ν E = h λ E = h c /

Реклама
Электромагнитные колебания
Длина волны
λ
E
E=hν
H
E=hc/λ
H
E
Направление
распространения
Длина волны в Å
1
10
Рентгеновское
излучение
102
103
104
УФ- и видимое
излучение
105
Инфракрасное
излучение
106
107
Микроволновое Радиоволны
излучение
Уменьшение энергии падающего излучения
Электронные переходы
Абсорбционная спектроскопия в
видимой и УФ-области спелтра
Колебательные и вращательные
Инфракрасная
спектроскопия и рассеяние
Мандельштама-Рамана
Ядерные
ЯМР
1
Электронные и колебательные переходы в атоме или молекуле
Энергия
S1
S0
hc

E2  E1
УФ-излучение
ИФ-излучение
r v e
К о н ф о р м а ци о н н а я к о о р дин а та
Диаграмма типичных уровней энергии, показывающая основное
состояние (So) и первое возбужденное состояние (S1) в атоме или молекуле.
Колебательные
уровни основного состояния показаны тонкими
горизонтальными линиями.
r, v, и e - соответственно вращательные, колебательные и электронные
переходы
2
Закон Бера-Ламберта
Величина поглощения при данной длине волны характеризуется молярным
коэффициентом экстинкции. Если свет интенсивности I0 проходит через раствор
толщины d и молярной концентрации C, то интенсивность I прошедшего света
подчиняется закону Бера-Ламберта :
 dC
0
I  I 10
или
log( I o / I f )  C ( )d  A( )
OП = 2
где ε- молярный коэффициент экстинкции.
If – интенсивность света, пропущенного
образцом. Поглощение измеряется в %
(100 I/I0), но чаще всего в поглощении A,
(log I/I0).
Когда d = 1 cm, A называется оптической
плотностью ОП, где  есть длина волны ,
при которой производятся измерения.
Оптическая плотность равна ε× C
3
В ол ь ф ра м ова я л ам па
К ач а ю щ а яс я во гн у та я
д иф р ак ци он на я ре ш етк а
Д ей те ри ева я л ам па
К ач а ю щ е ес я в о гн у то е
с ф е ри ч ес к ое з ер ка л о
Ра с щ еп ите ль п у ч ка
Д ете кт ор с р ав нен ия
О бр аз ец
Д ете кт ор
Оптический путь в однолучевом спектрофотометре. Лампа накаливания для
видимой области и дейтериевая лампа для УФ-области служат источниками
излучения. Поворачивающаяся вогнутая голографическая дифракционная решетка
геометрически разлагает луч на спектральные компоненты. Затем весь диапазон
длин волн измеряется одновременно диодной линейкой (линейным детектором).
Часть луча с помощью светового делителя отводится на контрольный детектор для4
эталонных измерений
Применение абсорбционной спектроскопии для измерения концентрации белков и
нуклеиновых кислот
280 нм
λ=280 nm
Поглощение ближнего ультрафиолета
для ароматических аминокислот в
водных растворах при pH 6. Отметьте,
по оси ординат молярное поглощение
отложено в логарифмической шкале.
λ=258 nm
258 нм
Поглощение ближнего ультрафиолета для
пуриновых и пиримидиновых оснований
в водных растворах при pH 7. Отметьте,
по оси ординат молярное поглощение
отложено линейной шкале.
Примеры, оптическое поглощение для tRNA ОП258 = 1 соответствует концентрации 44 g/ml;
оптическое поглощение для рибосом ОП258 = 1 соответствует концентрации 66 g/ml. 5
Применение абсорбционной спектроскопии для определения концентрации
белков.
0.6
S6
0.4
S13
0.18
0.3
0.38
Absorbance
0.5
Пример белка в растворе,
не образующего истинного
молекулярный раствор
Absorbance
Пример белка в растворе,
образующего истинный
молекулярный раствор
0.7
0.2
0.1
0.0
24 0
26 0
28 0
30 0
32 0
Wavelength (nm)
34 0
36 0
24 0
26 0
28 0
30 0
32 0
34 0
36 0
Wavelength (nm)
6
Применение абсорбционной спектроскопии для определения
конформационных переходов в ДНК.
Оптическая плотность трех образцов ДНК
как функция температуры: E. Coli (50% GC)
при ионной силе 0.01 и 0.1. Pseudomonas
aeroginosa DNA (68% GC). Отметьте, что
температура перехода (денатурации) зависит
как от ионной силы, так и от содержания ГЦ
пар.
Кривая плавления раствора ДНК фага Т7. При
прогревании раствора ДНК до температуры
денатурации с последующем охлаждением
кривая обратима. При прогревании раствора
ДНК выше температуры денатурации кривая
необратима. Поглощение раствора падает до
величины 1.12 и ДНК выпадает в осадок.7
Скачать