет части Apn1 импортироваться в
митохондрии.
40
Base excision repair (BER) в митохондриях:
застраивание бреши и лигирование
АР эндонуклеаза освобождает OH-группу на 3’-конце бреши, но
механизм дальнейшей репарации зависит того, какая группа
расположена на 5’-конце.
В митохондриях застраивание бреши осуществляет ДНКполимераза γ, у неё есть и полимеразная и лиазная активность,
но последняя слабее, чем у DNA pol β, осуществляющей BER в
ядре.
41
В случае, если
АР эндонуклеаза
и
ДНКполимераза
может оставить
на
5’-конце
фосфат,
репарация идет
по
механизму
short patch BER –
вставляется
только
один
нуклеотид.
PMID:22992591
В случае, если продукт вырезания устойчив к лиазной активности
ДНК-полимеразы (например, при образовании 2-deoxyribonolactone) репарация идет по механизму long patch BER – вставляется 2-6
42
нуклеотидов.
Base excision repair (BER) в митохондриях:
Считается, что
в
long patch
BER
в
митохондриях
участвуют
FEN1
(или
EXOG1)
и
хеликаза DNA2.
PMID:22992591
Последняя стадия BER-репарации – лигирование. В митохондриях
человека лигирование проводит DNA ligase 3 (LIG3). У дрожжей в
митохондриях работает LIG1.
43
Регуляция BER
PMID:20950654
•ROS
повреждают
свободные dNTP и мтДНК
•Сигнал
о
повреждении
поступает в цитозоль, белки
системы
репарации
транспортируются
в
митохондрию
•Сигнал
о
повреждении
мтДНК
дополняется
сигналами о повреждении
ядерной ДНК
• Происходит
перераспределение
факторов репарации: OGG1,
UNG1 и NTH1, дрожжевого
NTG1, CSA, CSB.
44
Основные пути репарации в митохондриях:
•Уничтожение
окисленных
dNTPs (I)
•Short-patch
BER (II)
•Long patch
BER (III)
•Регуляция
репарационных
процессов (IVV)
PMID:20950654
Зеленым выделены главные факторы репарации; дополнительные факторы – желтым и
фиолетовым; ДНК связывающие белки выделены серым.
45
TFAM участвует в репарации мтДНК
•TFAM связывается с
поврежденной
ДНК
прочнее,
чем
с
интактной.
У
TFAM
аффинность
к
ДНК,
содержащей
8-охоG,
выше, чем у гликозилаз
OGG1 и MYH.
Factors from
cytoplasm
•Клетки, устойчивые к
циспластину
(алкилирующий агент),
гиперэксперессируют
TFAM
и
TRX2
(тиоредоксин 2).
•TFAM ингибирует разрезание ДНК некоторыми
репарации (OGG1, UNG1, APE1) in vitro.
ROS
PMID:20950654
ферментами
46
TFAM снижает скорость репарации
•Это может быть связано с тем, что TFAM плотнее
упаковывает ДНК, что снижает доступ к ней
ферментов.
•р53 может ослаблять связывание TFAM с
поврежденными основаниями, что увеличивает
скорость репарации.
•3’-5’ экзонуклеазная активность р53 может удалять
8-охоG на 3’-конце, эта реакция усиливается SSB.
47
1. В митохондриях происходит репарация BER
двух типов:
• SP (short patch) BER
• LP (long patch) BER
2. Основные стадии BER:
• Гликозилаза удаляет поврежденное азотистое основание
• АР-эндонуклеаза освобождает 3’-конец бреши
• В зависимости от группы на 5’-конце бреши ДНК полимераза
ɣ застраивает брешь одним (SP BER) или несколькими (LP
BER) нуклеотидами.
• FEN1, EXOG1 и DNA2 участвуют в LP BER
• LIG 3 зашивает разрыв
3. Существует регуляция BER в митохондриях:
• Многие ферменты переходят в митохондрии в ответ на
сигналы о повреждениях
• В репарации BER участвуют TFAM и p53
48
MMR – mismatch repair
Удаление несоответствий и небольших петель.
Эффективность невысокая, т.к. не всегда
происходит верный выбор материнской цепи,
что приводит к мутациям.
Удаление
несоответствий
некомплементарных пар G:T и G:G показано в
лизатах митохондрий млекопитающих.
Одним из основных факторов MMR в ядре
служит YB-1, предполагается, что он является
ключевым
компонентом
MMR
и
в
митохондриях.
49
YB-1 в отличие от остальных
участников
ядерной MMR
(MSH1, MSH3, MSH6) частично
локализован в митохондриях.
В
митохондриальных
экстрактах
из
клеток
с
отсутствием
MSH2
наблюдается
MMR
=>
механизм
MMR
в
митохондриях отличается от
ядерного.
MMR
в
экстрактах
митохондрий снижается при
уменьшении
уровня
YB-1
(нокдаун siRNA).
PMID:19272840
50
PMID:22992591
51
Предполагается, что DNMT1 может
участвовать в MMR в митохондриях
•Нокдаун DNMT1 в человеческих клетках увеличивает
количество мутаций в микросателлитах
•Снижение
экспрессии
уменьшением
количеств
комплексов MytSa и MutLa
DNMT1
белков
сопровождается
–
компонентов
52
•Вопрос о наличии MMR в митохондриях
остается открытым.
•BER
тоже
несоответствия.
может
репарировать
• Существует предположение, что MMR
необходима для удаления маленьких
петель
в
большей
степени,
чем
несоответствий в парах нуклеотидах.
53