Проект «Изучение закономерностей взаимодействий

Федеральная целевая программа «Научные и научно-педагогические
кадры инновационной России» на 2009 - 2013 годы
Проект «Изучение закономерностей взаимодействий
низкомолекулярных органических соединений и специфических
антител с использованием флуоресцентных маркеров и разработка
новых методов индивидуального и класс-специфического
определения антибиотиков, пестицидов и микотоксинов»
Государственный контракт N 16.740.11.0158 от 2 сентября 2010 г.
Организация – исполнитель – Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН
Руководитель работ – д.х.н., проф. С.А. Еремин
Методы:
 Поляризационный флуороиммуноанализ
 Мембранный иммуноанализ с флуоресцентной
детекцией
Маркеры:
 Низкомолекулярные флуорофоры
(производные флуоресцеина)
 Коллоидные флуоресцентные наночастицы
(квантовые точки)
Объекты:
 Пестициды
 Микотоксины
 Антибиотики
ПРИНЦИП ПОЛЯРИЗАЦИОННОГО
ФЛУОРОИММУНОАНАЛИЗА
Sensors
F
F
Ag
F-Ag
Быстрое вращение
Низкая поляризация
Ab
Ag
F-Ag:Ab
Медленное вращение
Высокая поляризация
F – флуоресцентная метка
Ag – антиген
Ab – антитело
F-Ag – трейсер = меченное флуоресцентной меткой
производное определяемого вещества
РАЗРАБОТКА И ОПТИМИЗАЦИЯ ПФИА
Разработка и оптимизация флуоресцентного иммуноанализа должна включать в
себя ряд последовательных процедур:
 определение аффинности (константы связывания) антител;
Ag + Ab
k1
k-1
AgAb
k1
[ AgAb]
K
k 1
[ Ag ][ Ab]
 подбор оптимального трейсера;
 подбор оптимальной длины и структуры спейсерного мостика;
 подбор оптимального состава среды проведения анализа
а) материал иммунохимического планшета;
б) природа и концентрация детергента.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПФИА ГЕРБИЦИДОВ
Градуировочные кривые ПФИА
метсульфурон-метила
и хлорсульфурона
Аналитические параметры ПФИА
метсульфурон-метила
и хлорсульфурона
Параметр
ПФИА МСМ
ПФИА ХС
5,4±2,3
9,89±3,35
123,3±7,8
93,1±7,6
30-1000
15-500
0,91±0,03
0,76±0,06
RSD intra, %
0,9
4,6
RSD inter, %
7,1
12,8
Предел обнаружения,
мкг/мл
IC50, мкг/мл
Линейный диапазон,
мкг/мл
Наклон
СПЕЦИФИЧНОСТЬ ПФИА АНТИБИОТИКОВ
Коэффициенты перекрестного реагирования
Анализируемый
Перекрестнореагирующее соединение
антибиотик
Хлорамфеникол
Название
CR, %
Тиамфеникол
<0.1
Пенициллин G
1
Метициллин
7
Амоксициллин
15
Метампициллин
40
Азлоциллин
30
Бакампициллин
20
Дигидрострептомицин
75
Ампициллин
Стрептомицин
Применение квантовых точек
как маркеров в иммунохроматографии
Коллоидное
золото
Квантовые
точки
0,5
140
100
0,3
80
Поглощение
60
0,2
40
0,1
20
0,0
300
400
500
600
, нм
 Invitrogen
 ядро – CdSe, оболочка - ZnS
 водорастворимые
с полимерным покрытием
 пик эмиссии при 625 нм
 свободные СООН – группы
 диаметр около 10 нм
0
700
Флуоресценция, отн. ед
120
0,4
Поглощение
Свойства:
 поглощение в широком
диапазоне длин волн
 поглощение, зависящее от размера
 высокий квантовый выход
 фото- и химическая стабильность
Флуоресценция
Иммунохроматографический анализ хлорамфеникола
с использованием квантовых точек
Контрольная
зона
Тестовая
зона
Визуальная детекция
Флуоресцентный
ридер
Аналитические характеристики тест-системы
Предел обнаружения
0,03 нг/мл*
Диапазон определяемых содержаний
0,04-3 нг/мл
Предел обнаружения при визуальной детекции
1 нг/мл
Время анализа
20 минут
* ПДК хлорамфеникола в молоке (СанПиН 2.3.2 1078-01) составляет 0,3 нг/мл
Berlina A.N. et al. (2013). Analytical & Bioanalytical Chemistry. 405 (14): 4997-5000
Предложена высокопроизводительная мультипараметрическая
тест-система для одновременного контроля определения 3-х
пороговых уровней ХФ с целью контроля степени превышения
нормативов пищевой безопасности.
Принцип многозонной тест-системы заключается в
расположении на мембране 3-х тестовых зон, в которых
сорбировано различное количество конъюгата ХФ-Белок.
С увеличением концентрации ХФ в пробе
происходит исчезновение одной или
нескольких тестовых зон:
 при С(ХФ)= 0 нг/мл наблюдается 3 полосы;
 при С(ХФ)= 1 нг/мл наблюдается 2 полосы;
 при С(ХФ)= 10 нг/мл наблюдается 1
полосы;
СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!