КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

Структурно-функциональная организация ферментов
Леонор Михаэлис
Мауде Леонора Ментен
Берлин, 1912 г.
Структурно-функциональная организация ферментов
Задача
• Получить уравнение для скорости
ферментативной реакции, исходя из
известных, доступных наблюдению
параметров
Структурно-функциональная организация ферментов
Начальная скорость
Структурно-функциональная организация ферментов
Уравнение Михаэлиса-Ментен
В чем его смысл? — Позволяет получить формальные
характеристики скорости ферментативной реакции вида
ES
•
•
•
k1
k-1
ES
k2
k-2
EP
Уравнение реакции превращения субстрата (S) в продукт (P),
катализируемой ферментом (E);
Уравнение Михаэлиса-Ментен описывает зависимость скорости
реакции от концентрации субстрата и, в частности, демонстриует
явление насыщения.
Условия, при которых работает уравнение Михаэлиса-Ментен:
1)
2)
3)
Стационарная фаза реакции, т.е. [ES]=const, d[ES]/dt=0;
Измеряется начальная скорость; [S]  [S0]
[E] = [E0] – [ES]
Структурно-функциональная организация ферментов
Формальная ферментативная кинетика
•
Скорость мономолекулярной реакции прямо пропорциональна
концентрации вещества [A]
AP
v
v
d [ A]
 k[ A]
dt
[A]
•
Если ту же реакцию катализирует фермент, при определенной
концентрации наблюдается насыщение.
ент
A Ферм

 P
v
[A]
Структурно-функциональная организация ферментов
Условие стационара 
ES
k1
k2
ES
k-1
k-2
EP
• При стационарной фазе реакции концентрация
фермент-субстратного комплекса, [ES], не
меняется
d [ ES ]

dt
0
• Престационарная фаза, при которой происходит
накопление [ES] обычно очень короткая
• Уравнение Михаэлиса-Ментен описывает скорость
ферментаивной реакции только в стационарной
фазе
Структурно-функциональная организация ферментов
Измеряется начальная скорость
k1
ES
k-1
k2
ES
k-2
EP
• В начале реакции концентрация продукта, [P] очень
мала. Так что количеством [ES], полученного из
обратной реакции E+P, можно пренебречь.
• Иными словами, реакция ES -> E+P необратима
• Субстрат только начал расходоваться, [S]  [S0].
• В этом случае уравнение приобретает вид:
ES
k1
K-1
ES
k2
EP
Структурно-функциональная организация ферментов
Скорость реакции пропорциональна
концентрациям реагентов
ES
k1
k-1
ES
k2
EP
• Пригодилось наследие неферментативной кинетики:
• Скорость накопления фермент-субстратного комплекса, vf :
v f  k1 E S 
• Скорость обратной реакции (исчезновения ES) vd :
vd  k 1 ES   k 2 ES   (k 1  k 2 )ES 
• В стационарной фазе [ES] не меняется:
k1E S   (k1  k2 )ES 
v f  vd
Структурно-функциональная организация ферментов
Вывод уравнения Михаэлиса-Ментен
• Мы не можем узнать текущую концентрацию фермента, но
знаем начальную [Eo], которая равна сумме концентраций
комплекса [ES] и текущей концентрации свободного
фермента, [E]:
Et   ES   E 
v f  k1 E S   k1 (Et   ES )S 
• В стационарной фазе скорость концентрация [ES] постоянна:
 k1 (Et   ES )S   (k 1  k 2 )ES 
 k1 Et   k1 ES S   (k 1  k 2 )ES 


Et S 
k1 Et S 
 ES  

(k1 S   (k 1  k 2 )) S   (k 1  k 2 )
k1 Et S   k1 ES S   (k 1  k 2 )ES 
k1 Et S   ES (k1 S   (k 1  k 2 ))
K m  ( k 1  k 2 )
k1
  
ES  
k1
• Скорость образования продукта v = k2[ES] :
v
k 2 Et S 
S   K m
Et S 
S   K m
Структурно-функциональная организация ферментов
Некоторые следствия уравнения ММ
• Скорость образования продукта обычно можно наблюдать
экспериментально.
• Максимальная скорость достигается при полном насыщении
субстратом, когда [S] ∞
v[ S ]
k E 
 2 K t  k 2 Et   v max
1  m [S ]
Переписываем уравнением ММ в виде:
Скорость реакции уже
не меняется
v
v max S 
S   K m
Структурно-функциональная организация ферментов
Смысл Km
• Km выводится из констант скоростей
Km 
k 1  k 2
k1
• Km в условиях Михаэлиса-Ментен определяет скорость
распада фермент-субстратного комплекса
k1
k1[ E]S   k 1[ ES ]
при
равновесии,
ES
ES
k-1
Kd 
[ E ]S  k 1

[ ES ]
k1
Константа диссоциации
Маленькая Km означает сильное связывание; высокая Km
означает слабое связывание.
• Km равна концентрации субстрата, при которой скорость
реакции равна половине максимальной v=1/2vmax
Структурно-функциональная организация ферментов
Смысл vmax
• Vmax в реальности недостижима, поскольку
требуется, чтобы все молекулы фермента были
заняты субстратом (а как же химическое
равновесие?)
ES
k1
k-1
ES
k cat 
vmax
[ E0 ]
• Число оборотов, kcat, —
Равно
числу молекул субстрата, превращаемых в продукт
одной молекулой фермента в единицу времени при
условии насыщения фермента субстратом,
[S]>>[Et],
vmax
k2 
[ E0 ]
 kcat
Структурно-функциональная организация ферментов
Vmax (число оборотов) некоторых
ферментов
Фермент
Скорость (c-1)
Каталаза
40 000 000
Ацетилхолинэстераза
Лактат-дегидрогеназа
Химотрипсин
ДНК-полимераза I
Лизоцим
14 000
1 000
100
15
0,5
Структурно-функциональная организация ферментов
Порядок уравнения ММ
• Когда концентрация субстрата мала, уравнение
ММ — уравнение первого порядка по [S]
v 
kcat [ E0 ][ S ] kcat [ E0 ][S]

[S ]  K m
Km

• При той же низкой концентрации субстрата,
[Et][E],
уравнение ММ — второго порядка по [E] и [S],
kcat/Km называют кажущейся константой второго
порядка:
k [ E ][S] k [ E ][S]
v 
cat
t
Km

cat
Km
• Когда концентрация субстрата велика, уравнение
ММ — уравнение нулевого порядка по [S]:
v 
vmax [ Et ][ S ]
 vmax [ Et ]
[S ]  K m
Структурно-функциональная организация ферментов
КПД ферментативного катализа, kcat/Km
• kcat/Km говорит о том, насколько «хорошо
работает» фермент
v 
kcat [ E0 ][S] kcat [ E ][S]

Km
Km
• Верхний предел kcat/Km лимитируется
скоростью диффузии E и S
k cat
k
k 2 k1
 2 
 k1
K m K m k 1  k 2
Структурно-функциональная организация ферментов
Графическое представление
уравнения ММ
•
v 
v max [ S ]
[S ]  K m
можно изобразить так
v
vmax
Km
• но это непрактично
[S]
Структурно-функциональная организация ферментов
Линеаризация по Лайнуиверу и Берку
(Lineweaver-Burk)
• Уравнение ММ приобретает вид y=kx+b для обратных
координат:
v 
vmax [ S ]
K
1 [S ]  K m
1
1
 

 m 
[S ]  K m
v
vmax [ S ] vmax vmax [S ]
1/v
Угловой к-т=Km/vmax
-1/Km
1/vmax
1/[S]
•График в двойных обратных координатах
Структурно-функциональная организация ферментов
Картинка из жизни
Структурно-функциональная организация ферментов
Картинка из хорошей жизни
Структурно-функциональная организация ферментов
Линеаризация по Эди-Хофсти
(Eadie-Hofstee)
v 
vmax [ S ]
K v
 v[ S ]  K m   vmax [ S ]  v[ S ]  vmax [ S ]  K m v  v  vmax  m
[S ]  K m
[S ]
v
vmax
Угловой к-т=-Km
v/[S]
Структурно-функциональная организация ферментов
Линеаризация по Хейнсу-Вольфу
(Hanes-Wolff), они же Диксон и Уэбб
v 
vmax [S ]
[S ] [S ]  K m [S ] K m




[S ]  K m
v
vmax
vmax vmax
[S]/v
-Km
Угловой к-т=1/vmax
Km/vmax
•Hanes-Wolff Plot
[S]
Структурно-функциональная организация ферментов
Ингибирование ферментов
• Ингибиторы — связываются с ферментами и уменьшают их
активность.
• Бывают обратимыми и необратимыми;
• Обратимые ингибиторы связываются с ферментами
посредством невалентных взаимодействий. Различают два
вида обратимых ингибиторов
– Конкурентные ингибиторы;
– Неконкурентные ингибиторы;
• Необратимые ингибиторы ковалентно связываются с
ферментами, уменьшая концентрацию активных ферментов.
Структурно-функциональная организация ферментов
Обратимые ингибиторы
субстрат
неконкурентный
ингибитор
конкурентный
ингибитор
Структурно-функциональная организация ферментов
Влияние ингибиторов на
уравнение ММ
k 2 Et S 
v
S   K m
Структурно-функциональная организация ферментов
Конкурентные обратимые ингибиторы
связывание только с E
ES

I
k3
k1
k-1
v 
k-3
EI
ES
k2
v max [ S ]
[I ]
[ S ]  K m (1 
)
KI
v
EP
Km повышается
vmax не меняется
+ингибитор
1/v
vmax
Угл. к-т=Km/vmax
Угл. к-т= Km(1+[I]/KI)/vmax
Km
Km(1+[I]/KI)
[S]
-1/Km
1/vmax
-1/(Km(1+[I]/KI))
1/[S]
Структурно-функциональная организация ферментов
Неконкурентные обратимые ингибиторы
Связывание с E и ES
ES

k1
k-1
ES

I
I
KI’
KI
EI  S
EIS
k2
v 
EP
[S ]

[S ]  K m
v max
[I ]
(1 
)
KI
Km не меняется
vmax уменьшается
v
+ингибитор
1/v
vmax
(1+[I]/KI)/Vmax
Vmax/(1+[I]/KI)
Km
Km
[S]
-1/Km
Угл. к-т =Km/vmax
Угл. к-т= Km(1+[I]/KI)/vmax
1/vmax
1/[S]
Структурно-функциональная организация ферментов
Бесконкурентные обратимые ингибиторы
Связывание только с ES
k1
ES
•
k-1
Km уменьшается
vmax уменьшается
Km /vmax не изм
ES

I
KI’
k2
v 
EIS
EP
v max
[S ]

Km
K
(1  I )
[S ] 
K
[I ]
(1  I )
[I ]
+inhibitor
v
1/v
vmax
(1+ KI/[I])/Vmax
Vmax/(1+KI/[I])
Km/(1+ KI/[I]) Km
[S]
-1/Km
- (1+ KI/[I])/Km
Slope=Km/vmax
Угл. к-т = Km/vmax
1/vmax
1/[S]
Структурно-функциональная организация ферментов
Смешанный тип ингибирования
+ингибитор
1/v
Угл. к-т =Km/vmax
-1/Km
1/vmax
1/[S]
+ингибитор
1/v
Угл. к-т=Km/vmax
-1/Km
1/vmax
1/[S]