УРАМН НИИ морфологии человека РАМН Лаборатория роста и развития Влияние трансплантации мононуклеаров красного костного мозга на ангиогенез у крыс Байкова Ю.П., Фатхудинов Т.Х. Цели и задачи исследования Цель исследования — изучить процессы ангиогенеза в рубцовой зоне постинфарктного миокарда после трансплантации мононуклеаров красного костного мозга крыс. Задачи: Изучить особенности васкуляризации рубца после трансплантации мононуклеаров. Оценить экспрессию генов ангиогенеза во фракции мононуклеаров красного костного мозга. Материалы и методы Экспериментальное исследование проводили на самцах аутбредного стока линии Спрейг-Доули (НПП «Питомник лабораторных животных ФИБХ РАН»). Всего использовали 56 животных в возрасте 8 недель массой тела 180-200 граммов. Соответствие нормативным документам: Работа с экспериментальными животными проводилась соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г. в Животных содержали в соответствии с GLP-условиями. На проведение исследования было получено разрешение биоэтической комиссии НИИ морфологии человека РАМН (протокол № 4 от 12.03.2008). Хирургические операции проводили на биологических испытаний ФИБХ РАН в г.Пущино базе Лаборатории Клеточный трансплантат Клеточный трансплантат представлял собой 5 млн. клеток в 1 мл физиологического раствора. Животным контрольной группы вводили 1 мл физраствора. Клеточный трансплантат маркировали мембранной флуоресцентной меткой PkH26. Кол-во животных Срок выведения из эксперимента (сут) Группа Трансплантат 14 30 Количество клеток (млн.клеток /кг) Объем (мл/кг) Контроль Физраствор 13 14 0 5 Опыт Аутологичные МН 12 + 3* 11 + 3* 25 5 Примечание: * - животные, которым вводили флуоресцентно меченные клетки RT-PCR 1. Выделение РНК: фенольный способ набор RNeasy Mini Kit 2. Проверка чистоты РНК: электрофорез спектрофотометрия 3. Синтез кДНК: набор RT2 First Strand Kit 4. RT-PCR набор The Rat Angiogenesis RT² Profiler™ PCR Array. Морфометрия Показатели: количество кровеносных сосудов в поле зрения площадь кровеносных сосудов в поле зрения площадь поля зрения На проделанных определяли: основании измерений общее количество сосудов на мм2 объемную плотность кровеносных сосудов на мм2 Результаты исследования В опытной группе не было обнаружено ни одной PkН26 меченной клетки, входящей в состав внутренней и средней стенки сосудов. Меченые клетки отсутствуют в стенке вены (А, В) и венулы (С, D). Количество кровеносных сосудов на мм2 Объемная плотность сосудов на мм2 Количество капилляров на мм2 Количество артериол на мм2 Количество венул на мм2 А – опыт, 14 суток В – опыт, 30 суток С – контроль, 14 суток D – контроль, 30 суток Оценка экспрессии генов во фракции мононуклеаров 3D профиль генной экспресиии Стабилизация процессов васкуляризации Поддержание васкуляризации в течение как минимум 30 суток после трансплантации Увеличение калибра кровеносных сосудов новообразованных выводы Трансплантированные мононуклеары не дифференцируются в клетки внутреннего и среднего слоя стенок кровеносных сосудов. Ни одной меченой PkH26 клетки не было обнаружено в сосудах рубцовой зоны или в неповрежденных сосудах, что исключает механизм клеточного слияния трансплантированных мононуклеаров. Трансплантация клеток приводит к стабилизации процессов ангиогенеза, поддерживая количество артериол и венул на постоянном уровне, и приводит к увеличению количества капилляров, по сравнению с контрольной группой, где наблюдается отрицательная динамика. Во фракции мононуклеаров красного костного мозга наблюдается повышенная экспрессия ангиогенных факторов (генов семейства Vegf), факторов роста и дифференцировки (генов семейства Tgf), хемоаттрактантов и молекул адгезии (Pecam1), за счет которой, вероятно, и реализуется положительный терапевтический эффект. Спасибо за внимание!