Лекция 5: •Репарация мтДНК •Транскрипция мтДНК 1

Лекция 5:
•Репарация мтДНК
•Транскрипция мтДНК
1
Double-strand break repair
Есть доказательства
наличия в митохондриях
обоих механизмов: NHEJ
(non-homologous end
joining) и
HR (homologous
recombination).
:
RAD51 – основной фермент
HR в ядре – локализован
также в человеческих
митохондриях
2
Доказательства наличия гомологичной
рекомбинации у эукариот:
•Гомологичная рекомбинация показана у дрожжей.
MTG1/CCE1 ген кодирует резольвазу, локализованную в
митохондриях.
•В лейкоцитах человека (особенно при лейкемиях) и
некоторых линиях клеток существенная часть мтДНК
образует кольцевые димеры и мультимеры. Они могут
образоваться в результате гомологичной рекомбинации.
3
•В сердечной мышце
человека,
мозге
человека
и
мыши
мтДНК
линейна
и
образует структуры, в
которых
возможна
рекомбинация.
4
PMID: 21290399
•Попадание отцовской мтДНК в зиготу и её рекомбинация
с материнской показана у ящериц, лосося и нематод.
•Есть данные, что у человека может также происходить
попадание отцовской мтДНК в зиготу: у одного пациента в
мышцах были обнаружены гибриды отцовской и
материнской мтДНК.
PMID:15143273
5
PMID:24006472
Ферменты-кандидаты на
участие в гомологичной
рекомбинации в
митохондриях человека:
•Хеликазы (Twinkle или Pif1)
•Белки, связанные с ДНК (TFAM)
•SSB (mtSSB)
•Экзонуклеаза (MGME1)
•Комплекс Rad51/RecA
•Медиатор Rad52 (MGM101 у
дрожжей)
6
TFAM и Twinkle
участвуют в
образовании
структур
Холлидея =>
могут
участвовать в
гомологичной
рекомбинации
7
MGME1(mitochondrial genome maintenance
exonuclease 1):
•локализована
в митохондриях
•ssDNA
5’->3’
exonuclease
PMID:23313956
8
•Мутации в экзонуклеазе MGME1 вызывают
митохондриальные болезни и множественные
делеции в мтДНК
•При снижении количества MGME1 в клетках
нарушается
репликация
в
митохондриях:
накапливаются короткие продукты, увеличивается
кол-во 7S ДНК
9
Rad 51 переходит в митохондрии в ответ на
окислительный стресс.
Для перехода Rad 51 необходима репликация.
PMID:23591384
10
MGM101 участвует в гомологичной
рекомбинации в митохондриях дрожжей
11
PMID:24006472
Ферменты-кандидаты на
участие в гомологичной
рекомбинации в
митохондриях человека:
•Хеликазы (Twinkle или Pif1)
•Белки, связанные с ДНК (TFAM)
•SSB (mtSSB)
•Экзонуклеаза (MGME1)
•Комплекс Rad51/RecA
•Медиатор Rad52 (MGM101 у
дрожжей)
12
1. Вероятно, в митохондриях происходит репарация
двуцепочечных разрывов.
2. Существуют
косвенные
доказательства
гомологичной рекомбинации в митохондриях
Млекопитающих, но детали этого процесса пока
неясны.
3. Несколько белков являются кандидатами на
участие
в
гомологичной
рекомбинации
в
митохондриях: mtSSB, экзонуклеаза MGME1,
Rad51, хеликазы Twinkle и Pif1, TFAM.
4. У дрожжей Rad52-подобный белок MGM101
участвует в гомологичной рекомбинации.
5. Какой фермент выполняет функции Rad52 в
митохондриях Млекопитающих неизвестно. В
митохондриях некоторых растений работает
13
изоформа Rad52.
Direct repair
(без разрезания фосфодиэфирной связи)
Повреждения ДНК УФ излучением в ядре репарирует
фотолиаза,
её
активность
не
показана
в
митохондриях
Млекопитающих.
У
дрожжей
фотолиаза работает в митохондриях.
O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) –
основной
фермент
прямого
репарирования
алкилированных оснований в ядерной ДНК. Есть
данные, что MGMТ присутствует в митохондриях, но
может репарировать только метилированные и
этилированные основания.
14
NER – nucleotide excision repair
Долгое время считалось, что этот механизм отсутствует в
митохондриях.
•В митохондриях дрожжей индуцированные УФ пиримидиновые
димеры репарируются эндонуклеазой Rad2. Этот механизм
UVER (UV excision repair) одновременно похож и на BER, и на
NER.
•Белки, участвующие в ядерной NER CSA (от Cockayne
Syndrome) и CSB найдены в митохондриях Млекопитающих в
условиях окислительного стресса. Они связываются с мтДНК и
компонентами BER.
Возможно, в митохондриях есть отличный от ядра механизм
NER, который еще будет исследован.
15
Белки CSA и CSB (Cockayne syndrome)
Синдром Кокейна - аутосомное рецессивное нейродегенеративное
заболевание проявляющееся в нарушении роста, неврологических
отклонениях, гиперчувствительности кожи к УФ.
16
Белки CSA и CSB (Cockayne syndrome)
Синдом Кокейна связан с
кодирующих белки CSA и CSB.
дисфункцией
генов,
Эти белки участвуют во многих ядерных процессах:
•инициации транскрипции
•репарации (NER и BER)
•Уровень CS белков в митохондрии в норме низкий, но
при обработке клеток перекисью он резко возрастает: СS
белки импортируются в митохондрию и связываются с
мтДНК.
17
CSA принадлежит к семейству белков с
WD40 доменами.
PMID:21468892
WD40 – повтор: около 40
аминокислот с WD на конце.
Такой домен имеет структуру ßпропеллера, обычно с 7-ю
лопастями.
18
PMID:25653723
19
Структура CSA
40 кДа
https://openaccess.leidenuniv.nl/handle/1887/19938
PMID:21468892
20
CSB принадлежит к семейству
SNF2/SWI2 ATФаз
168 кДа
PMID:23422418
•У SNF2/SWI2 ATФаз имеется центральный АТФазный домен с 7-ю
хеликазными мотивами.
•Они способны разъединять цепи дцНК, но настоящей хеликазной
активностью не обладают.
•Участвуют в регуляции структуры хроматина.
21
Функции CS белков в митохондриях
•Уровень CS белков в митохондриях при
окислительном стрессе резко возрастает: СS
белки импортируются в митохондрию и
связываются с мтДНК и некоторыми белками
•СS белки защищают мтДНК от образования
common deletion
22
Сommon deletion
Делеция 4978 bp, фланкированных короткими прямыми
повторами. Делеция захватывает > 30% митохондриального
генома.
Делеции в мт ДНК
возникают при множестве
различных заболеваний.
В том числе:
•в нейронах пожилых
людей
•у пациентов с болезнью
Паркинсона (32-80% мт
ДНК в черной субстанции
несут делеции)
23
Common deletion может образоваться в
ходе репликации
PMID:18305478
24
Common deletion может образоваться в
ходе репарации двуцепочечных разрывов
PMID:18305478
25
Функции CSB в мт-транскрипции
•CSB способен освобождать мтДНК из комплекса мтДНК-
СSB способствует
мтДНК с POLRMT
TFAM
=>
связыванию
•В клетках csb -/csb- падает транскрипционная активность
•in vitro CSB снижает инициацию транскрипции,
увеличивает количество длинных транскриптов =>
CSB увеличивает процессивность POLRMT,
действуя как фактор элонгации
26
Функции CSB в мт-репарации
•CSB взаимодействует с OGG1 и mt SSB
•В клетках мышей csb-/csb- возрастает уровень
окислительных повреждений ДНК (8oxoG) и нарушается
работа дыхательной цепи
•В клетках мышей csb-/csb- ogg1-/ogg1- уровень 8oxoG не
меняется.
Предполагается,
что
NEIL1
может
компенсировать потерю OGG1
•Потеря CSB снижает активность BER в митохондриях
Возможно, CSB участвует в BER, изменяя
структуру комплекса TFAM-мтДНК, чтобы
обеспечить доступ ферментов репарации к
27
ДНК.
PMID:23562423
l
28
•В митохондриях происходит репарация двух типов:
•BER – base excision repair
•MMR – mismatch repair
2. В митохондриях не показана NER – nucleotide
excision repair, хотя белки CSA и CSB импортируются в
митохондрию при окислительном стрессе. Вероятно,
CSB участвует в регуляции транскрипции и BER
3. Наличие репарации двуцепочеченых повреждений
мтДНК не изучено, но Rad 51 поступает в митохондрии
в условиях окислительного стресса и участвует в
репликации.
29
Топология репарации в митохондриях
•CSB рекрутирует факторы BER
к мембране; СSB способствует
связыванию мтДНК с POLRMT
•CSA and CSB взаимодействуют
с SSB и гликозилазой OGG1;
•p53 стимулирует гликозилазу и
POLγ;
•PARP-1 участвует в BER?
PARP1 – Poly (ADP-ribose) polymerase – ключевой ядерный фермент
репарации однонитевых разрывов. Такие разрывы образуются при BER,
поэтому PARP1 влияет и на BER.
PARP1 локализована в митохондрии и участвует в поддержании целостности
мтДНК. PARP1 входит в комплекс, включающий мтДНК и лигазу 3.
30
Мт ДНК связана с внутренней
мембраной. Один из белков,
связывающих ДНК с мембраной
– М19, вероятно, участвуют
также РНВ1 (prohibitin1) и ATAD3
(белок внутренней мембраны,
ответственный за перемещения
D-loop).
Большинство компонентов BER
связаны
с
внутренней
мембраной
(кроме
АРэндонуклеазы). Но стабильного
комплекса компоненты BER не
образуют. Есть данные, что CSB
вовлечен в сборку и сохранение
комплекса мтДНК и компонентов
BER: он связывает SSB и OGG1
в один комплекс с мтДНК.
31
Есть две модели:
•мтДНК мобильна и проходит через
комплексы, расположенные на внутренней
мембране, для репликации, репарации
и. т. д.
•мтДНК
заякорена
мембране.
на
внутренней
32
Регуляция репарации мтДНК
Мт изоформы многих ферментов мт репарации образуются с
помощью альтернативного сплайсинга, а, значит, возможна
посттранскрипционная регуляция.
Есть
данные
по
NTG1
дрожжей.
NTG1
динамично
перераспределяется между ядром и митохондриями при
окислительном стрессе. Переход NTG1 в митохондрии зависит от
окислительных повреждений, но не от уровня ROS. Значит, есть
специфичные сигналы об этих повреждениях, исходящие из
митохондрий.
Некоторые белки с двойной ядерной и митохондриальной
локализацией обнаруживаются в митохондриях только в условиях
окислительного стресса: Rad51, APEX1, CSA и CSB.
Многие белки имеют сигналы как ядерной, так и митохондриальной
локализации: NTG1, UNG1, APE1 у дрожжей и hOGG1a, hNTHL1 у
Млекопитающих. Возможно, механизм, показанный для NTG1,
является общим.
Окислительный стресс вызывает переход р53 в митохондрии.
33
34
Транскрипция мтДНК
PMID:
22137970
Три транскрипта:
1) C HSP1 – в D-loop
2) C HSP2 – upstream 5’-конца 12 S rRNA (частота инициации в 20 раз ↓)
3) С LSP – в D-loop
35
В транскрипции участвуют:
•POLRMT
•TFAM (h-mtTFA –
transcription factor A)
•TFBM1 (h-mtTFB1)
•TFBM2 (h-mtTFB2) образует гетеродимер с
POLRMT
•MTERF1 (mitochondrial
termination factor) –
терминирует
транскрипцию
PMID: 17189185
•TFEM (transcriptional elongation factor mitochondrial) ↑ процессивность POLRMT, осуществляет переключение между
транскрипцией и репликацией.
36
•TFAM – регулирует число копий
мтДНК и участвует в регуляции
транскрипции.
•TFBM1 (h-mtTFB1) и TFBM2 (hmtTFB2) имеют сходство с рРНКметилтрансферазами, которые
диметилируют аденозин около 3’конца 12S pРНК. Эта модификация
консервативна для про- и эукариот,
за исключением дрожжей.
TFAM
PMID:
17189185
Филогенетический анализ показал,
что они происходят от рРНК
метилтрансферазы эндосимбионта.
•TFBM1 и TFBM2 способны
связывать РНК или оцДНК.
37
TFB1M и TFB2M диметилируют А936 и А937 в
12S rRNA
Отсутствие
TFB1M:
PMID: 22642575
•приводит к потере
диметилирования
• снижает уровень
12S rRNA
•ведет к
невозможности
трансляции в
митохондриях.
38
TFB M1 имеет 2 функции:
•Участвует в транскрипции (не ясно как
именно)
•рРНК-метилтрансфераза (MT)
Мутации в МТ-мотиве не приводят к
отсутствию транскрипции in vitro.
Нокдаун TFB M1с помощью iRNA у
дрозофилы не меняет число
транскриптов, но ↓ синтез белка в
митохондриях => TFB M1 участвует в
трансляции
TFB M1 играет роль транскрипционного фактора в неких
специфических условиях или при транскрипции только
определенных мРНК.
39
TFBM2:
•рРНК-метилтрансферазная
активность менее выражена
•Специализированный
транскрипционный фактор:
нокдаун с помощью iRNA у
дрозофилы ↓ число транскриптов в
2-8 раз.
Возможны 2 функции:
•Связывает оцДНК, стабилизируя область промотора в
частично расплетенном состоянии во время инициации
транскрипции
•Связывает новую цепь РНК, предотвращая образование
ДНК-РНК гибридов, способных ингибировать промотор. 40
1. TFBM1 (h-mtTFB1) и TFBM2 (h-mtTFB2) – рРНКметилтрансферазы, диметилирующие аденозин
около 3’-конца 12S pРНК
2. TFBM1 и TFBM2
являются транскрипционными
факторами,
POLRMT
может
осуществлять
транскрипцию только в комплексе с одним из них
3. Нокдаун TFBM1 не влияет на транскрипцию, но
существенно снижает уровень трансляции
4. Основная функция TFBM1 – метилирование 12S
pРНК и регуляция трансляции
5. Нокдаун TFBM2 снижает уровень транскрипции
6. Основная функция TFBM2 – участие в транскрипции
41
РНК-полимераза POLRMT
•имеет высокую степень гомологии с РНК-полимеразой
Т-нечетных фагов (Т3/Т7)
•не имеет гомологии с мультисубъединичными РНКполимеразными комплексами прокариот.
PMID:22551784
42
У человека POLRMT (mtRNAP)
размером 1230ак, 134 кДа.
-
белок
В отличие от фаговой полимеразы, POLRMT не
может
инициировать
транскрипцию
самостоятельно, ей требуются дополнительные
белки
43
PMID:22551784
N-концевой домен NTE есть только в POLRMT. Он состоит из:
• pentatricopeptide repeat domain (PPR domain)
• протяженного участка с неизвестной структурой – остатки 42–217
• «митохондриального адреса»
N-концевой домен NTD имеет слабо выраженную гомологию с T7РНК-полимеразой. Но структурное сходство высокое.
Короткий богатый пролином линкер соединяет NTE и NTD
Каталитический домен СТD
PMID:22551784
СТD – каталитический домен: 12 консервативных блоков
расположенных линейно (A-L)
Кристаллическая структура: напоминает кисть руки
•Пальцы – основной элемент О-helix=мотив В, важен для субстратной
специфичности, катализа и транслокации. Расположена немного в
разной ориентации.
•Ладонь – мотивы А,С, мутации приводят к потере каталитической
активности
•Большой палец – α-спираль, осуществляет связь полимеразы с
матрицей во время элонгации
45
PMID:22551784
Домен Пальцы
•Нет finger flap – стабилизирует фермент на ДНК во время
элонгации. Возможно, для POLRMT нужны дополнительные факторы
для увеличения процессивности. TFEM ↑ процессивность.
•Specificity loop – нет в кристаллической структуре, узнает промотор
(-3 - -11) и взаимодействует с большой бороздкой ДНК, обеспечивая
специфичность узнавания промотора наряду с NTD, участвует также
в элонгации, ↑ процессивность. Вероятно, есть и в POLRMT (у
дрожжей есть похожая структура, но обеспечивает инициацию
только на оц матрице, на дц требуются дополнительные факторы).
46
NTD
PMID:
22551784
•нет сходства последовательности, а структура похожа: 6 спиралей
• β-hairpin – вставлена между матричной и нематричной цепью,
расплавляя промотор для инициации в Т7. В POLRMT возможно роль
та же, но требуются дополнительные факторы. Делеция в этой области
не дает POLRMT инициировать транскрипцию с дц промотора.
•AT-rich loop соединяет спирали D и E. Эти 2 спирали и петля имеют
плотный контакт с PPR-доменом NTE. АТ-петля взаимодействует с
малым желобком ДНК в области -13 - -17, это необходимо для
47
узнавания промотора.
PMID: 22551784
NTE уникален для POLRMT вариабелен у животных, растений и
грибов.
PPR (pentatricopeptide repeat domain)
•Содержит 2 PPR тандемных мотива. В дрожжах этого домена нет,
есть у растений.
•Образует 9 α-спиралей, из которых 4 включают в себя PPR-мотивы.
48
PPR-мотивы содержатся во многих белках
митохондрий и хлоропластов
PMID: 22051507
•PPR мотив: 35 аминокислот (повторяются от 2 до 26 раз)
•РРR мотив образует 2 альфа-спирали
•PPR мотив, вероятно, участвует в связывании с РНК, но
механизм этого взаимодействия неизвестен
49
1. LRPPRC (leucine-rich
pentatricopeptide repeat
containing protein) участвует
в регуляции транскрипции
2. MRPP3 (mitochondrial
RNAse P protein 3) –
компонент РНКазы Р,
участвует в процессинге 5’–
концов тРНК
3. MRPS27 (mitochondrial ribosomal protein of the small subunit 27) – компонент
малой субъединицы рибосом
4. POLRMT – каталитическая субъединица РНКполимеразы
5. PTCD1 (pentatricopeptide repeat domain protein 1) - участвует в процессинге 3’–
концов тРНК
6. PTCD2 (pentatricopeptide repeat domain protein 2) – участвует в процессинге
мРНК
7. PTCD3 (pentatricopeptide repeat domain protein 3) – связан с 12S рРНК, не50
влияет на её стабильность и процессинг, функции неизвестны.
PMID: 22551784
Участок 42-218 ак – структура не известна, к PPR
примыкает α-спираль. Делеция приводит к потере
транскрипции с промотора, каталитическая активность
сохраняется.
51
РНК-полимераза
POLRMT
cпособна
осуществлять транскрипцию только в
присутствии
TFAM
и
одного
из
транскрипционных факторов: TFBM1 или
TFBM2
52