Лекция 3: •Репарация мтДНК 1

http://goo.gl/9acqtM
Лекция 3:
•Репарация мтДНК
1
•За день в каждой клетке человека происходит
103-106 повреждений ДНК.
•В человеческом организме около ~1013 клеток.
•За сутки каждый из нас получает ~1017
повреждений ДНК.
2
С возрастом
частота
мутаций
в
мтДНК
увеличивается
примерно в 5
раз к 80ти
годам.
PMID: 24086148
3
МтДНК мутирует быстрее ядерной
Почему?
•в митохондриях повышенное содержание ROS
• в митохондриях
репарации
более
слабый
аппарат
•в митохондриях
репликации
менее
точный
аппарат
4
Наиболее распространенные продукты
окислительного стресса: 8охоG и 8охоА
В нормальной
человеческой клетке:
0.3-4.2 8oxoG/106 G,
что соответствует
7.7х104 – 1х105 8oxoG
в одной клетке
5
Частота разных типов
мутаций в мтДНК
PMID: 24086148
Частота трансверсии G ->T
практически
не
увеличивается с возрастом
также как и все остальные
трансверсий, в отличии от
транзиций.
•Транзиция
—
одно
пуриновое
основание замещается на другое
пуриновое (аденин на гуанин или
наоборот),
либо
происходит
аналогичная
перестановка
пиримидиновых оснований (тимин с
цитозином).
•Трансверсия — пуриновое основание
замещается
на
пиримидиновое
основание или наоборот.
6
Количество мутаций в мтДНК увеличивается с
возрастом не за счет образования 8охоG под
действием окислительного стресса.
7
Как распределены
мутации по мт
геному?
В области D-loop мутаций
больше, чем в остальном геноме.
Но относительное количество
каждого типа мутаций одинаково
по всему мт геному и не меняется
с возрастом.
Видимо, уже при рождении
мутаций в D-loop больше.
8
Как распределяются мутации по цепям мт ДНК?
Замены
G ->A и Т ->С
чаще
происходят в
L-цепи, чем в
Н-цепи
по всему
мт-геному,
но не D-loop.
9
Это
можно
объяснить
асинхронной
репликацией мтДНК: материнская Н-цепь
остается в оц состоянии, когда с oriH идет
синтез Н-цепи на матрице L-цепи.
В
одноцепочечном
состоянии в Н-цепи
происходит спонтанное
дезаминирование
цитозина
с
образованием тимина и
аденина
с
образованием гуанина.
10
За счет чего растет частота мутаций
в митохондриях?
•Возникает спонатнное дезаминирование С и А
особенно в одноцепочеченых участках ДНК в ходе
репликации
•ДНК полимераза γ ошибается в репликации
•Возможно, 8охоG удаляется до репликации или его
репарация усиливается с возрастом
11
Виды репарации
Изменение в одной цепи ДНК:
1. BER – base excision repair: замена измененного в результате
окисления, алкилирования, гидролиза или дезаминирования
азотистого основания
2. MMR – mismatch repair: удаление неспаренных нуклеотидов
3. NER – nucleotide excision repair: исправление нарушений
правильной двуцепочечной структуры ДНК (например,
пиримидиновых димеров)
12
Изменения в обеих цепях ДНК
(Double-strand break repair):
1. NHEJ – nonhomologous end joining:
DNA ligase IV использует
ближайшие выступающие
концы ДНК для
присоединения к месту
разрыва и его сшивания.
Этот процесс приводит к
серьезным нарушениям в
геноме
2. HR – homologous
recombination: для
восстановления структуры
ДНК в качестве матрицы
используются
гомологичные хромосомы
13
PMID:20950654
14
Репарация митохондриальной ДНК.
•BER – base
excision repair
•MMR – mismatch
repair
•NER – nucleotide
excision repair
• NHEJ – nonhomologous end
joining
•HR – homologous
recombination
PMID: 22138376
15
Base excision repair (BER) в
митохондриях:
• SN (single nucleotide) or SP (short patch) BER
– заменяется 1 нуклеотид
• LP (long patch) BER
– заменяется 2-6 нуклеотидов
16
Base excision repair (BER) в митохондриях:
PMID:20950654
1. Специфичная ДНКгликозилаза перемещает
поврежденное основание
ДНК
2. АP-эндонуклеаза (от
apurinic or apyrimidinic
site) расщепляет цепь
ДНК, оставляя
единичный разрыв,
содержащий 5’-dRPгруппу.
3. Вместо удаленного
нуклеотида ДНКполимераза вставляет
новый (ые).
4. Лигаза зашивает цепь
ДНК.
17
•SN BER: 5’-dRP- группа
удаляется, а gap заполняет
DNA pol γ, затем сшивает DNA
ligase III
Скорость dRP-лиазной
реакции у DNA pol γ ниже, чем
у DNA pol β, осуществляющей
BER в ядре.
•LP BER проходит в экстрактах
митохондрий в присутствии
белков:
•Хеликаза DNA2 процессирует
расширяющуюся flap-структуру
•Flap endonuclease FEN1
удаляет flap-структуру,
замененную DNA pol γ
•Ligase III сшивает разрыв
18
Основные виды повреждений
азотистых оснований:
•Окисление
•Алкилирование
•Дезаминирование
19
Base excision repair (BER) в
митохондриях:
Поврежденные азотистые основания удаляются
специфичными гликозилазами
20
Основные продукты окисления азотистых
оснований
21
Наиболее распространенные продукты
окислительного стресса: 8охоG и 8охоА
В нормальной
человеческой клетке:
0.3-4.2 8oxoG/106 G,
что соответствует
7.7х104 – 1х105 8oxoG
в одной клетке
22
Репарацию 8oxoG осуществляет гликозилаза
OGG1 (MutM у бактерий).
Альтернативный сплайсинг мРНК hOGG1 дает несколько изоформ
фермента, в том числе и митохондриальную.
В ядре есть другие ферменты для репарации 8oxoG, в митохондрии их
нет:
•В экстрактах митохондрий из ogg1-/- мышей in vitro не вырезается
8oxoG.
• У ogg1-/- мышей в ядре содержание 8oxoG увеличивается не сильно,
в митохондриях гораздо сильнее.
MYH (MutY у бактерий) перемещает аденин или гуанин, ошибочно
вставленные при репликации во вторую цепь ДНК напротив 8oxoG.
Альтернативный
изоформы MYH.
сплайсинг
дает
ядерную
и
митохондриальную
23
Образование тимингликоля из тимина
под действием окислительного стресса
блокирует работу РНК- и ДНКполимеразы
24
Тимингликоль удаляется тимингликольгликозилазой.
У дрожжей её кодируют два гена: NTG1 и NTG2. У NTG1
двойная локализация – в ядре и в митохондриях, а NTG2
образует ядерную изоформу.
PMID:10207101
25
Совместно с NTG1 в дрожжевых
митохондриях
при
BERрепарации работает хеликаза
PIF1.
Совместное потеря генов NTG1,
PIF1
и
SOD
(супероксиддисмутаза) приводит
к потере мтДНК.
Это
доказывает,
что
повреждения от окислительный
стресса вносят основной вклад
в геномную нестабильность
митохондриального
генома
дрожжей.
PMID:15923634
26
Для
тимингликоль-гликозилазы
Млекопитающих
hNTHL1
данные
противоречивы:
•по одним данным она локализована в ядре и
митохондриях, по другим – только в ядре.
•удаление
тимингликоля
не
происходит
в
митохондриях из клеток мышей nth-/-, но в то же
время
другой
группой
показано
удаление
тимингликоля в экстрактах митохондрий мышей nth-/-.
27
Продукты дезаминирования
28
Удаление урацила, образованного при
дезаминировании цитозина,
осуществляет урацил-ДНК-гликозилаза
Сущестуют ядерная и митохондриальная формы урацил-ДНКгликозилазы. Они образуются с двух разных промоторов одного
гена и в результате альтернативного сплайсинга.
У дрожжей одна изоформа этого фермента, в нем есть сигналы
как ядерной, так и митохондриальной локализации.
UNG2
UNG1
PMID:9016624
29
Наиболее распространенные продукты
алкилирования: О-4-alkylT О-6-alkylG
30
Алкилированные основания удаляет
N-methylpurine-DNA-glycosylase (MPG или
AAG – от alkyladenine-DNA-glycosylase или 3methyladenine-DNA-glycosylase).
Этот фермент не обнаружен в митохондриях, но в
митохондриях репарируются повреждения, обычно служащие
субстратами этого фермента.
31
Base excision repair (BER) в митохондриях:
АР эндонуклеазы
Основная АР эндонуклеаза Млекопитающих АРЕХ1 локализована
как в ядре, так и в митохондриях. Митохондриальная форма короче
ядерной. Есть и другая АР эндонуклеаза
АРЕ2, частично
транспортируемая в митохондрии, но её каталитическая активность
низка, функции требуют дальнейшего изучения.
У дрожжей основная эндонуклеаза Apn1 на N-конце имеет
митохондриальную адресную последовательность и сигнал ядерной
локализации на C-конце. Apn1 транспортируется в митохондрии,
взаимодействуя с Pir1 – белком клеточной стенки дрожжей. Pir1
конкурирует с
ядерными белками за связывание с сигналом
ядерной организации, что позволяет части Apn1 импортироваться в
митохондрии.
32
Base excision repair (BER) в митохондриях:
застраивание бреши и лигирование
АР эндонуклеаза освобождает OH-группу на 3’-конце бреши, но
механизм дальнейшей репарации зависит того, какая группа
расположена на 5’-конце.
В
митохондриях
застраивание
бреши
осуществляет
ДНКполимераза γ, у неё есть и полимеразная и лиазная
активность, но последняя слабее, чем у DNA pol β,
осуществляющей BER в ядре.
33
В
случае,
если
АР
эндонуклеаза
и
ДНКполимераза
может
оставить
на
5’-конце
фосфат, репарация идет
по механизму short patch
BER – вставляется только
один нуклеотид.
В случае, если продукт
вырезания
устойчив
к
лиазной активности ДНКполимеразы
(например,
при
образовании
2deoxyribonolactone)
репарация
идет
по
механизму long patch BER
–
вставляется
2-6
нуклеотидов.
34
Base excision repair (BER) в митохондриях:
PMID:20950654
Считается, что в
long
patch BER в митохондриях
участвуют
FEN1
и
хеликаза DNA2.
Последняя стадия BERрепарации – лигирование.
В митохондриях человека
лигирование
проводит
DNA ligase 3 (LIG3). У
дрожжей в митохондриях
работает LIG1.
35
Регуляция BER
•ROS,
образованные
вне
митохондрии или в результате утечки
электронов из ЭТЦ повреждают
свободные dNTP и мтДНК.
•Сигнал о повреждении поступает в
цитозоль, белки системы репарации
транспортируются в митохондрию
(возможно,
за
счет
посттрансляционных модификаций).
•Передача сигнала о повреждении
мтДНК
может
дополняться
передачей сигнала о повреждении
ядерной
ДНК
для
перераспределения
факторов
репарации. Происходит изменение
локализации OGG1, UNG1 и NTH1 и
дрожжевого NTG1.
PMID:20950654
Зеленым выделены главные факторы репарации;
дополнительные факторы – желтым и
фиолетовым; ДНК связывающие белки выделены
36
серым.
Основные пути репарации в митохондриях:
•Уничтожение
окисленных
dNTPs (I)
•Short-patch
BER (II)
•Long patch
BER (III)
•Регуляция
репарационных
процессов (IVV)
Зеленым выделены главные факторы репарации; дополнительные факторы – желтым и
фиолетовым; ДНК связывающие белки выделены серым.
37
TFAM
участвует
в
репарации мтДНК. TFAM
связывается
с
поврежденной
ДНК
прочнее,
чем
с
интактной.
У
TFAM
аффинность
к
ДНК,
содержащей
8-охоG,
выше, чем у гликозилаз
OGG1 и MYH.
Клетки, устойчивые к
циспластину
(алкилирующий агент),
гиперэксперессируют
TFAM
и
TRX2
(тиоредоксин 2).
Factors from
cytoplasm
ROS
TFAM связывается с р53, который тоже
может регулировать его связывание с ДНК
в зависимости от вида повреждения.
3’-5’ экзонуклеазная активность р53 может
удалять 8-охоG на 3’-конце, эта реакция
усиливается SSB.
38
1. В митохондриях происходит репарация BER
двух типов:
• SP (short patch) BER
• LP (long patch) BER
2. Основные стадии BER:
• Гликозилаза удаляет поврежденное азотистое основание
• АР-эндонуклеаза освобождает 3’-конец бреши
• В зависимости от группы на 5’-конце бреши ДНК полимераза
ɣ застраивает брешь одним (SP BER) или несколькими (LP
BER) нуклеотидами.
• FEN1 и DNA2 участвуют в LP BER
• LIG 3 зашивает разрыв
3. Существует регуляция BER в митохондриях:
• Многие ферменты переходят в митохондрии в ответ на
сигналы о повреждениях
• В репарации BER участвуют TFAM и p53
39
MMR – mismatch repair
Удаление
несоответствий
и
небольших
петель.
Эффективность невысокая, т.к. не всегда происходит
верный выбор материнской цепи, что приводит к
мутациям.
Удаление несоответствий - некомплементарных пар G:T и
G:G показано в лизатах митохондрий млекопитающих.
Одним из основных факторов MMR в ядре служит YB-1,
предполагается, что он является ключевым компонентом
MMR и в митохондриях.
40
YB-1 в отличие от остальных
участников
ядерной MMR
(MSH1, MSH3, MSH6) частично
локализован в митохондриях.
В
митохондриальных
экстрактах
из
клеток
с
отсутствием
MSH2
наблюдается
MMR
=>
механизм
MMR
в
митохондриях отличается от
ядерного.
MMR
в
экстрактах
митохондрий снижается при
уменьшении
уровня
YB-1
(нокдаун siRNA).
PMID:19272840
41
•Вопрос о наличии MMR в митохондриях остается
открытым.
•BER тоже может репарировать несоответствия.
• Существует предположение, что MMR необходима для
удаления маленьких петель в большей степени, чем
несоответствий в парах нуклеотидах.
42
Double-strand break repair
Есть доказательства
наличия в митохондриях
обоих механизмов: NHEJ
(non-homologous end
joining) и
HR (homologous
recombination).
:
RAD51 – основной фермент
HR в ядре – локализован
также в человеческих
митохондриях
43
Rad 51 переходит в митохондрии в ответ на
окислительный стресс.
Для перехода Rad 51 необходима репликация.
PMID:23591384
44
Direct repair (без разрезания фосфодиэфирной связи)
Повреждения ДНК УФ излучением в ядре репарирует
фотолиаза,
её
активность
не
показана
в
митохондриях
Млекопитающих.
У
дрожжей
фотолиаза работает в митохондриях.
O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) –
основной
фермент
прямого
репарирования
алкилированных оснований в ядерной ДНК. Есть
данные, что MGM присутствует в митохондриях, но
может репарировать только метилированные и
этилированные основания.
45
NER – nucleotide excision repair
Считается, что этот механизм отсутствует в митохондриях.
•В митохондриях дрожжей индуцированные УФ пиримидиновые
димеры репарируются эндонуклеазой Rad2. Этот механизм
UVER (UV excision repair) одновременно похож и на BER, и на
NER.
•Белки, участвующие в ядерной NER CSA (от Cockayne
Syndrome)
и
CSB
обнаруживаются
в
митохондриях
Млекопитающих в условиях окислительного стресса. Они
связываются с мтДНК и компонентами BER.
Возможно, в митохондриях есть отличный от ядра механизм
NER, который еще будет исследован.
46
•В митохондриях происходит репарация двух
типов:
•BER – base excision repair
•MMR – mismatch repair
2. В митохондриях отсутствует NER – nucleotide
excision repair
3. Наличие репарации при двуцепочеченых
повреждениях мтДНК не изучено, но Rad 51
поступает
в
митохондрии
в
условиях
окислительного стресса и участвует в
репликации.
47
Регуляция и топология репарации в
митохондриях
•CSB (от Cockayne Syndrome)
рекрутирует факторы BER к
мембране;
•CSA and CSB взаимодействуют
с SSB и гликозилазой;
•p53 стимулирует гликозилазу и
POLγ;
•PARP-1 модулирует BER.
PARP1 – Poly (ADP-ribose) polymerase – ключевой ядерный фермент
репарации однонитевых разрывов. Такие разрывы образуются при BER,
поэтому PARP1 влияет и на BER.
PARP1 локализована в митохондрии и участвует в поддержании целостности
мтДНК. PARP1 входит в комплекс, включающий мтДНК и лигазу 3.
48
Мт ДНК связана с внутренней
мембраной. Один из белков,
связывающих ДНК с мембраной
– М19, вероятно, участвуют
также РНВ1 (prohibitin1) и ATAD3
(белок внутренней мембраны,
ответственный за перемещения
D-loop).
Большинство компонентов BER
связаны
с
внутренней
мембраной
(кроме
АРэндонуклеазы). Но стабильного
комплекса компоненты BER не
образуют. Есть данные, что CSB
вовлечен в сборку и сохранение
комплекса мтДНК и компонентов
BER: он связывает SSB и OGG1
в один комплекс с мтДНК.
49
Есть две модели:
•мтДНК мобильна и проходит через
комплексы, расположенные на внутренней
мембране, для репликации, репарации
и. т. д.
•мтДНК
заякорена
мембране.
на
внутренней
50
Регуляция репарации мтДНК
Мт изоформы многих ферментов мт репарации образуются с
помощью альтернативного сплайсинга, а, значит, возможна
посттранскрипционная регуляция.
Есть данные по NTG1 и NTG2 дрожжей. NTG1 динамично
перераспределяется между ядром и митохондриями при
окислительном стрессе. Переход NTG1 в митохондрии зависит от
окислительных повреждений, но не от уровня ROS. Значит, есть
специфичные сигналы об этих повреждениях, исходящие из
митохондрий.
Некоторые белки с двойной ядерной и митохондриальной
локализацией обнаруживаются в митохондриях только в условиях
окислительного стресса: Rad51, APEX1, CSA и CSB.
Многие белки имеют сигналы как ядерной, так и митохондриальной
локализации: NTG1, UNG1, APE1 у дрожжей и hOGG1a, hNTHL1 у
Млекопитающих. Возможно, механизм, показанный для NTG1,
является общим.
Окислительный стресс вызывает переход р53 в митохондрии.
51