и Молекулярная масса (в Да)

Масс спектрометрия
Масс спектрометрия
Молекулярная вес Мr (отн. ед)
и
Молекулярная масса (в Да)
Абсолютная
и
относительная масса
или
Масс спектроскопия
12C = 12.000000
Ионы в электрическом и магнитном поле
+
v
q
FB
+
Ion source
B out of
pa ge
B out of
page
Motio n of
pa rti cle
Кинетическая энергия иона Екин
(электрическая ускоряющая сила)
Increasing mass
Сила Лоренца
(отклоняющая магнитная сила)
m B 2r 2

z
2Va cc
r2 
mV acc
2 zB
где z –заряд иона, m – его масса, Vacc- разница потенциалов
приложенного электрического поля, r - радиус кривизны траектории
иона, B - величина приложенного магнитного поля
Легкие ионы будут иметь
маленький радиус кривизны.
Этот радиус будет
увеличиваться с ростом массы
иона и ускоряющего
потенциала поля.
1
От ионов в растворе - к ионам в газовой фазе
Перенос ионов из раствора в газовую фазу требует большой энергии и не происходит
самопроизвольно. Например, перенос иона Na+ требует 98 ккал/моль. Поэтому перенос
десятков тысяч ионoв в газовую фазу из раствора в масс спектрометре требует очень большой
затраты энергии
Способы получения ионов
1)
2)
3)
Удаление электронов из молекулы для
получения позитивно заряженного катиона,
который может быть ускорен либо
увеличением отрицательного градиента или
уменьшением позитивного градиента поля.
Добавление электрона к молекуле для
получения отрицательно заряженного аниона.
В этом случае знак ускоряющего напряжения
противоположен знаку, требуемому для
катиона.
Удалением или добавления протона. В этом
случае результирующая масса будет
отличаться на ±1 от массы исходного
нейтрального иона.
Техника ионизации
Электронная ионизация
Ионизация полем
Бомбардировка быстрыми
атомами
Плазменная ионизация
Лазерная ионизация с
использованием матрицы
(MALDI)
Ионизация электрораспылением
(ESI)
2
Лазерная ионизация с использованием матрицы (MALDI)
(a)
(b)
(c)
Laser pulse
Analyte molecule
UV - absorbing matrix
Матрица – ключевой
элемент техники.
Специфика лазерного
излучения.
Специфика массспектрометра
Ее главная роль:
Два типа лазеров используются в
технике MALDI:
Поскольку большинство лазерных
источников
являются
пульсирующими,
то
для
регистрации используются такие
методы как метод времени
пролета или метода ионного
циклотронного
резонанса.
Точность определения массы
составляет ± 0.01% (±1 3Da при
молекулярной массе 10 кДa).
содержать хромофор,
поглощающий лазерное
излучение. Последнее не
должно затрагивать хромофоры
исследуемой молекулы.
Матрица испаряясь переходит в
газовую фазу, увлекая за собой
исследуемую молекулу.
Инфракрасный лазер, возбуждающий
вибрационные моды и УФ - лазер,
возбуждающий
электронные
переходы
в
молекуле.
Длина
импульса обычно составляет 100 нс
или
меньше.
Большие
длины
импульсов обычно приводят к
тепловому разложению образца.
Ионизация электрораспылением
Nanoflow electrospray
ionisation
Free jet expansion
in the ion source
Disassembly in the
collision cell
Mass analysis
-7
-10
1e - 1e
mBar
Схематическое представление прохождения ионов от кончика иглы, содержащего
раствор биологических макромолекул, до детектора масс спектрометра. Раствор белка
(объем - 1-2 μл, концентрация - 5 μM) выходит из тонкого капилляра (внутренний
диаметр около 10 μм). К концу капилляра, покрытого золотом, прикладывается
высокое напряжение (обычно несколько кВ), вызывая распад капель на очень мелкие
капли. Десольватация последних приводит к появлению облака молекул, которые
детектируются масс спектрометром. Точность определения молекулярных масс
4
составляет 0.001-0.005%.
Инструменты и техника регистрации в масс спектрометрии
ESA
Magnet
A
Single and double focusing
mass spectrometers
Source Slit
B
Collector Slit
Quadrupole
mass filter
Fourier transform mass
spectrometry
D
Triple mass filter
Signal
out
-Vdc + Vrf cos t
rf excite
QII
-Vdc + Vrfcos t
+Vdc + Vrf cos t
Fourier
Transform
RF only
q (collection cell)
+Vdc + Vrf cos t
-Vdc + Vrf cos t
Fourier
Transform
QI
S
+Vdc + Vrfcos t
Ion cyclotron resonance
mass spectrometry
Receiver plate
Time
Filament
Electric
lens
Electro n
gate
Ring
electrode
FT
+
Time-domain
signal
B
Transmitter
plate
Trap plate
Frequency
Quadrupole
ion trap
Top and bottom
end cap electrod es
Mass
Spectrum
5
Electro n
multiplier
To
amplifier
Определение масс белков
Моноизотопная масса
+1Da
horse cytochrome c
+2Da
+3Da
horse myoglobin
[Arg8]-вазопресин
1084.446
ESI-FTIR масс спектр двух белков: цитохрома c
и миоглобина лошади.
Концентрация образца 0.4 нM.
Общее количество белка около 135 зM
80 000 молекул).
1 зепто моль = 10-21 моля
(~
МАЛДИ спектр высокого разрешения белка
[Arg8]-вазопресина.
Основной спектр 1084.446 относится к
«моноизотопному» пику протонированного белка.
Три пика более высокой массы относятся к
вкраплению в белок изотопа 13C, доля
встречаемости которого в природе равна 1.108%.
6
Молекулярная масса нейтральной
молекулы M может быть найдена из
значений регистрируемых масс m1 и
m2 и (что эквивалентно значениям m/z)
и числа добавленных зарядов или
протонов n1 и n2 :
Цитохром с
М = n2 (m2 - 1)
(A)
где n1 = n2+1 и
n2 = (m1 -1) / (m2 - m1)
Следовательно, M, можно рассчитать,
если брать пики регистрируемых масс
попарно.
Применяя формулу (А) для расчета молекулярной массы цитохрома c с использованием двух соседних пиков с =
952.3 и = 1031.3, получим для следующее значение:
n2 
m1  1
m2  m1

951.3
1031.3  952.3
 12.04
Это означает, что 12 положительных зарядов ассоциированы с относительной массой, равной 1031.3.
Молекулярная масса в этом случае рассчитывается как М = n2 (m2 -1) и равна 12363.6.
Рассматривая следующие два пика с относительными массами = 884.3 и = 952.3, мы получим:
n2 
m1  1
884.3

 12.989
m2  m1 952.3  884.3
или Z = 13, т.е. 13 положительных зарядов ассоциированы с относительной массой 952.3.
Рассчитанная из этих пиков молекулярная масса равна 12366.9.
7
Сворачивание белков: конечные и промежуточные состояния
Folded Protein
ESI - MS
m/z
Unfolded Protein
ESI - MS
m/z
Различные моменты
времени
Различные pH
Цитохром c
Апомиоглоин
Кислая денатурация миоглобина
8
Виртуальный двумерный форез
Вертикальная полоска: одномерный полиакриламидный гель, окрашенный.серебром.
Каждый участок его дубликата ( не окрашенного серебром) анализируется масс
спектрометрией.
20
9
Нуклеиновые кислоты и их комплексы с белками. Проблема: «любовь НК» к
ионам.
bacterial plasmid (pBR322)
5 мМ Мg
Мономер
Димер
1 mM Mg
Гистограмма средних масс образца ДНК. Доминантный
пик 2.88 MДa соответствует Na-бактериальной ДНК
плазмиде (pBR322), а меньший пик ее димеру (Benner,
1997).
Расчетное значение молекулярной массы 30S субьединицы равно 852187 ± 3918 Дa. Эта
величина на 0.6% отличается от «точного значения», вычисленного из составляющих ее
10
компонентов (16S РНК и белков).
Статический и динамический протеомы и масс-спектрометрия
Cell or tissue sample
Extract cellular proteins
ic
c tr g
e
l
in
e
Iso cuss
fo
ele P
ctr ag
op e
ho
r
2D gel
Trypsin treatment
peptides
Si
ze
charge
es
is Trypsin
treatment
Liquid chromatograhy
separation
peptides
Mass Spectrometry
Две стратегии анализа протеома методом масс спектрометрии (GodovachZimmermann and Brown, 2001).
11
Формирование изображения с помощью масс спектрометрии
Методология
пространственного анализа
ткани методом MALDI-MS.
Замороженные секции
помещаются на металлической
плате и покрываются UVабсорбирующей матрицей.
Затем они помещаются в массспектрометр и сканируются
лазерным лучом. (Stoeckli et al.,
2001, Nature Medcine, 7, p.494).
Масс спектрометрическое изображение
замороженных секций ткани мозга мыши.
(а) Оптическое изображение замороженной
секции на золотой подложке.
(b) Распределение белков с m/z = 8528 в
области центральной коры головного мозга
(c) Тоже для m/z 6716 в области медиальных
сучковатых ядер.
(d) Тоже для m/z 2564 в области среднего
12
мозга.