Слайд 1 - Биокласс Московской гимназии на Юго–Западе №1543
advertisement
Молекулярно - генетический анализ видового разнообразия сообществ хемолитотрофных микроорганизмов Ученицы 11 класса «А» Московской гимназии на Юго-западе № 1543 А.А.Докшукиной Научный руководитель к.б.н. М.А. Турчанинова Актуальность Промышленное использование хемолитотрофных микроорганизмов для восстановления металлов из металлосодержащих руд - перспективный путь развития горнодобывающей отрасли В нашей стране всеми условиями для развития технологии биовыщелачивания обладает промышленный комплекс полуострова Камчатка Для внедрения технологии биовыщелачивания на Камчатке на начальном этапе необходимо определить видовой состав аборигенных хемолитотрофных сообществ микроорганизмов Одним из наиболее перспективных подходов к изучению микробиотических сообществ является анализ структуры ДНК микроорганизмов, входящих в их состав Цели и задачи Цель работы: молекулярно-генетический анализ видового разнообразия сообществ хемолитотрофных микроорганизмов сульфидных руд месторождения Шануч (полуостров Камчатка). Задачи работы: 1. Выбор оптимальной методики выделения ДНК из хемолитотрофных микроорганизмов. 2. Выбор универсальных праймеров, позволяющих выявлять фрагменты гена 16S РНК основных представителей хемолитотрофных сообществ. 3. Создание и скрининг библиотеки клонированных фрагментов гена 16S РНК, полученных с использованием универсальных праймеров. 4. Анализ видового разнообразия сообществ хемолитотрофных микроорганизмов сульфидных руд месторождения Шануч. Сравнение данных молекулярного анализа с данными микроскопии. Обзор литературы: биовыщелачивание Биовыщелачивание – совокупность окислительно востановительных процессов, происходящих при участии определенных микроорганизмов, и приводящих к востановлению металлов из металлосожержащих руд. MeS + 2O2 –> (бактерии) –> MeSO4, где MeS – сульфид металла Микроорганизмы, обладающие способностью к биовыщелачиванию: тионовые бактерии (Acidithiobacillus thiooxidans, Acidithiobacillus ferrooxidans), род Sulfobacillus (S. acidophilus, S. ambivalens,S. montserratensis, S. sibiricus, S. thermosulfidooxidans, S. yellowstonensis, S. thermotolerans), Ferroplasma acidiphilum. Обзор литературы: микрофлора месторождения Шануч Аборигенными микроорганизмами месторождения Шануч являются: Acidithiobacillus Acidithiobacillus Sulfobacillus Ferroplasma thermosulfidooxidans acidiphilum ferrooxidans thiooxidans Материалы и методы: Схема эксперимента Материалы и методы: Полимеразная цепная реакция Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод ферментативной наработки invitro определенных фрагментов ДНК. Материалы и методы: ПЦР «в реальном времени» Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод ферментативной наработки in vitro определенных фрагментов ДНК Интеркалирующий краситель SYBR Green 1 Пример графика real – time ПЦР Материалы и методы: Клонирование Клонирование - размножение введенной в бактериальные клетки чужеродной ДНК. Клонируемый фрагмент ДНК встраивается в плазмиду-переносчик («вектор»), при этом образуется новая («рекомбинантная") плазмида. Материалы и методы: Секвенирование Секвенирование - определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК. Исследованный материал Чистые культуры A. thiooxidans, A. ferrooxidans, S. thermosulfidooxidans и F. acidiphilum были предоставлены лабораторией хемолитотрофных микроорганизмов Института микробиологии им. Виноградского РАН Смешанные культуры микроорганизмов, выделенные из сульфидных руд месторождения Шануч (полуостров Камчатка) были предоставлены Научноисследовательским геотехнологическим центром ДВО РАН Результаты: Проверка универсальных праймеров 1 - A. thiooxidans 2 - A. ferrooxidans 3 - F. acidiphilum 4 - S. thermosulfidooxidans Результаты:Выбор оптимальной методики выделения ДНК 5 000 Флуоресценция 4 000 3 000 2 000 1 000 0 1 6 11 16 21 26 31 36 Номер цикла зеленый – лизис GuSCN, оранжевый – ферментативный лизис, синий – щелочной лизис, фиолетовый – лизис CTAB, черный – перетирание с частицами SiO2, красный – отрицательный контроль ПЦР Результаты: создание библиотеки клонированных фрагментов гена 16S РНК Были получены 4 чашки Петри с рассеянными колониями E.coli. 1,2 - голубые и белые колонии клеток, плазмида которых имеет необходимую вставку, 3 – синие колонии, плазмида которых не имеет вставки. Результаты: Анализ библиотеки клонов Необходимое и достаточное количество исследуемых клонов 50-100. Проанализировано – 80. Из них: 77 - род Acidithiobacillus sp. 2 - Tiobacillus sp. 1 - архей Ferroplasma acidifillum Пример представления результатов, полученных в ходе секвенирования (последовательность гена 16S A.ferrooxidans). Выводы 1. Наиболее эффективной методикой выделения ДНК из сообществ хемолитотрофных микроорганизмов стала методика, основанная на лизисе биоматериала с помощью GuSCN при 65°. 2. Выбрана пара универсальных праймеров, обеспечивающих одинаковую эффективность амплификации фрагмента гена 16S РНК 3. Установлено, что основная доля (96%) аборигенных хемолитотрофных микроорганизмов месторождения Шануч приходится на представителей рода Acidithiobacillus. 3% от общей бактериальной массы составляют представители рода Tiobacillus, и 1% архей Ferroplasma acidifillum. Выводы 4. Полученные нами данные не совпали с данными микроскопического анализа. Так, представители рода Sulfobacillus, присутствующие в образцах по данным микроскопии, молекулярными методами обнаружены не были. 5. Полученные данные о видовом составе аборигенных хемолитотрофных микроорганизмов месторождения Шануч в дальнейшем могут быть использованы для создания наиболее эффективных окисляющих сообществ. Благодарности Автор выражает благодарность - коллективу ЗАО «НПФ ДНК-Технология» за методическую помощь, - Научно-исследовательскому геотехнологическому центру Дальневосточного отделения Российской академии наук за предоставленный для исследований материал, - научным сотрудникам Института микробиологии им. С.Н. Виноградского за предоставленный для исследований материал и помощь в организации методической работы, - С.М. Глаголеву за организацию практики. Спасибо за внимание!
