Методы детекции LAMP

Петлевая изотермическая
амплификация ДНК (LAMP)
в молекулярной диагностике
Константин.А. Мирошников
Лаборатория молекулярной биоинженерии
Институт биоорганической химии
им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
Москва
Амплификация ДНК in vitro.
Полимеразная цепная реакция
Kary Mullis
Нобелевский
Лауреат 1993
Полимеразная цепная реакция.
Развитие метода и приложения.
1. Миниатюризация
реакции
2. Специализированные
ферменты
3. Детекция в реальном
времени
4. Дискретные реакции
(nested PCR, polony
PCR, digital PCR,
multiplex PCR)
5. Автоматизация
пробоподготовки,
протокола реакции и
детекции
1. Молекулярное
клонирование. Рекомбинантные продукты
генов
2. Определение
последовательности
ДНК. NextGen
sequencing
3. Молекулярная
диагностика
(патогены, мутации,
генетические
модификации)
Молекулярная диагностика
патогенов.
Применяемые/перспективные
методы
1. Культуральные
методы
2. Иммунологические
методы (ELISA)
3. ПЦР-диагностика
4. Биосенсоры
5. Масс-спектрометрия
6. Альтернативные
методы
амплификации
нуклеиновых кислот
Недостатки ПЦР
1. Точное
термоциклирование.
Дорогое оборудование
2. Чувствительность
полимераз к
загрязнениям. Сложная
пробоподготовка
3. Затрачиваемое время
(несколько часов)
4. Квалификация
персонала.
Изотермическая амплификация ДНК
- Хеликазо-зависимая амплификация (HAD, SIAC).
- Амплификация по принципу «катящегося кольца» (Rolling
circle amplification, RCA)
- Гибридизационная амплификация
- Амплификация с замещением цепи (SDA)
- Nickase (эндонуклеазно-полимеразная реакция)
- Петлевая амплификация (LAMP)
Loop-mediated Isothermal
AMPlification (LAMP)
Loop-mediated Isothermal
AMPlification (LAMP)
Молекулярные характеристики LAMP
Фермент: большая субъединица ДНК
полимеразы Bacillus stearothermophilus (Bstpolymerase) Eiken, NEB, 3M; Geobacillus spp
polymerase (Optigene)
Реакция более специфична к
последовательности матрицы (4-6 праймеров vs
2 у ПЦР)
Выход реакции в 10-100 раз (в зависимости от
метода детекции) выше, чем у ПЦР чувствительность
Время реакции 15-40 мин vs 2-3 часа ПЦР
RT стадия и LAMP в одной пробирке
Меньшая чувствительность к загрязнениям и
сторонним нуклеиновым кислотам
Аппаратурное оснащение
LAMP
• Приборы на базе термоблока (не
требуется точного
термоциклирования)
• Проведение реакции возможно в
водяной бане, градуированной
микроволновой печи и
химическом термопакете
Genie III (Optigene)
Isothermal detection(3M)
• Качественное определение
результата возможно визуально
и с помощью бытовых сканнеров
OC Sensor (Eiken)
Методы детекции LAMP
1. Визуализация продуктов реакции
электрофорез + окрашивание
бромидом этидия/нитратом серебра
2. Флуоресцентная детекция в
растворе интеркалирующими
агентами (SybrGreen, PicoGreen,YoPro-Iodide, PicoGreen) - Optigene
Методы детекции LAMP - II
1. Турбидиметрическая визуализация –
образование нерастворимого
пирофосфата
2. Турбидиметрия + флуоресценция.
Calcein/Naphtol Blue с пирофосфатом
магния – Eiken
3. BART - Турбидиметрия +
люминесценция – 3М
Методы детекции LAMP - III
1. Электрохимическое
определение продуктов
2. Реакция биотин-СТРпродуктов с Nanogoldчастицами
3. Surface Plasmon
Resonance
4. Флуоресцентно-меченые
праймеры
Разработанные диагностические
приложения
Коммерческие наборы: Escherichia coli, Listeria,
Salmonella (3М) Mycobacterium, Legionella, Vibrio
cholerae, Campylobacter (Eiken)
Экспериментальные разработки:
- более 100 вирусов человека, животных и
растений,
- более 100 видов бактерий (включая
генотипирование)
- простейшие паразиты (токсоплазма, малярийный
плазмодий, эймерия, бабезия, амеба)
- Нуклеотидный полиморфизм
- Детекция GMP-маркеров
Попытки сертификации
LAMP-диагностики
1061 пациент в Индии, Вьетнаме,Уганде и Перу
Метод
Точность
Стоимость
LAMP (Eiken)
97,8%
$10,48
Мазок
флуоресц.мик
роскопия
94,2%
$6,85
PCR (Amplicor
MTB Roche)
98,0
$12,2
Дальнейшее развитие метода
• Миниатюризация реакции (биочипы,
микрофлюидные картриджи)
• LAMP/детекция на твердой подложке
• Lateral flow наборы
• Мультиплексные приложения
• Совершенствование ферментов и
методов детекции
СПАСИБО
ЗА ВНИМАНИЕ!
[email protected]