Клеточные технологии в терапии гематологических

XXVIII (91) Сессия общего собрания
Российской академии медицинских наук
«Клеточные технологии и регенеративная медицина»
4 – 5 июня 2013
Москва
Клеточные технологии в
терапии гематологических
заболеваний
Академик РАМН, профессор А.Г.Румянцев,
профессор А.А.Масчан,
профессор С.А.Румянцев
ФГБУ Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и
иммунологии им. Дмитрия Рогачева
ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский
университет им. Н.И.Пирогова
Трансплантация гемопоэтических
стволовых клеток: эволюция технологии








Первые эксперименты ?
Первый клинический опыт
1957-58
 G.Mathe
 D.Thomas
Первая успешная трансплантация
1968
 R.Good
Первые успешные трансплантации при острых
лейкозах и приобретенной апластической анемии
1970-75
 D.Thomas
К 2013 году в мире выполнено более 1000 000 трансплантаций
Ежегодно в мире выполняется около 50 000 трансплантаций
Плотность трансплантаций в западной Европе и США – 300-500 на
10 000 000 населения
В России
 (потребность > 4000?)
Трансплантация –
“Паззл”

Пациент
Возраст
 Сопутствующие болезни
 Инфекционный статус


Чувствительность к химио
и иммунотерапии
 Стадия


Режимы
кондиционирования
 Профилактика РТПХ
 Стратегия контроля
инфекций




сиблинг/неродственный/г
аплоидентичный
Возраст/инфекционный
статус
Трансплантат (источник
истволовых клеток)

Процедура
трансплантации

Донор

Биология болезни



Костный мозг
Периферическая кровь
Пуповинная кровь
Генетика HLA
Направленное
изменение состава
трансплантата
Трансплантация ГСК у детей: опыт ФНКЦ ДГОИ/РДКБ
1992-2012 гг.
У 641 пациента
проведено 730 ТГСК
возраст: 1 мес - 18 лет
80
80
70
66
60
43
42 48
50
40
22 2127
30
20
10
0
1 0
73 71
54
54
31
13 12
1012 9
1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008 2010
Виды ТГСК
1 - от HLA-идентичных родственных
доноров
2 - неродственные
3 - аутологичные
4 - гаплоидентичные
300
279
250
177
200
170
150
100
55
50
0
1
2
3
4
Диагнозы Другие CML
FA MDS
5%
5%
ABL
5%
HLH
6%
JMML
6%
PID/IE
8%
3%
3%
AML
25%
ALL
14%
sAA
12%
MPS1
8%
Статус злокачественного заболевания
на момент трансплантации
Рефрактер
ность
28%
Трансплантат
Рецидив
6%
ПК
13%
Ремиссия 1
21%
СКПК
26%
КМ
61%
Ремиссия
>1
45%
Кондиционирование
Mel
2%
Профилактика РТПХ
FluCyATG±
TAI
12%
CsA
24%
Treo
21%
Tacro
76%
Bu
65%
Трансплантация от неродственного совместимого
донора у детей: опыт ФНКЦ ДГОИ/РДКБ
1997 – 2011 год
35
30
25
20
15
148 пациентов
10
160 трансплантаций
5
Медиана возраста 7,9 лет (0,5-18,7)
0




М:Ж 98:48

Общая выживаемость АА vs AML
100
100
80
80
доля живых
доля живых
Бессобытийная выживаемость: все пациенты
60
40
5y pEFS = 44±9%, n = 146, censored 73
20
5у рOS 84±10%
n - 16, живы 14
АА
AML
60
40
5у рOS 49±10%
n - 35, живы 17
20
0
0
0
0
5
время наблюдения, лет
10
2
4
6
8
время наблюдения, лет
10
Бессобытийная выживаемость:
статус злокачественного заболевания
100
advanced
CR1,2
log-rank p - 0,046
80
60
48%
40
26%
44±6%
43±8%
55±13%
80
доля живых
100
доля живых
Бессобытийная выживаемость: источник СК
60
40
20
20
log-rank p - ns
0
0
0
0
2
4
6
8
10
2
4
6
8
10
время наблюдения, лет
время наблюдения, лет
Бессобытийная выживаемость: HLA-совместимость
100
80
доля живых
10/10
<10/10
log-rank p - 0,024
60
57±5%
40
29±8%
20
0
0
2
4
6
8
время наблюдения, лет
10
ТРПХ
оРТПХ 1-4 ст – 63%
оРТПХ 2-4 ст – 42%
оРТПХ 3-4 ст – 15%
хрРТПХ
- 39%
хрРТПХ персистирует – 24%
BM
PBSC
UCB
Трансплантация от частично
совместимых доноров: подходы к
иммуномагнитному процессингу
трансплантата
Трансплантации от альтернативного донора: за и против
Неродственная
Пуповинная кровь
Гаплоидентичная
Доступность
20-70%
90%
100%
Срок от начала поиска
2-4 месяца
1 месяц
1 неделя
Сложность организации
+++
+++
+
Сложность процессинга
+
+
+++
Возможность
посттрансплантационной
иммунотерапии
+
-
++
Опыт
+++
++
+
Гаплоидентичная трансплантация: новые технологии в клинике
Новые методы иммуномагнитного процессинга:
CD34+ селекция
CD3+/CD19+ деплеция
TCR альфа/бета деплеция
Чистота продукта – 98%
Потери ~ 20%
Деплеция Т-лимфоцитов – 4.2 log
Деплеция B-лимфоцитов – 3.5 log
2006 – 1
2007 – 2
2008 – 6
2009 – 8
2010 – 10
2011 – 13
2012 – 15
Состав трансплантата
Характеристики
трансплантата
Трансплантация мезенхимальных
стволовых клеток
Опыт клинического применения МСК
в ФГУ ФНКЦ ДГОИ (2008-2010 г.)
Методика экспансии МСК оформлена в виде «новой медицинской технологии» и зарегистрирована Медицинская
технология «Экспансия ex vivo мезенхимальных стволовых клеток» от 09 августа 2007 г. № ФС-2007/176, выданная
Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития.
МСК применялись:
 у 26 пациентов с РТПХ в дозе 2-4 млн клеток на кг веса 2-4
кратно.

для ускорения приживления трансплантата у 16 пациентов в
дозе 1-3 млн клеток на кг веса однократно за 2-4 часа до
трансплантации кроветворных стволовых клеток.

Выращивали МСК костного мозга пациентов используя стандартную
методику клоногенного культивирования стромальных фибробластов
костного мозга.
Культивирование проводили до 2-3 пассажа.

Трансплантация NK-клеток
В ФГУ ФНКЦ ДГОИ разработана технология и проведена экспансия NK-
клеток для клинического использования (18 образцов).
Методика оформлена как новая медицинская технология.
Материал - продукта афереза, либо продукт селекции CD56+ клеток из афереза
периферической крови донора 10-50 х 106 клеток.
Способы культивирования — закрытая система (пластиковые мешки для
культивирования), открытая система (флаконы).
Сроки экспансии – 14-20 дней.
Результат - более чем 200-кратная экспансия CD56+ клеток
•
Использование NK-клеток в дозах 5-10 млн на кг веса тела позволяет рассчитывать на
улучшение исхода у пациентов с остаточными опухолями и после проведения
трансплантации.
•
Актуальность их применения растет с каждым годом в связи с широким применением
трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток, как одного из способов лечения
ряда гематологических и онкологических заболеваний.
•
NK-клетки - цитотоксические лимфоциты, обеспечивают эффект «трансплантат против
опухоли» , не вызывают РТПХ. фенотип: CD3-, CD16+,CD56+,CD94+.
•
NK-клетки могут быть применены для иммунотерапии пациентов, клетки которых
экспрессируют иные молекулы MHC класса I, что особенно актуально при
гаплоидентичной трансплантации.
Использование
дендритных вакцин
Экспансия дендритных клеток для
приготовления противоопухолевых вакцин
Опыт ФГБУ ФНКЦ ДГОИ:

Создана
персонифицированная
технология
лечения онкологических заболеваний.

Отработаны методы индукции созревания и
активации дендритных клеток с высоким уровнем
антигенпрезентирующего
потенциала
при
культивировании in vitro с ростовыми факторами и
опухолевым лизатом.

Разработаны методы оценки противоопухолевого
ответа у вакцинированных больных.

Создан банк хранения опухолевого материала.
Технология ex vivo экспансии
лимфокин-активированных
лимфоцитов
Технология ex vivo экспансии лимфокинактивированных лимфоцитов






Лимфокин-активированные киллеры (ЛАК) представляют собой
генерируемые из мононуклеарных лейкоцитов при инкубации с
интерлейкином-2 (ИЛ-2) активированные лимфоциты.
ЛАК, характеризуются высокой НК-активностью и обладают
цитотоксическим действием по отношению к аутологичным и аллогенным
опухолевым клеткам.
Подобно натуральным киллерам (НК), оказывают избирательное
действие на трансформированные клетки, вызывая лизис опухолевых
клеток-мишеней, и не влияют на нормальные клетки организма.
Антиген-специфическая Т-клеточная терапия
применяется при лечении:
Гемобластозов (ОМЛ,ОЛЛ,ХМЛ, НХЛ)
Солидных опухолей (рабдомиосаркома, опухоль Вильмса и др.)
Лечение осложнений после проведения высокодозной
химиотерапии и ТКМ (ЭБВ- лимфопролиферативные
заболевания)
Трансплантация стволовых клеток
пуповиной крови
Банки пуповинной крови

1993 год - New York, Milan, Dűsseldorf

2003 год - Bone Marrow Donor Worldwide (33
банка ПК из 21 страны)

2003 год – открытие БСК ДЗ г.Москвы

2005 год – открытие Центра крови в г. Самаре
На публичном хранении 6656 образцов, 42 выдано для трансплантации (из них 12 за рубеж), 1550
на персональном хранении
Процессинг в банке ПК
МЕТОД УМЕНЬШЕНИЯ ОБЪЕМА
до 25 ml

Усиление осаждения RBC с
применением HES

Центрифугирование и удаление
избытка эритроцитов и плазмы
для получения 20 мл
концентрата WBC

Криопротектант с конечной
концентрацией 0.8 % HES, 1 %
Dextran 40, 10 % DMSO в
окончательном объеме 25 мл
Особенности кроветворения
новорожденного ребенка
Высокая проницаемость
костномозгового барьера
Особенности
иммунитета
Мобилизующий эффект цитокинов,
запускающих роды
Большое количество коммитированных (в основном за
счет CFU-GM и CFU-GEMM) и более ранних клетокпредшественников, обладающих высокой
пролиферативной активностью.
Состав пуповинной крови (n=1004)
Количество CD34+клеток в ПК
доношенных новорожденных
CD34+клетки
CD34+клетки (%) – 0,827
CD34+клетки (10³/мм³) - 103
Спектр гемопоэтических клетокпредшественников пуповинной крови
13%
35%
14%
19%
19%
KOE-ГЭММ KOE-ГМ КОЕ-Г КОЕ-М КОЕ-Э
Колониеобразующую активность лейкоцитарной фракции ПК определяли при культивировании в течение 14 суток
в метилцеллюлозе (готовая среда, содержащая факторы роста «MethoCult 4338, StemCellTehnologies, Canada) с
подсчетом количества КОЕ-ГЭММ, КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-Э.
Влияние родового стресса на выраженность мобилизации ПК
0,106
0,11
0,105
0,095
0,1
0,095
0,09
0,085
CD34+ (10³/mm³)
Девочки
Мальчики
Пол новорожденного
Масса тела новорожденного
0,131
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0,101
CD34+ (10³/mm³)
без гипоксии
Способ родоразрешения
острая гипоксия
Острая гипоксия плода
Источники стволовых клеток



Костный мозг
Периферическая кровь
Пуповинная кровь
Г-КСФ
Кровь
нейтрофил
моноцит
IL-8
IL-8
MMP-9
G2/S
G0
К.М.
Г-КСФ
Кровь
G0
IL-8
IL-8
G2/S
MMP-9
К.М.
Strategy to separate CXCR4+ HSC from CXCR4+ TCSC
Bone Marrow Mononuclear Cells
Chemotaxis to
SDF-1
Medium alone
SDF-1
FACS SORTER
CD45-
CXCR4+CD45-
CD45+
CXCR4+CD45+
Strategy to separate CXCR4+ HSC from CXCR4+ TCSC
CXCR4+CD45+
Evaluation of hematopoietic
potential of sorted cells
CXCR4+CD45-
Biol Cell 2005, 97, 113-146.
in vitro - CFU-GM
In vivo - CFU-S
CXCR4
SDF-1
gradient
SDF-1
gradient
SDF-1
gradient
SDF-1
gradient
SDF-1
gradient
Blood 2002, 100, 515
Stem Cells 2003, 21: 363-371
Leukemia 2004, 18: 29-40
Circulation 2004, 110:3213-3
Circulation Res. 2004, 95:1191-9
Primary Organ
Tumor
Egress
CXCR4+
Normal SC
CXCR4+
Tumor SC
Circulation
SDF-1
Gradient
Adhesion
Homing/Metast
asis
Survival/Expansion
Patel and Rameshwar. Curr Pharmacogenomics Person Med. 2011 September 1; 9(3): 229–239.
Доказательства межклеточных взаимодействий
в системе мать-плод






При всех беременностях человека клетки плода встраиваются в
циркуляцию матери
Клетки плода обнаруживаются на 6 неделе гестации и частота
их обнаружения нарастает с ростом гестационного возраста,
достигая 100% к 36 неделе гестации
При нормальной беременности во втором триместре
беременности число клеток плода в венозной крови матери
составляет 1-6 клеток/мл (т.е., от 5 до 30х103 клеток)
При аномалиях плаценты и плода, эклампсии, проблемах
тканевой совместимости, невынашивании, самопроизвольных
абортах в сроки от 20и недель, число циркулирующих клеток
плода возрастает до 20-1500 клеток в мл.
После родов количество клеток плода в циркуляции резко
снижается, но 50% фетальных клеток обнаруживаются в крови
от 4 недель до 10 недель после родов
Специальные исследования послеродового микрохимеризма
обнаруживают его у 40% здоровых женщин, перенесших
беременность
37
Определение фетальной ДНК и РНК в
материнской плазме
1997 г.
Определение Y хромосомы для диагностики пола
плода и косвенно генной патологии, связанной с полом
плода
1998 г.
Определение RhD+ плода у RhD– матери и в
дальнейшем других редких групп крови плода
2000-2005 гг. Неинвазивная пренатальная диагностика:
Гомозиготная β-талассемия
Гемоглобинопатии (HbE и др.)
Муковисцидоз
Ахондроплазия
Болезнь Дауна
Болезнь Хантингтона
Врожденная гиперплазия надпочечников
Врожденная миодистрофия и др.
38
МАТЕРИНСКИЙ МИКРОХИМЕРИЗМ И
НЕОНАТАЛЬНЫЙ ИММУНИТЕТ
−
Поступление материнских клеток в плод документировано 53 года назад (Grenn I.
et al, Hodgkin’s disease: a maternal-to fetal lymphocyte chimera? Lancet, 1960)
−
Материнская ДНК определяется у плода с момента развития плацентарного
кровообращения. Панель для РТ-ПСР, информативна для 90% пар ребенок-мать с
чувствительностью1:106 разработана 8 лет назад (Lambert NC et al. Arthritis
Rheum, 2004, 50, 906-914) и протестирована на 47 клеточных линиях
−
Диагностика/скрининг – пуповинная кровь
−
Доказан перенос клеток с материнским молоком
−
Изучен клеточный состав ММХ: макрофаги, Т-клетки, В-клетки, естественные
киллеры
−
Имеются описания переноса опухолевых заболеваний (НХЛ, меланома и др.)
−
Материнские клетки обнаружены у детей не только в виде циркулирующих в
крови клеток, но и как дифференцированные тканевые клетки кожи, тимуса,
сердца, легких, поджелудочной железы, селезенки, почки, мышц и костного мозга
НОВЫЙ КОНЦЕПТ
−
Каждый ребенок представляет собой мультихимерный
организм, построенный из клеток не только многих
индивидов, но и многих поколений
−
ИДС сопровождаются активным ММХ, приживлением
клеток и возникновением РХПТ и/или РТПХ. ММХ –
один из механизмов, объясняющих аутоиммунные
расстройства при ИДС
Возможный вклад микрохимеризма в онкогенез
Трансмиссия вирус-инфицированных лимфоцитов
(Berencsi, 2012)
Трансмиссия клеток с предзлокачественными изменениями:
необходимость второго удара (second hit) для злокачественной
трансформации
(Berencsi, Barcsay, 2012)
Изменение иммунного надзора:
Материнские микрохимеризм обнаруживается у 1/3 женщин в клетках,
участвующих в осуществлении функций врожденного и адаптивного
иммунитета (Т- и В-лимфоциты, НК-клетки, макрофаги)
Lab investigation, 2006
Перспективы использования iPSCs
Sharkis et al. Sci Transl Med. 2012 March 28; 4(127):
Спасибо за внимание!