почему этой проблемой стоит заниматься?

Запрограммированная смерть
одноклеточных эукариот.
Федор Северин
НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, МГУ
[email protected]
http://yeastmolbiol.belozersky.msu.ru
почему этой проблемой стоит заниматься?
почему этой проблемой стоит заниматься?
- практический аспект: борьба с одноклеточными патогенами
почему этой проблемой стоит заниматься?
- практический аспект: борьба с одноклеточными патогенами
- моделирование апоптоза у высших организмов
почему этой проблемой стоит заниматься?
- практический аспект: борьба с одноклеточными патогенами
- моделирование апоптоза у высших организмов
- моделирование феноптоза высших организмов (?)
зачем нужна запрограммированная смерть
одноклеточных эукариотам?
зачем нужна запрограммированная смерть
одноклеточных эукариотам?
- при истощении питания часть клеток умирает, их содержимым
питаются остальные.
Durand PM, Rashidi A, Michod RE: How an organism dies
affects the fitness of its neighbors. Am Nat 2011, 177:224-232:
Запрограммированная смерть Chlamydomonas
reinhardtii полезна для выживших, простой лизис - нет
зачем нужна запрограммированная смерть
одноклеточных эукариотам?
- при истощении питания часть клеток умирает, их содержимым
питаются остальные.
Durand PM, Rashidi A, Michod RE: How an organism dies
affects the fitness of its neighbors. Am Nat 2011, 177:224-232:
Запрограммированная смерть Chlamydomonas
reinhardtii полезна для выживших, простой лизис – нет
- важно для паразитов: чтоб не убить хозяина слишком рано
зачем нужна запрограммированная смерть
одноклеточных эукариотам?
- при истощении питания часть клеток умирает, их содержимым
питаются остальные.
Durand PM, Rashidi A, Michod RE: How an organism dies
affects the fitness of its neighbors. Am Nat 2011, 177:224-232:
Запрограммированная смерть Chlamydomonas
reinhardtii полезна для выживших, простой лизис – нет
- важно для паразитов: чтоб не убить хозяина слишком рано
- очистка популяции от «слабых» (?)
Истощение среды роста
Неблагоприятные условия
клетка
клетка
Оторванная от коллектива
Неблагоприятные условия
клетка
клетка
В окружении других клеток
“Альтруистическая смерть”
Слизевики
У слизистого гриба Dictyostelium discoideum переход к многоклеточному образу
жизни индуцируется голоданием и начинается с агрегации отдельных амеб
сытые
Плодовое
тело
споры
цАМФ
голодные
смерть
“Альтруистическая смерть”
1) Истощение среды роста
2) Выяснение кто слабый
3) Слабые жертвуют себя в пользу сильных
Высокая плотность
клеток
Как возникла запрограммированная смерть одноклеточных в
процессе эволюции?
Как возникла запрограммированная смерть одноклеточных в
процессе эволюции?
«классический» апоптоз:
- Сигнал (повреждение ДНК, гормон….)
- Увеличение проницаемости внешней мембраны митохондрий
- Выход цитохрома с и других факторов из межмембранного
пространства
- цитохром с связывется с APAF
- APAF активирует каспазы
- внутривидовая борьба
- эгоистическая плазмида
-токсин устойчивее ингибитора:
смерть при снижении скорости
белка, следовательно, смерть
«слабых».
Taylor-Brown and Hurd, Parasites & Vectors 2013, 6:108
Запрограммированная смерть почкующихся дрожжей
Saccharomyces cerevisiae
Дрожжи
Saccharomyces cerevisiae
5 мкм
Наиболее изученные индукторы
запрограммированной смерти
дрожжей: перекись водорода,
уксусная кислота, осмотический
стресс и т.п., а также хронологическое
и репликативное старение
Маркеры апоптоза,
обнаруженные у дрожжей
1. Образование АФК (активных форм
кислорода)
2. Выход цитохрома с из митохондрий
3. Фрагментация ДНК на ранних этапах
4. Переход фосфатидилсерина из
внутреннего в наружный монослой
цитоплазматической мембраны
5. Чувствительность к ингибиторам
синтеза белка
6. Участие в процессе белков,
гомологичным апоптотическим
белкам животных :
- метакаспаза
- AIF
хронологическое и репликативное старение:
Хронологическое старение: клетки в жидкой культуре растут до стационарной
плотности, живут 2 – 3 недели, потом умирают.
- Хронологическое старение - модель старения высших организмов?
Хронологическое старение: клетки в жидкой культуре растут до стационарной
плотности, живут 2 – 3 недели, потом умирают.
- Хронологическое старение - модель старения высших организмов?
- много работ типа: ограничение по калориям, усиление антиоксидантной
защиты, мутации по гомологам/ортологам апоптозных генов млекопитающих
продлевали жизнь в этой модели
Хронологическое старение: клетки в жидкой культуре растут до стационарной
плотности, живут 2 – 3 недели, потом умирают.
- Хронологическое старение - модель старения высших организмов?
- много работ типа: ограничение по калориям, усиление антиоксидантной
защиты, мутации по гомологам/ортологам апоптозных генов млекопитающих
продлевали жизнь в этой модели
но:
- в воде живут годами
Хронологическое старение: клетки в жидкой культуре растут до стационарной
плотности, живут 2 – 3 недели, потом умирают.
- Хронологическое старение - модель старения высших организмов?
- много работ типа: ограничение по калориям, усиление антиоксидантной
защиты, мутации по гомологам-ортологам апоптозных генов млекопитающих
продлевали жизнь в этой модели
но:
- в воде живут годами
-в среде со стабилизированным pH –тоже.
все дело – в отравлении уксусной кислотой!
Дрожжи
Saccharomyces cerevisiae
5 мкм
Наиболее изученные индукторы
запрограммированной смерти
дрожжей: перекись водорода,
уксусная кислота, осмотический
стресс и т.п., а также хронологическое
и репликативное старение
Маркеры апоптоза,
обнаруженные у дрожжей
1. Образование АФК (активных форм
кислорода)
2. Выход цитохрома с из митохондрий
3. Фрагментация ДНК на ранних этапах
4. Переход фосфатидилсерина из
внутреннего в наружный монослой
цитоплазматической мембраны
5. Чувствительность к ингибиторам
синтеза белка
6. Участие в процессе белков,
гомологичным апоптотическим
белкам животных :
- метакаспаза
- AIF
Saccharomyces cerevisiae
феромоны
α
альфа
Альфа-фактор
α
α
Былобизвестно: большие дозы альфа-фактора токсичны для дрожжей.
Вопрос: не связано ли это с индукцией запрограммированной клеточной смерти
Дрожжи а-типа, обработанные высокой (100х) дозой
альфа-фактора
АФК
Фаза
Флоксин Б (мертвые клетки)
-феромон
+феромон
мутант ste20
+ феромон
Насколько физиологична 100-кратная доза феромона?
Смесь а- и альфа-клеток: эффект вещества, тормозящего
слияние клеточных стенок
без добавок
+ хлорохин
Окраска флоксином Б
Вывод: при задержке спаривания естественные концентрации феромонов
достигают смертельных значений
Феромоновую смерть можно снизить добавлением антиоксидантов или
нокаутом белка Ysp1
Это указывает на то, что феромон – зависимая смерть – не просто пассивный
лизис клеток, а активный каскад
Изучение механизма феромон-зависимой смерти:
опосредована повышением концетрации кальция в цитозоле.
Для повышения эффективности экспериментальной модели вместо
Феромона использовали искусственный индуктор повышения
концетрации кальция
Амиодарон, 80 мкМ
«пет» - петитная форма дрожжей (без мито-ДНК)
«миксо» - миксотиазол, ингибитор дыхательной цепи
«ysp1» - нокаут гена, найденного в скрининге
«F» - FCCP, протонофор (разобщитель)
Почему FCCP в небольшой концентрации спасает от смерти?
FCCP
H+
Дыхательная
цепь
“протечка”
АТФ-синтаза
H+
почему снижение сопротивления мембраны
может быть полезным?
Гиперполяризация митохондрий вызывает генерацию АФК
Sergey S. Korshunov, Vladimir P. Skulachev, Anatoly A. Starkov
FEBS Lett. 1997
Феромон, как и амиодарон, вызывает гипер-поляризацию митохондрий
Каков механизм гипер-поляризации, вызванной амиодароном?
олигомицин
H+
Дыхательная
цепь
H+
“протечка”
АТФ-синтаза
FCCP
Концентрация кислорода
Вывод: амиодарон увеличивает сопротивление мембраны
Оценка уровня гипер-поляризации митохондрий и АФК методом проточной флуорометрии (FACS)
FCCP снижает оба параметра, а нокаут YSP1 – не снижает.
Почему нокаут улучшает выживание?
реконструкция структуры митохондрий путем объединения 20 оптических
срезов через клетку
10 мкм
нокаут YSP1 и N-ацетил-цистеин препятствуют фрагментации митохондрий
Модель амиодароновой смерти использовали для поиска участников каскада с помощью скринирования делеционной библиотеки
5 мкм
Найден ген YSP2 – как и YSP1, мембранный белок без очевидных гомологий
почему ингибирование фрагментации митохондрий защищает клетку
от смерти?
почему ингибирование фрагментации митохондрий защищает клетку
от смерти?
набухание матрикса приводит к разрыву наружной мембраны митохондрий
возможно, в нокаутах по YSP1 и YSP2
фрагментируется только внутренняя мембрана митохондрий?
При этом площадь поверхности не изменяется,
а максимальный суммарный объем уменьшается
Inactivation of YSP2 protects cells from amiodarone induced death AND
increases number of cells with "mosaic" pattern of mitochondria staining
Normal mitochondria
network
Mosaic staining
Depolarized mitochondria
(dead cells)
JC-1 staining of amiodarone treated cells
WT
1%
11%
88%
Δysp2
2%
35%
63%
Laser hit experiments
laser
laser
A
Wild-type cells
ysp2-delta cells
Before
laser
After
laser
ЛАЗЕР??
5 min
10 min
Электронная микроскопия: митохондрия в ysp2 мутанте
феромон
подъем
уровня сопряжения
(1)
рецептор
(2)
амиодарон
(1а)
∆ste20
(3)
(4)
подъем [Ca]
в цитоплазме
синтез белка
циклогексимид
(5)
(6)
подъем ∆Ψ
(7)
низкий FCCP
миксотиазол
митохондрия
Модель каскада феромон-зависимой смерти
NAC, токоферол
АФК
(8)
Ysp1, Ysp2-зависимая
фрагментация митохондрий
(9)
падение ∆Ψ, выход
цитохрома ц
(10)
смерть клетки
∆ysp1,
∆ysp2
Гиперполяризация митохондрий вызывает генерацию АФК
Sergey S. Korshunov, Vladimir P. Skulachev, Anatoly A. Starkov
FEBS Lett. 1997
как снизить мембранный потенциал «мягким» образом?
- использовать протонофор, который будет ингибировать собственное
действие при повышении концентрации
Б
C12TPP
SkQ1
Положительно-заряженные
протонофоры (ионы класса SkQ)
- использовать протонофор, который будет ингибировать собственное
действие при повышении концентрации
Б
C12TPP
SkQ1
Положительно-заряженные
протонофоры (ионы класса SkQ)
Стимуляция дыхания
Низкий pH в цитоплазме
тормозит дыхательную цепь.
Поэтому при закислении среды
добавка FCCP не стимулирует
потребление кислорода
C12-TPP
В отличии от FCCP, положительнозаряженный протонофор ускоряет
дыхание даже при pH=3 в среде
С12TPP – мягкий митохондриальноадресованный протонофор.
Перспективное вещество для
применения в медицине. Сейчас идут
испытания на мышах
Немного на тему митоптоза (не путать с апоптозом)
Клетки S. сerevisiae часто мутируют или теряют митохондриальную ДНК
Grande
растут на несбраживаемом
источнике углерода
petite
не растут на
несбраживаемом
источнике углерода
Клетки petite растут медленно, но устойчивы к стрессам.
Устойчивость к митохондриальным ядам; активация
retrograde response и, как следствие, экспрессия MDR.
- является ли переход в petite активным процессом, типа
перехода в persister у бактерий?
Переход в persister обратим. Возможен ли переход из
petite в Grande?
Haploid
Grande
Haploid
petite
10-2
survival
in unfavorable
conditions
Haploid
petite
Haploid
Grande
meiosis
10-4
Diploid
Grande
Diploid
petite
degradation
Очень многие стрессы во много раз увеличивают вероятность
перехода в petite. Этот факт – в пользу активной программы
случайное наблюдение:
Erythromycin (Er) protects the cells from EtBr-induced petite transformation.
- один из продуктов митохондриальной трансляции разрушает
мито-ДНК при стрессе?
Var1, кодируется геномом митохондрий,
белок митохондриальных рибосом
аргинины, лизины
Var1
глутамины, аспарагины
- положительно заряжен и легко агрегирует
Erythromycin (Er) protects the control but not Var1u cells from EtBr-induced petite
transformation.
Var1u – клетки, экспрессирующие модифицированный Var1 в ядре.
Erythromycin protects control but not Var1u cells from heat shock-induced petite
transformation.
Nuclear expression of Var1 decreases cellular content of DNA-positive structures after
heat shock.
DNase affects Var1 content in purified nucleoids. Nucleoids were purified on a
discontinuous sucrose gradient with or without DNase addition. Four nucleoid fractions
were collected from each sample
Допустим, переход в petite - активная программа.
Зачем избавляться от ДНК? Можно вместо этого, например,
заглушить митохондриальную транскрипцию
Клетки переходят в petite при старении
Переход сопровождается паузой: клетки ищут способы усиления работы
митоАТФ-азы и, возможно, других дефектов энергетического обмена.
Veatch JR, McMurray MA, Nelson ZW, Gottschling DE.
Mitochondrial dysfunction leads to nuclear genome instability via an iron-sulfur
cluster defect
Cell. 2009, 137(7):1247-58.
Допустим, переход в petite - активная программа.
Зачем избавляться от ДНК? Можно вместо этого, например,
заглушить митохондриальную транскрипцию
Избавление от ДНК – более радикально (долговременно).
Вынуждает оптимизировать некоторые параметры
энергетического обмена
Механизм токсичности агрегации белков, вызванной удлиненными
полиглутаминами (полиQ). Экспрессия полиQ-CFP в дрожжах.
CFP- синий цвет, иодид пропидия
(мертвые клетки) – красный,
FITC-VAD-fmk (детекция каспазной
активности) – зеленый.
ко-локализация, %
103Q накапливается в ядре, делеция
дрожжевого гомолога каспаз
предотвращает это накопление.
Следовательно, 103Q-зависимая смерть –
активный процесс. Значит, можно пытаться
прервать каскад нокаутом гена.
Отношение размеров колоний при и без индукции 103Q, %
Дикий
тип
нокауты
гиперэкспрессия
Ase1 – субстрат циклосомы
регуляция клеточного цикла
циклины
Cdk1
этапы фаза деления
циклосома (APC-Cdc20 и APC-Cdh1)
поли-убиквитинирование циклинов
деградация циклинов в протеасоме
переход в G0/G1
рабочая модель:
Отношение размеров колоний при и без индукции 103Q, %
Дикий
тип
нокауты
гиперэкспрессия
контроль
103Q
Δclb6
Δclb6,
103Q
- накопление субстратов циклосомы (циклины, Ase1) являются
лимитирующим в клетках, экспрессирующих 103Q.
контроль
103Q
Δclb6
Δclb6,
103Q
- накопление субстратов циклосомы (циклины, Ase1) являются
лимитирующим в клетках, экспрессирующих 103Q.
а какова ситуация при нейродегенеративных заболеваниях?
репликативное старение: клетки генерируют 20 – 30 дочек,
и только потом умирают.
SIR2 – ген семейства сиртуинов
• Гомологи SIR2 встречаются у C. elegans, дрозофилы, у
млекопитающих
• SIR2 продлевает репликативную продолжительность жизни
дрожжей и тормозит старение высших организмов
♦ - wt
▲- sir2Δ
× - sir2Δ SIR2
■ - SIR2 SIR2
Guarante L. (2013) Methods Mol Biol. ; Kaeberlein M et al. (1999) Genes Dev.
репликативное старение: клетки генерируют 20 – 30 дочек,
и только потом умирают. Почему так много?
- возможно, функциональная готовность дрожжей снижается значительно
раньше, чем средняя продолжительность жизни (как и у людей)
Заключение
Sorokin et al., 2014