лекцию (размер 9,9 Mb).
реклама
Современные технологии анализа точечного нуклеотидного полиморфизма. Генотипирование человека. Методы анализа SNP Ферментативные подходы: По электрофоретической подвижности полиморфных фрагментов RFLP Аналитические SSCP Химия анализа AFLP Гетеродуплексный анализ детекторы CFLP Детекция на твердой фазе EMD гибридизация на LDR, LCR, Padlock олигонуклеотидных матрицах Invader оптиковолоконный ДНК RAPD, AP-PCR гибридизационный анализ DT-PCR Высокопроизводительный элонгация иммобилизованных AS-PCR праймеров (минисеквенс) анализ SNP Химические методы пиросиквенс + химическое расщепление гетеродуплексов химическое лигирование Хроматографические методы CDGE, TGGE, DGGE, DHLPC Физические методы MALDI-TOF, TAQ-MAN ПЦР-ПДРФ (PCR-RFLP) – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов 1) ПЦР-аплификация 2) Рестрикция 3) Электрофорез Структура TaqMan® MGB зонда NFQ MGB R R : Репортер MGB увеличивает температуру плавления (Tm) зонда. Возможно применение более коротких зондов. Лучше дискриминация точечных замен NFQ : Нефлюоресцентный гаситель MGB : Minor Groove Binder (Tm Enhancer) SNP анализ Используются мультиспектральные зонды Аллель 1 – генерируется сигнал от зонда с красителем VIC FAM NFQ VIC A C NFQ G C Аллель 2 – генерируется сигнал от зонда с красителем FAM FAM NFQ A T VIC NFQ G T Хроматографическая дискриминация точечных мутаций DHPLC - (denaturating high-performance liquid chromatography) Хроматографическая дискриминация точечных мутаций DHPLC - (denaturating high-performance liquid chromatography) Клевазный тест- Third Wave Tech. Invader assay 25-35 bases Invader Oligo - Mut Probe Tm span + 2-3 C Pyrosequencing light time Affymetrix Inc. Предлагаемый нами аналитический подход Химия анализа: Реакция минисеквенирования на матрице ПЦР-амплифицированной ДНК Легко стандартизируется, не критична к температурным режимам гибридизации Аналитическая часть: Масс-спектрометрический анализ продуктов реакции Не требуется использование изотопных или флуоресцентных меток, высокая точность и скорость анализа Реакция минисеквенирования PCR ssDNA Отжиг олигонуклеотидного зонда A G + ddT, +ddC, +ДНК полимераза T A С G или Детекция Масс-спектрометрический этап Принцип: Измерение отношения массы заряженных частиц к их заряду Ионизация Требования: Разделение достроенных олигонуклеотидных зондов, отличающихся по 3’-окончанию. Аналитический диапазон: 4000 – 8000 Da. Сортировка заряд/масса Регистрация масс-спектра Необходимая точность: +/- 9 Da (разница между ddT и ddC) dG dA dT dC 329,2091 313,2097 304,1964 289,1847 ddG ddA ddT ddC 313,2142 297,2148 288,2015 273,1898 MALDI-TOF Ионизация -MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption\Ionization) лазерная десорбция и ионизация в присутствии вспомогательного вещества – матрицы МАТРИЦА: * Поглощает энергию лазерного излучения, “вскипая” увлекает в газовую фазу молекулы анализируемого вещества * Способствует ионизации Регистрация -TOF (Time of Flight) Измерение времени (time of flight) требующегося ионам для достижения детектора (пропорционально квадратному корню соотношения заряд/масса) Масс-спектрометрический этап Проблемы: •Деградация нуклеиновых кислот входе ионизации •Многозарядность •Образование комплексов с другими заряженными молекулами Решения: •Применение MALDI-TOF схемы масс-спектрометрии •Хроматографическая очистка аналита на ионнообменной смоле Разрешение и точность MALDI-TOF-MS р а з р е ш е н и е Масс-спектрометрический этап Reflex IV (Bruker Daltonics) Масс-спектрометрический этап Аналитическая мишень: AnchorChip 400TF-384 (Bruker Daltonics) Стальной тефлонизированный планшет на 384 образца Матрица: 3-гидроксипиколиновая кислота Масс-спектрометрический этап Снятие спектра в автоматическом режиме 30 импульсов / 10 секунд / 1 образец исх. +dG Интерпретация: 7023-6693 = 330 Da (dG) 7321-7023 = 298 Da (ddA) +ddA Принципиальная аналитическая схема Разработка высокопроизводительной аналитической схемы Проблемы Очистка ампликонов перед реакцией минисеквенирования Оптимизация реакции минисеквенирования Решения SAP-дефосфорилирование dNTP Использование рекомбинантной ДНК полимеразы, эффективно включающей ddNTP Очистка образцов перед MALDITOF спектрометрией 1) Реакционные буферы без K, Tris H-Cl 2) Ионнообменная хроматография Повышение чувствительности системы 1) Масс-тюнинг олигонуклеотидов 2) Использование AnchorChip планшетов Разработка высокопроизводительной аналитической схемы Амплификация, дефосфорилирование, минисеквенирование в микропланшетном формате (96 или 384 образцов) Разработка высокопроизводительной аналитической схемы Автоматизированное нанесение образца на мишень при помощи Biomek 2000 Workstation (Beckman Coulter) Объем образца – 200 nl. Дальнейшие перспективы: Мультиплексорность (Ross et al. Nature Biotechnology 1998) Мультиплексорность (Ross et al. Nature Biotechnology 1998) Зарубежные аналоги и другие высокопроизводительные системы генотипирования Название/ Производител ь Метод (Химия/Детекция) Производ ительность SNP/день MassArray 200 K System (Sequenom) Минисиквенс/MALDI-TOF 200 000 Genolink (Bruker Daltonics) Минисиквенс/MALDI-TOF 1440 Pyrosequencing (Biotage AB) Минисиквенс/люминисцентная 10 000 детекция TaqMan Assay (Applied Biosystems) Дискриминирующая гибридизация /флуоресцентная детекция 9000 Значимость анализа SNP. Исследовательский аспект Идеальные маркеры для геномного скрининга Среднее растояние между маркерами ~1000нт-5000нт Поиск кандидатных генов мультифакториальных заболеваний Удобные маркеры молекулярной эволюции Значимость анализа SNP. Прикладное значение Генетическая паспортизация человека. Индивидуализированное определение уже известных SNP-профилей, ассоциированных с: предрасположенностью к развитию мультифакториальных заболеваний: Кардиоваскулярные патологии Нейродегенеративные заболевания Злокачественные новообразования индивидуальной чувствительностью к лекарственной терапии Генотипирование Геном – совокупность всего генетического материала организма Генотип – совокупность данных о всех или избранных вариантах генетического материала. Точечный нуклеотидный полиморфизм Делеции, инсерции Хромосомные аберрации Генотипирование – комплекс лабораторных процедур, направленных на получение информации о генетическом статусе индивидуума. Генотипирование Вопросы и ответы… Задачи и значимость генотипирования человека? Объект исследования? Методика? Интерпретация результата? Генотипирование в медицине Информационная значимость Оценка индивидуальных рисков развития мультифакторных заболеваний Оценка индивидуальной предрасположенности/резистентности к инфекционным заболеваниям Определение индивидуальной чувствительности к лекарственным препаратам Информация, актуальная при планировании семьи Формат индивидуальной медицины Медицинский генетический паспорт Важное замечание… Генотипирование – это скрининговая процедура, направленная на анализ наследуемых признаков. Процедуру генотипирования достаточно выполнить единственный раз, так как в ходе исследования определяются генетические комбинации единожды унаследованные от генетических родителей. Объект исследования? SNP single nucleotide polymorphism точечный нуклеотидный полиморфизм а так же непротяженные инсерции и делеции в нуклеотидной последовательности Точечный нуклеотидный полиморфизм – элементарная аналитическая единица генетического исследования SNPs (single nucleotide polymorphisms) - однонуклеотидные позиции в геномной ДНК, для которых в некоторой популяции имеются различные варианты последовательностей (аллели), причём редкий аллель встречается с частотой не менее 1% (Brookes, A.J. 1999. The essence of SNP. Gene 234:177-186) Пример: замена G на A в позиции 1691 гена V фактора свертывания крови (Ляйденовская мутация) Геном человека – предположительно до 10 млн SNP. Точечный нуклеотидный полиморфизм, а так же более крупные генетические повреждения (делеции, хромосомные аберрации) являются формальной причиной развития как моногенных, так и мультифакторных заболеваний Информация о медицински значимых полиморфизмах – результат научноисследовательских работ Технологические и биоинформационные возможности современных медицинских лабораторий позволяют использовать эти знания в диагностических целях Публикации в год по взаимосвязи генотипфенотип 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 Актуальные направления медицинского генотипирования Категории/полиморфизмы Сердечно-сосудистые заболевания - 1700 Онкологические заболевания - 5700 Нейро-дегенеративные заболевания - 1800 Заболевания обмена веществ - 1400 Фармакогеномный анализ – 900 ПРИМЕРЫ… Коагуляционный каскад Транскрипционные факторы и их лиганды в регуляции обмена холестерина и жирных кислот CYP26 PPA R Acetyl CoA RA R RX Retinoic R Acids Fatty Acids CYP4A ABCB4, D2, D4 Isoprenoids Diet Lanosterol CYP27B1 1,25-Dehydroxy7-DehydroVitamin D3 Cholesterol VDR Diet CYP24 26OHase CYP3A CYP2B ABCB1 , C2, D3 Xenobiotics PX R CA R Steroids Cholesterol Insects CYP7A1 Oxysterols LX R G5, G8 ABCA1, G1, 20-HydroxyEcdysone EcR Bile Acids FXR E2 3 CYP7A1 CYP8B1 ABCB11 Значимые полиморфизмы для оценки риска сердечно-сосудистых заболеваний. 1 Name Prothrombin (F II) Gene FII Polymorpism G20210A 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Leiden factor Fibrinogen Methylenetetrahydrofolate reductase Apolipoprotein С3 Apolipoprotein С3 Apolipoprotein E Apolipoprotein E Apolipoprptein B Apolipoprptein B Apolipoprotein(a) Apolipoprotein(a) Lipoprotein lipase Lipoprotein lipase Hepatic lipase Hepatic lipase Hepatic lipase ABCA1 transporter ABCA1 transporter Lipoprotein receptor-related protein 1 Lipoprotein receptor-related protein 1 Lipoprotein receptor-related protein 1 Lectin-like oxidazed LDL receptor Lectin-like oxidazed LDL receptor Angiotensinogen Angiotensinogen Angiotensin I-converting enzyme Angiotensin receptor I nitric oxide synthase Paraoxonase FV FGB MTHFR АРОС3 APOC3 APOE APOE ApoB ApoB LPA LPA LPL LPL LIPC LIPC LIPC ABCA1 ABCA1 LRP1 LRP1 LRP1 LOX-1/OLR1 LOX-1/OLR1 AGT AGT АСЕ AGTR1 NOS PON I G1691A G 455A С677T C1100T C -482T T334C T472C C2488T G4154A C93T G121A C1595G G281A C(-514)T C(-2)T A884G R-219-K Ile823Met C200T C663T C766T C(-25)G G501C T174M M235T Alu I/D A1166C E298D С (-108) Т 31 endothelin receptor EDNR C969T Значимые полиморфизмы для оценки риска развития рака молочной железы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Name Breast cancer gene 1 Breast cancer gene 1 Breast cancer gene 1 Breast cancer gene 2 Breast cancer gene 2 Breast cancer gene 2 Tumor protein p53 Tumor protein p53 Tumor protein p53 Cell-cycle checkpointkinase Tumor necrosis factor alpha Tumor necrosis factor alpha Tumor necrosis factor alpha Tumor necrosis factor beta Tumor necrosis factor alpha Methylenetetrahydrofolate reductase Gene BRCA1 BRCA1 BRCA1 BRCA2 BRCA2 BRCA2 TP53 TP53 TP53 CHEK2 TNFA TNFA TNFA TNFB TNFA MTHFR Polymorpism 5382insC 4153delA G181T S1099X 1528delAAAA 9318delAAAA C215G IVS3-16bpI/D IVS6-AluI/D 1100delC G(-308)A G(-238)A C(-863)A G(-1031)A 863 С677T Значимые полиморфизмы для оценки риска развития инсулин-независимого диабета 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Name Peroxisome proliferator activated receptor A Peroxisome proliferator activated receptor G Glucocorticoid receptor Matrix metalloproteinase-9 Glucose transporter 2 Glucose transporter 2 Glucose transporter 2 Sulfonylurea receptor Sulfonylurea receptor Sulfonylurea receptor Sulfonylurea receptor Gene PPARA PPARG NR3C1 MMP-9 SLC2A2 SLC2A2 SLC2A2 ABCC8 ABCC8 ABCC8 ABCC8 Polymorpism K162V P12A A1220G C(-1562)T IVS5-15 C/T G592T C3307T IVS38+54 C/G IVS18-36 C/T G1948A IVS11-74 G/A Значимые полиморфизмы генов детокискации 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Cytochrome P450 Cytochrome P450 Cytochrome P450 Cytochrome P450 Cytochrome P450 Cytochrome P450 Cytochrome P450 Cytochrome P450 Cytochrome P450 Cytochrome P450 Cytochrome P450 Cytochrome P450 Cytochrome P450 Cytochrome P450 Cytochrome P450 CYP2C9 CYP2C9 CYP1A2 CYP1A2 CYP1A2 CYP1A2 CYP2C19 CYP2C19 CYP2C19 CYP2D6 CYP2D6 CYP2D6 CYP2D6 CYP2E1 CYP3A4 R144C L208V -2964(G/A) -164A-->C 2464T-->delT 3858G-->A CYP2C19*2 (40bp del) CYP2C19*5 R433W CYP2C19*3 R296C G42R P34S G169Stop G1293T CYP3A4*1B A392G ПИННИ ЗАО «Постгеномные и нанотехнологические инновации» 119435, Москва, ул.М.Пироговская, д.1А, тел/факс (095) 2464882, т.8(917)5844651 e-mail: [email protected], [email protected], [email protected] РЕЗУЛЬТАТЫ АНАЛИЗА ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОЛИМОРФИЗМОВ www.pynny.ru Р\с 40702810600010001990 в КБ «Альта-Банк» www.genepassport.ru К\с 30101810900000000424 в ОПЕРУ МГТУ Банка России, 044525424 БИК НАПРАВЛЕНИЕ НА АНАЛИЗ ГЕНЕТ ИЧЕСКИХ ПОЛИМОРФИЗМОВ ОРГАНИЗАЦИЯ:_______________ ДАТА: ________ Ф.И.О. _____________________ КОД ________ ПОЛ _______ ВОЗРАСТ _______ ДИАГНОЗ ___________________________________________________ ____________________________________________________________ ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВРАЧА-ГЕНЕТИКА ( Да / Нет )** Способ получения результата: 1. Оригинал - в регистратуре, 2. Эл. почта, укаж ите свой эл.адрес: ______________________3. Факс __________________ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬ К СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ Полиморфизмы, предрасположенности к развитию гипертензивных состояний (№1) N 1 2 3 4 5 Заказать Название гена Ангиотензин-конвертирующий фермент Рецептор I типа ангиотензина II Ангиотензиноген Ангиотензиноген Синтаза окиси азота Сокр. Полиморф изм АСЕ AGTR1 AGT AGT NOS Alu Ins/Del I>D АpoС3 АpoС3 АpoС3 LPL LPL ApoE ABCA1 PON1 PON1 PON1 -455 T>C -482 C>T (SstI) C3238G C>G Сер447Стоп C>G N291S A>G L28P T>C R219K G>A -107 C>T L54M T>A Q192R A>G A1166C A>C T174M C>T M235T T>C E298D G>T Общая стоимость профиля: 750 руб. Полиморфизмы генов липидного обмена (№7) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Аполипопротеин С3 Аполипопротеин С3 Аполипопротеин С3 Липопротеиновая липаза Липопротеиновая липаза Аполипопротеин E ABCA1 транспортер Параоксоназа Параоксоназа Параоксоназа Общая стоимость профиля: 1500 руб. Полиморфизмы генов, контролирующих свертывание крови (№9) 1 2 Протромбин(коагуляционный факторII) Фактор Ляйдена (фактор V) 3 Ингибитор активатора плазминогена 4 Фибриноген Тромбоцитарный рецептор фибриногена Метилентетрагидрофолатредуктаза Метионин-синтаза редуктаза Коагуляционный фактор VII Интегрин Альфа-2 Тромбоцитарный гликопротеин 1B P-селектин лиганд гликопротеина 5 6 7 8 9 10 11 F2 F5 SERPINE1 (PAI-I) FGB beta polypeptide ITGB3 (GP IIIa) MTHFR MTRR F VII GPIA GP1BA SELPLG G20210A G>A R506Q G>A –675 (5G/4G) –455 G>A L33P T>C A223V С677T C>T I22M A66G A>G R353Q G>A F224F, C807T C>T (-5) T>C M62I G>A Общая стоимость профиля: 1650 руб. Для получения более полной картины предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям рекомендуется проводить исследования одновременно по трем вышеперечисленным блокам. Стоимость исследования - 3900 руб. **Стоимость аналитического заключения врача-генетика (к.м.н) одного профиля = 650 руб., двух или более профилей = 1100 руб. Полиморфизмы генов системы свертывания крови 1 Протромбин (Коагуляционный фактор II) F2 G-20210-A Протромбин является одним из главных компонентов свертывающей системы крови: в ходе его протеолиза образуется тромбин. Данная реакция является первой стадией образования кровяных сгустков. Вариант А полиморфизма G-20210-A приводит к повышенной экспрессии гена и является маркером риска развития тромбозов и инфаркта миокарда. 2 Фактор Ляйдена (коагуляционный фактор V) F5 G-1691-A Является белковым кофактором при образовании тромбина из протромбина. Вариант A полиморфизма G-1691-A (R506Q, известен так же как «вариант Ляйден») является маркером риска развития венозных тромбозов. 3 Ингибитор активатора плазминогена SERPINE1 (PAI-I) –675 (4G(-675)5G). Является центральным компонентом фибринолитической системы. Ингибирует урокиназу, протеин-С и тканевой активатор плазминогена. 4G полиморфизм, в случае присутствия в гомозиготном состоянии является фактором риска развития тромбозов и инфаркта миокарда. 4 Фибриноген FGB beta polypeptide G –455A Фибриноген является предшественником фибрина. Вариант -455A FGB обуславливает повышенную транскрипцию гена FGB и, соответственно, приводит к повышенному уровню фибриногена в крови, что приводит к увеличению вероятности образования тромбов. Полиморфизмы генов системы свертывания крови 5 Тромбоцитарный рецептор фибриногена ITGB3 (GP IIIa) C /T (L33P) Кодирует β 3 цепь комплекса обуславливает повышенную адгезию тромбоцитов и к увеличению риска развития острого коронарного синдрома. У пациентов с этим полиморфизмом часто отмечается пониженная эффективность аспирина как тромболитического препарата. - 6 G P I I b / I I I a , у ч а с т в у ю щ е г о в р а Метилентетрагидрофолатредукта MTHFR за з н о о б р а з н ы х м е ж д у к л е т о ч н ы х в з а и м о д е й с т в и я х . В а р и а н т Т I T G B 3 С-677-T (A223V) Участвует в метилировании гомоцистеина. Термолабильный вариант 677Т приводит к нарушению фолятного метаболизма, что приводит к повышенному уровню гомоцистеина и к развитию тромбообразования и кардиоваскулярных заболеваний. У носителей варианта Т во время беременности наблюдается дефицит фолиевой кислоты, что приводит к дефектам развития нервной трубки у плода. Курение усугубляет влияние данного варианта. У носителей двух аллелей Т (гомозиготное состояние) высок риск развития побочных эффектов при приеме некоторых лекарственных препаратов, исползуемых в раковой химиотерапии (метотрексат). Печальные примеры… Смерть двухкратного олимпийского чемпиона Сергея Гринькова. Возможные причины развития острого коронарного синдрома – повышенная адгезия тромбоцитов вследствие мутации C –1565-T (L33P) в гене фактора агрегации тромбоцитов GPIIIA Lancet. 1996 Jun 29;347(9018):1833. “Clues to the death of an Olympic champion.” GoldschmidtClermont PJ, Shear WS, Schwartzberg J, Varga CF, Bray PF. Полиморфизмы генов липидного обмена 1 2 3 -482C/T Аполипротеин С3 АРОС3 -455 T/C 3238 C/G (SstI) Аполилпопротеин С3 является ингибитором липопротеинлипазы. Варианты -482T и -455C гена APOC3 характеризуются повышенным уровнем триглицеридов вследствие изменения уровня базовой экспрессии гена. Курение увеличивает влияние варианта -455C. Вариант G полиморфизма C3238G характеризуется атерогенными сдвигами липидного профиля (повышенным уровнем триглицеридов, ЛПНП-холестерина и аполипопротеина В), что при наличии других факторов риска увеличивает риск развития сердечно-сосудистых заболеваний. 4 5 Липопротеидная липаза LPL C>G Сер447Стоп N291S A/G Липопротеидная липаза катализирует гидролиз фосфолипидов и триглицеридов. Ключевой фермент в метаболизме липопротеинов высокой плотности. Вариант G N291S характеризуется повышенным уровнем триглицеридов и пониженным уровнем ЛПВП-холестерина, что обуславливает повышенный риск развития ишемической болезни сердца и инсультов. Вариант G полиморфизма Сер447Стоп, наоборот, ассоциирован с благоприятными изменениями липидного спектра: пониженным уровнем триглицеридов и повышенным уровнем ЛПВП-холестерина.. Полиморфизмы предрасположенности к развитию гипертензивных состояний 1 Ангиотензин-конвертирующий фермент АСЕ Alu I/D Является компонентом ренин-ангиотензиновой системы. Играет важную роль в регуляции кровяного давления и поддержании баланса электролитов гидролизуя ангиотензин-1 в вазопрессор ангиотензин-2. Вариант D полиморфизма Alu I/D является фактором риска развития сосудистых патологий, таких как ишемическая болезнь сердца и диабетическая нефропатия. 2 Рецептор I типа ангиотензина II AGTR1 A1166C Компонент ренин-ангиотензиновой системы, важный эффектор контролирующий кровяное давление. Рецептор I типа ангиотензина-2 (AGTR1) в результате взаимодействия с ангиотензином-2 обуславливает его основные кардиоваскулярные эффекты. Вариант С полиморфизма A1166C является фактором риска развития гипертензии. 3 4 Ангиотензиноген AGT T174M M235T Компонент ренин-ангиотензиновой системы, предшественник ангиотензина-2. Ренин отщепляет от ангиотензиногена декапептид, из которого в дальнейшем образуется ангиотензин-2. Полиморфизмы T174M и M235T являются факторами риска гипертензии и инфаркта миокарда. Генетические факторы предрасположенности к онкологическим заболеваниям Рак молочной железы и яичников Делеционные мутации в генах BRCA1 и BRCA2. Охарактеризовано более 15000 мутаций. Носители таких мутаций имеют на 80% увеличенный риск развития рака молочной железы и/или яичника в возрасте до 60 лет Показана необходимость определения полной нуклеотидной последовательности генов или наиболее распространенных мутаций Предрасположенность к развитию колоректального рака Sporadic (65%–85%) Familial (10%–30%) Rare CRC Hereditary syndromes nonpolyposis colorectal (<0.1%) Familial adenomatous cancer (HNPCC) (5%) polyposis (FAP) (1%) Adapted from Burt RW et al. Prevention and Early Detection of CRC, 1996 Генетические маркеры развития рака молочной железы и яичников 1 Breast cancer gene 1 BRCA1 185 delAG 2 Breast cancer gene 1 BRCA1 T181G 3 Breast cancer gene 1 BRCA1 4153delA 4 Breast cancer gene 1 BRCA1 5382insC 5 Breast cancer gene 2 BRCA2 1528delAAAA 6 Breast cancer gene 2 BRCA2 1099SX C>G 7 Breast cancer gene 2 BRCA2 6174delT 8 Breast cancer gene 2 BRCA2 9318delAAAA Гены рака молочной железы 1 и 2 (BRCA1 и BRCA2) функционально препятствуют развитию рака молочной железы и, в меньшей степени, рака яичников. На настоящий момент известно около 1500 мутаций в этих генах, нарушающих их функцию и приводящих к развитию заболевания. В славянской популяции, а так же в этнической группе евреев Ашкенази наиболее часто выявляются патогенные мутации 185delAG, T181G, 4153delA, 5382insC в гене BRCA1 и 1528delAAAA, 1099SX C>G, 6174delT, 9318delAAAA в гене BRCA2. Обнаружение этих мутаций у пациентов увеличивает риск развития заболевания до 80%. При необходимости более точного прогноза рекомендуется проводить полное определение всей нуклеотидной последовательности генов BRCA1 и BRCA2. Полиморфизмы генов системы детоксикации организма 1 Цитохром CYP1A1 CYP1A1 I462V A1506G Цитохром CYP1A1 конвертирует полициклические ароматические углеводороды, являющиеся наиболее вредными компонентами табачного дыма в канцерогенные полупродукты. Вариант G полиморфизма 462V обуславливает повышенную активность цитохрома CYP1A1, что приводит к большей экспозиции вредных компонентов табачного дыма на легкие и, как следствие, приводит к повышенному риску развития рака легких.. 2 Цитохром CYP2D6 CYP2D6 G-A nt1 Цитохром CYP2D6, как и другие ферменты семейства цитохромов P-450, участвует в детоксикации ксенобиотиков. Кроме того, этот цитохром участвует в метаболизме примерно 20% современных лекарственных препаратов, в том числе таких адреноблокаторов, как метопролол, пропранолол, тимолол. Для носителей полиморфизмов, снижающих активность этого фермента необходим индивидуальный подбор дозировок препаратов; увеливается риск развития онкологических заболеваний. GSTP1 I105V A/G GSTP1 A114V C/T 5 GSTT1 del 6 GSTM1 del 3 4 Глутатион S-трансферазы В группу глутатион S трансфераз входят ферменты, играющие важную роль в детоксикации ксенобиотиков посредством присоединения глутатиона к субстратам. Варианты G полиморфизма I105V и Т полиморфизма A114V ассоциированы с повышенным риском развития различных форм рака (рак легких, рак молочной железы, лейкемия). Риск развития рака легких значительно повышается при курении. Делеции генов GSTT1 и GSTM1 так же обуславливают больший по сравнению с нормой риск развития новообразований. Во всех случаях риск развития заболевания многократно увеличивается при курении. Значимость генотипирования в оценке эффективности проводимой терапии. Неблагоприятные лекарственные реакции (Adverse Drug Reactions – ADR) Lazarou et all. 1998. JAMA (Journal of the American Medical Association) В 1994 году в США зарегистрировано: 2,2 млн. случаев тяжелых осложнений, обусловленных неблагоприятными лекарственными реакциями от правильно назначенных препаратов Свыше 100 000 случаев со смертельным исходом 4-6 место среди причин смерти Значимость генотипирования в оценке эффективности проводимой терапии. Фармакогеномика – наука, изучающая влияние генетических факторов на особенности реакции организма в ответ на медикаментозное воздействие Задачи фармакогеномики Разработка оптимальных мишеней для фармакологического воздействия 90% потенциальных лекарственных препаратов отсеиваются только на этапах клинических испытаний Разработка клинических фармакогеномных тестов Неблагоприятные лекарственные реакции (Adverse Drug Reactions – ADR) Lazarou et all. 1998. JAMA (Journal of the American Medical Association) В 1994 году в США зарегистрировано: 2,2 млн. случаев тяжелых осложнений, обусловленных неблагоприятными лекарственными реакциями Свыше 100 000 случаев со смертельным исходом 4-6 место среди причин смерти Лекарства с ярко выраженной индивидуальной переносимостью (по A.Philips, JAMA 14,2001) Therapeutic Category With Drug Class Cardiovascular B-blockers Drug Atenolol, metoprolol Angiotensin-converting enzyme inhibitors Lisinporil Diuretics Furosemide, hydrochlorothiazide Calcium channel blocker Ditiazem, verapamil Inotropic agents/pressors Digoxin Analgetic Nonsteroidal anti-inflammatory drugs Psychiatric Tricyclic antidepressants Antibiotics Penicillin Aspirin, piroxicam, ibuprofen, naproxen Impramine hydreochloride, notripthyline hydrochloride Amoxicillin Antitubercular agents Isoniazid, rifampicin Macrolides Erythromycin Other Anticoagulants Warfarin sodium Corticosteroids Prednisone Anticonvulsants Carbamazepine, phenytoin Antidiabetic agents Insulin Bronchodilators Theophylline Antihistamine Meclizine hydrochloride Основные причины неблагоприятных лекарственных реакций Ошибочное назначение препарата Качество лекарственного препарата Индивидуальная чувствительность Генетически детерминированная недостаточность или избыточность ферментов, метаболизирующих лекарственный препарат Нарушения в транспорте лекарственных препаратов и др. причины, не связанные с метаболизмом Этапы метаболизма лекарственных препаратов Фаза I Цитохромы P450 Эпоксид-гидролазы Активация ксенобиотиков с образованием активных промежуточных электрофильных метаболитов Фаза II Фаза III Глютатион-трансферазы N-ацетил трансферазы Преобразование активных промежуточных метаболитов в водорастворимые нетоксичные компоненты Выведение водорастворимых нетоксичных компонентов из организма Генетический полиморфизм ферментов детоксикации Фаза I Фаза II экспозиция активация детоксикация низкая высокая высокая низкая высокая низкая высокая низкая высокая низкая высокая низкая низкая высокая Риск развития патологии Цитохромы человека 15 групп 001 002 003 004 005 007 008 011 017 019 021 024 026 027 051 31подгруппа: 001A 001B 002A 002B 002C 002D 002E 002F 002G 002J 003A 004A 004B 004F 005A 007A 007B 008A 008B 011A 011B 017A 019A 021A 021B 024A 026B 027A 027B 051A 051P 59 генов 001A01 001B01 002A06 002A06V2 002A07 002A07P 002A13 002B06 002B07P 002C00 002C08 002C09 002C10 002C17 002C18 002C19 002D06 002D07P 002D08P 002E01 002F01 002G01 002J02 003A03 003A04 003A05 003A05P 003A07 003A43 004A11 004B01 004F02 004F03 004F03v1 004F08 004F09P 004F10P 004F11 004F12 005A01 007A01 007B01 008A00 008B01 011A01 011B01 011B02 017A01 019A00 021A01 021A02P 021B00 024A00 026B01 027A00 027B01 051A00 051P01 051P02 Функциональная значимость Метаболизм широкого спектра эндогенных (холестерин, стероидные гормоны, простагландины) и экзогенных (лекарственные препараты, канцерогены, мутагены, аллергены, пестициды) субстратов. Развитие мультифакториальных заболеваний в следствие нарушения экспрессии и регуляции генов индифидуальных цитохромов Полиморфизм генов цитохромов, ассоциированных с нарушенным метаболизмом ряда лекарств (по A.Philips, JAMA 14,2001) Ассоциация лекарственных препаратов, часто вызывающих побочные реакции и полиморфизма генов детоксикации (по A.Philips, JAMA 14,2001) CYP2C9. Биологическая значимость Подгруппа CYP2C 18% от всей цитохромной фракции печени Катализирует ~20% CYP-зависимых лекарственных препаратов СYP2C9 – варфарин, фенитоин, лозартан, ирбесартан, толбутамид, глипизид, торсемид, ибупрофен, пироксикам, изониазид. Варфарин Антикоагулянт непрямого действия Производное 4-гидроксикумарина Ингибирует синтез витамин-К зависимых факторов свертывания крови (факторы: VII, IX, X, II) Варфарин: Показания Профилактика и/или лечение: Венозные тромбозы Легочная эмболия Тромбоэмболические осложнения, связанные с мерцательной аритмией и трансплантацией сердечных клапанов Инфаркт миокарда: снижение риска смерти, повторного инфаркта миокарда и случаев тромбоэмболических осложнений (инсульт, системная эмболия) Профилактика и лечение кардиогенной эмболии Побочный эффект - кровотечение Факторы риска: Сопутствующие заболевания Применение других препаратов Нарушения дозировки Интенсивное воздействие антикоагулянта Индивидуальная чувствительность (обусловлена генетическим полиморфизмом в основном метаболизируещем ферменте – CYP2C9) Полиморфизм гена CYP2C9 Аллельные варианты гена: CYP2C9*1 – нормальная каталитическая активность 1075 ATT CGT 430 Exon 3 Exon 7 Arg Ile CYP2C9*2 (Arg144Cys) - пониженная каталитическая активность 430 TGT Exon 3 Cys Arg 1075 ATT Exon 7 Ile CYP2C9*3 (Ile359Leu) – выраженная пониженная каталитическая активность 1075 CTT 430 CGT Exon 3 Arg Exon 7 Leu Возможности генетической идентификации мутантных аллелей CYP2C9 *1 AvaII Ggagcattgaggaccgtgttcaagaggaagcccgc *2 ggagcattgaggatcgtgttcaagaggaagcccgc *1 NsiI Aggtccagagatgcattgaccttctccccaccagcc *3 aggtccagaggtaccttgaccttctccccaccagcc KpnI Полиморфизм гена CYP2C9 в российской поппуляции Клиническая группа: мужчины старше 35 лет (n=186) CYP2C9 CYP2C9 CYP2C9 CYP2C9 CYP2C9 CYP2C9 *1/*1 *2/*1 *2/*2 *3/*1 *3/*3 *2/*3 126 30 4 24 0 2 (67,7%) (16,1%) (2,1%) (12,9%) (0%) (1,1 %) Частота встречаемости аллелей: CYP2C9*1 CYP2C9*2 CYP2C9*3 0,82 0,11 0,07 Полиморфизм гена CYP2C9 и терапевтическая доза (мг/сутки). C.R.Lee et all. 2002. Pharmacogenetics. Выборк а 794 Генотип *1* 1 *1* 2 *1* 3 *2* *2*3 *3*3 2 5.28 4,59 3,78 3.04 3.52 0,5 Полиморфизм гена CYP2C9 и метаболизм других CYP-зависимых лекарственных препаратов. Фенитоин. Эпилепсия, постравматические состояния, нарушения мышления, болевые синдромы Показан пониженный метаболизм препарата у носителей CYP2C9*2 и CYP2C9*3 аллелей. Симптомы передозировки: атаксия, сонливость, дефицит витамина D и фолиевой кислоты Полиморфизм гена CYP2C9 и метаболизм других CYP-зависимых лекарственных препаратов. Толбутамид Инсулинонезависимый сахарный диабет легкого и среднетяжелого течения Показан пониженный метаболизм препарата у носителей CYP2C9*3 аллелей. Полиморфизм гена CYP2C9 и метаболизм других CYP-зависимых лекарственных препаратов. Лозартан (блокада ангиотензиновых рецепторов) Артериальная гипертензия Метаболизируется в фармакологически активную форму ферментом CYP2C9 и частично CYP3A4 Показан пониженный метаболизм препарата у носителей CYP2C9*3 аллелей. Полиморфизм гена CYP2C9 и метаболизм других CYP-зависимых лекарственных препаратов. Диклофенак, хлорпропамид, глипизид, флурбипрофен, торсемид, ирбесартан, ибупрофен Показаны CYP2C9-ассоциированные эффекты in vitro. Идут масштабные исследования in vivo Интерпретация результатов генотипирования Плейотропность влияния генетических полиморфизмов Оценка действия факторов внешней среды Вклад индивидуальных факторов (курение, алкоголь, диета) Осуществляется разработка биоинформационной базы данных по медицински значимым генетическим полиморфизмам Достоверность Степень риска Этническая привязка Кооперативный эффект генетических и средовых факторов, определяющих риск развития инфаркта миокарда у мужчин в возрасте до 45 лет Относительный риск 16 Курение 14 GPIIIa 12 5-HTT 10 8 GPIIIa+ST 6 Курение+ST 4 Курение+GPIIIa 2 0 Курение +ST+GPIIIa Результат генетического анализа. Пациент #V26. N Ген 1 Ангиотензинконвертирующий фермент Полиморфизмы АСЕ 2 3 Аполипротеин С3 АРОС3 4 5 Преобладающий генотип (Европейцы) Результат анализа Alu I/D ID ID -482C/T СC CT -455 T/C TT TC 3238 C/G (SstI) CC CC C>G Сер447Стоп CC CC N291S A/G AA AA Липопротеидная липаза LPL 7 Протромбин (Коагуляционный фактор II) F2 G-20210-A GG GG 8 Фактор Ляйдена (коагуляционный фактор V) F5 G-1691-A GG GG 9 Ингибитор активатора плазминогена SERPINE 1 (PAI-I) –675 (4G(-675)5G). 10 Фибриноген FGB beta polypeptid e G –455A GG GA 11 Тромбоцитарный рецептор фибриногена ITGB3 (GP IIIa) T –1565-C (L33P) TT TC 12 Метилентетрагидрофолатред уктаза MTHFR С-677-T (A223V) СC CT 13 Коагуляционный фактор VII F VII Arg353Gln 10976 G/A GG GG 14 Цитохром CYP2C9 (Чувствительность к варфарину) CYP2C9 CYP2C9*1 CYP2C9*1 6 15 5G/4G 5G/4G R144C (CYP2C9*2) L208V (CYP2C9*3) Результат генетического анализа. Пациент #V26 (продолжение). N Ген Мутация Преобладающий генотип Результат анализа 1 ADH1B 3 exon R-47-H G/A GG GG 2 ALDH2 12 exon E-487-K G/A GG GG 3 CYP2E1 5’-region -1293 to G/C GG GG 4 CYP2E17 intron 9896 C>G CC CC Результат анализа N Ген Ген Полиморфизм 1 Breast cancer gene 1 BRCA1 185 delAG не обн. 2 Breast cancer gene 1 BRCA1 T181G не обн. 3 Breast cancer gene 1 BRCA1 4153delA не обн. 4 Breast cancer gene 1 BRCA1 5382insC не обн. 5 Breast cancer gene 2 BRCA2 1528delAAAA не обн. 6 Breast cancer gene 2 BRCA2 1099SX C>G не обн. 7 Breast cancer gene 2 BRCA2 6174delT не обн. 8 Breast cancer gene 2 BRCA2 9318delAAAA не обн. 9 CYP1A1 CYP1A1 I462V A1506G AG 10 CYP2D6 CYP2D6 G-A nt1 GG 11 glutathione S-transferase GSTP1 I105V G/A GA 12 glutathione S-transferase GSTP1 A114V T/C CC 13 glutathione S-transferase GSTT1 del не обн. 14 glutathione S-transferase GSTM1 del не обн. Медицинское генотипирование человека. Значимость: Предиктивность, индивидуальность, информативность. Оценка здоровья «здоровых» Оценка факторов риска при планировании семьи Учет индивидуальных особенностей лекарственной терапии Возможность построения принципиально новых диагностических алгоритмов Перспективы…
