На правах рукописи СУРИН Александр Михайлович
реклама
На правах рукописи СУРИН Александр Михайлович МЕХАНИЗМЫ ДИСФУНКЦИИ МИТОХОНДРИЙ И НАРУШЕНИЙ ИОННОГО ГОМЕОСТАЗА ПРИ ГЛУТАМАТНОЙ НЕЙРОТОКСИЧНОСТИ. 14.03.03 – Патологическая физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2013 1 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение «НИИ общей патологии и патофизиологии» Российской Академии медицинских наук Работа выполнена в Лаборатории патологии ионного транспорта и внутриклеточной сигнализации ФГБУ «НИИ общей патологии и патофизиологии» РАМН и в Лаборатории клеточных и молекулярных технологий ФГБУ «Научный центр здоровья детей РАМН. Научные консультанты доктор медицинских наук, профессор Б.И. Ходоров доктор медицинских наук, профессор В.Г. Пинелис Официальные оппоненты: Лукьянова Людмила Дмитриевна, доктор медицинских наук, профессор, чл.корр. РАМН, ФГБУ НИИОПП РАМН, Зав. лаб. Зинченко Валерий Петрович, доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «Институт биофизики клетки» РАН, Зав. лаб. Черняк Борис Викторович, доктор биологических наук, НИИ физикохимической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, Зав. лаб. Ведущая организация: ФГБУ «Научный центр неврологии» РАМН Защита состоится « » декабря 2013г. в 14 час. на заседании диссертационного совета Д 001.003.01 при ФГБУ «НИИ общей патологии и патофизиологии» РАМН по адресу: 125315 Москва, ул. Балтийская, д.8 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ общей патологии и патофизиологии» РАМН Автореферат разослан « » ноября 2013г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук 2 Л.Н. Скуратовская Общая характеристика работы Актуальность проблемы По данным ВОЗ (Информационный бюллетень №310, июнь 2011) в странах со средним и высоким уровнем дохода инсульт и другие цереброваскулярные заболевания прочно занимают второе место (9-13%) после сердечно-сосудистых по уровню смертности (14-16%). С учетом нейродегенеративных заболеваний (болезнь Альцгеймера и др.) и травм, полученных при несчастных случаях, повреждения мозга становятся на один уровень с сердечно-сосудистыми заболеваниями по доле летальных исходов. По потерям трудоспособности инсульт, цереброваскулярные и нейродегенеративные заболевания опережают все остальные причины инвалидности среди выживших. При повреждениях мозга, вызванных кислороддефицитными состояниями, травмами или инсультами, вокруг участков поражения развиваются зоны энергозависимого нарушения метаболизма клеток, в первую очередь, нейронов (так называемая «ишемическая полутень» или «пенумбра» (penumbra) (Dirnagl et al, 1999). В синапсах нейронов, оказавшихся в этих зонах, происходит неконтролируемое высвобождение основного возбуждающего нейромедиатора центральной нервной системы глутамата (Glu). Избыточная стимуляция глутаматных рецепторов, прежде всего ионотропных рецепторов NMDA-типа, приводит к перегрузке нейронов ионами Са2+ и Na+, нарушению сигнальных, метаболических и энергетических процессов и, в итоге, к увеличению области поражения мозга в результате отсроченной гибели нейронов (Mattson & Mark, 1995; Nicotera & Orrenius, 1998; Sattler & Tymianski, 2000). Разработка методов, позволяющих ограничить область вторичного поражения мозга, требует учета многих параметров, влияющих на способность нейронов к выживанию. Первичные культуры нейронов, полученных из различных разделов мозга млекопитающих (в основном крысы и мыши), являются общепризнанной и часто незаменимой моделью исследования процессов, происходящих в мозге в норме и при патологии (Choi, 1987, 1992). Предшествующие пионерские исследования (Tymianski et al, 1993; Adamec et al, 1998; Castilho et al, 1998), выполненные, в том числе, с участием нашего коллектива (Khodorov et al, 1996; см. также обзоры Ходоров, 2000; Khodorov, 2004), показали, что в нейрональных культурах длительное воздействие высоких доз Glu вызывает двухфазное увеличение внутриклеточной концентрации свободного Са2+ ([Ca2+]i). Вторая фаза подъема [Ca2+]i , т.н. отсроченная кальциевая дисрегуляция (ОКД), всегда происходит синхронно со значительным падением трансмембранного потенциала внутренней мембраны 3 митохондрий (далее «митохондриального потенциала», ΔΨm) (Vergun, et al, 1999). Измерения на сестринских культурах показали, что доля нейронов, в которых возникла ОКД, почти линейно соотносится с долей нейронов, погибших через несколько часов после окончания Glu воздействия (Limbric et al, 1995). Этим обстоятельством, а также тем, что Са2+ является вторичным мессенджером во всех типах клеток и регулирует мириады внутриклеточных процессов (Авдонин и Ткачук, 1994; Berridge, 2000), и обусловлен незатухающий интерес к механизму возникновения ОКД и использованию этого феномена для тестирования нейротропных свойств различных агентов (см., например, Suwanjang et al, 2013; Vaarmann et al, 2013). Исследования, выполненные за последние 20 лет, выявили ряд возможных причин развития ОКД и последующего сохранения высокого [Ca2+]i плато. Эти исследования можно разделить на два направления в зависимости от того, какой из механизмов развития ОКД считается основным: (1) возникновение неспецифической поры высокой проводимости во внутренней мембране митохондрий (mitochondrial permeability transition, мРТ) или (2) развитие энергетического кризиса, приводящего к дисбалансу ионного гомеостаза, кульминацией которого является ОКД. Центральная роль митохондрий не подвергается сомнению в любой из гипотез развитии ОКД и последующей гибели нейронов. При этом остаются невыясненными следующие вопросы: 1) на какой стадии ОКД образуется мРТ в нейронах; 2) Является ли образование мРТ главной причиной ОКД и последующего энергетического кризиса, или наоборот, мРТ является следствием развития ОКД? 3) Предшествует ли критическое падение концентрации АТФ в цитозоле ([ATP]с) развитию ОКД или низкий уровень [ATP]с достигается только на стадиях высокого [Ca 2+]i плато? 4) Каковы механизмы вовлечения митохондрий в развитие ОКД и поддержание высокого [Ca2+]i плато ? Для решения этих вопросов необходимо не только расширение арсенала методов исследования, но и разработка методических приемов, позволяющих проводить многопараметрические прижизненные высокочувствительные измерения процессов, вовлекаемых в развитие ОКД. Значительный прогресс в изучении разнообразных аспектов внутриклеточной сигнализации в норме и патологии был достигнут благодаря применению белковых конструктов, состоящих из флуоресцентных и сенсорных белков, которые селективно реагируют на изменения внутриклеточных параметров, таких как рН, концентрации Са2+, пероксида водорода, циклического АМФ и др. (Shaner et al, 2006; Chudakov et al, 2010; Lukyanov et al, 2010; Orosco et al, 2013). В дифференцированных клетках экспрессия флуоресцентных белковых сенсоров затруднена и поэтому примеры применения этого метода при исследовании 4 внутриклеточных процессов в нейронах пока немногочисленны (Rintoul et al, 2003; Shalbueva et al, 2006; Bolshakov et al, 2008; Kovac et al, 2012). Вирусная трансфекция позволяет достичь 80-90% экспрессии флуоресцентного сенсора в нейронах (Bano et al, 2005), однако требует особых мер предосторожности при проведении экспериментов и поэтому реже используется. Главными преимуществами флуоресцентных белковых сенсоров являются (1) возможность отслеживать такие внутриклеточные характеристики, для которых пока не удалось создать синтетические индикаторы и (2) адресная доставка в интересующие внутриклеточные компартменты с прецизионностью, недоступной для низкомолекулярных синтетических флуоресцентных зондов. Учитывая все это, при выполнении данной работы были разработаны способы одновременной экспрессии в культивируемых нейронах различных флуоресцентных белковых сенсоров и исследование с их помощью внутриклеточной сигнализации, ионного гомеостаза и биоэнергетики нейронов в норме и при нейротоксическом действии Glu. Цель и задачи исследования Целью работы являлось выяснение роли митохондрий в механизмах нарушения ионного гомеостаза нейронов при гиперстимуляции ионотропных глутаматных рецепторов, приводящей к развитию отсроченной Са2+ дисрегуляции (ОКД) и последующей гибели клеток. Задачи исследования: 1. Разработать мультипараметрическую флуоресцентно-микроскопическую систему для измерений функционального состояния митохондрий и ионного гомеостаза в индивидуальных нейронах с комбинированным использованием синтетических флуоресцентных зондов и флуоресцентных белковых сенсоров с адресной доставкой в цитозоль и митохондрии. 2. Исследовать взаимосвязь между индуцированной глутаматом ОКД, митохондриальной деполяризацией и механизмом последующей гибели нейронов. 3. Исследовать влияние на развитие ОКД внешних факторов, модулирующих функциональное состояние митохондрий (инигбирования дыхания, разобщения окислительного фосфорилирования, глюкозной депривации, реверсии Na+/Са2+ обмена). 4. Изучить вклад в развитие дисфункции митохондрий и ОКД эндогенных факторов, возникающих в результате индуцированной глутаматом активации фосфолипаз А2 и поли(АДФ-рибоза)полимеразы-1. 5. Исследовать процессы, в которых митохондрии играют активную роль в противодействии развитию ОКД. 5 6. Исследовать различия биоэнергетики культивируемых нейронов при действии глутамата и в нейронах, полученных из животных пре- и постнатального периода развития. Научная новизна 1. Впервые показано, что более 90% культивируемых нейронов, в которых за время аппликации Glu успела развиться ОКД и сильная митохондриальная деполяризация, погибают спустя 14-20час от некроза и апоптоза. 2. Показано, что эндогенными факторами развития ОКД, снижающими митохондриальный синтез АТФ и Са-буферные свойства митохондрий, являются арахидоновая кислота, высвобождаемая в результате активации фосфолипаз А2, и падение NADH вследствие активации поли(АДФрибоза)полимеразы-1. 3. Установлено, что в культивируемых нейронах наряду с Gluиндуцированными патогенными процессами, развиваются также процессы, противодействующие дисфункции митохондрий и глутаматной токсичности: 1) переключение на другой метаболический путь окисления субстратов, компенсирующий глюкозную депривацию и дефицит пирувата; 2) увеличение градиента рН между матриксом митохондрий и цитозолем (ΔрН), компенсирующее снижение митохондриального потенциала (ΔΨm); 3) рост активности сукцинатдегидрогеназы. 4. Впервые показано, что в индивидуальных культивируемых нейронах развитию ОКД предшествует падение концентрации АТФ в цитозоле до 1020% от уровня в покоящихся клетках. 5. Обнаружены кардинальные отличия в биоэнергетики нейронов пре- и постнатального периодов: в культивируемых нейронах, из гиппокампа эмбрионов крысы (Е17-Е18), основным способом производства АТФ является гликолиз, тогда как в нейронах из гиппокампа постнатальных крыс (Р1-Р2) АТФ синтезируется преимущественно за счет окислительного фосфорилирования. Научно-практическое значение работы Разработаны флуоресцентно-микроскопические методы регистрации в индивидуальных клетках изменений одновременно нескольких (от двух до четырех) внутриклеточных параметров, таких, как внутриклеточная концентрация свободного Са2+ и Nа+ , NAD(P)H и FAD автофлуоресценции, активных форм кислорода, потенциала митохондриальной и плазматической мембраны, рН в цитозоле и митохондриях. Применены новые фармакологические подходы (ингибиторный анализ) и внедрен многопараметрический морфологический анализ выживаемости нейрональной культуры. 6 Впервые удалось достичь экспрессии в нейрональных культурах одновременно двух сенсорных флуоресцентных белков, имеющих разные спектральные параметры и локализованных в разных внутриклеточных компартментах. Разработанные методы могут служить для тестирования механизмов действия биологически активные веществ. Вещества, задерживающие развитие ОКД, могут быть перспективными при разработке препаратов нейропротекторного действия. Увеличение лаг-периода ОКД под влиянием испытуемого вещества, является количественным критерием эффективности подобных веществ. Основные положения, выносимые на защиту 1. Развитие ОКД происходит синхронно с развитием сильной митохондриальной деполяризации (МД). Нейроны, в которых ОКД достигла фазы высокого [Ca2+]i плато, гибнут через 14-20час в результате некроза или апоптоза в пропорции ~1:1. Длительность лаг-периода ОКД и МД может служить количественной мерой для тестирования нейропротекторных или нейротоксических свойств биологически активных соединений. 2. Развитие ОКД вызвано действием нескольких факторов, в числе которых высвобождение из фосфолипидов арахидоновой кислоты, снижение NAD(P)H, увеличение ионной (протонной) проводимости внутренней мембраны митохондрий, разобщение окислительного фосфорилирования, падение [ATP]с , снижение Са2+-буферной емкости митохондрий. Восходящая фаза ОКД и начало высокого [Ca2+]i плато не являются следствием образования «классической» неспецифической высокой проводимости (мРТ), поскольку являются обратимыми, происходит сильное падение, но не коллапс ΔΨm и ΔрН, митохондрии удерживают в матриксе NAD+ и более низкомолекулярные субстраты цикла трикарбоновых кислот. 3. При действии нейротоксических доз Glu, одновременно с появлением факторов, ослабляющих функционирование митохондрий в качестве производителей АТФ и основных Са2+-буферных емкостей нейронов, происходит привлечение внутриклеточных ресурсов, препятствующих ОКД, а именно, мобилизация «резервного» субстрата взамен пирувату при блокаде гликолиза, рост ΔрН, усиление работы FAD-зависимого комплекса II дыхательной цепи. 4. При переходе от эмбриональной (Е17-Е18) к постнатальной (Р1-Р2) стадии развития в нейронах мозга происходит перестройка биоэнергетики проявляющаяся в том, что в основной массе (~84%) культивируемых нейронов из мозга пренатальных животных основным способом производства АТФ служит гликолиз, тогда как в нейронах из гиппокампа новорожденных крыс доминирующим способом синтеза АТФ становится окислительное фосфорилирование. Апробация работы 7 Результаты диссертационной работы были представлены на Международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003, 2007, 2009, 2011, 2013), на 3-ем Съезде Биохимического общества России, Санкт-Петербург-2003, на Конференциях Физиологического общества Великобритании (Aberdeen-2000, London-2002), 3-ем Российском Конгрессе по патофизиологии (Москва-2004), на Конференциях Американского Общества нейронаук (Society for Neurosciences, Washington-2005, 2008, 2011; Chicago 2009; San-Diego, 2010), на Съезде Американского биофизического общества (Baltimore-2011), на 8-ом Всемирном конгрессе IBRO (Florence-2011), на 3-ем Съезде физиологических обществ стран СНГ (Ялта-2011). Публикации Основные положения диссертации опубликованы в 43 печатных работах, из которых 16 в журналах, рекомендуемых ВАК. Структура и объем работы Диссертация написана на стр., состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы», который включает отечественных и иностранных источника. Методы и материалы Приготовление первичных нейрональных культур. Культуры приготавливали из мозжечка 6-7-дневных или из гиппокампа 1-2-дневных крыс Вистар. Эксперименты с животными выполняли в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и декларацией о гуманном отношении к животным. Животных анестезировали, декапитировали, извлекали мозг и затем гиппокампы. Суспензию клеток (106 клеток/мл) получали, обрабатывая гиппокампы папаином (10ед/мл), диссоциируя 15-кратным пипептированием, и отмывали от разрушенных клеток 2-кратным осаждением в центрифуге (1000об/мин). Суспензию (200мкл) переносили на покровные стекла, прикрепленные к лункам 35мм пластиковых чашек Петри (MatTek, США). Стекла предварительно покрывали поли-этиленимином (10 мг/мл). Через час добавляли 1,5 мл нейробазальной среды, содержащей 2% Supplement B-27 и 0.5 мМ L-глутамина. Клетки содержали при 37оС в атмосфере 5%СО2/95% воздуха при 100%влажности. На 3-4 день добавляли арабинозид (AraC, 10мкМ) для подавления роста глиальных клеток. Культуры использовали на 8-13 день после посадки (2-7 дней после трансфекции). Содержание NAD+ и NADH в клеточных культурах измеряли в плашечных ридерах с помощью наборов, в которых NAD+ восстанавливается до NADH с последующим восстанавлением формазана до интенсивно 8 окрашенного соединения. Среднюю [АТФ] в клеточной культуре измеряли методом люциферин/люциферазной хемилюминесценции. Для измерения активности ПАРП-1 применяли иммуноцитофлуоресцентное окрашивание продукта реакции поли(АДФ-рибозы) с последующим анализом флуоресцентно-микроскопических изображений. Флуоресцентно-микроскопические измерения. Для измерения [Ca2+]i клетки нагружали Са2+ индикаторами (Fura-2, Fluo-3, Rhod-2 или их низкоаффинными аналогами) в форме ацетоксиметиловых (АМ) эфиров (4050мин, 37оС, концентрации, в зависимости от индикатора, составляли 0,55мкМ). Изменения ΔΨm отслеживали, окрашивая клетки потенциалчувствительным зондом Rh123 (2,5мкг/мл, 15мин, 37оС) или TMRM (4-40нМ, 40мин, 37оС). Измерения выполнены при 27-29оС в буфере, содержащем (мM): 135 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 20 HEPES, 5 D-глюкозы; pH 7,4. В безнатриевом буфере NaCl заменяли на N-метил-D-глюкамин (130мМ); рН 7,4 устанавливали, добавляя 20мМ HEPES и дотитровывая 1М HCl. Номинально бескальциевые растворы вместо CaCl2 содержали 0,1мМ EGTA и 2мМ MgCl2. Смену растворов осуществляли 2х2мл заменой содержимого чашки с клетками за время не более 30с. Клетки термостатировали на предметном столике микроскопа при 28-29оС. Для измерения рН митохондрий и цитозоля, а также [ATP]с с помощью флуоресцентных белковых сенсоров плазмиды, несущие гены соответствующих белков, доставляли в клетки, используя Lipofectamin-2000 (LF-2000). ДНК (0,5-1мкг/50мкл OptiMem) смешивали с LF-2000 (1мкл/50мкл OptiMem) и после образования комплекса ДНК с LF-2000 вносили смесь в культуру с клетками (50мкл на 200мкл клеточной среды). Для одновременного измерения [ATP]с и рНс мы воспользовались тем, что в АТ1.03 реализован феномен флуоресцентного (фёрстеровского) резонансного переноса энергии (FRET). При регистрации сигнала АТ1.03 в условиях возбуждения флуоресценции только белка-акцептора энергии (возбуждение 485-500нм, испускание 525-535нм) практически исключена зависимость флуоресценции от уровня [ATP]с , что позволило отслеживать изменения только рНс. Калибровку рН-зависимости сигналов флуоресцентных белковых сеносоров в нейронах проводили как описано в (Bolshkov et al, 2008), используя растворы с ионофорами, обеспечивающими выравнивание рН между буфером и внутриклеточной средой. Калибровочные растворы имели состав (мМ): 0,005 нигерицина, 0,001 FCCP, 134 глюконата калия, 1 MgCl2, 20 HEPES. Для установки рН использовали 1М растворы HCl или КОН. Для предотвращения работы митохондриальной АТФсинтазы в прямом или реверсивном режиме в калибровочные растворы добавляли олигомицин (2,5мкг/мл). 9 В экспериментах по исследованию выживаемости культивируемых нейронов с помощью флуоресцентных красителей применяли Hoechst 33342 (10мкг/мл), Syto-13 (1мкМ) и этидиум гомодимер (EthD-1, 3мкМ). Концентрацию NAD+ и NADH определяли с помощью аналитического набора BioAssay Systems (США). Флуоресцентно-микроскопические измерения выполнены на установках, включающих инвертированный микроскоп Olympus IX-71 или Zeiss Axiovert200, систему освещения Sutter Labmda 10-2 со 175Вт ксеноновой лампой (Sutter Instruments) и CCD-камеру CoolSNAP HQ2 (Photometrics), управляемых через компьютерную программу MetaFluor 6.2 или 7.2 (Molecular Devices, США). Все реагенты фирмы Sigma (США). Флуоресцентные реагенты, включая Са2+ индикаторы, потенциал-чувствительные зонды, МитоТрекеры, витальные красители, ред-окс-индикаторы приобретены у Invitrogen (США). Плазмиды, кодирующие флуоресцентные белковые сенсоры, были любезно предоставлены Dr. R.Rizzuto, Dr. H.Imamura, Д-ром Д.Чудаковым и Д-ром В.Белоусовым. Для обсчета флуоресцентных сигналов и построения графиков, а также для статистической обработки данных использовали программы MetaFluor Analyst, Excel-2007, Prizm-4 и Origin 7.5. Основные результаты и обсуждения 1. Исследование взаимосвязи между индуцированной глутаматом отсроченной Са2+ дисрегуляцией, митохондриальной деполяризацией и механизмом последующей гибели нейронов. 1.1. Синхронность изменений внутриклеточной концентрации свободного Са2+ ([Ca2+]i) и трансмембранного потенциала внутренней мембраны митохондрий (ΔΨm). Типичные изменения [Ca2+]i (Рис. 1А) и ΔΨm (Рис. 1Б), индуцированные Glu в культуре гранулярных нейронов мозжечка крысы и в двух представительных нейронах (Рис. 1В,Г) из этой группы клеток показаны на рисунке 1А,В. Видно, что токсическая доза Glu (100кМ, 10мкМ глицина, 0 Mg2+) вызвала вторичный подъем [Ca2+]i (ОКД) и митохондриальную деполяризацию (падение ΔΨm) с лаг-периодами (DCD-Lag) индивидуальными для каждого нейрона. Совмещение графиков [Ca2+]i и изменений сигнала потенциал-чувствительного зонда Rh123 (Рис. 1В,Г) демонстрирует, что при развитии ОКД рост [Ca2+]i и падение ΔΨm происходят синхронно. Соотношение между началом ОКД и началом сильной митохондриальной деполяризации (МД) соответствует линейной функции во всем диапазоне измерений (r2=0,995) (Рис. 1Д). Отмывание Glu бескальциевым буфером, способствует 10 восстановлению низкого [Ca2+]i , причем задержка между моментом удаления Glu и началом снижения [Ca2+]i (Recovery-Lag) также индивидуальна для каждого нейрона, как и задержка между моментом добавления Glu и началом ОКД (DCD-Lag) (Рис. 1Е). Такое соотношение объясняется, вероятно тем, что при более раннем наступлении ОКД (короткий DCD-Lag) в митохондриях накапливается больше Са2+ и, соответственно, требуется больше времени на его удаление в постглутаматный период (более длительный Recovery-Lag). Деполяризация митохондрий в бескальциевом буфере высвобождает из них Са2+ (Рис. 1А,В,Г), причем тем больше, чем короче период между удалением Glu и деполяризацией митохондрий что согласуется с опубликованными ранее данными (Kiedrowski et al., 1994; Brocard et al, 2001). Коэффициент линейной корреляции между DCD-Lag и Recovery-Lag не велик (на Рис. 1Д r2=0,45), что отражает различие механизмов, регулирующих поступление и удаление Са2+ во время ОКД и в постглутаматный период. На это же указывает различие в сигналах потенциал-чувствительного зонда в нейронах, имеющих разную кинетику снижения [Ca2+]i в постглутаматный период (Рис. 1В,Г). В среднем, чем раньше возникала ОКД, тем продолжительнее была фаза высокого [Ca 2+]i плато (Рис. 1Е). 1.2.Математическое моделирование сигналов потенциалчувствительныч флуоресцентных зондов Rh123 и TMRM. Важно отметить, что сигналы потенциал-чувствительных зондов сложным образом зависят от потенциала как митохондриальной (ΔΨm), так и плазматической мембраны (ΔΨp). Анализ математической модели, связывающей изменения флуоресценции «одноволновых» потенциал-чувствительных зондов, таких как Rh123 и TMRM, показал, что наиболее критическими факторами, которые, помимо ΔΨm и ΔΨp , определяют изменения сигналов Rh123 и TMRM, являются проницаемость этих зондов через плазматическую мембрану, доля митохондриального матрикса в объеме клетки и концентрация самотушения (Ward et al., 2000; Nicholls & Ward, 2000). Мы выполнили расчеты изменений ΔΨm и ΔΨp на основании алгоритмов, предложенных в указанных работах. Имитация изменений флуоресценции TMRM и Rh123 во время 1-ой фазы Glu-индуцированных изменений [Ca2+]i и при развитии ОКД показала следующее. Более гидрофобный и быстро проникающий через плазмалемму зонд TMRM вытекает из нейронов в ответ на Glu настолько быстро, что возникновение ОКД отражается на его сигнале лишь как небольшое ускорение снижения флуоресценции. В то же время проницаемость Rh123 сквозь плазмалемму почти в 20 раз меньше по сравнению с TMRM (соответственно 0,00045с-1 и 0,007с-1) и поэтому за время от момента добавления Glu и до развития высокого [Ca2+]i плато Rh123 циркулирует 11 A Б FCCP -Ca Glu m (Rh123, F486/Fo) 10 [Ca2+]i (fura-2FF, F340/F380) 8 6 4 2 0 Glu 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 2000 3000 4000 2000 Время (с) -Ca Glu 6 2.5 5 2.0 4 3 1.5 2 1.0 1 1500 Д 2000 2500 3000 3500 4000 FCCP 9 Glu 3.5 8 3.0 7 6 2.5 5 2.0 4 3 1.5 2 1.0 1 1500 05-01-19B/ cell 34 Время (с) -Ca 2000 2500 3000 3500 m (Rh123, F486/Fo) 3.0 7 m (Rh123, F486/Fo) 3.5 8 05-01-19B/ cell 12 4000 Г FCCP 9 3000 Время (с) [Ca2+]i (Fura-FF, F340/F380) B [Ca2+]i (Fura-FF, F340/F380) FCCP -Ca 4000 Время (с) E Рис. 1. Глутамат индуцируете двухфазные изменения 2+ 2+ внутриклеточной концентрации Са ([Ca ]i ) и митохондриального потенциала (ΔΨm) в культивируемых нейронах. Изменения [Ca2+]i (А) и ΔΨm (Б) в группе клеток и в двух представительных нейронах (В и Г) из этой группы. (Д) Соотношение между началом ОКД (DCD-Lag, c) и началом второй фазы митохондриальной деполяризации (MD-Lag, c). (Е) Соотношение между лаг-периодом ОКД (DCD-Lag, c) и лаг-периодом восстановления [Ca2+]i в 12 постглутаматный период (Recovery-Lag, c); Представлены данные культур гранулярных нейронов мозжечка крысы (возраст культур 7 дней, 7DIV). На этом и последующих рисунках (если не отмечено особо) изменения [Ca2+]i представлены, как изменения рэйшиометрического сигнала флуоресцентного Са2+ индикатора Fura-FF (F340/F380); на этом и последующих рисунках, если не указано специально, относительные изменения ΔΨm представлены, как изменения флуоресценции потенциал-чувствительного зонда Rh123 (F/Fo), где F – текущее значение сигнала, а Fo – исходное в покоящихся нейронах. преимущественно между цитозолем и митохондриями, не вытекая наружу. Благодаря этому свойству, изменения сигнала Rh123 отражают изменения ΔΨm и слабо зависят от ΔΨp. Это упрощает интерпретацию данных и поэтому мы использовали в основном Rh123, за исключением случаев, когда перекрывание спектров Rh123 со спектрами других флуорофоров не допускало такого применения. Анализ кинетики Rh123 показывает также, что снижение флуоресценции, наступающее во время высокого [Ca2+]i плато и пост-глутаматного периода, может быть вызвано ускорением вытекания зонда из клетки за счет изменения барьерных свойств плазмалеммы. Важным фактором, облегчающим вытекание зонда из клетки, может быть появление в мембране гидрофобного аниона в качестве противоионов для липофильных катионов Rh123 и TMRM (Nicholls, 2006). В роли таких противоионов могут выступать свободные жирные кислоты (Severin et al, 2010), которые при Glu воздействии образуются в результате активации фосфолипаз А2 (см. далее). 1.3. Продолжительность ОКД и механизм гибели нейронов. На примере культивируемых нейронов гиппокампа крысы было показано, что нейроны, имевшие ОКД и не сумевшие восстановить низкую [Ca2+]i после удаления Glu, погибают (Limbric et al, 1995). Необходимо отметить, что эти измерения были выполнены на сестринских культурах. Вывод о том, что гибли именно те нейроны, которые имели затруднения в восстановлении низкой [Ca2+]i, был сделан на основании сопоставления статистических данных, а не прямого наблюдения за теми же самыми нейронами. Мы проверили, имеется ли корреляция между длительностью лаг-периода ОКД (продолжительностью высокого [Ca2+]i плато во время действия Glu, см. Рис. 1Е) и последующей гибелью именно тех нейронов, которые имели ОКД. Для этого клетки, не нарушая стерильности культур, подвергали действию Glu, а затем возвращали в кондиционную среду и оставляли на 18-20час в СО2-инкубаторе. Выживаемость определяли, анализируя изображения в проходящем свете и флуоресцентные изображения тех же самых нейронов, окрасив их 13 Некроз Necrosis A А Glu 14 [Ca 2+]i (FuraFF, F340/F380) 12 10 8 6 4 2 0 0 400 800 1200 1600 2000 2400 2800 3200 3600 4000 2800 3200 3600 4000 Time (s) Время (с) Апоптоз Apoptosis Б B Glu 14 [Ca 2+]i (FuraFF, F340/F380) 12 10 8 6 4 2 0 0 400 800 1200 1600 2000 2400 Time (s) Время (с) (14) ВC (12) DCD Lag Period (s) 4000 3000 2000 1000 Рис. 2. Кинетика изменений [Ca2+]i в гранулярных нейронах мозжечка, рассортированных по признаку последующей гибели от некроза или апоптоза. Пути гибели нейронов определены с помощью витальных флуоресцентных красителей Hoechst33342, Syto-13 и этидиум гомодимера, EthD-1. [Ca2+]i ответы на Glu рассортированы в зависимости от последующего пути гибели по некротическому (А) или апоптотическому (Б) пути. Времена наступления ОКД для каждого из указанных типов гибели представлены в виде прямоугольников (некротические клетки) и треугольников (апоптотические клетки). Горизонтальные отрезки на (В) отмечают среднее время наступления ОКД (DCD Lag Period, сек). Числа в скобках указывают количество клеток. 0 Necrosis Некроз Apoptosis Апоптоз 10-11-19/ CGC, 11&12 DIV . одновременно Hoechst33342 (или DAPI), Syto-13 и EthD-1. Разделение нейронов на живые и погибшие в результате некроза или апоптоза проводили в соответствии с критериями, предложенными в (Kroemer et al, 2005). На рисунке 2 графики [Ca2+]i ответов клеток на Glu разделены на две группы в зависимости от того, погибли клетки впоследствии от некроза (Рис. 2А) или апоптоза (Рис. 2Б). Видно, что кинетика развития ОКД одинакова, как в клетках погибших от некроза, так и от апоптоза, хотя в первых DCD-Lag в среднем короче и ОКД наступала раньше, чем в нейронах, погибших по 14 апоптотическому пути (Рис. 2В). Из всех нейронов, имевших ОКД, удалось обнаружить среди живых только 3% клеток (2 из 76 нейронов в трех посадках культур). Среди погибших 60% находились в некрозе, остальные 37% в апоптоза. Все нейроны, которые перед удалением Glu сохранили относительно низкую [Ca2+]i и не имели ОКД, остались живы. Возможно, при развитии ОКД происходит активация сразу нескольких внутриклеточных механизмов гибели, кульминацией которых (через 18-20час) является некроз либо апоптоз. 1.4. Исследование роли ингибирования протонных насосов и увеличения проводимости внутренней митохондриальной мембраны в возникновении Са2+ дисрегуляции. Учитывая тесную связь индуцированных 2+ нейротоксическими дозами Glu изменений [Ca ]i и ΔΨm (Рис.1), и последующей гибели нейронов (Рис.2), мы исследовали, как отражается на этих параметрах дисфункция митохондрий, вызванная митохондриальными ядами, и повышением протонной проводимости внутренней митохондриальной мембраны. Кратковременная аппликация Glu не успевала, как правило, вызвать ОКД и сильную МД в молодой культуре нейронов (7DIV) (Рис.3А,Б). Протонофор FCCP (0,3мкM), добавленный перед Glu, быстро деполяризовал митохондрии, но не влиял на [Ca2+]i (Рис.3В,Г), свидетельствуя о том, что в покоящихся нейронах концентрация Са2+ в матриксе митохондрий и цитозоле одинаково низкая. Аппликация Glu в присутствии FCCP вызывала скачок [Ca2+]i , названный немедленной Са2+ дисрегуляцией, (НКД, Tymianski et al, 1993; Nicholls & Budd, 2000). Одна из двух причин НКД состоит в том, что деполяризованные митохондрии не способны на электрофоретический захват Са2+, поступающего в цитозоль по Glu-активированным каналами, указывая на важную роль митохондрий в нейронах как Са2+ буфера. Высокое [Ca2+]i плато удерживалось даже после удаления Glu до тех пор, пока протонофор оставался в растворе (Рис.3В,Г), свидетельствуя о нарушении системы удаления избытка Са2+ из цитозоля. Очевидно, в результате вызванного протонофором коллапса ΔΨm , митохондриальная АТФсинтаза переходит в режим АТФазы и, становясь протонным насосом, поддерживает ΔΨm . Реверсия АТФсинтазы в АТФазу создает дефицит АТФ для Са2+ насосов плазматической мембраны, что и служит второй причиной НКД. Это предположение было подтверждено экспериментами, в которых протонофор добавляли вместе с ингибитором F1FoАТФазы олигомицином. В этом протоколе Glu также вызвал НКД, однако большинство нейронов восстанавливало исходную [Ca2+]i сразу после удаления Glu, несмотря на сохраняющуюся сильную МД (Рис.3Д,Е). Оубаин, ингибитор Na+/K+-АТФазы плазматической мембраны, являющейся в нейронах одним из главных потребителей АТФ (Ames, 2000), подобно олигомицину, придавал нейронам способность восстанавливать низкую [Ca2+]i после удаления Glu при продолжающейся МД (Рис.3Ж,З). Напротив, ингибирование Са2+-насосов плазматической мембраны эозином Ж (0,25мМ) затягивало восстановление 15 низкого [Ca2+]i. Такой же эффект вызывала замена Са2+ его суррогатом Ва2+, который может входить в клетку по Са2+-проницаемым каналам (Ascher et al, 1988), но плохо удаляется Са2+-АТФазой (Graf et al, 1982). Б n =12 3.4 FCCP-Ca 3.0 2.6 Mem 2.2 1.8 2.2 1.0 1.0 400 600 800 Glu 200 400 Г Mem Mem Rh-123 (F475/Fo) 2.6 2.2 1.8 1.4 2.6 2.2 1.8 1.4 1.0 FCCP 200 400 1.0 FCCP-Ca 600 800 1000 0 200 400 4.0 800 1000 00-11-19_3/ Hippoc. 12DIV Е MK-801 FCCP Glu 2.2 FCCP-Ca MK-801 FCCP Rh-123 (F475) 3.5 600 Time (s) n=10 Glu FCCP-Ca FCCP Time (s) [Ca2+]i (Fura-2FF, F340/F380) 1000 3.0 0 Д 800 Glu 3.4 3.0 600 Time (s) 00-11-21_1/ Hippoc, 14DIV n = 14 3.4 0 1000 Time (s) Mem 1.8 1.4 200 Glu 2.6 1.4 B FCCP-Ca 3.0 Glu 0 [Ca2+]i (Fura-2FF, F340/F380) 3.4 Rh123 (F/Fo) [Ca2+]i (fura-2FF, F340/F380) A 3.0 2.5 2.0 1.5 FCCP-Ca 1.8 1.4 1.0 1.0 Oligo 0 400 Oligo 0.6 800 1200 0 1600 400 800 Ж 1200 1600 Time (s) Time (s) 00-12-11_2/ Hippoc. 11DIV З n=13 MK-801 FCCP Glu 2.6 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 a 2.2 1.8 1.4 1.0 Ouab Ouab 400 FCCP-Ca a 1.0 0 MK-801 FCCP FCCP-Ca Rh-123 (F475/Fo) [Ca2+]i (Fura-2FF, F340/F380) Glu 4.0 800 Time (s) 1200 1600 0 00-12-11_3/ Hippoc. 11DIV 16 400 800 Time (s) 1200 1600 Рис. 3. Немедленная Са2+ дисрегуляция (НКД), вызванная Glu в условиях коллапс ΔΨm , может быть подавлена в постглутаматный период ингибиторами F1Fo-АТФазы митохондрий или Na+/K+-АТФазы плазмалеммы. Изменения [Ca2+]i (А,В,Д,Ж) и ΔΨm (Б,Г,Е,З) индуцированные Glu в контрольной культуре гиппокампальных нейронов (7DIV) (А,Б), в присутствии протонофора FCCP (0.3мкM) (В,Г) и в присутствии FCCP при одновременном ингибировании F1Fo-АТФазы олигомицином (Oligo, 2.5мкг/мл) или Na+/K+-АТФазы оубаином (Ouab, 0.5мМ). Для предотвращения действия эндогенного Glu в отмывающий раствор добавляли ингибитор NMDA-каналов МК-801 (10мкМ). (Ж,З) Пунктиром выделены сигналы астроцита. НКД можно было получить, используя в аналогичных протоколах вместо протонофоров ингибиторы дыхательной цепи (ротенон, антимицин А, цианид). Добавление цианида (3мМ NaCN) к покоящимся нейронам вызывало небольшую МД за счет того, что F1Fo-АТФаза, расходуя поступающий из цитозоля АТФ, работала как протонный насос, генерируя ΔΨm. НКД и сильная МД возникала после добавления Glu в результате поступления в цитозоль Са 2+ и Na+ по Glu-управляемым каналам. Расход АТФ, производимого гликолизом, многократно возрастал за счет потребления Na+/K+-АТФазами и при такой конкуренции за АТФ производительности F1Fo-АТФазы уже не хватало для генерации высокого ΔΨm при поступлении Са2+ в митохондрии по унипортеру. Удаление Са2+ из буфера значительно уменьшало МД, вызванную Glu в присутствии блокатора комплекса IV дыхательной цепи цианида. МД, вызванную Glu в присутствии CN, можно было уменьшить еще больше, отменив потребление АТФ Na+/К+-АТФазами предынкубацией клеток с оубаином. НКД возникала также при добавлении протонофоров или ингибиторов протонных насосов дыхательной цепи, если эти агенты добавляли не заранее, а уже после начала действия Glu. Также, как в протоколе с предварительным добавлением этих агентов, восстановление низкого [Ca2+]i в постглутаматный период становилось возможным только после отмывания митохондриальных ядов и восстановления ΔΨm. Блокада F1Fo-АТФазы олигомицином способствовала восстановлению [Ca2+]i сразу после удаления Glu при продолжающемся присутствии митохондриальных ядов Поскольку отключение Na+/К+-АТФазы от потребления АТФ с помощью оубаина облегчало восстановление [Ca2+]i в постглутаматный период, был применен другой способ блокирования Na+/К+-АТФазы, а именно, замена Na+ в буфере на непроникающий органический катион N-метил-D-глюкамин (NMG+). Замена Na+ на NMG+ не повлияла на базальный уровень [Ca2+]i и ΔΨm покоящихся нейронов (Рис. 4Г,Д,Е). Glu вызвал в безнатриевом буфере (NMG17 A 8 6 4 2 0 0 10 20 30 40 NMG 8 6 4 2 0 50 0 10 20 Время (мин) Б 30 40 50 Время (мин) Д -Ca Glu 5 -Ca Glu 10 [Ca2+]i (Fura-FF, F340/F380) [Ca2+]i (Fura-FF, F340/F380) Г -Ca Glu 10 5 -Ca Glu 4 m (Rh123, F/Fo) m (Rh123, F/Fo) NMG 3 2 1 4 3 2 1 0 10 20 30 40 50 0 10 20 Время (мин) В Е ROI 1 -Ca Glu 4.0 40 4 2.5 3 2.0 2 1.5 1 1.0 0 0.5 Glu NMG 5 -Ca 3.5 3.0 4 2.5 3 2.0 2 1.5 1.0 1 10 20 30 40 50 0 Время (мин) m (Rh123, F/Fo) 3.0 m (Rh123, F/Fo) 5 [Ca2+]i (Fura-FF, F340/F380) 3.5 0 50 ROI 18 ROI 18 6 [Ca2+]i (Fura-FF, F340/F380) 30 Время (мин) 10 20 30 40 50 Время (мин) Ж Рис. 4. Замена Nа+ на непроникающий органический катион NMG+ усиливает индуцированный глутаматом рост внутриклеточной 2+ 2+ концентрации свободного Са ([Ca ]i) и вызывает глубокую митохондриальную деполяризацию. Изменения [Ca2+]i (А и Г) и митохондриального потенциала (ΔΨm) (Б и Д) в буфере с обычным содержанием Na+ (А, Б, В) и в безнатриевом растворе (Г, Д, Е) в первичной культуре нейронов из гиппокампа крысы. (В и Е) Изменения [Ca2+]i (сплошные линии) и ΔΨm (пунктирные линии) в двух представительных нейронах 18 совмещены попарно для демонстрации синхронности изменений [Ca 2+]i (левые оси ординат) и ΔΨm (правые оси ординат). В безнатриевом буфере Na+ полностью заменен на N-метил-D-глюкамин (NMG, 130мМ). Концентрация Glu 20мкМ (10мкМ глицина, 0Mg2+). Олигомицин (2,5мкг/мл) добавляли за 5мин до Glu и в течение всего времени действия Glu . буфере) настолько сильный рост [Ca2+]i и быстрое падение ΔΨm, что практически отсутствовала стабилизация [Ca2+]i и ΔΨm на промежуточном относительно низком уровне и изменение этих параметров было таким же, как при НКД. Вызвано это тем, что в отсутствие трансмембранного Na+ тока (1) ΔΨp почти не снижается и поэтому увеличен электрофоретический захват Са2+ нейронами (Kiedrowski, 1999; Czyz et al., 2002) и (2) Na +/Са2+-обмен через плазматическую мембрану осуществляется только в реверсивном режиме, превращая Na+/Са2+-обмен из механизма поддержания Са2+ гомеостаза в дополнительный путь поступления Са2+ в нейроны (Kiedrowski, 1999; Czyz et al., 2002; Storozhevikh et al., 2007) Синхронность изменений [ATP] и ΔΨm в NMG-буфере сохранилась, что более ясно видно на совмещенных графиках [Ca2+]i и ΔΨm одного из нейронов (Рис. 4Е), входящих в группу клеток на рисунках 4Г,Д. На кумулятивной кривой (Рис. 4Ж) видно, что в NMG-буфере 50% клеток вступило в фазу высокого [Ca2+]i плато быстрее, чем в обычном Na+-содержащем буфере. Сходство с НКД подкрепляется тем, что олигомицин отдалял наступление ОКД и сильной МД (Рис. 1Ж), указывая на реверсию F1Fo-АТФсинтазы. Данные, представленные на рисунке 6 показывают, что экономия АТФ за счет уменьшения его расхода Na+/К+-АТФазой не гарантирует удаления Са2+ из нейронов Са2+-АТФазой плазмалеммы. В случае одновременного поступления Са2+ по NMDA-каналам и реверсированным Na+/Са2+-обменникам Са2+ дисрегуляция и дисфункция митохондрий могут наступить также быстро, как при НКД, индуцированной Glu в присутствии митохондриальных ядов. 2. Исследовать влияние на развитие ОКД внешних факторов, модулирующих функциональное состояние митохондрий 2.1. Изменения митохондриального NAD(P)H и ΔΨm при химической гипоксии, разобщении окислительного фосфорилирования и глюкозной депривации. Протонные насосы дыхательной цепи черпают энергию для перекачивания протонов из матрикса в цитозоль (межмембранное пространство митохондрий) и создания трансмембранного электрохимического потенциала за счет окисления NADH комплексом I, убихинола комплексом III и цитохрома 19 С комплексом IV. NADH образуется в результате восстановления NAD+ пируватдегидрогеназой и тремя ферментами цикла трикарбоновых кислот. Изменения концентрации митохондриального NADH являются важным показателем окислительно-восстановительных процессов в митохондриях и поэтому были исследованы нами в нейронах в условиях, нарушающих фукционирование митохондрий и при токсическом воздействии Glu. Для этого измеряли собственную флуоресценции клеток, обусловленную суммой сигналов NADH и NADPH (NAD(P)H-автофлуоресценцию). Доминирующим компонентом является NADH-флуоресценция (Chance et al, 1979). Сопоставление NAD(P)H автофлуоресцентных изображений нейронов с флуоресцентными изображениями Rh123 тех же самых клеток (не показано), согласуются с данными двух-фотонной микроскопия высокого разрешения, что при регистрации флуоресценции NAD(P)H всей клетки около 70% сигнала принадлежит митохондриальному NADH (Li et al, 2008). В покоящихся нейронах ингибирование комплекса IV дыхательной цепи цианидом (CN, 3мМ) прекращает окисление субстратов всеми протонными насосами, в том числе NADH комплексом I, и вызывает максимально возможный подъем флуоресценции этого динуклеотида (Рис. 5А). Возникающая при этом небольшая деполяризация митохондрий (Рис. 5В), обусловлена тем, что инверсия митохондриальной АТФсинтазы в АТФазу и гидролиза поступающего из цитозоля АТФ позволяет поддерживать ΔΨm+ на уровне близком к тому, который создают насосы дыхательной цепи (Nicholls & Budd, 2000). Отмывание CN восстанавливало сигналы как Rh123 и, так и NADH. Последующая блокада F1FoАТФазы олигомицином вызывала рост флуоресценции NAD(P)H до 87.1+1.9% (n=24) от подъема, вызванного цианидом (Рис. 5А). Оставшиеся 13% NADH дыхательная цепь затрачивает, очевидно, на компенсацию «токов утечки» сквозь внутреннюю митохондриальную мембрану. 20 А (n=9) CN 3.0 CN NAD(P)H (F/Fo, отн. ед.) FCCP 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 Oligo 0.0 0 500 1000 1500 2000 2500 Время (с) Б (n=9) 2.0 FCCP CN CN m (Rh123, F/Fo) 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 Oligo 0.6 0 500 07-11-05_1/ CGC 7DIV/ #4 1000 1500 2000 2500 Рис. 5. В покоящихся нейронах основная часть NAD(P)H тратится на обеспечение синтеза АТФ. Изменения митохондриального NAD(P)H (А) и ΔΨm (В), вызванные блокадой дыхательной цепи и ингибированием митохондриальной АТФсинтазы в культивированных гранулярных нейронах мозжечка крысы. На этом и последующем рисунках блокаду дыхания осуществляли цианидом натрия (CN, 3мМ), АТФсинтазу ингибировали олигомицином (Oligo, 2,5мкг/мл). Для определения минимального уровня NAD(P)H флуоресценции к нейронам добавляли протонофор FCCP (1мкМ). Время (с) Добавка CN в присутствии Oligo вызывала полную деполяризацию, как и применение высокой концентрации протонофора (FCCP, 1мкМ) в конце эксперимента (Рис. 5В). Изменения флуоресценции NAD(P)H в ответ на CN и FCCP имели противоположную направленность – протонофор снижал сигнал NAD(P)H до минимального уровня, что отражает максимальную скорость дыхания и, соответственно, потребления NADH дыхательной цепью. (Jackobson & Nicholls, 2004). В дальнейшем остановка дыхания цианидом, являющаяся химической имитацией аноксии, и максимальное потреблении NADH в присутствии высокой концентрации протонофора служили процедурами калибровки максимального и минимального сигналов NAD(P)H. Пируват (Pyr), окисление которого служит первым из четырех процессов восстановления NAD+ до NADH митохондриальными дегидрогеназами, образуется в результате окисления глюкозы в цитозоле. Поэтому мы проверили как будут изменяться важнейшие энергетические показатели митохондрий, NAD(P)H и ΔΨm , при глюкозном голодании нейронов. Замена глюкозы на 21 неметаболизируемый аналог 2-дезоксиглюкозу (DG) вызывала медленную деполяризацию митохондрий и постепенное снижение NAD(P)H автофлуоресценции (Рис.6). Плавное падение ΔΨm и NAD(P)H является отражением того, что в условиях ингибирования гликолиза снижается соотношение АТФ/АДФ в цитозоле, увеличивается нагрузка на F1FoАТФазу по синтезу АТФ и, соответственно, растет протонный ток через F1FoАТФазу, деполяризующий митохондрии. Ингибирование F1FoАТФазы олигомицином увеличивало ΔΨm , резко снижая сигнал Rh123, подобно представленному на Рис.5Б, но с большей амплитудой (не показано). Добавление Pyr в безглюкозный буфер быстро восстанавливало NAD(P)H и ΔΨm до исходного уровня в покоящихся нейронах (Рис. 6), в соответствии с тем, что Pyr служит основным субстратом митохондрий, а NADH, в свою очередь, является основным источником автофлуоресценции нейронов. После отмывания Pyr добавление цианида в безглюкозный буфер вызвало сильный рост сигнала Rh123, такой же как FCCP в конце измерений (Рис. 6Б). Вызвано это тем, что в условиях ингибирования гликолиза F1FoАТФаза не может поддерживать потенциал за счет гидролиза цитозольного АТФ и поэтому остановка дыхательной цепи цианидом в безглюкозном буфере вызвала коллапс ΔΨm. Неожиданным оказалось то, что, несмотря на отсутствие глюкозы (и Pyr), цианид вызвал сильный подъем NAD(P)H, составлявший 74±5% (n=47) от максимального, вызванного CN в обычном буфере с глюкозой (Рис. 6А,В). Этот эффект указывает на то, что нейроны имеют для митохондрий «запасной» субстрат, который окисляется в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК), обеспечивая относительно небольшое снижение ΔΨm в отсутствии гликолиза. Наиболее вероятным, на наш взгляд, субстратом может быть Glu, поскольку концентрация этой аминокислоты в цитозоле может достигать 10мМ (Nicholl, 2009) и имеется механизм ее транспорта в митохондрии (Frigerio et al, 2008), где Glu окисляется до одного из субстратов ЦТК, α-кетоглутарата. 22 a A Mean (n=9) CN CN 2.5 Pyr FCCP NAD(P)H Fluorescence (F/Fo) DG 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 1000 2000 3000 4000 5000 Time (sec) Бb CN Pyr 2.0 CN FCCP m (Rh123 Fluorescence, F/Fo) DG 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0 1000 2000 07-11-25_1/ CGC 13 DIV 4000 5000 1.8 NAD(P)H Fluorescence (rel.un.) В c 3000 Time (sec) 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 CN CN DG DG DG+Pyr DG+CN DG+Pyr DG+CN Fig. 6. Влияние ингибирования гликолиза и митохондриальных ядов на NAD(P)H и митохондриальный потенциал (ΔΨm) нейронов. Усредненные сигналы NAD(P)H (А) и Rh123 (Б) одного из экспериментов (9 клеток). (С) Усредненные изменения NAD(P)H (6 экспериментов; 47 клеток) при ингибировании дыхательной цепи цианидом (3мМ, CN), замене глюкозы на неметаболизируемый аналог 2-дезоксиглюкозу (DG, 10мМ), при сочетанном применении DG с митохондриальным субстратом пируватом (Pyr, 10мМ), при одновременном ингибировании гликолиза и дыхания (DG+CN) и при коллапсе ΔΨm с помощью высокой концентрации протонофора FCCP (1мкМ). Все флуоресцентные сигналы нормированы относительно исходного значения (F/Fo) (на (С) это отношение обозначено пунктирной линией). FCCP FCCP 2.2. Изменения [Ca2+]i и ΔΨm индуцированные Glu в отсутствии глюкозы. Молодые нейрональные культуры (6-8DIV), особенно приготовленные из гранулярных клеток мозжечка крысы, довольно устойчивы к действию Glu и в течение первых 10-20мин ОКД и вторичное падение ΔΨm развивается в небольшой доле нейронов (Рис. 7А,В,Е; см. также, Рис. 3А,Б), по сравнению с 23 Бb 1.0 FCCP 0.8 0.6 0.4 0.2 -Ca2++EGTA 0 5 10 15 Time (min) 20 cB 1.4 1.0 0.6 5 10 15 Time (min) 20 25 FCCP Glu Glu 1.9 2.5 2.0 1.5 1.0 5 10 15 Time (min) 20 1.7 1.5 1.3 1.1 0.9 0.7 -Ca2++EGTA 0 1.4 1.2 1.3 0.8 1.2 -Ca+EGTA DG 0.0 0 5 10 15 Time (min) 20 25 0) 1.1 0.4 10 15 Time (min) 20 25 80 Percent of cells (%) 1.5 m (Rh123, F/F 1.6 5 Еf FCCP 1.6 Glu 2.0 -Ca2++EGTA DG 0.5 0 25 eД 340 /F 380 ) DG Г d 3.0 [Ca 2+ ] i (Fura-2FF, F -Ca2++EGTA 0.2 0 m (Rh123, F/F 0 ) 0) m (Rh123, F/F 1.8 25 FCCP 3.5 FCCP Glu 340 /F 380 ) Glu [Ca 2+]i, (Fura-2FF, F [Ca 2+ ]i (Fura-2FF, F 340 /F 380 ) A a 60 40 20 1.0 0.9 0 Control DG DG+Pyr DG+Lac Fig. 7. Блокада гликолиза приближает наступление Са2+ дисрегуляции и вторичного падения ΔΨm, а митохондриальный субстрат пируват отдаляет ОКД и сильную МД. Изменения [Ca2+]i (А,В) и ΔΨm (Б,Г) в группе нейронов в глюкозу-содержащем буфере (А,Б) и в буфере, в котором глюкоза заменена на 2-дезоксиглюкозу (DG, 10мМ) (В,Г). (Д) Изменения [Ca2+]i и ΔΨm в представительном нейроне в условиях блокады гликолиза. (Е) Доля нейронов (%) имевших ОКД при действии одного Glu (Control), а также при действии Glu в безглюкозном буфере (DG) и в этом буфере в присутствии пирувата (DG+Pyr) или лактата (DG+Lac). Концентрации Glu (100мкМ), Pyr и Lac по 10мМ. 24 более зрелыми культурами (12-14DIV и более; Vergun et al, 1999). Блокада гликолиза заменой глюкозы на DG резко ускоряло наступление ОКД и сильной МД (Рис. 7Б,Г,Е). Синхронность ОКД и вторичного падения ΔΨm при этом не нарушалась (Рис. 7Д). Любопытно, что Glu вызывал в безглюкозном буфере кратковременную гиперполяризацию митохондрий, проявившуюся в опускании сигнала Rh123 ниже уровня, предшествующего добавлению Glu (Рис. 7Д). Возможно, вход Са2+ в цитозоль и захват его митохондриями активирует работу ЦТК (McCormac & Denton, 1990; Denton, 2009). Не исключено также, что Glu индуцирует Са2+-зависимое ингибирование F1FoАТФазы (Mareno-Sanches, 1985), вызывая подобно олигомицину, рост ΔΨm . Введение в безглюкозный буфер Pyr или лактата (Lac) восстанавливало лаг-период ОКД (снижало долю клеток, имевших ОКД за время наблюдения) до контрольного уровня в обычном буфере с глюкозой (Рис. 7Е). Lac оказывал даже несколько больший положительный эффект, чем Pyr. Вероятно, Lac, окисляясь цитозольной лактатдегидрогеназой до Pyr и восстанавливая NAD+ до NADH, предоставлял митохондриям через посредство челноков дикарбоновых кислот дополнительный источник восстановительных эквивалентов для РедОкс процессов дыхательной цепи. 2.3. Изменения NAD(P)H при глутаматном воздействии. При действии на нейроны Glu на митохондрии ложится дополнительная нагрузка по увеличению производства АТФ для ионных насосов, удаляющих Са2+ и Nа+ из цитозоля наружу, а также по поглощению избытка Са2+ из цитозоля, благодаря его электрофоретическому транспорту по кальциевому унипортеру (Kirichok et al, 2004) и, возможно, другими Са2+ каналами внутренней мембраны митохондрий (Michels et al, 2009). Поэтому мы проверили, как изменяется соотношение между затратами NADH на производство АТФ и компенсацию других ионных потоков через внутреннюю мембрану во время первой фазы действия Glu и во время ОКД. В 57% нейронов (113/206) из мозжечка крысы во время первой фазы Glu-индуцированных изменений [Ca2+]i происходило снижение NAD(P)H до уровня, промежуточного между исходным в покоящихся клетках и минимальным, наблюдаемым при добавлении высокой концентрации протонофора в конце эксперимента. Развитие сильной МД (и, следовательно, ОКД, см. Рис. 1Д) происходило одновременно со вторичным падением NAD(P)H. Пример изменений ΔΨm и NAD(P)H в группе гранулярных нейронов мозжечка и в одном из представительных нейронов показан на Рис. 8А,Б. Низкие концентрации протонофоров (10-50нМ FCCP или 5-8мкМ 25 А Б В Г Д Рис. 8. Частичное ингибирование дыхательной цепи ускоряет наступление ОКД. Изменения ΔΨm и NAD(P)H в нейронах из мозжечка крысы (16DIV) под действием одного глутамата (Glu) (А,Б) и Glu в присутствии низких концентраций ингибитора дыхания (0,2мМ NaCN) (В,Г). Для калибровки максимального и минимального сигнала NAD(P)H в начале и конце эксперимента добавлены, соответственно, 1мМ NaCN и 1 мкМ FCCP. (Д) Увеличение доли клеток (%), в которых Glu и Glu+CN индуцировали сильную митохондриальную деполяризацию. (Б,Г) Изменения сигналов потенциалчувствительного зонда Rh123 и NAD(P)H автофлуоресценции в двух представительных нейронах. Сигналы Rh123 (возб.485нм; исп.525нм) и NAD(P)H (возб.360нм; исп.460нм) нормированы относительно исходных значений в покоящихся нейронах (F/Fo). 26 динитрофенола), не вызывавшие коллапса ΔΨm , снижали NAD(P)H и ускоряли наступление ОКД (не показано). На этом основании можно заключить, что ОКД начинается тогда, когда [NADH] в митохондриях опускается ниже величины, необходимой для поддержания ΔΨm на уровне, достаточном для синтеза АТФ и поглощения избытка Са2+ из цитозоля. Однако частичная блокада дыхания с помощью небольшой концентрации ингибитора комплекса IV дыхательной цепи (0,1-0,2мМ NaCN) снижала ΔΨm примерно настолько же, насколько низкая концентрация FCCP, и тоже значительно ускоряла наступление сильной митохондриальной деполяризации (Рис. 8В,Д). Принципиальным отличием действия цианида от протонофора является то, что первый не уменьшал, а увеличивал NAD(P)H (сравните Рис. 8Б и 8Г) за счет понижения окисления NADH комплексом I дыхательной цепи. На примере нейрона на рисунке 8Г видно, что сильная МД (и, следовательно, ОКД) могут развиваться при уровне NAD(P)H, даже превышающем исходный в покоящихся нейронах. Из этого следует, что причиной наступления ОКД является не снижение NADH, как таковое, а неспособность протонных насосов дыхательной цепи поддерживать электрохимический потенциал на уровне, необходимом для поглощения избытка Са2+ из цитозоля и осуществления ОксФос. Такая ситуация может возникнуть даже при достаточном уровнеNAD(P)H, если в при патологическом состоянии (токсической концентрации Glu) в нейронах появляются эндогенные ингибиторы дыхательной цепи, например, оксид азота (Moncada & Bolaños, 2006) и другие низкомолекулярные соединения (Brown, 2010). Пример такого эндогенного ингибитора рассмотрен далее в параграфе, посвященном влиянию арахидоновой кислоты на Glu-индуцированные изменения [Ca2+]i и ΔΨm. Более высокий уровень NADH является, очевидно, показателем способности протонных насосов дыхательной цепи поддерживать достаточно высокий ΔΨm , но не гарантией предотвращения ОКД. 3. Вклад эндогенных факторов, возникающих в результате индуцированной глутаматом активации поли(АДФрибоза)полимеразы-1 и фосфолипаз А2, в развитие дисфункции митохондрий и ОКД. 3.1. Роль поли(АДФ-рибоза)полимеразы-1 (ПАРП-1) в возникновении ОКД и гибели нейронов. При гиперстимуляции NMDA рецепторов происходит избыточная активация фермента ПАРП-1, который расщепляет NAD+, присоединяя АДФ-рибозильную часть динуклеотида к ядерным белкам и запуская, таким образом, процесс репарации повреждений ДНК (Cosi et al, 27 1994; Zhang et al., 1994; Duan et al., 2007; Wang et al., 2007). Недавно появились сообщения о том, что в культуре гиппокампальных нейронов причиной возникновения ОКД может быть исчерпание NAD+ в результате повышенной активности ПАРП-1 и, как последствие, дефицит NADH (Abramov & Duchen, 2008, 2010). Выполненный нами биохимического анализа содержания NAD + и NADH в культуре гранулярных нейронов мозжечка показал, что при действии Glu NAD+ снижался на 25% относительно уровня в покоящихся клетках (2,2пикомоль/мг белка), тогда как NADH падал на 75% (в контроле 1,6 пикомоль/мг белка). Наиболее потентный из ингибиторов ПАРП-1 антибиотик миноциклин (Alano et al, 2006) удерживал NAD+ при действии Glu на контрольном уровне, но не предотвращал падения NADH. Миноциклин (0,2мкМ) удлинял время, за которое в 50% нейронов развивалась ОКД, на ~35% (n=198), не влияя на синхронность второй фазы роста [Ca2+]i и падения ΔΨm. 1.0 0.8 CN Iono 2.0 -Ca 12 CN 1.5 8 Delay NADH - DCD FCCP 1.0 Glu+CN NAD(P)H fluorescence ratio (Glu+CN)/CN N=51 R2=0.415 CN Glu 4 0.5 0 NAD(P)H fluorescence (Ex 360; Em 460) 1.2 Fluo-3FF fluorescence (Ex 490; Em 540) CN 0.0 0 1000 2000 3000 4000 5000 Time (s) 07-10-26_1/ CGC 11DIV/ #8 0.6 0.4 0.2 0.0 0 400 800 1200 1600 2000 Delay NAD(P)H - DCD (s) Рис.9. Зависимость флуоресцентного сигнала NAD(P)H от времени, прошедшего от начала ОКД до момента добавки цианида (CN). Сигнал NAD(P)H представлен как отношение прироста флуоресценции NAD(P)H, вызванного добавкой CN в присутствии глутамата (Glu), к приросту флуоресценции NAD(P)H, вызванного добавкой CN к покоящимся клеткам (Glu+CN/CN). Значения величин, отложенных по Х–У-осям, иллюстрированы на вставке, на которой показаны сигналы NAD(P)H и кальциевого индикатора Fluo-3FF, индуцированные CN и Glu в одном из нейронов. Точкам, лежащим на 28 вертикальной пунктирной линии, присвоено нулевое время задержки роста флуоресценции NAD(P)H относительно ОКД. Это означает, что в соответствующих нейронах ОКД еще не успела начаться и в момент добавки CN эти клетки все пребывали в первой фазе подъема [Ca2+]i . Таким образом представление об исчерпании NAD+, ведущем к дефициту NADH и, соответственно, снижению эффективности работы дыхательной цепи, не получили подтверждения в наших исследованиях. Для дополнительной проверки было изучено влияние блокады дыхательной цепи на уровень NAD(P)H на разных стадиях [Ca2+]i ответа нейронов на Glu (Рис. 9). Поскольку лаг-период ОКД находится в диапазоне десятков минут (см. Рис.1), то добавка CN застает соседние нейроны на разных стадиях изменений [Ca2+]i и ΔΨm. Если ОКД была в фазе развития или только что достигла [Ca2+]i плато, то добавка NaCN вызывала такой же подъем NAD(P)H, как и в нейронах, находившихся к моменту добавления CN в первой фазе [Ca2+]i ответа на Glu (Рис. 9). Из этого следует, что, если бы к началу ОКД весь NAD+ был израсходован ПАРП-1 на реакцию поли(АДФ-рибозилирования), то подъем флуоресценции в момент добавления CN был бы невозможен. Другими словами, вторичное падение NAD(P)H, совпадающее с развитием ОКД (см. вставку на Рис.9 и Рис.8Б,Г) не является последствием исчерпания NAD+/ Продление графика линейной регрессии на рисунке 9 до пересечения с осью абсцисс показывает, что, спустя примерно 30-40 минут после начала ОКД, добавление CN уже не вызывает подъема флуоресценции NAD(P)H. Нейроны, находившиеся в стадии [Ca2+]i плато такое длительное время, как правило, не способны восстановить низкий уровень [Ca2+]i и вернуться к высокому ΔΨm после удаления Glu. По нашему мнению, такие последствия длительного пребывания нейронов в фазе высокого [Ca2+]i плато, как необратимость этой фазы и отсутствие роста NAD(P)H в ответ на CN могут свидетельствовать о возникновении в митохондриях нейронов неспецифической поры высокой проводимости (мРТ). ОКД, возможно, является начальной стадией образования такой поры, но не «классическим» ее состоянием, при котором мРТ способна пропускать молекулы размером до 1500Да (Zoratti & Szabo, 2005; Bernardi et al, 2006; Zorov et al, 2009). Благодаря большому диаметру мРТ, митохондриальный NAD+ способен «вытекать» из матрикса в цитозоль, прекращая дыхание (Di Lisa et al, 2001). Судя по быстрому увеличению NAD(P)H при остановке дыхания цианидом, NAD+ остается в митохондриях культивируемых нейронов, по крайней мере, вплоть до выхода на высокое [Ca2+]i плато (Рис.9). 29 3.2. ОКД и образование активных форм кислорода (АФК). Считается, что повреждения ядерной ДНК активными формами кислорода являются пусковым фактором ПАРП-1 (von Zglinicki et al., Beneke & Bürkle, 2007). Поскольку проверка гипотезы об исчерпании NAD+ как основном факторе энергетического кризиса нейронов (Abramov & Duchen, 2008, 2010) привела к отрицательному результату, мы решили убедиться происходит ли образование АФК в условиях наших экспериментов. Мы проверили каково соотношение между возникновением ОКД и образованием АФК в культуре, используя флуоресцентный индикатор MitoSox, наиболее избирательный для обнаружения супероксиданион радикала в митохондриях (Robinson et al., 2006). Мы обнаружили, что за время действия Glu флуоресцентный сигнал MitoSox возрастал только в тех нейронах, в которых возникла ОКД и оставался на постоянно низком уровне в нейронах, не имевшем ОКД. Добавление протонофора FCCP (1мкМ) в постглутаматный период вызывала коллапс ΔΨm , однако, роста флуоресценции MitoSox не происходило. Эти данные показывают, что при действии нейротоксических доз глутамата возникают АФК, а значит и условия для повреждения ДНК и гиперактивации PARP-1, но только в тех нейронах, в которых произошла ОКД. 3.3. Иммунофлуоресцентный анализ локалазации продукта активности PARP-1 при действии глутамата. Если ОКД возникает вследствие слишком сильного расхода NAD+, потраченного на образование избыточного количества поли(АДФ-рибозы) (ПАР), то естественно ожидать более высокий уровень ПАР в тех нейронах, в которых возникла ОКД, по сравнению с нейронами, сохранившими [Ca2+]i на относительно низком уровне. Для проверки этого предположения на культуру гранулярных нейронов мозжечка воздействовали нейротоксической дозой глутамата (Glu) до тех пор, пока примерно в половине нейронов возникла ОКД. Затем методом иммунофлуоресцентного окрашивания определяли распределение ПАР в этих же самых клетках. Результаты представлены на рисунке 10. Видно, что большинство нейронов, в которых возникла ОКД, имели распределение PAR преимущественно по периметру ядра. Однако подобное окрашивание наблюдалось и в некоторых нейронах, в которых ОКД не возникла (например, клетка 26 и еще 3 нейрона в данном поле). Преимущественно ядерную локализацию PAR имели те нейроны, в которых ОКД наступила быстро (клетка 1). Остальные нейроны, не испытавшие ОКД, имели более слабую и диффузную иммунофлуоресценцию (например, клетки 24 и 25). Для сравнения на Рис.1 буквами «А» отмечены два 30 астроцита, поскольку в этих клетках Glu вызывает лишь небольшой монофазный подъем [Ca2+]i , либо осцилляции [Ca2+]i малой амплитуды (см., например, Рис. 3Ж). Астроциты имели небольшое окрашивание цитоплазмы и еще более слабое окрашивание ядерной зоны. Fura-FF F340/F380 Alexa568 II-aB 24 4 DAPI 24 24 25 11 26 4 20 11 18 25 26 20 18 18 A A A A A 19 1 25 11 26 20 9 A 19 1 9 1 9 19 8 7 [Ca2+]i (Fura-FF, F340/F380) 6 18 5 4 A 1 3 9 A 20 11 2 A 26 1 Glu 0 600 1000 1400 1800 25 2200 2600 3000 3400 3800 Time (s) Рис. 10. Распределение поли(АДФ-рибозы) и графики изменения [Ca ]i в нейронах, подвергнутых нейротоксическому воздействию глутамата. Сопоставление изображения клеток, нагруженных Ca2+ индикатором Fura-FF и подвергнутых действию нейротоксической концентрации глутамата, с изображениями, полученными последующим иммунофлуоресцентным окрашиванием тех же клеток моноклональными антителами против PAR, а затем вторичными поликлональными антителами (goat antimouse), содержащими флуоресцентную метку Alexa-568. Изображение клеток, окрашенных Fura-FF (левое изображение), является рэйшиометрическим (F340/F380), в котором более теплому цвету соответствует более [Ca2+]i. Рэйшиометрическое изображение было получено непосредственно перед удалением Glu. Среднее изображение (красным цветом) показывает распределение поли(АДФ-рибозы) в клетках, после глутаматного воздействия. Цифры возле нейронов соответствуют графикам изменения [Ca2+]i, приведенным в нижней части рисунка. Буквами «А» отмечены два из пяти астроцитов в поле наблюдения. Правое изображение получено после 2+ 31 завершения иммунофлуоресцентного окрашивания и отмечает положение ядер клеток, окрашенных DAPI. Сопоставление [Ca2+]i ответов и иммунофлуоресцентного окрашивания показывает, что причиной гибели нейронов может быть не столько дефицит NAD+, сколько продукт ферментативной активности PARP-1 – поли(АДФрибоза), способствующая высвобождению из перимембранного пространства митохондрий фактора апоптоза, AIF (Andrabi et al., 2006, 2008). Исследование протекторного действия ингибиторов PARP-1 3-аминобензамида (АВА, 1мМ) и миноциклина (0,2мкМ) на гибель гранулярных нейронов мозжечка крысы, вызванную Glu (60мин, 100мкМ) показало, что оба ингибитора снижают долю погибших клеток примерно на 14%. Эти данные согласуются с результатами измерения [Ca2+]i , продемонстрировавшими, что доля нейронов, имевших ОКД после 1часа экспонирования Glu, составляла 65%, тогда как в присутствии миноциклина Glu вызывал ОКД в 55% нейронов. 3.4. Исследование обратимости ОКД при прекращении поступления Са из внеклеточной среды. Развитие ОКД, т.е. переход от относительно небольшого стационарного уровнях [Ca2+]i к высокому плато, может отражать возникновение и развитие во внутренней мембране митохондрий обратимой поры низкой проводимости, способной закрыться при удалении Са 2+ (Ichas & Mazat, 1998; Brustovetsky & Dubinsky 2000). Мы проверили, существует ли такая обратимость по отношению к субстратам дыхательной цепи. На рисунке 16 приведены изменения [Ca2+]i и автофлуоресценции, обусловленной NAD(P)H и FAD, в двух представительных нейронах из гиппокампа крысы. У флавинаденин динуклеотида, являющегося кофактором сукцинатдегидрогеназы (комплекса II дыхательной цепи), в отличие от никотинамидаденин динуклеотида, флуоресцирует не восстановленная, а окисленная форма (FAD), поэтому при усилении дыхания и увеличении концентрации окисленных форм этих динуклеотидов изменения их сигналов имеют противоположную направленность (Chance et al, 1979). Сигнал NAD(P)H снижался сразу после добавления Glu (Рис. 11) тогда как флуоресценция FAD, отражающая активность сукцинат-дегидрогеназы изменялась слабо (Рис. 11А). Это может означать, что во время первой фазы Са2+ ответа на Glu восстановление убихинона происходит преимущественно в комплексе I, тогда как комплекс II находится в «резерве». Во время развития ОКД резко увеличивается нагрузка на протонные насосы по поддержанию 2+ 32 электрохимического потенциала митохондрий и в этом случае в действие вступает комплекс II, что проявляется в резком увеличении сигнала FAD. При развитии ОКД происходило вторичное снижение NAD(P)H и одновременно увеличение FAD (Рис. 11Б). Эти изменения показывают, что ни NAD(P)H, ни FADH2 не находились на минимальном уровне перед развитием ОКД и свидетельствуют о том, что дефицит субстратов дыхательной цепи не является причиной развития ОКД. - Ca Glu 24 1.6 1.4 20 1.2 16 FAD 1.0 12 0.8 NAD(P)H 8 0.6 4 NAD(P)H и FAD (F/Fo) [Ca2+]i (Rhod-FF , F/Fo) А 0.4 Rhod-FF 0.2 0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Время (c) Б - Ca Glu 1.6 1.4 FAD 20 1.2 1.0 15 0.8 10 0.6 5 0.4 Rhod-FF NAD(P)H 0.2 0 0 500 11-02-05_2/ Hippoc 10DIV 1000 1500 2000 2500 3000 NAD(P)H и FAD (F/Fo) [Ca2+]i (Rhod-FF , F/Fo) 25 Рис. 11. Начальная стадия ОКД является обратимой. Изменения [Ca2+]i и автофлуоресценции, обусловленной NAD(P)H и FAD, индуцированные глутаматом в культуре гиппокампальных нейронов. Приведены сигналы представительных нейронов, в одном из которых ОКД не возникла, а в другом ОКД достигла стадии высокого [Ca2+]i плато непосредственно перед 2+ удалением Са из буфера. Для измерения [Ca2+]i использовали Rhod-FF. Флуоресценцию возбуждали и регистрировали при (нм): 565 и >610 (Rhod-FF); 360 и 460 (NAD(P)H); 440 и 525 (FAD). Все сигналы нормированы относительно исходных значений. Время (c) Удаление Са2+ из буфера при продолжающемся действии Glu вызывало снижение [Ca2+]i, которое всегда происходили синхронно с ростом NAD(P)H и FAD (Рис. 11) и увеличением ΔΨm (не показано). Рост NAD(P)H и FAD и восстановление ΔΨm были бы невозможны в том случае, если ОКД вызвано образованием поры такого размера, через которую способен пройти NAD+ и тем более низкомолекулярые субстраты ЦТК, в частности сукцинат. Другими 33 словами, если при ОКД образуется пора, то она, вероятно, относится к «низкопроводящей, не классической», способной пропускать неорганические ионы, но не молекулы размера субстратов ЦТК и выше. Способность нейронов к немедленному восстановлению [Ca2+]i и реполяризации митохондрий при удалении Са2+ из буфера вскоре после выхода на высокое [Ca2+]i плато указывает на то, что повреждение Са2+-насосной функции Са2+-АТФазы (Schwab et al. 2002) или прямой моды Na+/Са2+обменника (Bano et al, 2005), если и происходит, то не перед развитием ОКД, а уже после того, как клетки достаточно долго пребывали в стадии высокого [Ca2+]i плато (Brustovetsky et al, 2010). Возвращение Са2+ в буфер приводило к подъему [Ca2+]i . В тех нейронах, в которых удаление Са2+ из буфера произошло до возникновения ОКД, этот подъем [Ca2+]i имел двухфазный характер, напоминающий ОКД (Рис. 11А). Если до удаления Са2+ нейроны успели войти в фазу высокого [Ca2+]i плато, то возвращение Са2+ в буфер вызывало быстрое увеличение [Ca2+]i, напоминающее НКД (Рис. 11Б). В ~80% нейронов (n=6) подъем [Ca2+]i начинался до того, как NAD(P)H и FADН2 падали до минимального уровня, указывая на то, что развитие «повторной» Са2+ дисрегуляции вызвано в большинстве случаев не падением субстратов дыхания до минимального уровня, а другой причиной. 3.5. Влияние блокады F1Fo-АТФаза на NAD(P)H и ΔΨm. Сопоставление эффектов блокатора дыхания СN и ингибитора F1Fo-АТФазы олигомицина на ΔΨm и NAD(P)H (Рис.5) показало, что в покоящихся нейронах ~87% NAD(P)H. затрачивается на обеспечение синтеза АТФ. Используя тот же методический прием, мы исследовали как меняется это соотношение при действии нейротоксических концентраций Glu Добавление олигомицина во время Glu воздействия вызывало увеличение ΔΨm и рост NAD(P)H в нейронах, имевших небольшую митохондриальную деполяризацию, и находившихся, следовательно, в первой фазе [Ca 2+]i ответа на Glu (Рис. 12А,В,Г). Эти данные свидетельствуют о том, что F1Fo-АТФаза работала в режиме синтеза АТФ (Nicholls & Budd, 2000). Рост NAD(P)H в ответ на Oligo составил 65,4±3,8% (n=15), указывая на повышение до 35% потребления NAD(P)H на процессы, не связанные непосредственно с синтезом АТФ, по сравнению с 13% в покоящихся нейронах (см. Рис.5). В основной части нейронах к моменту добавления Oligo уже произошло вторичное падение ΔΨm и, следовательно, синхронно с деполяризацией развилась ОКД, т.е. добавление Oligo пришлось на фазу [Ca2+]i плато. В этих нейронах ингибирование F1Fo-АТФазы также увеличивало ΔΨm (Рис. 12Б,В). Это говорит о том, что, несмотря на сильную митохондриальную 34 деполяризацию, F1Fo-АТФаза продолжала синтезировать АТФ. Другими словами, синхронная с ОКД сильная МД не снижала ΔΨm настолько глубоко, чтобы прекратился синтез АТФ. Кроме того, снижение ΔΨm может быть компенсировано поддержанием ΔрН на таком уровне, что электрохимический потенциала остается достаточно высоким для синтеза АТФ (ниже Рис. 17). Данные о продолжающемся синтезе АТФ согласуются с изложенными выше аргументами о том, что развитие ОКД не является результатом образования классической поры высокой проводимости. А Б В Г 1,33±0,02 0,94±0,01 0,90±0,01 1,00±0,01 Рис.12. В нейронах, подвергнутых токсическому действию глутамата (Glu), при достижении высокого [Ca2+]i плато происходит разобщение окислительного фосфорилирования. Изменения митохондриального трансмембранного потенциала (ΔΨm) и NAD(P)H в двух представительных гранулярных нейронах мозжечка, в одном из которых (А) добавление ингибитора F1Fo-АТФазы олигомицина (Oligo, 2,5мкг/мл) совпало с 1-ой фазой [Ca2+]i ответа на Glu (100мкМ, 10мкМ глицина, 0 Mg2+), а во втором нейроне (Б) добавка Oligo пришлась на фазу высокого [Ca2+]i плато. Данные экспериментов на трех культурах (45 нейронов), полученных в разные дни, суммированы на панелях (В,Г), показывающих относительное снижение сигналов Rh123 (В) и NAD(P)H (Г) при добавлении Oligo. 35 Ингибирование F1Fo-АТФазы в тех нейронах, в которых Oligo был добавлен во время [Ca2+]i плато, не увеличивало NAD(P)H (Рис. 12Б,Г), что указывает на отсутствие сопряжения окисления NAD(P)H с синтезом АТФ. Таким образом, гиперполяризация митохондрий в ответ на Oligo указывает на продолжение синтеза АТФ во время ОКД, а отсутствие роста NAD(P)H на прекращение работы F1Fo-АТФазы в режиме АТФ синтетазы во время ОКД. Это противоречие между митохондриальным синтезом АТФ и отсутствием сопряжения окисления NAD(P)H с фосфорилированием можно разрешить, на наш взгляд, если учесть подключение сукцинатдегидрогеназы и усиление окисления FADH2 до FAD во время развития ОКД (см. Рис. 11Б). Кроме того, добавление Oligo и прекращение расходования энергии на поддержание Н+тока через F1Fo-АТФазы высвобождает часть NAD(P)H, которая немедленно расходуется комплексом I на компенсацию «токов утечки». В результате Oligo не увеличивает автофлуоресценцию, если добавлен во время высокого [Ca 2+]i плато, зато увеличивает ΔΨm (Рис. 12Б,Г). Последующая блокада дыхания цанидом при продолжающемся присутствии Oligo вызывала быстрый рост NAD(P)H (Рис. 12Б). Этот рост NAD(P)H подтверждает то, что снижение автофлуоресценции до минимального уровня не связано с исчерпанием NAD + , а также то, что сильная митохондриальная деполяризация во время [Ca2+]i плато не равнозначна понятию «коллапс митохондриального потенциала». 3.6. Роль глутамат-индуцированной активации фосфолипазы А2 и арахидоновой кислоты (АА) в развитии ОКД. Выше было показано, что частичная блокада дыхательной цепи и глюкозная депривация приближают ОКД (см. Рис. 7 и 8). Воздействие Glu, особенно в отсутствие глюкозы, вызывает в культуре нейронов или срезах мозга Ca2+-зависимое высвобождение жирных кислот, среди которых значительная доля принадлежит АА (Lazarewicz et al, 1990; Williams et al, 1995). АА образуется в нейронах в результате индуцированной Glu активации различных подтипов фосфолипазы А2 (PLA2) (см., например, обзор Sun et al, 2004). Свободные жирные кислоты, особенно в сочетании с поступлением в клетку Ca2+, могут значительно влиять на функциональное состояние митохондрий, увеличивая ионную проводимость митохондриальной мембраны (Sultan & Sokolove, 2001; Mironova et al, 2004), блокируя комплекс I дыхательной цепи (Morii et al, 1991; Loskovich et al, 2005), индуцируя образование неспецифической поры высокой проводимости (Scorrano et al, 2001). Мы исследовали, способна ли экзогенная арахидоновая кислота (АА) увеличивать долю нейронов, которые в ответ на Glu имеют двухфазный подъем [Ca2+]i и вторичное падение ΔΨm. 36 AA + Glu Glu Б Glu 10 FCCP 8 6 7 Iono 5 4 3 2 Iono -Ca 600 1200 1800 2400 3000 1 AA 600 Glu 12 10 8 6 4 Iono 2 1200 1800 2400 3000 -Ca AA 0 Время (с) Время (с) Glu 3.0 m (rh123, F486/Fo) FCCP 2.5 2.0 1.5 1.0 Iono -Ca 0.5 600 1200 1800 2400 Время (с) 3000 3600 Е Glu 3 600 1200 1800 2 -Ca FCCP Iono 1 3 FCCP Iono 2 1 AA AA 0 0 600 1200 1800 Время (с) 3000 Glu -Ca 0 2400 Время (с) Д Г 0 14 0 0 3600 FCCP m (rh123, F486/Fo) 0 -Ca 0 n=16 FCCP 6 2+ 2 0 m (rh123, F486/Fo) В 2+ 4 n=26 Glu [Ca ] i (fura-2FF, F340/F380) n=34 [Ca ]i (fura-2FF, F340/F380) 2+ [Ca ] i (fura-2FF, F340/F380) А Glu + AA 2400 3000 0 600 1200 1800 2400 3000 Время (с) Рис. 13. Действие арахидоновой (АА) кислоты на изменения [Ca2+]i (А, Б, В) и ΔΨm (Г, Д, Е), вызванные глутаматом (100 мкМ; – Mg2+ + 10 мкМ глицина) в гранулярных нейронах мозжечка крысы. Kонцентрация АА 10 мкМ. Экзогенная АА (=< 10мкМ), не влияя на [Ca2+]i , немного снижала ΔΨm. (Рис. 13Б,Д). Добавление АА при воздействии Glu приводило к тому, что индуцированные Glu подъем [Ca2+]i и падение ΔΨm были значительно выше, чем при действии одной АА (Рис. 13В,Е). Независимо от способа добавления АА (до Glu или после начала действия Glu) высокое [Ca2+]i плато и сильная МД сохранялись в пост-глутаматный период, напоминая эффекты блокатора дыхания и протонофора (Рис.3В,Г). Предотвращение метаболизма экзогенной АА с помощью ETYA, ингибитора цикло- и липоксигеназного окисления АА, увеличивало долю нейронов, в которых Glu вызывал двухфазное повышение [Ca2+]i и падение ΔΨm., свидетельствуя, что АА, а не продукты ее метаболизма вызывают обнаруженные эффекты. Полученные результаты показывают, что АА может вызывать изменения функционального состояния митохондрий, способствующие возникновению двухфазных [Ca2+]i и ΔΨm ответов нейронов на Glu и напоминает совместное действие Glu с ингибитором дыхания или протонофором (см. Рис.3). Поэтому 37 мы сопоставили влияние АА на ΔΨm , с эффектами протонофоров DNP и FCCP, и ингибитора дыхания цианида в покоящихся нейронах (Рис. 13). Б n=13 200 DNP 2.8 3 FCCP 2 NaCN Oligo 1 m (rh123, F486/Fo) m (rh123, F486/Fo) 4 В n=12 2.0 Oligo 2.4 2.0 1.6 1.2 AA 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 Время (с) 1.6 1.2 Oligo NaCN 0.8 0.8 600 n=5 DNP 8 DNP m (rh123, F486/Fo) А 0 300 600 Время (c) 900 0 300 600 900 1200 Время (c) Рис. 14. Изменения митохондриального потенциала (ΔΨm ), вызванные арахидоновой кислотой, напоминают действие ингибитора дыхания. Изменения ΔΨm в гранулярных клетках мозжечка, обработанных протонофорами динитроферолом (DNP, 200 и 8мкМ) и FCCP (1мкМ), арахидоновой кислотой (АА, 10мкМ), ингибитором F1Fo-АТAазы олигомицином (Oligo, 2,5мкг/мл) и ингибитором дыхания цианидом (NaCN, 3мМ). Изменения ΔΨm регистрировали с помощью зонда Rh123 . Деполяризация, вызванная АА была сравнительно небольшой, сопоставимой с той, которую можно получить с помощью низкой концентрации DNP (8мкМ) (Рис. 14Б). Высокие дозы протонофоров DNP (200мкМ) или FCCP (1мкМ), вызывающие полную деполяризацию митохондрий, увеличивали флуоресценцию Rh123 в 3–4 раза сильнее, чем АА. Сочетанное действие АА и ингибитора F1Fo-ATФазы олигомицина приводило к резкой деполяризации, почти столь же сильной, как и МД, вызванная FCCP (Рис. 14А), тогда как сам Oligo вызывал гиперполяризацию митохондрий нейронов. В отличие от небольшой деполяризации, вызванной АА, равное по величине снижение ΔΨm, вызванное низкой концентрацией DNP, было нечувствительно к Oligo (Рис. 14Б). Совместное действие АА с Oligo (Рис. 14А), вызывало такую же полную деполяризацию, как цианид с Oligo (Рис. 14В). Из сравнения данных, представленных на рисунке 14, можно заключить, что действие АА на митохондриальный потенциал нейронов вызвано не только, 38 или не столько протонофорными свойствами АА, сколько тем, что она каким-то образом блокирует дыхание. Рис. 15. Ингибитор фосфолипазы А2 задерживал наступление ОКД. Зависимость доли нейронов (%), в которых возникла ОКД, от длительности действия глутамата в контрольной опыте без ингибитора (сплошные квадратики, n=52) и в культуре, в которую за 5 мин до Glu и в течение действия Glu присутствовал ингибитор фосфолипаз А2 арахидоноил трифторметил кетон (AACOCF3, 50мкМ, полые квадратики, n=44). Вертикальные стрелки отмечают момент времени, когда в 50% нейронов наступила ОКД. Характер изменений [Ca2+]i и ΔΨm, индуцированных Glu в присутствии экзогенной АА (Рис. 13), а также сопоставление изменений ΔΨm под влиянием АА и митохондриальных ядов в покоящихся нейронах (Рис. 14) находятся в согласии с предположением о возможном участии АА развитии ОКД. Поэтому мы проверили, будет ли предотвращение образования АА за счет ингибирования гидролиза фосфолипидов клеточных мембран фосфолипазами А2 задерживать наступление ОКД. Для этого сопоставили изменения [Ca2+]i , вызванные одним Glu и в присутствии арахидоноил-трифторметил кетона (AACOCF3, 50мкМ), который ингибирует преимущественно Са2+-зависимую цитозольную PLA2 (cPLA2, MW 61-114kDa) и, в меньшей степени, Са2+независимую PLA2 (iPLA2, MW 84-88kDa) (Ackermann et al, 1995; Street et al,1995), причем AACOCF3 подавляет гидролиз преимущественно тех фосфолипидов, в состав которых входит АА. AACOCF3 удлинял лаг-период ОКД, сдвигая вправо кумулятивную кривую увеличения доли нейронов, имевших ОКД (Рис.15). 39 Измерения [АТР] методом люциферин-люциферазной люминесценции показали, что совместное применение АА и Glu приводит к падению [АТР], в 2– 3 раза большему, чем вызванному АА и Glu по отдельности (не показано). Результаты исследования эффектов экзогенной арахидоновой кислоты и свободные жирные кислоты, блокады высвобождения АА (и, вероятно, других жирных кислот) из фосфолипазой A2 из фосфолипидов, позволяют предположить, что свободные жирные кислоты, обладая свойствами протонофоров (и ингибиторов дыхания в случае АА) могут быть одним из факторов развития сильной МД и ОКД. 4. Различия биоэнергетики культивируемых нейронов при действии глутамата и в нейронах, полученных из животных пре- и постнатального периода развития 4.1. Изменения [ATP]c, при нейротоксическом воздействии глутамата. В предыдущих параграфах изменения [Ca2+]i и ΔΨm при действии Glu, митохондриальных ядов и протонофоров трактовали в тесной связи с изменениями [ATP]с, хотя прямых измерений [ATP]с в тех же самых нейронах, в которых отслеживали [Ca2+]i и ΔΨm , не проводили. Возможность восполнить этот пробел появилась благодаря применению флуоресцентного белкового АТФ-сенсора. Установлено, что в культуре гиппокампальных нейронов Р1-Р2 крыс Glu (20мкМ, 10мкМ глицина, 0 Mg2+) вызывал быстрое снижение [ATP]с . Между скоростью снижения [ATP]с и латентным периодом развития ОКД существует примерно линейная зависимость (r2=0,56), при которой большей скорости падения [ATP]с соответствует более короткий лаг-период ОКД. В среднем (n=15) ОКД начиналась при снижении [ATP]с до 16% и далее опускалась в фазе высокого [Ca2+]i плато до 10% относительно [ATP]с в покоящихся нейронах. Если Glu добавляли в присутствии ингибитора Na +/К+АТФазы плазматической мембраны, оубаина (0,5мМ), то ОКД возникала при [ATP]с ~37% относительно уровня в покоящихся нейронах (n=5). Скорость синтеза АТФ в митохондриях определяется (помимо концентраций АДФ и неорганического фосфата) протонным электрохимическим потенциалом, который включает два слагаемых –ΔΨm и разность рН между матриксом митохондрий и цитозолем (ΔрН = рНм – рНс) (Mitchell, 1968). Конструктивная особенность АТФ-сенсора АТ1.03 позволяет использовать его для измерения рН в том же внутриклеточном компартменте, в котором одновременно производят измерения [ATP] (см. Методы и Материалы). Поэтому мы выполнили двойную трансфекцию нейронов, направив в цитозоль АТ1.03, а в митохондрии рН-чувствительный красный флуоресцентный белок mito-mKate-1 (Chudakov et al, 2010). 40 А ROI 2 -Ca Glu 1.0 [Ca 2+]i 3 0.9 [ATP]c 0.8 2 0.7 1 0.6 0 10 ROI 2 20 30 40 50 60 70 Время (мин) 80 90 ROI 2 9 -Ca Glu 8 pH ROI 2 1.1 4 0 Б Iono [ATP]c (AT1.03, F440/F485) [Ca2+]i (Fura-FF, F340/F380) FCCP FCCP 0.5 100 110 Iono pHm 7 6 pHc 5 0 В 10 20 30 40 50 60 70 Время (мин) 90 ROI 2 -Ca Glu FCCP 100 110 Iono ROI 2 2.0 4 pH 1.5 [Ca2+]i 3 1.0 2 pHm - pHc [Ca2+]i (Fura-FF, F340/F380) 80 0.5 1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Время (мин) 80 90 Рис. 16. Изменения [Ca2+]i , [ATP]с , рН цитозоля и митохондрий (рНс и рНм) и трансмембранной разности рН (рНм-рНс), вызванные глутаматом (Glu) в представительном нейроне из гиппокампа новорожденной крысы, экспрессирующем в цитозоле флуоресцентный АТФ-сенсор. (А) Изменения [Ca2+]i и [ATP]с , (Б) рН цитозоля и рН митохондрий и (В) [ATP]с и разности рН между матриксом митохондрий и цитозолем. Концентрация Glu 29мкМ (10мкМ глицина, 0 Mg2+). 0.0 100 110 13-07-16_1/Hippoc 8DIV На рисунке 16 представлены изменения [Ca2+]i , [ATP]с , рНм и рНс , индуцированные Glu в одном из таких гиппокампальных нейронов. Видно, что [ATP]с может опускаться до минимального уровня прежде, чем начнется ОКД (Рис. 16А) и, соответственно, предшествует падению NAD(P)H до минимального уровня (см. Рис. 7,9,10). Это еще раз свидетельствует, что падение NAD(P)H до минимального уровня не является необходимым условием или причиной падения [ATP]с, поскольку наступает позже. Неожиданным 41 оказалось то, что восстановление низкого [Ca2+]i в постглутаматный период, а значит и рост ΔΨm (см. Рис. 1Г), могут происходить до начала увеличения [ATP]с (Рис. 16А). Вероятно, значительный расход АТФ на выкачивание из цитозоля Na+, при котором снижение [Na+] начинается после снижения [Ca2+]i (Сторожевых и соавт, 2007), задерживает восстановление [ATP]с. Протонофор FCCP (1мкМ) в конце эксперимента индуцировал резкое падение [ATP]с и высвобождение Са2+ в цитозоль (Рис. 16А), очевидно, в результате коллапса ΔΨm и последовавшими за этим реверсией митохондриальной АТФсинтазы в АТФазу, и исчезновением электрофоретической силы, удерживавшей Са2+ в митохондриях. Glu вызывал быстрое снижение рНс, которое сменялось ростом рНс примерно тогда же, когда начиналось развитие ОКД (Рис. 16Б). Изменения рНм имели более сложный вид (Рис. 16Б), причем профили этих изменений были более индивидуальны для каждого отдельного нейрона, чем графики изменений рНс. Этот феномен более четко виден на графике изменений ΔрН (Рис. 16В). FCCP (1мкМ) в конце эксперимента ликвидировал различие между рНм и рНс (Рис. 16Б), делая ΔрН=0 (Рис. 16В). Одновременные измерения рНм и рНс показали, что даже во время [Ca2+]i плато может не происходить коллапса ΔрН. Аналогичный результат был получен при одновременной экспрессии двух белковых флуоресцентных рНсенсоров – красного mKate в цитозоле и желто-зеленого YFP в матриксе митохондрий (не показано). Это наблюдение является еще одним аргументом против «классической» поры высокой проводимости, по крайней мере, в начальный период высокого [Ca2+]i плато. Необходимо подчеркнуть, что изменения [Ca2+]i на (Рис. 16А,В) синхронны с изменения ΔΨm (см. Рис.1В,Г и Рис.2) и поэтому в совокупности с графиками ΔрН указывают на сложнй характер изменений протонного электрохимического потенциала митохондрий нейронов при действии на них Glu. 4.1. Изменения концентрации АТФ в цитозоле индивидуальных нейронов ([ATP]c), вызванные химической гипоксией и глюкозной депривацией в пре- и постнатальных нейронах. Считается, что в нейрональной культуре, так же как и в мозге, более 90% АТФ производится митохондриями. Тот факт, что Oligo вызывает лишь небольшое снижение [ATP], измеренное биохимическими методами в среднем по клеточной популяции в культуре (см., например, обзор Б.И. Ходорова, 2003), объясняют компенсаторным эффектом усиления гликолитического синтеза АТФ в цитозоле. Мы впервые исследовали изменения концентрации АТФ в цитозоле индивидуальных нейронов ([ATP]c), вызванные химической гипоксией 42 (блокадой дыхательной цепи митохондрий цианидом) или/и удалением глюкозы (чаще с эквимолярной заменой ее на 2-дезоксиглюкозу). Для этого в цитозоле клеток нейрональных культур экспрессировали флуоресцентный белковый АТФ-сенсор, АТ1.03 (Imamura et al, 2009). Культуры, часть нейронов в которых экспрессировала АТ1.03, нагружали TMRM, что позволяло проводить одновременные измерения [ATP]с и ΔΨm . Нейроны из гиппокампа эмбрионов [ATP] 0.50 1.5 0.45 m 1.0 0.40 0.5 0.35 0.0 CN 10 20 30 40 50 0.80 [ATP]c 0.75 1.5 0.70 0.65 m 1.0 0.60 0.55 0.5 0.50 0.30 0 - Gluc+2DG Oligo 2.0 [ATP]c (AT1.03 Fluorescence ratio) Pyr - Gluc+2DG Oligo [ATP]c (AT1.03 Fluorescence ratio) m (TMRM) Fluorescence, F/Fo) Б CN 2.0 m (TMRM) Fluorescence, F/Fo) A 0 60 10 20 30 40 50 60 Time (min) Время (мин) Time(мин) (min) Время Нейроны из гиппокампа новорожденных 0.9 - Gluc+2DG 1.4 0.8 [ATP]c 1.2 0.7 1.0 m 0.8 0.6 0.6 30 40 50 60 70 80 1.1 Oligo 2.5 [ATP]c 1.0 2.0 0.9 1.5 0.8 m 1.0 0.7 0.6 0.5 0.5 0.4 - Gluc+2DG 50 90 [ATP]c (AT1.03 Fluorescence ratio) m (TMRM) Fluorescence, F/Fo) Oligo [ATP]c (AT1.03 Fluorescence ratio) Pyr 1.6 CN Г CN m (TMRM) Fluorescence, F/Fo) B 60 70 80 90 Time (min) Time (min) Время (мин) Время (мин) Рис.17. В культивируемых нейронах из гиппокампа эмбрионов крысы (А,Б) АТФ производится в результате гликолиза, а в нейронах из гиппокампа новорожденных крыс (В,Г) преимущественно благодаря окислительному фосфорилированию. Изменения [ATP]с (зеленые графики – o-o-, правые оси ординат) и ΔΨm (красные графики ----, левые оси ординат), индуцированные в нейронах последовательной заменой (А,В) буфера с глюкозой на безглюкозный с 5мМ 2-дезоксиглюкозы (-Gluc+2DG), добавлением митохондриального субстрата пирувата (Pyr, 10мМ), ингибитора F1Fo-АТФазы олигомицина (Oligo, 5мкг/мл) и цианида (CN, 3мМ), либо последовательным (Б,Г) добавлением Oligo, заменой глюкозы на 2DG и добавлением CN. Было обнаружено, что в культурах, приготовленных из гиппокампов эмбрионов крысы (17-18 день беременности, Е17-Е18), удаление глюкозы 43 (Gluc) вызывало падение [ATP]с до почти минимального уровня (Рис.17А). Последующая замена Gluc на 2-дезоксиглюкозу (2-DG) при одновременной блокаде дыхательной цепи цианидом вызвала дальнейшее понижение [ATP]с лишь на 2,5±1,0% (принимая исходный [ATP]с в покоящихся нейронах за 100%). Блокада гликолиза вызывала небольшую деполяризацию (Рис.17А). Pyr не увеличивал [ATP]с в безглюкозном буфере в 84% нейронов (96/114; 43 эксперимента), хотя при этом Pyr увеличивал ΔΨm (Рис.17А) и закислял цитозоль (не показано), что свидетельствует о проникновении этого субстрата митохондрий в клетку и поступлении в митохондрии. Oligo не уменьшал [ATP]с в этих нейронах, но при этом вызывал снижение ΔΨm (Рис.17Б), свидетельствуя, что F1Fo-АТФаза работала в реверсивном режиме, не синтезируя, а потребляя АТФ. Эта особенность Е17-Е18 нейронов оставалась неизменной на протяжении всего срока исследования культуры (от 5 до 15 дней). Нейрональные культуры из гиппокампов постнатальных крысят (1-2 день после рождения, Р1-Р2) кардинально отличались от Е17-Е18 по реакции на митохондриальные яды и глюкозную депривацию. Удаление Gluc вызывало гораздо меньшее снижение [ATP]с (на 30,1±6,5%) по сравнению с нейронами из Е17-18 (на 97,5±1,0%), но при этом заметно деполяризовала митохондрии (Рис.17В). Pyr, добавленный во время глюкозного голодания, значительно увеличивал как [ATP]с (на 54±8%), так и ΔΨm (Рис.17В). Oligo резко уменьшал [ATP]с (на 66±11%, n=8) и гиперполяризовал митохондрии (Рис.17В,Г). Исходя из перечисленных характеристик, мы заключили, что Р1-Р2 нейроны синтезировали АТФ преимущественно благодаря ОксФос. В перинатальный период в нейронах мозга (по крайней мере, гиппокампа крыс), по-видимому, происходит переключение синтеза АТФ с преимущественно гликолитического. в цитозоле на ОксФос в митохондриях. Заключение Проведенные нами исследования на нейрональных культурах мозжечка и гиппокампа крысы показали, что индуцированное Glu поступление в нейроны Са2+ и Na+ запускает каскад событий, в которых митохондрии демонстрирую самые разные аспекты своих функциональных возможностей. Вход Са2+ в цитозоль по НМДА-каналам в первую же минуту увеличивает [Ca2+]i до уровня, необходимого для активации кальциевого унипортера и захвата Са2+ митохондриями. Быстрая деполяризация плазматической мембраны (Czyz et al, 2002) и падение градиента концентрации Na+ между буфером и цитозолем (Czyz et al, 2002; Сторожевых и соавт, 2007) существенно снижают способность Na+/Са2+-обменников, наиболее производительных механизмов плазмалеммы, 44 удалять избыток Са2+ из нейронов, вынуждая митохондрии поглощать значительную, если не основную, долю поступающего в цитозоль Са 2+. Сильный ацидоз цитоплазмы, возникающий в результате активации Са 2+АТФаз плазматической мембраны сразу после добавления Glu, приводит к снижению рН митохондрий (Рис. 23Б), подавляя их способность удерживать Са2+ в форме комплексов с фосфатами (Chalmers & Nicholls, 2003). Быстрое падение [ATP]с во время первой фазы [Ca2+]i ответа на Glu до уровня, лишь на ~16% превышающего минимальный [ATP]с, вызвано, судя по влиянию оубаина, интенсивной работой Na+/К+-АТФазы плазмалеммы. Одновременный мониторинг рН цитозоля и митохондрий позволил обнаружить, что во время низкого [Ca2+]i плато, относительно небольшая митохондриальная деполяризация (снижение ΔΨm на 40-60мВ, см. Рис. 2В) компенсируется ростом ΔрН на 0,8-1,2 (Рис. 23В). Таким образом, сильное падение [ATP]с во время первой фазы [Ca2+]i ответа на Glu вызвано не столько значительным ослаблением электрохимического потенциала митохондрий, сколько многократным усилением его потребления в цитозоле. Нельзя, однако, исключить и такого фактора падения [ATP]с, как способность высоких концентраций Са2+ снижать эффективность работы АТФ/АДФ-транслокатора и F1Fo-АТФсинтазы (Moreno-Sanchez, 1985), хотя влияние Са2+ на функциональные и структурные элементы митохондрий зачастую неоднозначно (Hansford & Zorov, 1998; Brookes et al, 2004). Полученные результаты показывают, что любой способ снижения ΔΨm и [ATP]с будет способствовать развитию ОКД. Поэтому ингибирование гликолиза или химическая гипоксия, моделируемая применением ингибиторов дыхательной цепи, сокращали лаг-период ОКД. Поскольку доставка глюкозы сквозь плазматическую мембрану нейронов осуществляется в форме котранспорта с Na+ (Espinoza-Rojo et al, 2010), то снижение потенциала плазматической мембраны и трансмембранного градиента концентрации Na+, происходящее при действии Glu, также можно рассматривать как факторы, ухудшающие синтез АТФ и приближающие ОКД. Аноксия, имитируемая высокими концентрациями CN, оказалась опаснее блокады гликолиза, так как вызывала немедленную дисрегуляцию Са2+ гомеостаза, тогда как глюкозная депривация приближала наступление ОКД, но не превращала ее в НКД. В отсутствие гликолиза нейроны в состоянии на некоторое время (от единиц до ~30мин, в зависимости от типа нейронов и возраста культуры) (Рис. 9,12) компенсировать дефицит пирувата мобилизацией эндогенного субстрата для цикла трикарбоновых кислот. Таким субстратом, по нашим представлениям, может быть цитозольный глутамат, концентрация которого в соме культивируемых нейронов составляет около 10мМ (Nicholls, 2009). 45 Повышенный уровень [Ca2+]i в совокупности с другими внутриклеточными сигнальными системами, запускаемыми Glu (Farooqui & Horrocks, 2004, 2006; Ferraguti et al, 2008), приводит к активации фосфолипаз А2 и высвобождению свободных жирных кислот (СЖК), которые (по крайней мере, арахидоновая кислота) способны усиливать митохондриальную деполяризацию, вызванную Glu или ингибированием дыхания (Рис. 13,14). Необходимо отметить, что СЖК не имеют быстрой системы удаления и накапливаются в клеточных мембранах, ухудшая их барьерные свойства тем сильнее, чем дольше действует Glu. Совокупность перечисленных выше процессов, происходящих во время первой фазы [Ca2+]i ответа на Glu, приводит к тому, что наступает момент, индивидуальный для каждого нейрона, когда удаление Са2+ из цитозоля во внеклеточное пространство и захват его митохондриями перестают уравновешивать поток Са2+ из внеклеточного пространства. Это событие быстро приобретает характер кооперативного процесса. На ключевую роль дисфункции митохондрий в возникновении ОКД указывает синхронность этого процесса с : 1) началом сильной деполяризации митохондрий, 2) появлением второй ступени снижения NAD(P)H и усилением окисления флавиновых нуклеотидов, 3) сильным снижением рНм и ΔрН на восходящей фазе ОКД, 4) образованием АФК. Начало ОКД не обусловлено исчерпанием NAD+ в результате гиперактивации ПАРП-1 и, соответственно, истощением митохондриального NADH, необходимого для питания комплекса I дыхательной цепи. Наши данные свидетельствуют в пользу развития неселективной поры, способной пропускать неорганические ионы, но слишком узкой для NAD+ и даже для молекул, меньшего, чем NAD+ размера, таких, как субстраты цикла трикарбоновых кислот. Сопоставление Glu-индуцированных изменений [Ca2+]i и распределения поли(АДФ-рибозы) (ПАР) в одних и тех же нейронах показало, что за время действия Glu ПАР успевает диффундировать в цитозоль. Взаимодействие ПАР с внешней митохондриальной мембраной способствует высвобождению фактора апоптоза AIF (Wang Y. et al, 2009). Вероятно, это является одной причин того, что в течение первых суток после действия Glu около половины нейронов, имевших ОКД, погибает от апотоза (Рис. 4 и 15). Сопоставление изменений [Ca2+]i при действии Glu и путей последующей гибели тех же самых нейронов показало, что развитие ОКД ведет к смерти ~97% клеток в течение первых суток после глутаматного стресса. Нейроны, имевшие более длительный лаг-период ОКД, имели более высокую вероятность гибели от апоптоза, чем от некроза. Необходимо отметить, что все нейроны, в которых за время действия Glu не возникла ОКД, выжили. Поэтому 46 удлинение лаг-периода ОКД может служить полезным для практики критерием отбора химических агентов на пригодность в качестве нейропротекторных препаратов. Выводы 1. Индуцированная глутаматом отсроченная кальциевая дизрегуляция (ОКД) и синхронная с ней сильная митохондриальная деполяризация (МД) являются результатом, изменений концентраций Са2+, Na+, Н+, АТФ, NAD(P)H, потенциалов митохондриальной и плазматической мембраны. 2. Нейроны, в которых возникла ОКД, гибнут в результате апоптоза и некроза. Увеличение или сокращение лаг-периода ОКД и МД может служить количественным критерием соответственно нейропротекторных или нейротоксических свойств биологически активных веществ. 3. ОКД возникает тогда, когда скорость поступления Са2+ в цитоплазму начинает превышать скорость удаления Са2+ из клетки. Важным фактором дисбаланса скоростей является реверсия Na+/Са2+ обмена через плазмалемму. 4. Анализ эффектов глюкозной депривации, экзогенных ингибиторов протонных насосов дыхательной цепи, протонофоров и усиление показывает, что причиной развития ОКД являются процессы, снижающие митохондриальный синтез АТФ и способность митохондрий захватывать и удерживать Са2+. 5. Эндогенными факторами ускорения ОКД являются: усиление потребления NADH и разобщение окислительного фосфорилирования; активация фосфолипаз А2 (PLA2), приводящая к высвобождению арахидоновой кислоты, способной снижать эффективность работы протонных насосов; активация фермента поли(АДФ-рибоза)полимеразы1 (ПАРП-1), расходующего NAD+ на репарацию ДНК и вызывающего дефицит NADH. Ингибиторы PLA2 и ПАРП-1 задерживают наступление ОКД. 6. Во время первой фазы Ca2+ ответа на Glu в нейронах усиливаются процессы, препятствующие развитию ОКД: увеличивается градиент рН между митохондриями и цитозолем (ΔрН), который компенсирует снижение митохондриального потенциала; активируются альтернативные пути окисления субстратов; повышается активность сукцинатдегирогеназы. 7. При развитии ОКД происходит падение ΔΨm и ΔрН, что приводит к ослаблению захвата митохондриями избытка Са2+ из цитозоля и дополнительному снижению концентрации цитозольного АТФ, необходимого Са2+- и Nа+/К+-АТФазам для поддержания потенциала плазмалеммы и концентрации этих ионов в цитозоле. 47 8. В перинатальный период происходят кардинальные перестройки биоэнергетики нейронов – в культивируемых нейронах из гиппокампа эмбрионов крысы (Е17-Е18), доминирующим способом производства АТФ является гликолиз, тогда как, в нейронах, полученных из гиппокампа постнатальных крыс (Р1-Р2), АТФ синтезируется преимущественно за счет окислительного фосфорилирования. Список основных публикаций по теме диссертации 1. B. Khodorov, T. Storozhevykh, A. Surin, E. Sorokina, A. Yuravichus, A. Borodin, N. Vinskaya, L. Khaspekhov, and V. Pinelis. (2001). Mitochondrial depolarization play a dominant role in the mechanism of perturbation of calcium homeostasis caused by glutamate in cultured cerebellar granule cells. Biological Membranes (Rus), 18 : 421-432. 2. Сторожевых Т.П., Пинелис В.Г., Винская Н.П., Сурин А.М., Ходоров Б.И. (2001) Ведущая роль митохондриальной деполляризации в механизме глутамат-вызванного нарушения Са2+ гомеостаза. Фиизол. Журнал им.И.М.Сеченова 87(4): 459-467. 3. Duchen M.R., Surin A.M. (2002). On the role of mitochondria and calcium in glutamate-induced neurotoxicity in hippocampal neurons in culture. Biological Membranes (Rus), 19 : 97-109. 4. Duchen M.R., Surin A.M., Jacobson J. (2003). Imaging mitochondrial function in intact cells. Methods in Enzymology 361: 353-389. 5. Сторожевых Т.П., Пинелис В.Г., Винская Н.П., Сурин А.М., Ходоров Б.И. Ведущая роль Са2+-АТФазы плазматической мембраны в восстановлении Са2+ гомеостаза нейронов после глутаматного удара. (2003). Бюллетень Эксперим. Биол. и Медицины. 135(2): 162-165 6. Bolshakov A.P., Mikhailova M.M., Jurevicius A., Surin A.M., Pinelis V.G., Khodorov B.I. (2003). Contribution of Ca2+ and Na+ to glutamate-induced mitochondrial depolarization in cerebellar granule cells. Biological Membranes (Rus). 20: 443-445. 7. Михайлова М.М., Большаков А.П., Сурин А.М., Пинелис В.Г. Ходоров Б.И. (2003). Снижение устойчивости нейронов к токсическому воздействию глутамата в отсутствие глюкозы. Биологические Мембраны, 20: 446-448. 8. Surin A.M., Storozhevykh T.P., Vinskaya N.P., Pinelis V.G., Duchen M.R., Khodorov B.I. (2004) Does mitochondrial ATP synthаse reversal play a crucial role in glutamate-induced deterioration of Ca2+ homeostasis in cultured mature neurons? Biological Membranes (Rus). 21: 157-160 9. А.В.Вабниц, Я.Е.Сенилова, Е.В.Колесникова, А.М.Сурин, В.Г.Пинелис, Б.И.Ходоров. (2006) Отсроченная Са2+ дерегуляция в молодых нейронах мозжечка при гиперстимуляции глутаматных рецепторов. Роль NMDAканалов. Биологические Мембраны, 23: 311-319 10.Surin AM, Bolshakov AP, Mikhailova MM, Sorokina EG, Senilova YE, Pinelis VG, Khodorov BI. (2006). Arachidonic acid enhances intracellular 48 [Ca2+]i increase and mitochondrial depolarization induced by glutamate in cerebellar granule cells. Biochemistry (Rus). 71(8): 864-870. 11.Kolikova J, Afzalov R, Giniatullina A, Surin A, Giniatullin R, Khiroug L. (2006) Calcium-dependent trapping of mitochondria near plasma membrane in stimulated astrocytes. Brain Cell Biol. 35(1): 75-86. 12.A.M. Surin , S.N.Zobova, G.R.Tukhbatova, Y.E.Senilova, V.G.Pinelis, B.I.Khodorov (2010). Changes in mitochondrial NAD(P)H and calcium homeostasis deregulation in cultured rat cerebellar granule neurons. Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology, 4 : 32–37. 13.Kolikova J, Afzalov R, Surin A, Lehesjoki AE, Khiroug L. (2011) Deficient mitochondrial Ca(2+) buffering in the Cln8(mnd) mouse model of neuronal ceroid lipofuscinosis. Cell Calcium. 50(6): 491-501. 14.Г. Д. Миронова, К. Н. Белослудцев, А. М. Сурин, А. С. Трудовишников, Н. В. Белослудцева, В. Г. Пинелис, И. А. Красильникова, Б. И. Ходоров (2011) Митохондриальная липидная пора в механизме глутаматиндуцируемой кальциевой дисрегуляции нейронов мозга. Биологические Мембраны, 28(6): 483-494. 15.Khodorov, B.I., Mikhailova, M M., Bolshakov, A P., Surin, A.M., Sorokina, E.G., Rozhnev, S.A., and Pinelis, V.G. (2012). Dramatic effect of glycolysis inhibition on the cerebellar granule cells bioenergetics. Biochemistry (Mosc.) Suppl. Series A: Membrane Cell. Biol. 6: 186-197. 16.Surin А.М., S. Khiroug, L.R. Gorbacheva, B.I. Khodorov, V.G. Pinelis and L. Khiroug . Comparative analysis of cytosolic and mitochondrial ATP synthesis in embryonic and postnatal hippocampal neuronal cultures. Front. Mol. Neurosci. 5:102. doi: 10.3389/fnmol.2012.00102. Epub 2013 Jan 10. 17.Сурин А.М., Зобова С.Н., Тухбатова Г.Р., Сенилова Я.Е , Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. Исследование роли изменений NAD(P)H в возникновении отсроченной кальциевой дисрегуляции в гранулярных нейронах мозжечка. Материалы конференции «Гипоксия – механизмы, адаптация, коррекция». Москва, 9-11 октября 2008 г 18.АA.M. Surin, Zobova S.N., V.G. Pinelis, B.I. Khodorov. Role of mitochondrial NADH in the glutamate-induced delayed Ca2+ deregulation in cerebellar granule neurons. Society for Neuroscience 38th Annual Meeting, Washington DC, November 15-18, 2008, Abstract 51.19 19.А.M. Surin, V. G. Pinelis*, Д. D. Vinogradov, B. I. Khodorov. Evidence for pore opening in mitochondrial membrane during glutamate-induced delayed calcium deregulation in brain neurons. Материалы научной конференции «Ионные каналы: Структура и функции», 17-18 марта 2009, С.-Петербург. Биол. Мембраны Т.26, № 4, С.330 20.Сурин А.М., Зобова С.Н., Тухбатова Г.Р., Сенилова Я.Е., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. Изменения митохондриального NAD(P)H и нарушения кальциевого гомеостаза в культивируемых нейронах мозжечка крысы при гиперстимуляции глутаматных рецепторов. Материалы Международной 49 конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 4-6 июня 2009, стр.157-162 21.А.M. Surin, V. G. Pinelis*, Д. D. Vinogradov, B. I. Khodorov. Evidence for pore opening in mitochondrial membrane during glutamate-induced delayed calcium deregulation in brain neurons. Материалы научной конференции «Ионные каналы: Структура и функции», 17-18 марта 2009, С.-Петербург. Биол. Мембраны Т.26, № 4, С.330 22.Сурин А.М., Зобова С.Н., Тухбатова Г.Р., Сенилова Я.Е., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. Изменения митохондриального NAD(P)H и нарушения кальциевого гомеостаза в культивируемых нейронах мозжечка крысы при гиперстимуляции глутаматных рецепторов. Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 4-6 июня 2009, стр.157-162 23.V. G. Pinelis, G. Tuhbatova, A. Surin, B. Khodorov, L. Khiroug; Disturbance of oxidative phosphorilation coupling during glutamate-induced delayed calcium deregulation in cultured brain neurons. Society for Neuroscience 38th Annual Meeting, Chicago, IL, October 17-21, 2009, Program 634.21, N13 24.Сурин А.М., Красильникова И.А., Персиянцева Н.А. , Ефремова А.С., Шрам С.И., Горбачева Л.Р., Савинкова И.Г., Зобова С.Н., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. Роль поли(АДФ-рибоза)-полимеразы-1 (PARP-1) в нарушении кальциевого гомеостаза нейронов мозжечка крысы. Международная конференция “Рецепторы и внутриклеточная сигнализация” Пущино, 24-26 мая 2011г. Сборник статей, Т.1 стр. 150156 25.Миронова Г.Д., Белослудцев К.Н., Сурин А.М., Трудовишников А.С., Белослудцева Н.В., Пинелис В.Г., Красильникова И.А., Ходоров Б.И. Возможная роль митохондриальной Са2+-зависимой липидной поры в глутамат-индуцируемой кальциевой дерегуляции нейронов. международная конференция “рецепторы и внутриклеточная сигнализация” Пущино, 24-26 мая 2011г. Сборник статей, Т.2 стр. 680687 26.Pinelis V, Surin A, Imamura H, Khiroug S, Zobova S, Molotkov D, Gorbacheva L, Noji H, Khodorov B and Khiroug L. Dynamic imaging of intracellular ATP concentration in single cultured neurons. Society for Neuroscience 40th Annual Meeting, Washington, DC, November 12-16, 2011, Program#/Poster#: 106.18/YY27 27.Surin A.M., Pinelis V.G., Krasilnikova I.A., Khiroug L.S., Chudakov D., Khodorov B.I. On the mechanism of glutamate-induced delayed mitochondrial depolarization in brain neurons. 8th IBRO World Congress of Neuroscience. Florence, Italy, July 14-18, 2011. Abstract C074. 28. Сурин А.М., Горбачева Л.Р., Савинкова И.Г., Шарипов Р.Р., Ходоров Б.И., Пинелис В.Г. Флуоресцентно-микроскопические измерения [АТФ] в цитозоле культивируемых нейронов при токсическом действии глутамата. МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ “РЕЦЕПТОРЫ И 50 ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ СИГНАЛИЗАЦИЯ” Пущино, 24-26 мая 2013г. Сборник статей , Т.2 стр. 718-723. 51
