Соглашение о предоставлении субсидии

Министерство образования и науки Российской Федерации
ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям
развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы»
Мероприятие 1.3, приоритетное направление «Науки о жизни»
Соглашение о предоставлении субсидии № 14.579.21.0022
от 5 июня 2014 г.
«Разработка конъюгированных вакцин на основе
синтетических углеводных лигандов против возбудителей
госпитальных инфекций»
Симбирцев Андрей Семенович, руководитель проекта, профессор, д.м.н.
Получатель субсидии - Федеральное государственное унитарное предприятие
«Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов»
Федерального медико-биологического агентства (ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России)
Индустриальный партнер - Закрытое акционерное общество «Р-Фарм» (ЗАО «Р-Фарм»)
Организация-соисполнитель - Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Институт органической химии им. Н.Д.Зелинского Российской академии наук (ИОХ РАН)
Общий объем финансирования работ
•
•
•
•
Объем средств субсидии:
всего – 43 500 000 рублей, в том числе:
в 2014 году – 15 000 000 рублей;
в 2015 году – 13 500 000 рублей;
в 2016 году – 15 000 000 рублей.
•
•
•
•
Объем привлекаемых внебюджетных средств
Всего – 45 000 000 рублей, в том числе:
в 2014 году – 15 000 000 рублей;
в 2015 году – 15 000 000 рублей;
в 2016 году – 15 000 000 рублей.
Цель проекта
Разработка конъюгированных вакцинных препаратов на основе рекомбинантного
белка-носителя CRM197 и синтетических спейсерированных углеводных лигандов,
структурно родственных альгинату бактерии Pseudomonas aeruginosa и общему
полисахаридному антигену клеточной стенки патогенных грибов – прототипов
вакцин для лечения госпитальных бактериальных и грибковых инфекций.
Планируемые результаты проекта
•
Методики синтеза β-(1→4)-олигоманнуронозидов и β-(1→3)-олигоглюкозидов,
включающих 3, 5, 7 и 9, 11 и 13 моносахаридных звеньев.
•
Методика очистки рекомбинантного белка CRM197.
•
Методика конъюгирования белка-носителя CRM197 с синтетическими
олигосахаридными лигандами.
•
Лабораторный регламент получения конъюгированных вакцин на основе
синтетических олигосахаридных лигандов и белка-носителя CRM197.
•
Экспериментальные образцы конъюгированной вакцины против P. aeruginosa на
основе белка-носителя CRM197 и синтетических олигосахаридных лигандов
различной длины – фрагментов бактериального альгината.
•
Экспериментальные образцы конъюгированной вакцины против грибов Candida и
Aspergillus на основе белка-носителя CRM197 и синтетических олигосахаридных
лигандов - фрагментов поверхностных углеводных антигенов патогенных грибов.
Области применения,
способы использования результатов
•
•
Результаты проекта предполагается использовать для доклинического
исследования вакцинных препаратов и разработки технологии
производства конъюгированных вакцин. По результатам
доклинических исследований будут отобраны кандидаты
конъюгированных вакцин для последующих клинических
исследований.
Разрабатываемые конъюгированные вакцинные препараты могут быть
использованы для организации производства и медицинского
применения на территории Российской Федерации. За счет снижения
стоимости препарата в сравнении с зарубежными аналогами
ожидается улучшение лекарственного обеспечения, повышение
качества оказания медицинской помощи и улучшение результатов
лечения больных бактериальными и грибковыми госпитальными
инфекционными заболеваниями, а также повышение качества их
жизни.
Задачи проекта
• Оптимизация процесса культивирования штамма-продуцента
белка CRM197 и разработка технологии очистки
рекомбинантного белка CRM197.
• Разработка метода синтеза олигоглюкозидных и
олигоманнуронозидных лигандов.
• Получение компонентов конъюгированных вакцин (белка
CRM197 и олигосахаридных лигандов).
• Разработка метода конъюгирования CRM197 с синтетическими
олигосахаридными лигандами.
• Наработка экспериментальных образцов конъюгированных
вакцин против P.aeruginosa и грибов Candida и Aspergillus.
• Проведение иммунологических исследований
конъюгированных вакцин in vitro и in vivo.
Текущие результаты проекта
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Разработаны методы очистки рекомбинантного CRM197 из клеток штамма-продуцента E.coli BL21 и
рефолдинга белка путем последовательного применения ионообменной, гидрофобной и молекулярноситовой хроматографии.
Разработан метод синтеза спейсерированных -(1→3)-олигоглюкозидов различной длины,
включающих 9, 11 и 13 моносахаридных звеньев.
Разработан метод синтеза спейсерированных -(1→4)-олигоманнуронозидов различной длины,
включающих 3, 5 и 7 моносахаридных звеньев.
Разработан метод определения подлинности рекомбинантного белка CRM197 с помощью косвенного
неконкурентного метода иммунофермнтного анализа. Проведены работы по организации
экспериментального производства и контроля качества конъюгированных вакцин на базе ЗАО «РФарм».
Получен рекомбинантный белок CRM197 и изучены его физико-химические свойств.
Выполнен синтез и характеристика олигосахаридных лигандов для получения конъюгатов с белкомносителем CRM197.
Разработан метод синтеза покрывающих антигенов для оценки эффективности и специфичности
иммунного ответа с использованием иммуноферментного анализа.
Подана заявка на изобретение № 2015135165 от 19.08.2015 г. «Метод избирательного удаления Оацетильных защитных групп в присутствии О-бензоильных». ФГУП "Гос.НИИ ОЧБ" ФМБА России
Д.В. Яшунский, Ю.Е. Цветков, Н.Э. Нифантьев. Synthesis of 3-aminopropyl glycosides of linear β(1→3)-D-glucooligosac-charides // Carbohydrate Research, октябрь 2015г.
Е.Г. Богомолова, О.А. Добровольская, А.А. Мировская, Р.И. Аль-Шехадат, Е.А.Федорова, И.В.
Духовлинов, А.С. Симбирцев. Разработка кандидатной субстанции рекомбинантного белка
CRM197. Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2015 г., в печати.
Участие в конференции «Аллергология и клиническая иммунология», Россия, Ялта, 27.09-3.10.2015 г.,
Министерство здравооохранения РФ; Российское научное общество иммунологов и др.
Разработка метода очистки рекомбинантного белка CRM197
Разработана технология очистки рекомбинантного белка CRM197 из клеток штамма-продуцента
E.coli BL21.
Процесс выделения и очистки рекомбинантного CRM197 включает несколько стадий:
- получение телец включения, содержащих целевой белок, путем разрушения клеток штаммапродуцента;
- хроматографическая очистка рекомбинантного белка с помощью ионообменной, гидрофобной
и молекулярно-ситовой хроматографии;
- количественный и качественный анализ белка.
100 кДа
70 кДа
55 кДа
CRM197
35 кДа
25 кДа
15 кДа
10 кДа
Электрофореграмма результатов индукции
экпрессии гена CRM197 с использованием 0,5
мМ ИПТГ, а также очистки белка CRM197,
12,5% ПААГ, 0,1% ДДС-Na
Калибровочный график для расчета
концентрации белка CRM197
Оптическая плотность пробы белка CRM197
составила 0,53 оптических единиц. Таким
образом, концентрация полученного белка в
препарате –1,35 мг/мл.
Разработка метода рефолдинга белка CRM197 в процессе очистки
При разработке метода исследованы два способа рефолдинга белка CRM197.
Способ рефолдинга белка CRM197 из солюбилизованных телец включения методом
разведения в буфере для рефолдинга и последующим применением молекулярно-ситовой
хроматографии.
Применение молекулярно-ситовой хроматографии непосредственно после очистки.
Количественное определение белка CRM197 с помощью метода Бредфорд
Калибровочный график для расчета
концентрации белка CRM197
Контроль фолдинга белка CRM197 с помощью ВЭЖХ
Хроматограмма анализа белка CRM197
с помощью ОФ ВЭЖХ
Разработка метода синтеза спейсерированных -(1→3)-олигоглюкозидов
различной длины, включающих 9, 11 и 13 моносахаридных звеньев
Схема удлинения олигосахаридной цепи в
рамках разработанного на этапе 1 общего
метода синтеза -(13)-глюкоолигосахаридов
различной длины
Синтез защищенных -(13)глюкоолигосахаридов, содержащих
9, 11 и 13 моносахаридных остатков
Получение свободных 3-аминопропилгликозидов -(13)-глюкоолигосахаридов,
содержащих 9, 11 и 13 моносахаридных остатков
• Разработан метода синтеза спейсерированных -(1→3)-олигоглюкозидов различной
длины, включающих 9, 11 и 13 моносахаридных звеньев.
• С использованием этого метода синтезированы -(13)-олигоглюкозиды,
содержащие 9, 11 и 13 моносахаридных звеньев.
• Строение полученных продуктов доказано методами спектроскопии ЯМР на ядрах
1Н и 13С и масс-спектрометрии высокого разрешения.
• Синтезированные олигоглюкозиды строго соответствуют по своей структуре
фрагментам грибкового -(13)-глюкана, а их чистота по данным 1Н ЯМР
составляет не менее 97%.
Разработка метода синтеза спейсерированных -(1→4)олигоманнуронозидов различной длины, включающих 3, 5 и 7
моносахаридных звеньев
Ретросинтетический анализ 3аминопропилгликозидов -(1→4)олигоманнуронозидов, содержащих 3, 5 и 7
моносахаридных остатков
Синтез моносахаридного
предшественника 21
Синтез спейсерированногогликозилакцептора 16
Синтез дисахаридного донора 15
Сборка целевых спейсерированных (1→4)-олигоманнуронозидов, содержащих 3,
5 и 7 моносахаридных звеньев
Разработан метод синтеза спейсерированных -(1→4)-олигоманнуронозидов различной
длины, включающих 3, 5 и 7 моносахаридных звеньев
С использованием этого метода синтезированы спейсерированные -(1→4)олигоманнуронозидов различной длины, включающих 3, 5 и 7 моносахаридных звеньев
Строение полученных продуктов доказано методами спектроскопии ЯМР на ядрах 1Н
и 13С и масс-спектрометрии высокого разрешения.
Синтезированные олигоглюкозиды строго соответствуют по своей структуре фрагментам
грибкового -(13)-глюкана , а их чистота по данным 1Н ЯМР составляет не менее 97%.
Разработка метода определения подлинности рекомбинантного белка
CRM197 с помощью ИФА
•
Разработана методика определения подлинности белка CRM197 с
использованием иммунохимического метода – иммуноферментного анализа
(ИФА).
•
Проанализированы три стандартных метода иммуноферментного
анализа:
- косвенный неконкурентный метод ИФА;
- прямой неконкурентный метод ИФА;
«сэндвич» метод ИФА.
подтверждена подлинность рекомбинантного белка CRM197,
полученного с использованием штамма-продуцента E.coli BL21 (DE3).
Наиболее эффективным признан косвенный неконкурентный метод
ИФА, позволяющий исключить этапы, связанные с конъюгацией
специфических антител с ферментативной меткой (пероксидазой хрена),
что существенно сокращает время проведения анализа и делает его
наименее трудоемким.
Получение рекомбинантного белка CRM197 и изучение его физикохимических свойств
Получен высокоочищенный рекомбинантный белок CRM197 с чистотой 98%.
Электрофореграмма результатов очистки
рекомбинантого белка CRM197
1 – маркер PageRulerPrestained Protein Ladder
(Fermentas);
2 – лизат клеток штамма-продуцента
E.сoliBL21(DE3) до индукции;
3- лизат клеток штамма-продуцента E.сoliBL21(DE3)
после индукции 0,2% лактозой
4 –фракции, рекомбинаный белокCRM197,
полученные после проведения ионообменной
хроматографии
5 – очищенный рекомбинантный белокCRM197,
полученны йпослепроведения гидрофобной
хроматографии.
Синтез и характеристика олигосахаридных лигандов для
получения конъюгатов с белком-носителем CRM197
Наработаны защищенные предшественники спейсерированных-(13)олигоглюкозидов, содержащих 5, 7, 9 и 11 моносахаридных остатков и защищенные
предшественники спейсерированных -(1→4)-олигоманнуронозидов, содержащих 3 и
5 моносахаридных звеньев.
Разработка метода синтеза покрывающих антигенов для оценки
эффективности и специфичности иммунного ответа с использованием
иммуноферментного анализа
Разработаны методики синтеза покрывающих антигенов с использованием в
качестве модельного олигосахаридного лигандаспейсерированного -(13)нонаглюкозида.
Разработаны методики получения двух типов покрывающих антигенов –
конъюгатов олигосахаридного лиганда с бычьим сывороточным альбумином и
биотином.
Способы поддержки проекта
Индустриальным партнером
Индустриальный партнер - ЗАО «Р-Фарм»
Объем фактически привлеченных внебюджетных средств по этапу 2-3
(2015 год) - 15 000 000 рублей
За счет указанных средств Индустриальным партнером были проведены
следующие работы Плана-графика:
- Разработка метода определения подлинности рекомбинантного белка
CRM197 с помощью ИФА.
- Контроль качества рекомбинантного белка CRM197: чистоты (содержание
белка и ДНК штамма-продуцента, бактериальных эндотоксинов), аномальной
токсичности.
- Контроль качества полученных олигосахаридных лигандов.
- Организация экспериментального производства и контроля качества
конъюгированных вакцин (этап 2, этап 3).