Инструкция к набору - Ольвекс Диагностикум

Инструкция по применению набора, укомлектованного
реагентами из наборов для определения активности
аланинаминотрансферазы в сыворотке крови «АЛТ-РФОЛЬВЕКС» кат. № 001.001 и для определения активности
аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови «АСТ-РФОЛЬВЕКС» кат. № 002.001.
АЛТ-РФ-ОЛЬВЕКС
АСТ-РФ-ОЛЬВЕКС
Кат.№: 001.006 – 200 определений АЛТ
200 определений АСТ
_______________________________________________________________________________________
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор предназначен для количественного определения
активности аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови человека с фиксированным временем
инкубации в клинико-диагностических и биохимических
лабораториях и в научно-исследовательской практике.
Набор рассчитан на проведение по 200 определений каждой из
трансаминаз при конечном объёме реакционной смеси 3,05 мл.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Аланинаминотрансфераза (АЛТ) катализирует реакцию переаминирования между L-аланином и α-кетоглутаровой кислотой с
образованием пирувата.
Аспартатаминотрансфераза (АСТ) катализирует реакцию переаминирования между L-аспартатом и α-кетоглутаровой кислотой
с образованием оксалоацетата.
Далее пируват и оксалоацетат в щелочной среде реагируют с
2,4-ДНФГ
(динитрофенилгидразином)
с
образованием
окрашенных продуктов реакции гидразонов пирувата и
оксалоацетата. Интенсивность окраски реакционной среды
пропорциональна
активности
трасаминаз
(количеству
образовавшихся соответствующих гидразонов) и определяется
фотометрически при длине волны 537 (500-560) нм.
СХЕМА РЕАКЦИИ
L-аланин + α-кетоглутарат
L-аспартат + α-кетоглутарат
АЛТ
АСТ
пируват + L-глутамат
оксалоацетат + L-глутамат
СОСТАВ НАБОРА
Реагент 1 Реагент 1 Реагент 2 Реагент 3 Калибр.
Кат.№
АЛТ
АСТ
ДНФГ
NaOH
пируват
001.006
50 мл
50 мл
100 мл
100 мл
4 мл
Реагент 1 АЛТ (буфер-субстратная смесь)
Фосфатный буфер, рН 7,40
100 ммоль/л
L-аланин
100 ммоль/л
α-Кетоглутаровая кислота
2,0 ммоль/л
Азид натрия
0,5 г/л
Реагент 1 АСТ (буфер-субстратная смесь)
Фосфатный буфер, рН 7,40
100 ммоль/л
Аспартат натрия
100 ммоль/л
α-Кетоглутаровая кислота
2,0 ммоль/л
Азид натрия
0,5 г/л
Реагент 2 (раствор 2,4-ДНФГ)
2,4-Динитрофенилгидразин
1,0 ммоль/л
Соляная кислота (3 % раствор)
1,0 моль/л
Реагент 3 (натрия гидроокись)
Натрия гидроокись
4,0 ммоль/л
Калибратор:
(калибровочный раствор пирувата натрия 1,0 ммоль/л)
Пируват натрия
1,0 ммоль/л
Азид натрия
1 г/л
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
 Линейная область определения активности трансаминаз в
диапазоне от 0,03 до 1,67 мкмоль/(с×л);
 отклонение от линейности не более 10;
 чувствительность определения не более 0,01 мкмоль/(с×л);
 коэффициент вариации определений не более 10.
Качество набора может проверяться на отечественных или
зарубежных контрольных сыворотках с аттестованным по
данному методу показателем.
Нормальные величины активности трансаминаз в сыворотке
крови 0,03 - 0,19 мкмоль/(с×л) или 0,1 - 0,68 ммоль/(ч×л).
Рекомендуется в каждой лаборатории уточнять диапазон
нормальных величин для обследуемого контингента.
АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ
Сыворотка крови без следов гемолиза.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Потенциальный риск применения набора – класс 1.
В состав компонентов набора входят азид натрия, соляная
кислота и натрия гидроокись обладающие токсическим и
раздражающим действием. Следует избегать попадания
реагентов на кожу и слизистые; при попадании немедленно
промыть поражённое место большим количеством проточной
воды. При случайном проглатывании реагента следует
немедленно выпить 0,5 л тёплой воды и вызвать рвоту.
При работе с набором следует соблюдать «Инструкции по мерам
профилактики распространения инфекционных заболеваний
при работе в клинико-диагностических лабораториях лечебнопрофилактических учреждений», утверждённой Минздравом
СССР 17 января 1991г.
Утилизацию или уничтожение, дезинфекцию использованных
реагентов следует проводить в соответствии с СанПиН
2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к
обращению с медицинскими отходами» и МУ 287-113
«Методические указания по дезинфекции, предстерилизационной очистке и стерилизации изделий медицинского назначения».
Так как образцы крови человека следует рассматривать как
потенциально
инфицированный
материал,
способный
длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирусы гепатита
или любой другой возбудитель инфекции, необходимо при
работе надевать одноразовые резиновые или пластиковые
перчатки.
ОБОРУДОВАНИЕ, МАТЕРИАЛЫ, РЕАГЕНТЫ
 Спектрофотометр, длина волны 537 нм или фотоколориметр,
длина волны 500 - 560 нм, кювета с длиной оптического пути
1,0 см;
 термостат, поддерживающий температуру +37±1°С;
 таймер;
 колбы вместимостью 100 мл;
 пипетки, позволяющие отбирать объёмы жидкости 5-50 мкл,
100-1000 мкл и 5,0 мл;
 пробирки стеклянные химические вместимостью 5,0-10 мл;
 вода дистиллированная;
 одноразовые перчатки резиновые или пластиковые.
ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ
Реагенты 1, 2 и калибратор готовы к применению.
Содержимое флакона с Реагентом 3 (или аликвоту) развести
дистиллированной водой, свободной от карбонатов, в
соотношении 1:9. Полученный рабочий раствор Реагента 3
хранить при комнатной температуре +(18-25)°С в плотно
закрытом полиэтиленовом флаконе не более 3 месяцев.
УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА
Набор хранить в упаковке предприятия-изготовителя при
комнатной температуре +(18-25)°С в течение всего срока
годности.
Срок годности набора - 18 месяцев.
Вскрытые флаконы с Реагентом 1 и Калибратором хранить при
температуре +(2-8)°С в плотно закрытой таре не более 6
месяцев.
Вскрытые флаконы с Реагентом 2 и Реагентом 3 хранить при
комнатной температуре +(18-25)°С в плотно закрытой таре в
течение всего срока годности.
Рабочий раствор Реагента 3 хранить при комнатной
температуре +(18-25)°С в плотно закрытом полиэтиленовом
флаконе не более 3 месяцев.
Для проведения анализа рекомендуется использовать
полуавтоматические одноканальные пипетки со сменными
наконечниками, аттестованные на точность по значению
средней дозы и сходимости результатов дозирования.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛТ
Подготовить пробы в соответствии с таблицей 1:
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АСТ
Подготовить пробы в соответствии с таблицей 3:
Таблица 1
Компоненты
Опытная
Контрольная
реакционной среды
проба
проба
Реагент 1 АЛТ,мл
0,25
0,25
Содержимое пробирок прогреть 5 минут
при температуре +37°С
Сыворотка крови, мл
0,05
−
Пробы перемешать и инкубировать 30 минут
при температуре +37С
Реагент 2, мл
0,25
0,25
Сыворотка крови, мл
−
0,05
Пробы тщательно перемешать и инкубировать
20 минут при комнатной температуре +(18-25)°С
Рабочий раствор
2,5
2,5
Реагента 3, мл
Пробы тщательно перемешать и инкубировать
10 минут при комнатной температуре +(18-25)°С
Таблица 3
Компоненты
Опытная
Контрольная
реакционной среды
проба
проба
Реагент 1 АСТ,мл
0,25
0,25
Содержимое пробирок прогреть 5 минут
при температуре +37°С
Сыворотка крови, мл
0,05
−
Пробы перемешать и инкубировать 60 минут
при температуре +37С
Реагент 2, мл
0,25
0,25
Сыворотка крови, мл
−
0,05
Пробы тщательно перемешать и инкубировать
20 минут при комнатной температуре +(18-25)°С
Рабочий раствор
2,5
2,5
Реагента 3, мл
Пробы тщательно перемешать и инкубировать
10 минут при комнатной температуре +(18-25)°С
Измерить оптическую плотность опытной пробы против
соответствующей контрольной пробы при длине волны 537 нм
(500-560 нм) в кювете с длиной оптического пути 1,0 см.
Окраска растворов стабильна не более 2 часов.
Измерить оптическую плотность опытной пробы против
соответствующей контрольной пробы при длине волны 537 нм
(500-560 нм) в кювете с длиной оптического пути 1,0 см.
Окраска растворов стабильна не более 2 часов.
ПОСТРОЕНИЕ КАЛИБРОВОЧНОГО ГРАФИКА
Подготовить пробы в соответствии с таблицей 2:
ПОСТРОЕНИЕ КАЛИБРОВОЧНОГО ГРАФИКА
Подготовить пробы в соответствии с таблицей 4:
Таблица 2
Ферментативная
Вода
№ Калибратор
Реагент 2,
активность АЛТ
дистил.
мкл
пробы
мкл
мкл
мкмоль/(с×л) ммоль/(ч×л)
1
5
595
500
0,028
0,10
2
20
580
500
0,112
0,40
3
50
550
500
0,278
1,00
4
100
500
500
0,556
2,00
5
200
400
500
1,112
4,00
6
300
300
500
1,668
6,00
контр.
−
600
500
−
−
Пробы перемешать и инкубировать 20 минут
при комнатной температуре +(18-25)°С
Внести во все пробирки по 5,0 мл
рабочего раствора Реагента 3
Пробы перемешать и инкубировать 10 минут
при комнатной температуре +(18-25)°С
Таблица 4
Ферментативная
Вода
№ Калибратор
Реагент 2,
активность АСТ
дистил.
мкл
пробы
мкл
мкл
мкмоль/(с×л) ммоль/(ч×л)
1
5
595
500
0,014
0,05
2
20
580
500
0,056
0,20
3
50
550
500
0,139
0,50
4
100
500
500
0,278
1,00
5
200
400
500
0,556
2,00
6
300
300
500
0,834
3,00
контр.
−
600
500
−
−
Пробы перемешать и инкубировать 20 минут
при комнатной температуре +(18-25)°С
Внести во все пробирки по 5,0 мл
рабочего раствора Реагента 3
Пробы перемешать и инкубировать 10 минут
при комнатной температуре +(18-25)°С
Измерить оптические плотности калибровочных растворов
против контрольной пробы (контр.) при длине волны 537 нм
(500-560 нм) в кювете с длиной оптического пути 1,0 см.
Измерить оптические плотности калибровочных растворов
против контрольной пробы (контр.) при длине волны 537 нм
(500-560 нм) в кювете с длиной оптического пути 1,0 см.
Построить график зависимости оптической плотности от
активности фермента.
По калибровочному графику рассчитать коэффициент расчёта
активности фермента ( К ) по формуле:
Построить график зависимости оптической плотности от
активности фермента.
По калибровочному графику рассчитать коэффициент расчёта
активности фермента ( К ) по формуле:
К = А / Екалибр.,
К = А / Екалибр.,
где: А – активность фермента мкмоль/(с×л) или ммоль/(ч×л),
взятая из таблицы,
Екалибр – экстинкция соответствующей калибровочной пробы.
где: А – активность фермента мкмоль/(с×л) или ммоль/(ч×л),
взятая из таблицы,
Екалибр – экстинкция соответствующей калибровочной пробы.
РАСЧЁТ
Активность АЛТ (А) мкмоль/(с×л) или ммоль/(ч×л) рассчитать по
формуле:
А = К × Еопыт,
где: Еопыт – экстинкция опытной пробы,
К – коэффициент расчёта активности фермента.
РАСЧЁТ
Активность АСТ (А) мкмоль/(с×л) или ммоль/(ч×л) рассчитать по
формуле:
А = К × Еопыт,
где: Еопыт – экстинкция опытной пробы,
К – коэффициент расчёта активности фермента.
Если активность АЛТ в анализируемом образце сыворотки крови
превышает 1,67 мкмоль/(с×л), его следует развести
физиологическим раствором в 2 раза, повторить анализ и
полученный результат умножить на 2.
Если активность АСТ в анализируемом образце сыворотки
крови превышает 1,67 мкмоль/(с×л), его следует развести
физиологическим раствором в 2 раза, повторить анализ и
полученный результат умножить на 2.
КОНТАКТЫ
По вопросам, касающимся качества набора, обращайтесь в
ООО «ОЛЬВЕКС ДИАГНОСТИКУМ»
по адресу:
Россия, 192029, г. Санкт-Петербург,
просп. Обуховской обороны, д.70, корп.2, а/я 3,
Тел: (812) 412-84-46, (812) 412-83-02
Факс: (812) 412-84-29.