презентацию (pdf 0,6 Mb)

1
Оптогенетический подход в изучении механизма глутаматной
нейротоксичности.
Сурин А.М., (Москва, ФГБНУ «НИИОПП»)
При патологиях мозга (инсульте, черепно-мозговой травме, и некоторых
нейродегенеративных заболеваниях) вокруг очага поражения возникает зона
полутени (пенумбра), в которой изменения еще не приобрели необратимый
характер. Зона очага со временем расширяется, и задача состоит в помощи
организму терапевтическими средствами как можно сильнее затормозить
расширения очага, предотвратив гибель нейронов в пенумбре. Каждая из
этих зон имеет морфологические и биохимические характеристики.
Методами микродиализа установили, что гибель клеток в пенумбре вызвана
гиперактивацией ионотропных глутаматных рецепторов NMDA-типа,
поэтому усилия направили, прежде всего, на поиск специфичных
ингибиторов этих рецепторов. Однако выяснилось, что терапевтический
эффект ингибиторов невелик, но при этом значительно ухудшаются
когнитивные способности пациентов, а в ряде случаев, происходит
увеличение зоны поражения. Поэтому были предприняты всесторонние
систематические исследования процессов в пенумбре с привлечением
широкого спектра биохимических и биофизических методов. Незаменимой
моделью в этих исследованиях служат первичные нейрональные культуры из
различных разделов мозга. Было показано, в том числе с участием нашего
коллектива, что длительное действие высоких доз глутамата (Glu),
имитирующих межклеточную концентрацию Glu в пенумбре, вызывает
дисрегуляцию Са2+ гомеостаза, представляющего собой двух-фазное
увеличение концентрации Са2+ ([Са2+]). Наличие второй фазы, т.н.
отсроченной Са2+ дисрегуляции, коррелировало с последующей гибелью
нейронов. Предотвращение избыточного входа Са2+ и развития Са2+
дисрегуляции спасало нейроны от гибели. Однако оставалось много
нерешенных проблем, прежде всего связанных с ролью митохондрий в Са 2+
дисрегуляции поскольку эти органеллы являются главным источником АТФ
для поддержания ионного гомеостаза Са2+ и Na+ насосами. Кроме того, в
нейронах митохондрии служат основным Са2+ депо, оберегающим цитозоль
от Са2+ перегрузки.
Ранее были представлены результаты применения методов оптогенетики в
сочетании с традиционными флуоресцентными красителями для выяснения
механизмов регуляции ионного гомеостаза в нейронах, подвергнутых
2
действию нейротоксических доз глутамата (Khodorov et al, 2012; Сурин и
соавт, 2014). Кроме того, совместное применение синтетических
флуоресцентных зондов и флуоресцентных белковых сенсоров позволило
обнаружить принципиальные различия в биоэнергетике культивируемых
нейронов, полученных из эмбрионов по сравнению с культурами из
новорожденных крыс (Surin et al, 2013). В докладе, посвященном 70-летию
РАМН, эти представлены результаты исследований, выполненных в развитие
описанного направления. Нам (совместно с Научным центром здоровья
детей)
впервые
удалось
получить
нейрональные
культуры,
экспрессирующие АТФ-сенсор в матриксе митохондрий. Это позволило
исследовать изменения концентрации АТФ ([ATP]) именно там, где
происходит его синтез его основной доли – в матриксе митохондрий.
Измерения были выполнены в покоящихся нейронах, а также в условиях,
имитирующих инсульт (глюкозная депривация, ингибирование дыхания,
гиперактивация глутаматных рецепторов).
На Рис. 1 представлены изображения участка клеточной культуры,
нагруженной индикатором на ионы Са2+ (верхнее красное изображение) и
содержащей нейроны, экспрессирующие флуоресцентный АТФ-сенсорный
белок в митохондриях (среднее зеленое изображение). Нам удалось
подобрать условия, позволившие использовать АТФ-сенсор не только для
измерения концентрации АТФ в митохондриях, но и для мониторинга рН
внутри митохондрий (Рис. 1, правая нижняя панель). Последнее важно
потому, что разность рН между митохондриями и цитозолем в совокупности
с электрическим потенциалом характеризующего энергетическое состояние
митохондрий. На Рис.1 графики изменений [Ca2+]i , [ATP] и рН представлены
справа от соответствующих изображений. Полученные результаты
показывают, что блокада гликолиза не устраняет синтез АТФ в течение 1020минут и только остановка дыхания в отсутствии глюкозы прекращает
синтез АТФ в митохондриях. Это свидетельствует о том, что при отсутствии
гликолиза и, соответственно, основного субстрата митохондрий пирувата,
нейроны способны несколько минут обеспечивать цикл Кребса другим
субстратом, вероятно, цитозольным глутаматом в результате активации GluGABA-цикла (цикла Робертса).
3
[Ca2+]
[ATP]
pH
Рис. 1. Изображения поля культивируемых гиппокампальных нейронов,
которые экспрессируют, АТФ/рН-чувствительный зеленый флуоресцентный
белок в митохондриях и окрашены Са2+ индикатором (X-rhod-FF). Справа
показаны соответствующие сигналы, вызванные удалением глюкозы,
блокадой дыхательной цепи митохондрий цианидом и высокой
концентрацией Glu : красным цветом изменения рН в матриксе митохондрий,
целенным – изменения рН в цитозоле, сиреневым – изменения [ATP] в
цитозоле и синим – средние по клетке изменения [Ca2+]i. Флуоресценцию Xrhod-FF возбуждали при 565нм и регистрировали при 635нм. Изменения
[Ca2+]i определяли как относительные изменения интенсивности
флуоресценции (F/Fo), где F – текущее значение интенсивности, а Fo –
исходное в начале эксперимента. Изменения рН цитозоля (рНс) определяли
как относительные изменения интенсивности флуоресценции АТФ-сенсора
(F/Fo), где F – текущее значение интенсивности, а Fo – исходное в начале
эксперимента; возбуждение и испускание, соответственно 485 и 525нм. При
регистрации изменений [ATP] не вводили поправку на зависимость
рэйшиометрического сигнала АТФ-сенсора от рН.
4
Изменения [АТФ] обратимы (Рис. 1, правая средняя панель), если не
сопровождаются ростом [Ca2+]i (Рис. 1, правая верхняя панель).
Стимуляция глутаматных рецепторов, приводит как к падению [ATФ] , так и
росту [Ca2+]i и поэтому снижение [ATФ] более продолжительное и не
устраняемое даже экзогенным пируватом. Из данных, представленных на
Рис. 1, можно заключить, что в условиях ограниченного доступа глюкозы и
кислорода снижение поступающего в нейроны Са2+ будет помогать нейронам
выжить после глутаматного воздействия. Изменения [Ca2+]i, [ATP] и рН (Рис.
1) в митохондриях, в совокупности с данными по изменению рН в цитозоле и
митохондриального потенциала (Khodorov et al, 2012; Сурин и соавт, 2014)
указывают на то, что одним из пусковых факторов отсроченной кальциевой
дисрегуляции является увеличения протонной проводимости внутренней
мембраны митохондрий.
Традиционно исследования лаборатории патологии ионного транспорта и
внутриклеточной сигнализации НИИОПП были сосредоточены на
регулировании ионного гомеостаза основных неорганических катионов –
Са2+, Na+ и Н+. Создание чувствительных и специфичных белковых
флуоресцентных сенсоров на ионы хлора, основного неорганического аниона
всех эукариотических клеток, позволило исследовать
одновременно с гомеостазом указанных катионов.
гомеостаз
-
Cl
На Рис. 2 представлены результаты одновременных измерений [Ca2+], [Cl-] и
pH в цитозоле гиппокампальных нейронов при воздействии тормозящего
нейротрансмиттера гамма-аминомасляной кислоты (GABA, 100 мкМ), при
деполяризации плазматической мембраны с помощью KCl (50мМ) и в
условиях глутаматной нейротоксичности (Glu, 30мкМ). Видно, что активация
проницаемых для ионов хлора GABA-управляемых каналов (GABAAрецепторов) не повлияла ни на один из измеряемых параметров [Ca2+] (левая
верхняя панель), [Cl-] (правая верхняя панель), рН (левая нижняя панель).
Измерения [АТФ], выполненные по аналогичному протоколу на сестринской
культуре (правая нижняя панель), также показали отсутствие изменений
[АТФ] в цитозоле .
5
[Ca2+]
[Cl-]c
pH c
[ATP]
Рис.2. Влияние возбуждающего (Glu, 30мкМ) и тормозящего (GABA,
100мкМ) нейромедиаторов, и деполяризации мембран на концентрации
ионов Сa2+, Cl-, Н+ и АТФ в цитозоле культивируемых нейронов гиппокампа.
Деполяризацию плазматической мембраны достигали эквимолярной заменой
NaCl в буфере на 50мМ KCl. Флуоресценцию X-rhod-FF возбуждали как
описано на Рис. 1. Изменения рН цитозоля (рНс) определяли как
относительные изменения интенсивности флуоресценции хлорного сенсора
(F/Fo), где F – текущее значение интенсивности, а Fo –исходное в начале
эксперимента; возбуждение и испускание, соответственно 485 и 525нм. При
регистрации изменений [ATP] не вводили поправку на зависимость
рэйшиометрического сигнала АТФ-сенсора от рН.
Деполяризация плазматической мембраны вызывает быстрые, легко
обратимые подъемы [Ca2+], [Cl-] и [H+], не приводящие к падению [АТФ]
(Рис.2). Из этого следует, что поддержание гомеостаза ионов хлора в
отсутствие глутамата не требует больших затрат АТФ. Напротив, даже
кратковременная аппликация нейротоксической дозы Glu, индуцировала
сразу рост [Ca2+], [Cl-] и [H+] и стремительное снижение [АТФ] (Рис.2). Эти
6
данные указывают на критическую роль потенциала плазматической
мембраны и поступления в нейроны Са2+ для поддержания баланса ионов
хлора. Представленные результаты по хлорному гомеостазу демонстрируют
необходимость мультипараметрических измерений и учета действия
возбуждающих и тормозящих нейромедиаторов для исследования клеточных
механизмов нейротоксичности и эпилептогенеза.
Цитированная литература

Khodorov, B.I., Mikhailova, M M., Bolshakov, A P., Surin, A.M., Sorokina, E.G., Rozhnev,
S.A., and Pinelis, V.G. (2012). Dramatic effect of glycolysis inhibition on the cerebellar
granule cells bioenergetics. Biochemistry (Mosc.) Suppl. Series A: Membrane Cell. Biol. 6,
186-197.
 A.M. Surin, S. Khiroug, L.R. Gorbacheva, B.I. Khodorov, V.G. Pinelis and L. Khiroug (2013).
Comparative analysis of cytosolic and mitochondrial ATP synthesis in embryonic and postnatal
hippocampal neuronal cultures. Front. Mol. Neurosci. 5:102. doi: 10.3389/fnmol.2012.00102.
Epub 2013 Jan 10.
 Сурин А.М., Горбачева Л.Р. , Савинкова И.Г., Шарипов Р.Р., Ходоров Б.И., Пинелис В.Г.
(2014) Исследование изменений [АТФ] в цитозоле индивидуальных нейронов при
развитии глутамат-индуцированной дизрегуляции кальциевого гомеостаза. Биохимия.2014.- Т 79, №2. - С. 196-208.