запрограммированная смерть микроорганизмов. Федор Северин НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, МГУ
advertisement
запрограммированная смерть микроорганизмов. Федор Северин НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, МГУ severin@mail.genebee.msu.ru http://yeastmolbiol.belozersky.msu.ru Истощение среды роста Неблагоприятные условия клетка клетка Оторванная от коллектива Неблагоприятные условия клетка клетка В окружении других клеток “Альтруистическая смерть” PCD in autolysis of S. pneumoniae. Lewis K Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000; Model of the fate of a bacterial population. GASP – growth advantage at stationary phase Lewis K Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000; Слизевики У слизистого гриба Dictyostelium discoideum переход к многоклеточному образу жизни индуцируется голоданием и начинается с агрегации отдельных амеб сытые Плодовое тело споры цАМФ голодные смерть “Альтруистическая смерть” 1) Истощение среды роста 2) Выяснение кто слабый 3) Слабые жертвуют себя в пользу сильных Высокая плотность клеток «классический» апоптоз: Сигнал (повреждение ДНК, гормон….) Увеличение проницаемости внешней мембраны митохондрий Выход цитохрома с и других факторов из межмембранного пространства цитохром с связывется с APAF APAF активирует каспазы Дрожжи Saccharomyces cerevisiae 5 мкм Наиболее изученные индукторы запрограммированной смерти дрожжей: перекись водорода, уксусная кислота, осмотический стресс и т.п. Маркеры апоптоза, обнаруженные у дрожжей 1. Образование АФК (активных форм кислорода) 2. Выход цитохрома с из митохондрий 3. Фрагментация ДНК на ранних этапах 4. Переход фосфатидилсерина из внутреннего в наружный монослой цитоплазматической мембраны 5. Чувствительность к ингибиторам синтеза белка 6. Участие в процессе белков, гомологичным апоптотическим белкам животных : - метакаспаза - AIF Saccharomyces cerevisiae феромоны α альфа Альфа-фактор α α Былобизвестно: большие дозы альфа-фактора токсичны для дрожжей. Вопрос: не связано ли это с индукцией запрограммированной клеточной смерти Дрожжи а-типа, обработанные высокой (100х) дозой альфа-фактора АФК Фаза Флоксин Б (мертвые клетки) -феромон +феромон мутант ste20 + феромон Насколько физиологична 100-кратная доза феромона? Смесь а- и альфа-клеток: эффект вещества, тормозящего слияние клеточных стенок без добавок + хлорохин Окраска флоксином Б Вывод: при задержке спаривания естественные концентрации феромонов достигают смертельных значений Феромоновую смерть можно снизить добавлением антиоксидантов или нокаутом белка Ysp1 Это указывает на то, что феромон – зависимая смерть – не просто пассивный лизис клеток, а активный каскад Изучение механизма феромон-зависимой смерти: опосредована повышением концетрации кальция в цитозоле. Для повышения эффективности экспериментальной модели вместо Феромона использовали искусственный индуктор повышения концетрации кальция Амиодарон, 80 мкМ «пет» - петитная форма дрожжей (без мито-ДНК) «миксо» - миксотиазол, ингибитор дыхательной цепи «ysp1» - нокаут гена, найденного в скрининге «F» - FCCP, протонофор (разобщитель) Почему FCCP в небольшой концентрации спасает от смерти? FCCP H+ Дыхательная цепь “протечка” АТФ-синтаза H+ почему снижение сопротивления мембраны может быть полезным? Гиперполяризация митохондрий вызывает генерацию АФК Sergey S. Korshunov, Vladimir P. Skulachev, Anatoly A. Starkov FEBS Lett. 1997 Феромон, как и амиодарон, вызывает гипер-поляризацию митохондрий Каков механизм гипер-поляризации, вызванной амиодароном? олигомицин H+ Дыхательная цепь H+ “протечка” АТФ-синтаза FCCP Концентрация кислорода Вывод: амиодарон увеличивает сопротивление мембраны Оценка уровня гипер-поляризации митохондрий и АФК методом проточной флуорометрии (FACS) FCCP снижает оба параметра, а нокаут YSP1 – не снижает. Почему нокаут улучшает выживание? реконструкция структуры митохондрий путем объединения 20 оптических срезов через клетку 10 мкм нокаут YSP1 и N-ацетил-цистеин препятствуют фрагментации митохондрий Модель амиодароновой смерти использовали для поиска участников каскада с помощью скринирования делеционной библиотеки 5 мкм Найден ген YSP2 – как и YSP1, мембранный белок без очевидных гомологий почему ингибирование фрагментации митохондрий защищает клетку от смерти? почему ингибирование фрагментации митохондрий защищает клетку от смерти? набухание матрикса приводит к разрыву наружной мембраны митохондрий возможно, в нокаутах по YSP1 и YSP2 фрагментируется только внутренняя мембрана митохондрий? При этом площадь поверхности не изменяется, а максимальный суммарный объем уменьшается Inactivation of YSP2 protects cells from amiodarone induced death AND increases number of cells with "mosaic" pattern of mitochondria staining Normal mitochondria network Mosaic staining Depolarized mitochondria (dead cells) JC-1 staining of amiodarone treated cells WT 1% 11% 88% Δysp2 2% 35% 63% Laser hit experiments laser laser A Wild-type cells ysp2-delta cells Before laser After laser ЛАЗЕР?? 5 min 10 min Электронная микроскопия: митохондрия в ysp2 мутанте феромон подъем уровня сопряжения (1) рецептор (2) амиодарон (1а) ∆ste20 (3) (4) подъем [Ca] в цитоплазме синтез белка циклогексимид (5) (6) подъем ∆Ψ (7) низкий FCCP миксотиазол митохондрия Модель каскада феромон-зависимой смерти NAC, токоферол АФК (8) Ysp1, Ysp2-зависимая фрагментация митохондрий (9) падение ∆Ψ, выход цитохрома ц (10) смерть клетки ∆ysp1, ∆ysp2 Гиперполяризация митохондрий вызывает генерацию АФК Sergey S. Korshunov, Vladimir P. Skulachev, Anatoly A. Starkov FEBS Lett. 1997 как снизить мембранный потенциал «мягким» образом? - использовать протонофор, который будет ингибировать собственное действие при повышении концентрации Б C12TPP SkQ1 Положительно-заряженные протонофоры (ионы класса SkQ) - использовать протонофор, который будет ингибировать собственное действие при повышении концентрации Б C12TPP SkQ1 Положительно-заряженные протонофоры (ионы класса SkQ) Стимуляция дыхания Низкий pH в цитоплазме тормозит дыхательную цепь. Поэтому при закислении среды добавка FCCP не стимулирует потребление кислорода C12-TPP В отличии от FCCP, положительнозаряженный протонофор ускоряет дыхание даже при pH=3 в среде С12TPP – мягкий митохондриальноадресованный протонофор. Перспективное вещество для применения в медицине. Сейчас идут испытания на мышах повреждающее и защитное действие АФК Иногда в ответ на ухудшение условий клетка вырабатывает количество АФК, достаточное для индукции анти-оксидантных систем и таким образом «готовится» к более сильным стрессам. Рассматривая популяцию дрожжевых клеток, логично ожидать, что относительно небольшой стресс будет индуцировать защитные АФК, а высокий уровень стресса (достаточный для массированного повреждения генома клетки) вызовет АФК-индукторы каскада смерти метилметансульфонат (ММС) – метилирующий агент, повреждающий ДНК Ионол (анти-оксидант) контроль Менадион (про-оксидант) Другие про-оксиданты действуют подобно менадиону Окраска на АФК контр С12ТРР СTAB SDS Морфология митохондрий C12TPP в высокой концентрации – мягкий про-оксидант А ответ на стресс Выживание, % ММС Н2О2 другие менадион ММС, мкМ Б катаболизм ДНК-связывающие В Синхронизованные клетки актиномицин + С12-ТРР актиномицин + менадион актиномицин менадион С12-ТРР без добавок Выживание, % Ингибирование транскрипции убирает защитное действие про-оксидантов Защитное действие про-оксидантов опосредовано их эффектом на экспрессию генов Механизм токсичности агрегации белков, вызванной удлиненными полиглутаминами (полиQ). Экспрессия полиQ-CFP в дрожжах. CFP- синий цвет, иодид пропидия (мертвые клетки) – красный, FITC-VAD-fmk (детекция каспазной активности) – зеленый. ко-локализация, % 103Q накапливается в ядре, делеция дрожжевого гомолога каспаз предотвращает это накопление. Следовательно, 103Q-зависимая смерть – активный процесс. Значит, можно пытаться прервать каскад нокаутом гена. Отношение размеров колоний при и без индукции 103Q, % Дикий тип нокауты гиперэкспрессия Ase1 – субстрат циклосомы регуляция клеточного цикла циклины Cdk1 этапы фаза деления циклосома (APC-Cdc20 и APC-Cdh1) поли-убиквитинирование циклинов деградация циклинов в протеасоме переход в G0/G1 рабочая модель: Отношение размеров колоний при и без индукции 103Q, % Дикий тип нокауты гиперэкспрессия контроль 103Q Δclb6 Δclb6, 103Q - накопление субстратов циклосомы (циклины, Ase1) являются лимитирующим в клетках, экспрессирующих 103Q. контроль 103Q Δclb6 Δclb6, 103Q - накопление субстратов циклосомы (циклины, Ase1) являются лимитирующим в клетках, экспрессирующих 103Q. а какова ситуация при нейродегенеративных заболеваниях?
