ПЦР-диагностика в России: современное состояние и перспективы развития Лаптинов И.А.1, Болдырева М.Н.2 1 - ЗАО "НПФ ДНК-Технология" 115478 Москва, Каширское ш. д.24 корп. 2, к.222 тел. 116-4902 e-mail: [email protected] 2 - ГНЦ РФ – Институт Иммунологии МЗ РФ 115478 Москва, Каширское ш. д.24 В последние годы все больше молекулярно-биологических методов находят практическое применение в различных областях медицины, промышленности и сельского хозяйства. Один из таких методов - полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая быстро нарабатывать в пробирке определенный фрагмент ДНК до концентрации, при которой его легко детектировать. В медицине ПЦР применяют при диагностике инфекционных заболеваний, наследственных заболеваний, различных видах генотипирования, определении отцовства и т.д. Санитарно-эпидемиологические службы используют ПЦР для контроля за микробиологическим загрязнением окружающей среды и продуктов питания, а также для выявления генетически модифицированных источников пищи (ГМИ). Наиболее важные параметры любых методов, используемых в диагностических лабораториях можно сформулировать следующим образом: надежность (в том числе чувствительность и специфичность), простота выполнения, время анализа и цена. Переход любого метода из научно-исследовательской лаборатории в лабораторию диагностическую сопряжен с рядом возникающих на этом пути проблем. Несмотря на высокую технологичность ПЦР и относительную простоту выполнения анализа, можно назвать ряд моментов, требующих специальной адаптации для практического использования метода в медицинской диагностике. Во первых, уровень специальной подготовки сотрудников диагностической лаборатории принципиально отличается от подготовки сотрудников научно-исследовательского института. Поэтому выполнение всех процедур должно быть максимально стандартизовано и упрощено, а трактовка результатов должна быть однозначной и по возможности не требовать субъективной оценки лаборантом. Во вторых, в отличие от НИИ, где олигонуклеотидные затравки (праймеры) для ПЦР чаще всего используют один или небольшое число раз для получения результатов в конкретном эксперименте, при проведении ПЦР-диагностики относительно небольшой набор ПЦР-тест-систем используют постоянно на протяжении многих лет. Такая работа с чрезвычайно чувствительной методикой, какой является ПЦР, при использовании методов детекции, требующих извлечения амплифицированного материала из пробирки, неизбежно ведет к загрязнению лаборатории продуктами реакции и, как следствие, получению ложных результатов исследования. Поэтому правильная организация диагностической ПЦР-лаборатории имеет принципиальное значение для получения достоверных результатов при проведении тестирования. В этой связи можно сформулировать основные направления развития ПЦР-диагностики в ближайшем будущем: а) повышение общей надежности метода; б) дальнейшее упрощение процедуры анализа; в) сокращение времени исследования; г) широкое внедрение количественной ПЦР. В свою очередь, эти тенденции будут реализованы за счет использования флуоресцентных методов детекции продуктов амплификации, автоматизации и применения компьютерных методов регистрации и трактовки результатов исследования. Уже сейчас техника выполнения процедур при проведении ПЦР-диагностики довольно проста. Весь анализ можно подразделить на три этапа: пробоподготовка (очистка ДНК или РНК исследуемого объекта от примесей), амплификация определенного фрагмента ДНК и регистрация результатов амплификации. Пробоподготовка: в настоящее время на отечественном рынке представлено большое разнообразие наборов реактивов для пробоподготовки (очистки нуклеиновых кислот). Поскольку ПЦР не требует высокой степени очистки ДНК, существуют методики, состоящие всего из одного-двух шагов, но достаточно хорошо удаляющие из раствора компоненты, снижающие эффективность ПЦР (ингибиторы). В среднем, упрощенный вариант пробоподготовки занимает 30 минут на обработку 20-30 образцов. Дальнейшее развитие методик пробоподготовки можно прогнозировать в направлении повышения эффективности удаления ингибиторов и удобства автоматизации процесса. Некоторые образцы биоматериала содержат агенты, существенно снижающие эффективность реакции. При проведении количественного ПЦР-анализа такое отличие в эффективности амплификации может внести существенную ошибку, поэтому с распространением количественного анализа требования к чистоте получаемой ДНК повышаются. Амплификация: поскольку амплификационная часть большинства диагностических ПЦР-тест-систем предлагается пользователю в виде предварительно смешанных и разнесенных по реакционным пробиркам реактивов (как правило это запечатанный парафином на дне пробирки раствор или сухая (лиофилизированная) смесь компонентов реакции), подготовка реакций на этапе амплификации состоит из добавления в пробирку очищенной ДНК и полимеразы (или только ДНК, если полимераза уже присутствует в смеси). Сколько-нибудь заметное упрощение или ускорение этого этапа практически невозможно. Стоит отметить только существующую тенденцию к переходу от использования отдельных реакционных пробирок к стандартным форматам скрепленных пробирок (8 или 12-луночные стрипы и 96 или 384-луночные планшеты). При этом возможность использования многоканальных пипеток и дозаторов ускоряет процедуру приготовления реакционной смеси. Крупные диагностические центры, при использовании планшетных форматов, могут использовать роботизированные дозирующие станции, снижающие вероятность ошибки лаборанта. Регистрация результатов амплификации: достоверность исследования в значительной мере связана со способом детекции и интерпретации результатов ПЦР. В настоящее время можно выделить четыре системы детекции результатов ПЦР, наиболее часто применяемых в диагностических лабораториях: гель-электрофорез, гибридизационноферментный анализ (ГиФА), флуоресцентная детекция результатов после ПЦР (FLASH) и флуоресцентная детекция во время ПЦР (Real-Time PCR). Последние два метода отличаются тем, что продукт амплификации для определения не извлекается из пробирки, а регистрация результатов (измерение флуоресценции) идет в закрытой пробирке через прозрачный пластик. Одной из основных проблем, возникающих в ходе проведения ПЦР-диагностики является загрязнение (контаминация) ампликонами, накапливающимися в лаборатории при проведении электрофореза в агарозном геле или гибридизации в планшетах. Исключение стадии электрофореза за счет применения систем регистрации результатов в закрытой пробирке позволяет полностью решить проблему контаминации ампликонами. Очевидно, что методики FLASH и Real-Time PCR обладают целым рядом преимуществ в сравнении с электрофоретическими методами анализа и ГиФА и будут стремительно занимать все большее место на рынке диагностических услуг (см. таблицу 1). Таблица 1. Сравнение методов детекции результатов ПЦР. Электрофорез ГиФА Система Система «FLASH» и детекции флуориметр результатов «Джин» ПЦР в режиме реального времени (Real Time PCR) 60 мин 3 мин 0 мин Приблизительное 40 мин время детекции для 30 образцов Высокая Высокая Отсутствует* Отсутствует* Контаминация продуктами ПЦР Вручную Автоматическое Автоматическое Автоматическое Фиксирование данных Возможность Повышение Повышение Возможность Особенности увидеть достоверности достоверности оценки результат ПЦР исследования за исследования за исходного в виде счет счет количества полоски на специфичности специфичности копий ДНК в геле, оценить пробы к пробы к образце количество и целевому целевому качество амплификату амплификату амплификата по нескольким параметрам *-если соблюдаются все рекомендации разработчика по работе с наборами. Применение системы детекции результатов ПЦР в режиме «реального времени», наряду с ответом на вопрос о наличии или отсутствии патогена, позволяет оценить его количество в исследуемом образце, что в ряде случаев позволяет уточнить диагноз и выбрать более адекватный метод лечения. Для оценки ПЦР в режиме «реального времени» реакцию проводят в специальном детектирующем амплификаторе со встроенной системой регистрации флуоресценции внутри реакционных пробирок непосредственно во время протекания реакции. Повышение надежности тест-систем за счет использования внутреннего контрольного образца: для повышения надежности результатов исследования и их однозначной трактовки, в лабораторной диагностике, так же, как и в научных экспериментах, используют ряд контрольных экспериментов (реакций). Помимо стандартных положительной и отрицательной контрольных реакций, в ПЦР-диагностике используют внутренний контрольный образец (ВКО). Использование ВКО основано на возможности проведения в одной реакционной пробирке нескольких практически независимых реакций амплификации для разных фрагментов ДНК. В частности, для контроля за эффективностью ПЦР можно использовать одновременное протекание двух реакций амплификации в одной пробирке. В одной из таких реакций происходит накопление целевого фрагмента ДНК (участок генома инфекционного агента, трансгенного растения и т.д.), а в другой амплифицируется специально добавленная в реакцию ДНК (обычно это фрагмент плазмидной ДНК). С помощью ВКО, добавляемого в образец перед этапом пробоподготовки (очистки ДНК от примесей), можно проконтролировать эффективность всех этапов анализа. Повышение надежности документирования, интерпретации и хранения результатов анализа: использование электрофореза для детекции результатов ПЦР, как правило, связано с визуальным анализом полученных данных и фиксированием результатов в лабораторном журнале вручную, что может вызывать целый ряд ошибок при документировании и интерпретации результатов исследования. Современные компьютерные программы в комбинации с применением гибридизационных олигонуклеотидных зондов для проявки результатов ПЦР (методы FLASH или Real-Time PCR) позволяют практически полностью исключить неверную трактовку результатов. Автоматизированная система фиксирования данных с детектирующего амплификатора или специализированного флуориметра в памяти персонального компьютера позволяет вести эффективную документацию и хранение информации с возможностью выведения отчета о проведенном анализе на принтер. Обучение лаборантов, повышение квалификации врачей: одним из направлений, требующих существенного развития, остается система обучения сотрудников диагностических ПЦР-лабораторий основам метода ПЦР, возможным ошибкам, выявлению ложноположительных и ложноотрицательных результатов исследования. Незнание лаборантами основ нового метода приводит зачастую к грубейшим ошибкам и неправильной трактовке результатов исследования. Не менее, а возможно и более важной задачей является повышение уровня подготовки врачей, использующих результаты ПЦР для постановки диагноза и выбора курса лечения. Возможность быстрого и чрезвычайно точного обнаружения широкого спектра инфекционных методом ПЦР является мощнейшим инструментом, неумелое использование которого может более навредить пациенту, чем помочь. Исключительная чувствительность ПЦР позволяет обнаружить в исследуемом образце единичные копии ДНК, и далеко не всегда присутствие условно-патогенных микроорганизмов должно трактоваться врачом как причина наблюдаемого заболевания. Повышение подготовки лечащих врачей в области трактовки результатов ПЦР-исследования позволит правильно поставить диагноз и выбрать оптимальный курс лечения. Подводя итог можно сказать, что на данный момент в России лабораторная ПЦРдиагностика проходит этап бурного развития. Соответствующим оборудованием оснащают санитарно-эпидемиологическую службу, станции переливания крови, инфекционные больницы, КВД и т.д. Сотрудники этих учреждений проходят обучение в специализированных государственных центрах (таких, как Российская медицинская академия последипломного образования МЗ СР РФ, ГУ НИИ питания РАМН). На отечественном рынке представлено большое количество официально зарегистрированных тест-систем для широкого спектра инфекционных агентов и задач генотипирования, причем как с детекцией методом гель-электрофореза, так и с флуоресцентной детекцией. Существует современное оборудование российского производства для оснащения ПЦРлабораторий, включая оборудование для количественной оценки нуклеиновых кислот с использованием детектирующих амплификаторов. Можно надеяться, что в ближайшем будущем лабораторная ПЦР-диагностика займет в нашей стране столь же существенное место в системе здравоохранения, какое этот метод уже занимает в большинстве ведущих стран мира. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. N.J.Walker. A Technique Whose Time Has Come. SCIENCE VOL 296 19 APRIL 2002 2. Bustin SA. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol. 2000 Oct;25(2):169-93. Review. 3. Schmittgen TD. Real-time quantitative PCR. Methods. 2001 Dec;25(4):383-5. 4. Giulietti A, Overbergh L, Valckx D, Decallonne B, Bouillon R, Mathieu C. An overview of real-time quantitative PCR: applications to quantify cytokine gene expression. Methods. 2001 Dec;25(4):386-401. Review. 5. Lay M.J. Wittwer C.T., Real-time fluorescence genotyping of factor V Leiden during rapid-cycle PCR//Clin Chem. 1997 Dec;43(12):2262-7. 6. Charalampos Aslanidis, Markus Nauck1 and Gerd Schmitz High-Speed Prothrombin GA 20210 and Methylenetetrahydrofolate Reductase C-T 677 Mutation Detection Using RealTime Fluorescence PCR and Melting Curves//BioTechniques 27: 234-238 (August 1999) 7. Feinberg M, Fernandez S, Cassard S, Bertheau Y. Quantitation of 35S promoter in maize DNA extracts from genetically modified organisms using real-time polymerase chain reaction, part 2: interlaboratory study. J AOAC Int. 2005 Mar-Apr;88(2):558-73.