Цитокинодиагностика: прошлое, настоящее и будущее Тотолян Арег Артемович Национальные дни

Цитокинодиагностика: прошлое,
настоящее и будущее
Тотолян Арег Артемович
Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и
микробиологии имени Пастера
Национальные дни
лабораторной медицины России-2011
Москва, 5 октября 2011 года
Цитокины – регуляторные белки,
секретируемые лейкоцитами крови и другими
клетками организма человека, плейотропные
эффекты которых включают регуляцию клеток
иммунной системы и модуляцию
воспалительной реакции
ЦИТОКИНЫ
• Интерлейкины
• Факторы некроза
опухолей
• Интерфероны
• Колониестимулирующие
факторы
• Факторы роста
негемопоэтических
клеток
• Хемокины
• Конститутивные
• Индуцибельные
– провоспалительные
– противовоспалительные
Основные характеристики действия цитокинов
Характеристика
Плейотропность
Комментарии
Большинство цитокинов имеют много клеток-мишеней
Избыточность эффектов Один цитокин имеет множество биологических
эффектов
Синергизм/Антагонизм
Одновременное влияние на клетки двух или
нескольких цитокинов может привести к качественно
различным эффектам
Цитокиновый каскад
Цитокины могут повысить (или снизить) продукцию
других цитокинов
Модуляция рецепторов
Цитокины могут повысить (или снизить) экспрессию
рецепторов для других цитокинов
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СИСТЕМЫ ЦИТОКИНОВ
Цитокины
СИНТЕЗ
• молекулярно-биологические
– мРНК
– планарные микрочипы
• иммунохимические
– проточная цитометрия
• внутриклеточное содержание
– иммуноцитохимический
ПРОДУКЦИЯ
• иммунохимические
– ИФА
– проточная цитометрия
• концентрация (мультиплексный анализ)
БИОЛОГИЧЕСКАЯ
АКТИВНОСТЬ
• биологические
– хемотаксис
– пролиферация
– дегрануляция и т.д.
Рецепторы цитокинов
СИНТЕЗ
• молекулярно-биологические
– мРНК
– планарные микрочипы
ЭКСПРЕССИЯ
• иммунохимические
– проточная цитометрия
Клеточные линии для оценки биологической активности цитокинов
Цитокины
Клеточные
линии
Способ оценки активности
Другие цитокины,
активные в данном тесте
ИЛ-1
Перв.культ.
Пролиферация
ИЛ-2, ИЛ-6; ИЛ-4, ФНО
D10S
Пролиферация
ИЛ-2
ИЛ-2
CTLL-2
Пролиферация
ИЛ-15, ТФР
ИЛ-3
TF-1
Пролиферация
ИЛ-4,5,9,13, ГМ-КСФ
ИЛ-4
CTLL-2
Пролиферация
ИЛ-15, ТФР
ИЛ-6
B9
Пролиферация
ИЛ-11, ИЛ-13
ИЛ-8
Перв.культ.
Миграция
Некоторые хемокины
ИЛ-12
KIT-225
Пролиферация
ИЛ-2,4,7,15,21
ИЛ-18
KG-1
Синтез ИФН-γ
ИЛ-12, ИЛ-21
ФНО
L929
Цитотоксичность
Лимфотоксин
ГМ-КСФ
TF-1
Пролиферация
ИЛ-3,4,5,9,13, ЭПО
ИФН-α
Перв.культ.
Антивирусная активность
А-549, 2D9,
Daudi
Антивирусная активность,
продукция белка MxA
Другие типы ИФН,
видоспецифично
А-549
Антивирусная активность
Другие типы ИФН
WiDr
Подавление пролиферации
-
ИФН-γ
Сравнительный анализ методов определения
цитокинов
Характеристика
Биологические методы
Выявляет
только биологически активные
молекулы
Специфичность
недостаточная (биологически
активности различных цитокинов
интерферируют); необходимо
подтверждать с помощью
нейтрализующих антител
Интерференция
специфические и неспецифические
нативные ингибиторы цитокинов,
антицитокиновые антитела
Чувствительность
Точность
Длительность
Иммунохимические методы
число доступных эпитопов
(биологически активные и
неактивные молекулы)
очень высокая
белки сыворотки крови,
компоненты комплемента,
антицитокиновые антитела,
ревматоидный фактор
высокая
очень высокая
низкая (CV может достигать 100%)
высокая (CV в пределах 5-10%)
1-4 дня
несколько часов
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СИСТЕМЫ ЦИТОКИНОВ
Цитокины
СИНТЕЗ
• молекулярно-биологические
– мРНК
– планарные микрочипы
• иммунохимические
– проточная цитометрия
• внутриклеточное содержание
– иммуноцитохимический
ПРОДУКЦИЯ
• иммунохимические
– ИФА
– проточная цитометрия
• концентрация (мультиплексный анализ)
БИОЛОГИЧЕСКАЯ
АКТИВНОСТЬ
• биологические
– хемотаксис
– пролиферация
– дегрануляция и т.д.
Рецепторы цитокинов
СИНТЕЗ
• молекулярно-биологические
– мРНК
– планарные микрочипы
ЭКСПРЕССИЯ
• иммунохимические
– проточная цитометрия
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИТОКИНОВ (2)
• ПРОДУКЦИЯ IN VIVO
• СПОНТАННАЯ ПРОДУКЦИЯ IN VITRO (активация
in vivo)
• ИНДУЦИРОВАННАЯ ПРОДУКЦИЯ IN VITRO
– НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ (митогены, ЛПС)
– СПЕЦИФИЧЕСКАЯ (аллергены, бактериальные
антигены и т.д.)
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИТОКИНОВ (3)
ПРОДУКЦИЯ IN VITRO
• ВЫДЕЛЕННЫЕ ФРАКЦИИ КЛЕТОК
• ЦЕЛЬНАЯ КРОВЬ
• ТКАНИ
Влияние тромбоцитов и плазмы
на индукцию IL-8 в крови
GBS
100
спонтанная продукция
Цельная кровь
IL-8 ng/ml
80
Кровь-Тромбоциты
60
*
40
20
*
25
0
Кровь-Плазма
GBS
10
5
*
Кровь-Плазма-Тромбоциты
15
*
LPS
*
0
1000
спонтанная продукция
800
IL-8 ng/ml
IL-8 ng/ml
20
600
400
*
200
0
LPS
xMap технология
xMap микросферы
100 классов = 100 тестов
Проточный цитофлуориметр
• Проточная система и кювета
• Двухлазерная компоновка
• Детекция флюоресцентного
сигнала
Карта микросфер (регионы)
• Каждый класс микросфер
картируется
– 100 регионов
Приборы для х-МАР технологии
Luminex
FLEXMAP 3D
Luminex-100
Luminex-200
MAGPIX
Анализ цитокинов
Гемопоэтическая:
IL-1β, IL-6, G-CSF, GM-CSF, IFNγ
Аутоиммунная:
IL-1β, IL-6, IL-12, TNFα
Воспалительная:
IL-6, IL-8, G-CSF, TNFα
Th1/Th2:
IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFNγ, TNFα
17-плексная:
IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13,
IL-17, G-CSF, GM-CSF, IFNγ, TNFα, MCP-1, MIP-1
23-плексная:
IL-1α, IL-2R, IL-3, IL-12(p40), IL-16, IL-18, CTACK, GRO-α,
HGF, ICAM-1, M-CSF, IFN-α2, LIF, MCP-3, MIF, MIG,
βNGF, SCF, SCGF-β, SDF-1α, TNF-β, TRAIL, VCAM-1
27-плексная:
IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL12(p70), IL-13, IL-15, IL-17, Basic FGF, Eotaxin, G-CSF,
GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MCP-1 (MCAF), MIP-1α, MIP-1β,
PDGF-BB, RANTES, TNFα, VEGF
Сравнительные характеристики ИФА и МИА
методов определения цитокинов
Сравниваемые
параметры
ИФА
МИА
Чувствительность
Высокая: ≤10 пг/мл
Высокая: несколько пг/мл
Определение
Количественное
Количественное
Специфичность
Высокая
Высокая
Выявление
Биологически активных и
неактивных молекул
Биологически активных и неактивных
молекул
Время проведения
анализа
Относительно небольшое (день)
Более быстрый анализ (часы)
Коэффициент
вариации
5-10%
10-15%
Интерференция
отсутствует
отсутствует
Протокол
исследования
Относительно простой
простой
Объем образца
Относительно большой (100-200
мкл на 1 определение)
Небольшой (50 мкл на все определения –
до 100 параметров)
Стимуляция
детекции
Отсутствует
Присутствует
Срок хранения тестсистемы
Небольшой
Более продолжительный
Разрешающая
способность
Определение 1 цитокина в одной
биопробе
Одновременное определение до 100
цитокинов в 1 биопробе
Биологический материал для определения
концентрации цитокинов
• Периферическая кровь
– сыворотка крови
– плазма крови (ЭДТА)
• Биологические жидкости
– цереброспинальная жидкость
– секреты
– смывы
– моча и т.д.
• Экстракты тканей
ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОКИНОВ
• АКТИВАЦИЯ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
• ДИФФЕРЕНЦИРОВКА Th1 И Th2
• МОНИТОРИНГ ВОСПАЛЕНИЯ
Уровни хемокинов в сыворотке крови больных системными
васкулитами, Me [LQ; HQ]
Хемокин, пг/мл
Практически
здоровые
(n=20)
Микроскопический полиангиит
Гранулематоз Вегенера
Синдром Черджа-Стросс
(n=49)
Узелковый
полиартериит
(n=36)
CCL3/MIP-1α
3,2
[3,0; 3,6]
4,1
[3,3; 5,2]
3,4
[2,7; 4,4]
CCL4/MIP-1β
11,0
[8,2; 13,3]
19,1
[16,6; 26,1]
15,6
[13,3; 19,9]
CCL5/RANTES
144,1
[142,5; 149,1]
150,3
[146,5; 153,5]
146,1
[144,1; 150,9]
CCL11/Eotaxin
7,7
[6,7; 10,0]
19,7
[15,6; 25,3]
17,9
[12,3; 26,8]
CXCL8/IL-8
0,7
[0,5; 1,4]
1,9
[1,5; 2,8]
1,5
[1,2; 2,9]
Уровни мРНК хемокинов в крови больных
системными васкулитами, Me [LQ; HQ]
мРНК хемокина
Практически
здоровые
(n=20)
Микроскопический полиангиит
Гранулематоз Вегенера
Синдром Черджа-Стросс
(n=49)
Узелковый
полиартериит
(n=36)
CCL3/MIP-1α
9,7
[6,4; 12,8]
12,6
[7,2; 25,3]
16,8
[11,4; 26,4]
CCL4/MIP-1β
1,9
[0,6; 6,4]
0,7
[0; 1,9]
0,5
[0; 1,1]
CCL5/RANTES
5,2
[4,3; 9,4]
1,3
[0; 3,8]
1,0
[0; 4,5]
CCL11/Eotaxin
3,7
[2,2; 5,9]
1,9
[0,4; 3,6]
0,9
[0; 2,4]
CXCL8/IL-8
1,3
[1,1; 1,6]
0,6
[0; 1,3]
0,8
[0; 1,3]
УРОВЕНЬ IL-8 (пкг/мл) ПРИ
ОСТРОМ ГНОЙНОМ ГАЙМОРИТЕ
смывы из гайморовых пазух
4500
3000
1500
0 острая фаза
подострая фаза
период реконвалесценции
Уровень цитокинов IL-1β, IL-6, IFN-γ, G-CSF
(пг/мл) в сыворотке крови больных СКВ
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
20
**
***
контрольная
группа
15
**
больные СКВ
10
5
**
0
IL-1beta
IFN-gamma
G-CSF
IL-6
21
Уровень IL-1ß, IL-6, IFN-γ (пг/мл) в сыворотке крови больных
СКВ с негативными и позитивными значениями АНФ, антител
к дсДНК , антител к КЛ IgG/IgM
IL-1β
0,35
**
0,3
20
0,25
4,5
**
**
4
3,5
3
15
2,5
0,2
2
10
0,15
IFN-γ
IL-6
25
0,4
1,5
0,1
1
5
0,5
0,05
0
0
0
1
2
3
1
2
3
1
2
3
Условные обозначения:
■ - антитела обнаружены
□ - антитела не обнаружены
*p<0,05
1 - АНФ
2 - антитела к дсДНК IgG
3 - антитела к кардиолипину IgG/IgM
22
Вклад клинических критериев и лабораторных
показателей в диагностику СКВ (n=105)
80
70
% повышенных значений/ патологических
поражений
60
50
40
30
20
10
0
*
*
в
к
и
ma
SF* 1be ta
а во
оче
m
C
кож
т
п
a
с
е
g
е
G
у
с
IL
ни
ни
IFN
же
ние ораже
а
е
р
аж
п
по
пор
Э
СО
СР
Б
6*
лин
у
ILб
ло
а-г
м
гам
* больные СКВ в сыворотке которых была измерена концентрация цитокинов (n=61)
** больные ДКВ и СКВ которым был выполнен ТВП (n=15)
Ф
АН
П*
ТВ
*
23
Псориаз
IL-1α
IL-1β
IL-12 (p40)
Практически
здоровые
(n=10)
Me (min-max)
0 (0 – 0)
0,1 (0 – 0,95)
0 (0 – 0)
IL-12(p70)
Цитокины, пг/мл
Провоспалительные
цитокины
Противовоспалительные
цитокины
Th1-цитокины
Больные псориазом с индексом PASI (n=10):
PASI< 10 Me (minPASI>20 Me (min-max)
max)
0 (0 – 0,65)
0,5 (0,37 – 1,18)
1,7 (0,59 – 3,15) *
0 (0 – 0)
0,4 (0,21 – 0,55)
3,4 (1,12 – 5,97) *
3,5 (0 – 5,04)
1,33 (0 – 2)
0,1 (0 – 1,68)
IL-16
1,7 (0 – 2,17)
2,5 (1,79 – 3,32)
2,4 (2,08 – 2,9)
IL-17
0 (0 – 0)
0 (0 – 0)
0 (0 – 0)
IL-18
61,4 (0 – 176,6)
159 (118,2 – 229,5)
173,3 (140,5 – 195,6)
TRAIL
79 (0 – 196,1)
125,8 (107,9 – 137,9)
109,9 (81,2 – 176,3)
IL-10
0 (0 – 3,43)
0,7 (0,02 – 1,04)
0 (0 – 0,82)
IL-1RA
0 (0 – 207,3)
61,1 (0 – 328,5)
55,4 (0 – 122,2)
IL-2Rα
52,9 (42,0 – 69,7) *
63,4 (46,6 – 87,8) *
IFNα-2
20,6 (17,7 –
25,1)
4,3 (0 – 20,1)
36,2 (32,6 – 47,7) *
38,0 (33,5 – 51,5) *
IFN-γ
1,3 (0 – 48,9)
17,0 (12,4 – 32,9)
5,4 (2,71 – 12)
IL-5
0,01 (0 – 2,38)
1,1 (0,03 – 1,49)
0,3 (0,14 – 0,65)
IL-9
0 (0 – 8,85)
88,6 (4,6 – 442,5)
22,5 (0 – 518)
IL-13
0,5 (0 – 14,41)
36,7 (8,0 – 53,8)
5,3 (1,2 – 33,6)
LIF
0 (0 – 0,16)
35,8 (0 – 55,7)
24,2 (0 – 56,8)
Th2-цитокины
Содержание цитокинов (пг/мл) в сыворотке крови больных
псориазом, групп сравнения и практически здоровых лиц
8
7
6
5
4
3
2
1
0
IL-2
IL-6
практически здоровые лица
GM-CSF
атопический дерматит
IFN-γ
склеродермия
TNF-alpha
псориаз
достоверность различий показателя по сравнению с практически здоровыми лицами, при
p<0,01
достоверность различий показателя по сравнению с группой больных атопическим
дерматитом, при p<0,01
Содержание IL-2, IL-6, IL-10, GM-CSF, IFN-γ и TNF-α (пг/мл) в сыворотке
крови больных псориазом в зависимости от индекса PASI
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
IL-2
IL-6
IL-10
практически здоровые лица
GM-CSF
PASI<10
IFN-γ
PASI от 10 до 20
TNF-alpha
PASI>20
достоверность различий показателя по сравнению с практически здоровыми лицами, при p<0,001
достоверность различий показателя между группами с индексом PASI до 10 и индексом PASI более 20, при
p<0,01
достоверность различий показателя между группами с индексом PASI от 10 до 20 и индексом PASI более 20,
при p<0,01
Содержание цитокинов (пг/мл) в моче больных псориазом,
групп сравнения и практически здоровых лиц
6
5
4
3
2
1
0
IL-2
IL-4
практически здоровые лица
IL-8
IL-10
атопический дерматит
GM-CSF
склеродермия
IFN-γ
TNF-alpha
псориаз (группав целом)
- достоверность различий показателя по сравнению с практически здоровыми лицами, при p<0,05
- достоверность различий показателя по сравнению с группой больных склеродермией, при p<0,01
- достоверность различий показателя по сравнению с группой больных атопическим дерматитом,
при p<0,01
Содержание IL-8, IL-10, GM-CSF, IFN-γ и TNF-α (пг/мл) в моче
больных псориазом в зависимости от индекса PASI
8
7
6
5
4
3
2
1
0
IL-8
IL-10
практически здоровые лица
GM-CSF
PASI<10
IFN-γ
PASI от 10 до 20
TNF-α
PASI>20
достоверность различий показателя по сравнению с практически здоровыми лицами, при p<0,001
достоверность различий показателя между группами с индексом PASI до 10 и индексом PASI более
20, при p<0,01
Корреляционные зависимости между содержанием некоторых
цитокинов от клинических и лабораторных показателей
Кореляция между IL-6 в моче и уровнем белка в моче
(r=0,4, p<0,006)
0,24
0,22
0,20
Взаимосвязь между уровнем
IL-6 (r=0,4, p<0,006) и
содержанием белка в моче
может указывать на
диагностическую
значимость этого цитокина
как маркера “активности
поражения почек “
0,18
белок моча
0,16
0,14
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
-0,02
-10
0
10
20
30
IL-6
40
50
60
70
ЭКСПРЕССИЯ ХЕМОКИНОВ И ИХ РЕЦЕПТОРОВ В БИОПТАТАХ
ВИЗУАЛЬНО ЗДОРОВОЙ И ПОРАЖЕННОЙ КОЖИ ПРИ ПСОРИАЗЕ
25
*
*
20
ХЕМОКИНЫ
15
норма
*
10
5
0
*
*
Eotaxin2
пораженная кожа
*
*
*
Eotaxin
здоровая кожа
MIP-1a
MIP-1b
RANTES
IL8
*
60
50
РЕЦЕПТОРЫ
ХЕМОКИНОВ
*- достоверные
40
*
30
20
*
10
0
CCR1
CCR3
CCR5
CXCR1
CXCR2
*
отличия по
сравнению с
контролем при
p<0,05
Экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов в визуально
здоровой коже пациентов псориазом и склеродермией
% к бета-актину
* Достоверные отличия
40
от практически здоровых
при p<0,05
35
30
25
20
*
15
10
5
*
*
*
*
*
0
Эотаксин
Эотаксин 2
MIP-1α
MIP-1β
Здоровые добровольцы
RANTES
IL8
ССR1
Склеродермия
ССR3
ССR5
СXCR1
Псориаз
СXCR2
Экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов
в визуально здоровой коже пациентов псориазом
% к бета-актину
25
*
*
Достоверные
отличия от
практически
здоровых
при p<0,05
20
15
5
*
*
10
*
**
*
*
* *
0
Эотаксин
Эотаксин 2
MIP-1α
MIP-1β
RANTES
IL8
40
Практически
здоровые
% к бета-актину
35
30
PASI < 10
25
*
20
15
*
10
*
*
*
*
5
0
ССR1
ССR3
ССR5
СXCR1
СXCR2
PASI (10-20)
PASI>20
Экспрессия внутрипеченочной MCP-1 при ХГС
r=0,37 p=0,013
8
7
6
25,0
ИГА
5
20,0
ИГА
печени
4
3
2
15,0
1
0
-2
10,0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
мРНК MCP-1 в биоптате
r=0,45 p=0,002
5,0
4
0,0
F1
F2
F3
ФИБРОЗ
3
фиброз
печени
2
F1 – слабый фиброз
1
F2 – умеренный фиброз
-2
F3 – тяжелый фиброз
0
2
4
6
8
10
12
14
мРНК MCP-1 в биоптате
16
18
20
22
24
Средние значения уровней цитокинов в ларингеальном секрете
больных папилломатозом и здоровых лиц
40
p=0,035
35
30
p=0,031
пкг/мл
25
20
15
10
p=0,044
5
0
TNF
IFN
GMCSF
IL13
Больные РРП
IL12
IL2
IL10
Здоровые
IL5
IL4
Эндоскопическая картина гортани пациента с респираторным
папилломатозом до и после курса ингаляционной интерфероновой терапии
до лечения
после лечения
Исходные уровни TNFα в ларингеальном секрете больных
папилломатозом в зависимости от результата лечения
*
пкг/мл
60
40
20
0
Группы обследованных
Частичный регресс
Полный регресс
Норма
* – различия между группами больных достоверны при р<0,05
Динамика уровней цитокинов в ларингеальном секрете больных с
частичным и полным регрессом папиллом в результате лечения
IFN-γ
IL-12
30
6
*
20
пкг/мл
пкг/мл
4
10
2
*
•
*
•
•
0
-10
0
до
лечения
через
сутки
через 5
суток
после
курса
через 5
до
через
через 5
после
суток
лечения
сутки
суток
курса
суток
после
после
курса
через 5
Част ичный регресс
Полный регресс
Норма
курса
IL-2
*
•
40
*
•
пкг/мл
30
* – различия с исходными значениями
достоверны при р<0,05 ,
20
• - различия с нормой достоверны при
10
при р<0,05
0
до
лечения
через
су тки
через 5
су ток
после
ку рса
через 5
су ток
после
ку рса
Выбор цитокина или комбинации
цитокинов, методов их определения и
биоматериала должно быть обусловлено
исключительно задачами исследования
Большой Арарат
Большой Арарат (тень)
БЛАГОДАРНОСТИ
СКВ, васкулиты
Мазуров В.И., Маслянский А.Л.,
Долгих С.В.
ЛОР-патология
Плужников М.С., Катинас Е.Б.
МАПО, Ленинградская областная больница
Кафедра ЛОР-болезней СПб ГМУ
Гепатит С
Лобзин Ю.В., Жданов К.В., Гусев
Д.А., Чирский В.С., Шахманов Д.М.
Псориаз
Манахов К.Н., Хобейш М.М.
Шемеровская Т.Г., Ильина Т.Н.
Чухловин А.Б., Сысоев К.А.,
Лапин С.В., Мазинг А.В.,
Бельтюкова А.С.
Кафедра инфекционных болезней Военномедицинской академии имени С.М.Кирова
Кафедра дерматовенерологии СПб ГМУ
им.акад.И.П.Павлова
Санкт-Петербургский городской
ревматологический Центр (ГБ №25)
НМЦ по молекулярной медицине
СПб ГМУ им.акад.И.П.Павлова