Влияние факторов, секретируемых плацентой, на адгезию и
advertisement
на правах рукописи СТЕПАНОВА Ольга Игоревна Функциональные характеристики эндотелиальных клеток в условиях in vitro в присутствии факторов, секретируемых плацентой при физиологической беременности и беременности, осложненной гестозом 14.03.03-патологическая физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2013 2 Работа выполнена в лаборатории иммунологии с группой по диагностике СПИД Федерального государственного бюджетного учреждения «Научноисследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта» СевероЗападного отделения Российской академии медицинских наук Научный руководитель: доктор биологических наук Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор, Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, заведующая лабораторией биогеронтологии Соколов Дмитрий Игоревич Кветная Татьяна Викторовна Доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры патофизиологии Шестакова Светлана Алексеевна Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Защита диссертации состоится «___» ___________ 2013 года в _______ часов на заседании Диссертационного совета Д 001.022.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12. Автореферат разослан «____» _____________ 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета, Доктор медицинских наук Дыбан П.А. 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования и степень ее разработанности. Одной из важных проблем физиологии и патофизиологии беременности является выяснение механизмов обеспечения своевременного и адекватного развития плаценты и децидуальной оболочки матки. В процессе подготовки эндометрия к имплантации бластоцисты происходит усиленная миграция клеток иммунной системы, в значительной степени моноцитов и NK-клеток, в эндометрий матки. В дальнейшем клетки иммунной системы матери контролируют многие этапы имплантации бластоцисты, развития плаценты и жизнеобеспечения плода. Однако молекулярно-клеточные механизмы формирования уникального адаптационного клеточного окружения вокруг плода остаются предметом изучения. Функциональное состояние эндотелиальных клеток (ЭК) и их взаимодействие с моноцитами периферической крови, целостность эндотелиальной выстилки сосудов во многом определяют физиологическое развитие плаценты благодаря контролю диапедеза клеток иммунной системы и формированию иммунологической толерантности в системе мать-плод. С течением беременности количество клеток иммунной системы, мигрирующих в плаценту, изменяется, однако молекулярные механизмы регуляции привлечения их в зону маточноплацентарного контакта остаются недостаточно изученными. После миграции в плаценту и децидуальную оболочку лимфоциты и моноциты\макрофаги за счет секреции цитокинов осуществляют аутокринную и паракринную регуляцию функций клеток микроокружения, оказывая влияние в том числе и на ЭК. Физиологическое развитие плаценты во многом зависит от обеспечения адекватного кровоснабжения плода, а ЭК являются активным участником ангиогенеза. Контроль процессов ангиогенеза обеспечивается благодаря сбалансированной секреции цитокинов и ростовых факторов клетками плаценты [Kaufmann P., 2004], среди которых основными продуцентами являются плацентарные макрофаги, NK-клетки, макрофаги децидуальной оболочки матки, эндотелиальные клетки и клетки трофобласта [Forbes K., 2010]. Однако влияние цитокинов, секретируемых клетками плаценты, при физиологической беременности на функции ЭК, характеристики адгезионной способности моноцитов, миграцию мононуклеаров периферической крови в децидуальную оболочку и плаценту во многом не ясны. Нарушение баланса ростовых факторов и цитокинов в плаценте приводит к дисфункции ЭК, снижению их жизнеспособности и нарушению развития сосудистой сети плаценты [Noori M., 2010]. Одним из последствий таких местных и системных патологических изменений является развитие гестоза у беременных женщин. Гестоз – одно из наиболее тяжелых осложнений беременности, характерными звеньями патогенеза которого являются гипертензия, протеинурия и задержка жидкости в организме женщины [Айламазян Э.К., 2008]. Эндотелиальная дисфункция играет главную роль в патогенезе гестоза [Айламазян Э.К., 2008]. Гестоз сопровождается развитием местного воспаления с наличием мононуклеарных инфильтратов в плаценте [Irminger-Finger I., 2008] и недостаточным развитием сосудистой сети плаценты. Однако в настоящее время молекулярные механизмы реализации патологического изменения межклеточных взаимодействий в плаценте при 4 развитии гестоза неизвестны. Недостаточно данных о влиянии факторов, секретируемых клетками плаценты при гестозе, на функциональное состояние моноцитов, ЭК и их способность контролировать миграцию мононуклеаров периферической крови в децидуальную оболочку и плаценту. Целью работы явилась оценка изменения функциональных характеристик эндотелиальных клеток линии EA.hy926 и особенностей их взаимодействия с моноцитоподобными клетками линии ТНР-1 в присутствии факторов, секретируемых плацентой при физиологической беременности и беременности, осложненной гестозом. Задачи исследования: 1. Провести сравнительный анализ секреции молекул, контролирующих ангиогенез (PlGF, MMP-2, MMP-9, Ang-1, Ang-2), клетками плаценты на ранних и поздних этапах ее развития при физиологически протекающей беременности, а также при беременности, осложненной гестозом. 2. Сопоставить продукцию секреторных вариантов поверхностных молекул sFas, sFasL, sTRAIL, sVEGFR-1, адгезионных молекул лейкоцитарного и эндотелиального происхождения (sVE-cadherin, sE-Selectin, sICAM-3, sPECAM1, sP-Selectin, sVCAM-1) клетками плаценты и их содержание в сыворотке периферической крови у женщин с физиологическим течением беременности и при беременности, осложненной гестозом. 3. Оценить влияние факторов, секретируемых клетками плаценты на ранних и поздних сроках физиологической беременности и при беременности, осложненной гестозом, на изменение количества эндотелиальных клеток линии EA.Hy926 и их миграционную активность. 4. Изучить влияние факторов, секретируемых клетками плаценты на ранних и поздних сроках физиологической беременности и при беременности, осложненной гестозом, на секрецию эндотелиальными клетками линии EA.Hy926 хемокинов (IL-8, MCP-1, RANTES) и ростовых факторов (VEGF, bFGF, ангиогенина), а также экспрессию ими адгезионных молекул и рецепторов цитокинов. 5. Провести сравнительную оценку влияния факторов, секретируемых клетками плаценты на ранних и поздних сроках физиологической беременности и при гестозе, на адгезию и трансэндотелиальную миграцию моноцитоподобных клеток линии THP-1. 6. Изучить влияние препарата на основе магния аспарагината (ООО «НФФТ «Полисан») на изменение количества эндотелиальных клеток линии EA.Hy926. Научная новизна. Проведен анализ секреции растворимых факторов клетками плаценты и их влияния на свойства эндотелиальных клеток линии EA.hy926. Впервые показано изменение фенотипических и функциональных характеристик эндотелиальных клеток линии EA.hy926 под влиянием факторов, секретируемых клетками плаценты на разных этапах физиологически протекающей беременности и при гестозе. Обнаруженная модификация функциональных и фенотипических характеристик эндотелиальных клеток линии EA.hy926, выраженная в изменении экспрессии адгезионных молекул и рецепторов для цитокинов, секреции цитокинов, изменении количества и миграционной активности эндотелиальных 5 клеток, может отражать механизмы участия эндотелиальных клеток в регуляции ангиогенеза и привлечении лейкоцитов из периферической крови в плаценту и децидуальную оболочку матки в условиях in vivo. Впервые выявлены возможные механизмы патологической активации эндотелиальных клеток при гестозе, а также показано, что факторы, секретируемые плацентой при наличии у женщины гестоза, способны усиливать трансэндотелиальную миграцию моноцитоподобных клеток линии ТНР-1 через монослой клеток линии EA.hy926, что в условиях in vivo может способствовать развитию воспаления в плаценте. Теоретическая и практическая значимость работы. Основными источниками цитокинов на протяжении всей беременности в децидуальной оболочке матки и плаценте являются клетки иммунной системы. Факторы, секретируемые плацентой в первом и третьем триместре физиологической беременности, различным образом изменяют фенотип и функциональные характеристики эндотелиальных клеток, контролируют активность трансэндотелиальной миграции моноцитов и изменение экспрессии поверхностных адгезионных молекул моноцитов в ходе трансэндотелиальной миграции. Полученные данные отражают роль некоторых поверхностных молекул эндотелиальных клеток в определении интенсивности специфической миграции моноцитов в децидуальную оболочку и плаценту при физиологической беременности и при гестозе. Выявленные изменения позволяют предположить роль цитокинов, ростовых факторов и других молекул, секретируемых клетками плаценты, в регуляции функционального состояния эндотелиальных клеток децидуальной оболочки и плаценты в условиях in vivo. Впервые выявлен повышенный уровень трансэндотелиальной миграции моноцитов в присутствии факторов, секретируемых плацентой при гестозе, сопровождающийся повышенной экспрессией CD11b моноцитами и молекулы CD119 (рецептора IFNγ) эндотелиальными клетками, что указывает на участие этих молекул в развитии воспаления в плаценте при гестозе. Факторы, секретируемые плацентой при гестозе, снижают количество и миграционную активность эндотелиальных клеток линии EA.hy926, что может являться механизмом нарушения ангиогенеза в плаценте in vivo и индукции системной эндотелиальной дисфункции вследствие изменения секреторной активности клеток иммунной системы. Предложен метод оценки биологической активности фармацевтических препаратов, предназначенных для коррекции эндотелиальной дисфункции, по определению их влияния на изменение количества эндотелиальных клеток. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Факторы, секретируемые клетками плацент женщин в первом триместре физиологической беременности, изменяют фенотип эндотелиальных клеток линии EA.hy926, стимулируют экспрессию СD11а и трансэндотелиальную миграцию моноцитоподобных клеток линии ТНР-1, усиливают миграционную активность эндотелиальных клеток и способствуют увеличению их количества. В условиях in vivo подобное влияние факторов, секретируемых клетками плаценты, на эндотелиальные клетки способно обеспечить физиологическое развитие сосудистого русла плаценты, в том числе за счет привлечения в децидуальную 6 оболочку и плаценту моноцитов\макрофагов, контролирующих процессы ангиогенеза и инвазии трофобласта. 2. Факторы, секретируемые плацентой женщин в третьем триместре физиологической беременности, снижают интенсивность трансэндотелиальной миграции моноцитоподобных клеток линии THP-1, а также экспрессию адгезионных молекул CD62P и CD54 эндотелиальными клетками линии EA.hy926 и экспрессию CD11a моноцитоподобными клетками линии ТНР-1. Подобное изменение фенотипа и функциональной активности эндотелиальных клеток плаценты и децидуальной оболочки под влиянием секреторных продуктов плаценты может способствовать физиологической стабилизации сосудистого русла плаценты и снижению миграции мононуклеаров периферической крови в децидуальную оболочку и плаценту к концу беременности. В третьем триместре беременности сниженная продукция плацентой как проангиогенных, так и антиангиогенных факторов, определяет сниженную интенсивность миграции эндотелиальных клеток линии EA.hy926 и сниженное их количество. 3. Факторы, секретируемые плацентой при беременности, осложненной гестозом, индуцируют повышенную трансэндотелиальную миграцию моноцитоподобных клеток линии ТНР-1, сопровождающуюся усиленной экспрессией молекулы CD119 эндотелиальными клетками и усиленной экспрессией адгезионной молекулы CD11b моноцитоподобными клетками, что свидетельствует об участии этих молекул в индукции воспаления в плаценте при гестозе в условиях in vivo. Отмеченные изменения фенотипа эндотелиальных клеток линии EA.hy926 в присутствии секреторных продуктов плацент при гестозе, сопровождается снижением миграционной активности и количества эндотелиальных клеток, и могут лежать в основе индукции системной эндотелиальной дисфункции при гестозе. 4. Изменение количества эндотелиальных клеток линии EA.hy926 может служить тест-системой для скрининга препаратов, предназначенных для терапии гестоза. Реализация работы. По материалам диссертации опубликовано 27 научных работ, в том числе 9 статей в журналах, включенных в Перечень ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов диссертационных исследований. Личное участие автора заключалось в проведении всех лабораторных исследований, статистической обработке, обобщении и анализе полученных результатов, подготовке статей. Методическая помощь была оказана в.н.с. отдела иммунологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН Стариковой Э.А. при освоении методов оценки миграционной активности ЭК и трансэндотелиальной миграции клеток линии ТНР-1. Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на XII Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (СанктПетербург, 2009), XIII Всероссийском форуме «Дни иммунологии в СанктПетербурге 2009» (Санкт-Петербург, 2009), на Втором Международный конгрессе по иммунологии (Берлин, Германия, 2009), X юбилейном всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2009), XVI Межгородской конференции молодых 7 ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2010), 4-ой Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» (Пермь, 2010), I ежегодной научной конференции молодых ученых и специалистов «Репродуктивная медицина: взгляд молодых 2010» (Санкт-Петербург, 2010), Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2010), XIV Всероссийском форуме с международным участием им. академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011), XVII межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2011), XII Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2011), Международном студенческом медицинском конгрессе (ISCOM 2011) (Гронинген, Голландия, 2011), XIII Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2012), V Российской конференции по иммунологии репродукции (Иваново, 2012), III ежегодной научной конференции молодых ученых и специалистов «Репродуктивная медицина: взгляд молодых – 2012» (Санкт-Петербург, 2012), III Европейском конгрессе по иммунологии (Великобритания, Глазго, 2012). Объем и структура диссертации. Материалы диссертации включают введение, обзор литературы, описание материалов и методов, полученные результаты, обсуждение, общее заключение, выводы, список сокращений и список литературы. Текст диссертации изложен на 181 странице, содержит 24 таблицы, 21 рисунок и 4 приложения. Список литературы состоит из 296 работы, из них 43 работ принадлежит отечественным авторам и 253 - зарубежным. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Обследовано 110 женщин во время и вне беременности: первая (контрольная) группа – здоровые небеременные женщины без признаков воспалительных изменений в организме; вторая группа – женщины с физиологическим течением беременности (9-11 недель и 32-39 недель); третья группа – беременные женщины с гестозом различной степени тяжести (32-39 недель) без признаков угрожающего прерывания беременности на момент исследования. Группы беременных были сопоставимы по возрасту, прохождению родов и акушерскому анамнезу. Все плаценты на сроке 38-39 недель получены при родоразрешении путем кесарева сечения. Помимо плацент у женщин вышеперечисленных групп исследовали содержание различных факторов в сыворотке периферической крови. Получено информированное согласие пациенток на обследование. Диагноз гестоза у беременных женщин установлен на основании ведущих клинических симптомов в соответствии с классификацией, предложенной акад. РАМН Г.М.Савельевой (2005). Культивирование плаценты проводили в среде DMEM/F12 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Sigma, США) или в среде DMEM/F12 без добавления ЭТС в течение 24 часов; кондиционированные среды собирали и замораживали (-20ºС) до исследования. Кусочки плацент взвешивали для пересчета концентрации изучаемых факторов на 1мг ткани. 8 Измерение содержания факторов в сыворотке периферической крови и кондиционированных средах, полученных после культивирования плаценты, определяли методом иммуноферментного анализа используя стандартные наборы для Ang-1 и Ang-2, TRAIL (R&D systems, США), PlGF, sFas (CD95), sFasL (sCD95L) (Bender Medsystems, Австрия), MMP-2 и MMP-9 (Amersham Bioscieces, Великобритания) и CBA-методом для sE-Selectin, sICAM-3, sPECAM-1, sP-Selectin, sVCAM-1, sVEGF-R1 (Bender Medsystems, Австрия) на проточном цитофлуориметре FacsCantoII (BD, США). Культуры клеток. Исследования проводили с использованием ЭК линии EA.Hy926 и моноцитоподобных клеток линии THP-1. Для культивирования ЭК линии EA.hy926 использовали среду следующего состава: среда DMEM/F12 (Sigma, США) с добавлением 10% инактивированной ЭТС, 100 Ед/мл пенициллина (Sigma, США) и 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma, США), 2 мМ Lглутамина (ICN, США), НАТ (Sigma, США). Для культивирования моноцитоподобных клеток линии ТНР-1 использовали среду следующего состава: среда RPMI1640 (Sigma, США) с добавлением 10% инактивированной ЭТС, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина. Все используемые клетки культивировали при 37ºС, 5% СО2, 100% влажности. Экспрессия поверхностных молекул эндотелиальными клетками в присутствии секретируемых плацентой факторов. ЭК культивировали в 24луночных плоскодонных планшетах до образования конфлюэнтного монослоя. Затем ЭК инкубировали с кондиционированными средами, полученными после культивирования плацент. Затем клетки снимали с планшета и проводили связывание с антителами к CD31, CD62E, CD62P, CD34, CD9, CD54, CD51/61, CD29, CD49d, CD58, CD141, CD146, CD44, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, CD140a, CD140b, Tie-1, Tie-2, CD36, CD119, CD184, CD192, TRAIL (BD, США), меченными флуоресцентной меткой. Оценку экспрессии этих молекул проводили с использованием проточного цитофлуориметра FacsCanto II (BD, США). Секреция цитокинов эндотелиальными клетками в присутствии факторов, продуцируемых плацентой. ЭК культивировали до образования конфлюэнтного монослоя. В лунки вносили кондиционированные среды, полученные после культивирования плацент, и инкубировали 3 часа. Клетки отмывали раствором Хенкса, вносили культуральную среду. После инкубации кондиционированные среды ЭК собирали и оценивали содержание VEGF, IL-8, bFGF, MCP-1, RANTES и ангиогенина при помощи СВА-метода, используя стандартный набор (BD, США) на проточном цитофлуориметре FacsCantoII. Содержание исследуемых цитокинов в культуральной среде не превышало 2 пг/мл. Количество эндотелиальных клеток в присутствии секретируемых плацентой факторов, определение колориметрическим методом. ЭК инкубировали в 96-луночных плоскодонных планшетах. Вносили кондиционированные среды, полученные при культивировании плацент, с содержанием ЭТС 2,5%. После инкубации 72 часа ЭК окрашивали 0,2% раствором кристаллического фиолетового (Sigma, США), содержащим 5% метанола. Экстракцию красителя проводили 10% раствором уксусной кислоты. 9 Учет оптической плотности проводили на микропланшетном ридере «Labsystems» (Финляндия) при длине волны 540 нм. Полученные значения оптической плотности переводили в количество клеток, используя калибровочную кривую. Миграционная активность эндотелиальных клеток в присутствии факторов, секретируемых плацентой. ЭК культивировали в 96-луночном плоскодонном планшете до образования конфлюэнтного монослоя. Монослой нарушали, соскабливая часть клеток в центре лунки. Вносили кондиционированные среды, полученные при культивировании плацент с содержанием ЭТС 2,5%, и инкубировали 24 часа. ЭК окрашивали 0,2% раствором кристаллического-фиолетового, проводили оценку изменения ширины линии нарушенного монослоя в пикселях, и количество мигрировавших клеток на инвертированном микроскопе Axio Observer Z1 в компьютерной программе Axio Vision (Carl Zeiss, Германия). Адгезия моноцитоподобных клеток линии ТНР-1 к эндотелиальным клеткам под влиянием факторов, секретируемых плацентой. ЭК культивировали в 24-луночном плоскодонном планшете до образования конфлюэнтного монослоя. Отмывали раствором Хенкса, вносили кондиционированные среды плацент. В качестве положительного контроля использовали TNFα в концентрации 50 Ед/мл. После инкубации с активаторами к ЭК, вносили моноцитоподобные клетки, предварительно окрашенные флуоресцентным витальным красителем CFSE (Sigma, США). Совместное культивирование ЭК и моноцитоподобных клеток проводили в течение 1 часа, после чего неадгезировавшие клетки линии ТНР-1 отмывали раствором Хенкса. Адгезировавшие моноцитоподобные клетки и ЭК переводили в суспензию и измеряли количество клеток каждого типа в полученной суспензии на проточном цитофлуориметре FACSCanto II. Трансэндотелиальная миграция моноцитоподобных клеток через монослой эндотелиальных клеток под влиянием факторов, секретируемых плацентой. ЭК инкубировали во вставках для 24-луночных планшетов с поликарбонатным фильтром (размер пор 8 мкм) до образования монослоя. Затем в верхнюю камеру вносили моноцитоподобные клетки. В нижнюю камеру (лунка 24-луночного планшета) вносили кондиционированные среды плацент, инкубировали 24 часа. Оценивали абсолютное количество мигрировавших в нижнюю камеру клеток линии THP-1 и их фенотип после связывания с антителами против молекул CD18, CD11a, CD11b и CD11c, мечеными флуоресцентной меткой (BD, США), на проточном цитофлуориметре. Оценка влияния препарата на основе магния аспарагината на изменение количества эндотелиальных клеток. Водорастворимый препарат на основе магния аспарагината (ООО «НТФФ «Полисан», Россия) содержит магния аспарагинат (5 г/л), натрия сукцинат (1г/л); рН =7,2. Для изучения влияния препарата на количество ЭК в 96-луночном круглодонном планшете (Sarstedt, Австрия) готовили серию разведений препаратов от чистого препарата до разведения 1:1024 в объеме 100 мкл на среде DMEM\F12, ЭТС 2,5%. Методика определения изменения количества ЭК описана выше. В качестве контроля 10 использовали препарат «Натрия хлорид», который не оказывал токсического действия на ЭК, а также не влиял на изменение их количества. Статистический анализ проводили в программе Statistica 7.0 при помощи непараметрических критериев Манна-Уитни, Вилкоксона, а также медианного теста, используемого для определения тенденции изменения признака [Makhseed М., 2001]. Для оценки влияния препарата магния на количество ЭК использовали критерий Стьюдента. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Секреция плацентой биологически активных молекул. В III триместре физиологической беременности секреция плацентой Ang-2, MMP-2, PlGF, sVEGFR1 была ниже по сравнению с I триместром, а секреция Ang-1 выше (табл. 1). При гестозе секреция плацентой Ang-1 и Ang-2 была ниже, а sVEGF-R1 – выше по сравнению с III триместром физиологической беременности. Полученные результаты указывают на участие изученных факторов в ограничении ангиогенеза к концу беременности и нарушении ангиогенеза в плаценте при гестозе, что может быть связано с нарушением секреторной активности макрофагов и ЭК. Таблица 1 Продукция плацентой ангиогенных молекул Ангиогенные молекулы PlGF MMP-2 MMP-9 Ang-1 Ang-2 Группы 9-11 недель (n=15) 38-39 недель (n=27) гестоз, 38-39 недель (n=28) 9-11 недель (n=15) 38-39 недель (n=27) гестоз, 38-39 недель (n=28) 9-11 недель (n=15) 38-39 недель (n=27) гестоз, 38-39 недель (n=28) 9-11 недель (n=15) 38-39 недель (n=27) гестоз, 38-39 недель (n=28) 9-11 недель (n=15) 38-39 недель (n=27) гестоз, 38-39 недель (n=28) Концентрация в 1мл кондиционированной среды, пг/мл 530±75 340±35* 300±32 114700±10300 42700±2300 * 45290±1833 8024±1127 8627±1544 10251±668 0,27±0,27 71,8±12,0 * 53,7±12,6 37789±3268 3188±698 * 1518±322 Концентрация в пересчете на 1мг ткани 6,7±1,0 3,5±0,4* 3,0±0,3 1467±147 480,9±26,4* 511,0±28,4 102,9±14,4 84,1±11,7 109,9±7,5 0,003±0,003 0,82±0,15 * 0,59±0,15 476±48 39,8±10,2 * 16,4±3,7 * - p<0,05 по сравнению с группой «9-11 недель». В III триместре физиологической беременности секреция sFasL ниже, а секреция TRAIL выше по сравнению с I триместром (табл.2), что может являться механизмом защиты клеток плаценты от цитотоксических эффектов лимфоцитов матери в III триместре беременности. При гестозе секреция плацентой sFas (табл. 2) и sFasL (медианный тест) повышена по сравнению с физиологической беременностью, что, вероятно, вносит вклад в инициацию апоптоза цитотоксических лимфоцитов матери при данной патологии и предотвращение апоптоза клеток плаценты. 11 Таблица 2 Продукция плацентой секреторных вариантов поверхностных молекул Секреторные молекулы sFas (sCD95) sFasL (sCD95L) TRAIL sVEcadherin (sCD144) sVEGF-R1 sPECAM-1 sICAM-3 sE-Selectin sP-Selectin sVCAM-1 Группы 9-11 недель (n=15) 38-39 недель (n=30) гестоз, 38-39 недель (n=35) 9-11 недель (n=15) 38-39 недель (n=30) гестоз, 38-39 недель (n=35) 9-11 недель (n=15) 38-39 недель (n=30) гестоз, 38-39 недель (n=35) 9-11 недель (n=15) 38-39 недель (n=30) гестоз, 38-39 недель (n=35) 9-11 недель (n=15) 38-39 недель (n=30) гестоз, 38-39 недель (n=35) 9-11 недель 38-39 недель гестоз, 38-39 недель 9-11 недель 38-39 недель гестоз, 38-39 недель 9-11 недель 38-39 недель гестоз, 38-39 недель 9-11 недель 38-39 недель гестоз, 38-39 недель 9-11 недель 38-39 недель гестоз, 38-39 недель Концентрация в 1мл кондиционированной среды, пг/мл 299±40 278±16 331±19 ‡ 50,9±9,3 16,8±3,5* 26,0±4,7 25,9±4,7 411±42* 399±31 0,1±0,1 307±118* 665±155 ‡ 77000±528 28514±306* 40779±401‡ 17493±2178 51814±5086* 67872±6364 3233±737 1706±547* 970±407 ‡ 948±329 4659±550* 3918±580 28310±5329 23517±4700 23732±5734 6704±784 10912±995* 8550±543 Концентрация в пересчете на 1мг ткани 4,0±0,7 3,0±0,2 3,4±0,2 0,6±0,1 0,18±0,03* 0,27±0,05 0,33±0,06 4,2±0,4* 4,4±0,3 0,001±0,001 2,8±1,0* 7,0±1,6‡ 1000±69 314±26* 491±54 ‡ 208,7±26,6 493±39* 678±57 ‡ 38,3±8,8 18±6,1* 10,0±4,3 11,1±3,9 48,9±6,6* 40,7±6,7 348,6±64,7 214±43 239±55 79,7±9,3 113±11 90±7 * - p<0,05 по сравнению с группой «9-11 недель», ‡.- p<0,05 по сравнению с группой «38-39 недель». Установлено, что секреция плацентой молекулы sVE-cadherin на сроке 9-11 недель отсутствует. В III триместре физиологической беременности секреция плацентой sVE-cadherin, sPECAM-1, sE-selectin, sVCAM-1 была выше по сравнению с I триместром, что может быть связано с усилением процессов апоптоза в плаценте к концу беременности. При этом секреция sICAM-3 снижена (табл. 2), что коррелирует со снижением привлечения лейкоцитов в плаценту к концу беременности. Секреторные варианты адгезионных молекул могут принимать участие в регуляции привлечения лейкоцитов в плаценту. Гестоз сопровождался повышенной секрецией sVE-cadherin плацентой по сравнению с физиологической беременностью, сниженной секрецией молекул sEselectin, sVCAM-1 (по результатам медианного теста), sICAM-3 (табл.2), что 12 может являться результатом их связывания с лигандами на поверхности лейкоцитов. При гестозе изменение секреции растворимых форм адгезионных молекул плацентой может служить механизмом, сдерживающим миграцию лейкоцитов матери в децидуальную оболочку и плаценту, а также снижающим цитотоксические эффекты лейкоцитов матери в отношении клеток плода. Изменение секреции растворимых форм поверхностных молекул плацентой не вносило вклад в их содержание в сыворотке периферической крови беременных женщин, что указывает на роль изученных молекул в местной регуляции развития плаценты. Влияние секретируемых плацентой факторов на количество клеток и миграционную активность эндотелиальных клеток линии EA.hy926. По результатам медианного теста количество ЭК в присутствии факторов плацент в III триместре физиологической беременности было ниже по сравнению с I триместром при разведениях кондиционированных сред от 1:2 до 1:256 (рис.1). При этом ширина линии нарушенного монослоя была ниже (рис. 2). Таким образом, происходит ограничение ангиогенеза к III триместру физиологической беременности. Рис. 1. Изменение количества эндотелиальных клеток линии EA.hy926. *- p<0,05, **- p<0,01, ***- p<0,001 – по сравнению с контролем. Рис. 2. Миграционная активность эндотелиальных клеток линии EA.hy926. *** - p<0,001 по сравнению с группой «9-11 недель»; # - p<0,05 по сравнению с группой «38-39 недель». 13 В присутствии факторов, секретируемых плацентой при гестозе, в разведениях от 1:2 до 1:126 количество ЭК было ниже по сравнению с количеством ЭК в присутствии факторов плацент женщин в III триместре физиологической беременности (рис. 1). При этом факторы, секретируемые плацентой при гестозе, снижали количество мигрировавших клеток по сравнению с III триместром физиологической беременности (рис. 2). Обнаруженное нарушение миграционной активности ЭК и снижение их количества под влиянием факторов плацент при гестозе, возможно, участвует в индукции эндотелиальной дисфункции, способствует нарушению проницаемости сосудов, появлению отеков и развитию протеинурии. Влияние секретируемых плацентой факторов на экспрессию поверхностных молекул эндотелиальными клетками линии EA.hy926. Факторы, секретируемые плацентой в I триместре физиологической беременности, повышали экспрессию исследованных молекул ЭК за исключением CD29 и CD58. Экспрессия изученных адгезионных молекул и рецепторов ангиогенных факторов ЭК после их инкубации в присутствии кондиционированных сред плацент в III триместре физиологической беременности была ниже по сравнению с экспрессией после инкубации ЭК в присутствии кондиционированных сред плацент в I триместре беременности. Такое изменение фенотипа ЭК в условиях in vivo коррелирует с активным ангиогенезом плаценты и активной миграцией лимфоцитов в плаценту в I триместре беременности и со снижением секреции ангиогенных факторов клетками иммунной системы плаценты и стабилизацией сосудистого русла, снижением уровня миграции лейкоцитов в децидуальную оболочку к III триместру физиологической беременности. В присутствии факторов плацент женщин с гестозом экспрессия CD119 была выше по сравнению с экспрессией в присутствии факторов плацент женщин в III триместре физиологической беременности, что отражает усиление чувствительности ЭК к действию провоспалительных цитокинов в условиях развития воспалительной реакции в плаценте при гестозе при участии NK-клеток. Влияние секретируемых плацентой факторов на секрецию цитокинов эндотелиальными клетками линии EA.hy926. Секреция исследованных цитокинов и хемокинов ЭК в присутствии секреторных продуктов плацент в I и III триместрах физиологической беременности не различалась, что указывает на роль секреторной активности ЭК в поддержании базового уровня миграции лимфоцитов в плаценту. В присутствии кондиционированных сред плацент женщин с гестозом, секреция bFGF была выше, а секреция IL-8 - ниже по сравнению с III триместром физиологической беременности (рис. 3), что не соответствует изменению секреторной активности плаценты при этой патологии и указывает на преимущественную роль клеток иммунной системы в секреции цитокинов плацентой. 14 Рис. 3. Изменение секреции цитокинов эндотелиальными клетками линии EA.hy926. # - p<0,05 по сравнению с группой «38-39 недель». Влияние факторов, секретируемых плацентой, на адгезию и трансэндотелиальную миграцию моноцитоподобных клеток линии THP-1. Адгезия моноцитоподобных клеток к ЭК в присутствии секреторных продуктов плацент женщин всех исследованных групп не отличалась от адгезии в контроле. Количество клеток, мигрировавших в нижнюю камеру после внесения в нее секреторных продуктов плацент в III триместре физиологической беременности и беременности, осложненной гестозом, было ниже по сравнению со спонтанным уровнем (рис.4). Под влиянием секреторных продуктов плаценты в III триместре физиологической беременности активность трансэндотелиальной миграции клеток линии ТНР-1 была ниже по сравнению с влиянием секреторных продуктов плацент в I триместре беременности (рис.4). При этом экспрессия CD11a моноцитоподобными клетками, находящимися в верхней камере, была снижена. Снижение трансэндотелиальной миграции может быть обусловлено как сниженной экспрессией CD11a моноцитоподобными клетками при одновременном снижении экспрессии CD54 ЭК, так и отмеченной ранее сниженной секрецией IL-6 и IL-8 плацентой в III триместре физиологической беременности по сравнению с I триместром [Соколов Д.И., 2009]. Рис. 4. Количество клеток линии ТНР-1 в нижней камере после трансэндотелиальной миграции. ♦♦ - p<0,01, ♦♦♦ - p<0,001 по сравнению с контролем; *** p<0,001 по сравнению с группой «9-11 недель», # - p<0,05 по сравнению с группой «38-39 недель» 15 Полученные результаты указывают на участие молекул CD11a и CD54 в регуляции миграции моноцитов в плаценту in vivo. Под влиянием факторов, секретируемых плацентой при гестозе, активность трансэндотелиальной миграции моноцитоподобных клеток линии ТНР-1 была выше по сравнению с действием факторов, секретируемых плацентой в III триместре физиологической беременности (рис. 4), чему может способствовать как повышенная секреция IL-6 плацентой при гестозе, так и обнаруженная повышенная экспрессия CD11b клетками линии ТНР-1 в этом случае и усиленная секреция эндотелиальными клетками цитокина bFGF в присутствии факторов, секретируемых плацентой при гестозе. В присутствии провоспалительных цитокинов, секретируемых при гестозе клетками иммунной системы, присутствующими в децидуальной оболочке и плаценте, bFGF может стимулировать трансэндотелиальную миграцию моноцитоподобных клеток, а в условиях in vivo за счет усиления миграции мононуклеаров в плаценту, активизировать воспаление в плаценте. Влияние препарата на основе магния аспарагината (ООО «НФФТ «Полисан») на изменение количества ЭК линии EA.Hy926. Препарат на основе магния аспарагината в разведении 1:2000 (концентрация магния аспарагината 2,5 мг/л) увеличивал количество ЭК линии EA.Hy926 (рис. 5). Таким образом, препарат на основе магния аспарагината представляется перспективным для коррекции эндотелиальной дисфункции. Количество клеток линии EA.Hy926 под влиянием препарата на основе магния аспарагината Рис. 5. Влияние препарата на основе магния аспарагината на количество эндотелиальных клеток. ** - p<0,01 увеличение количества ЭК по сравнению с контролем; ♦ p<0,05; ♦♦ p<0,01; ♦♦♦ p<0,001 снижение количества ЭК по сравнению с контролем. Таким образом, ограничение ангиогенеза плаценты и привлечения моноцитов в плаценту и децидуальную оболочку к концу беременности происходит не только за счет изменения секреторной активности клеток плаценты, но и посредством изменения экспрессии адгезионных молекул и рецепторов ЭК, следствием чего является изменение функциональной активности ЭК. При гестозе в развитии воспаления в плаценте ЭК принимают участие посредством усиления чувствительности к провоспалительным стимулам (повышение экспрессии 16 рецептора IFNγ) и стимуляции миграции моноцитов за счет локальной секреции цитокинов (bFGF). Выводы 1. От первого к третьему триместру физиологической беременности снижается секреция плацентой проангиогенных молекул PlGF (p<0,05), MMP-2 (p<0,001), Ang-2 (p<0,001) и секреторных вариантов поверхностных молекул sFasL (p<0,001), sICAM-3(p<0,05), а секреция молекул sTRAIL (p<0,001), sVECadherin (p<0,01), sPECAM (p<0,001), sE-Selectin (p<0,001), и sVCAM-1(p<0,01) повышается. 2. Беременность, осложненная гестозом, характеризуется повышением секреции плацентой sVEGF-R1 (p<0,05), sFas (p<0,05), sVE-Cadherin (p<0,05) и снижением секреции sICAM-3 (p<0,05). Изменения секреции этих растворимых форм адгезионных молекул плацентой ведут к изменению содержания этих молекул в сыворотке периферической крови женщин с патологическим течением беременности. 3. При физиологической беременности экспрессия эндотелиальными клетками линии EA.Hy926 адгезионных молекул CD9, CD29, CD34, CD54,CD49d, CD62P, integrin β7, рецепторов ангиогенных факторов VEGF-R1, VEGF-R2, VEGF-R3, Tie-1, CD140a, CD140b, CD184 и молекулы CD119 снижается в третьем триместре под влиянием секреторных продуктов плацент, что сопровождается снижением количества и миграционной активности эндотелиальных клеток линии EA.Hy926. 4. При патологической беременности, характеризующейся развитием гестоза, происходит усиление экспрессии эндотелиальными клетками линии EA.hy926 рецептора для IFNγ (CD119), усиление секреции этими клетками bFGF и снижение секреции IL-8 под влиянием факторов, секретируемых плацентой, что ассоциировано со снижением количества и миграционной активности эндотелиальных клеток линии EA.Hy926. 5. Сниженние трансэндотелиальной миграции моноцитоподобных клеток линии ТНР-1 в присутствии факторов плацент в третьем триместре физиологической беременности (по сравнению с первым триместром) коррелирует со снижением экспрессии CD54 эндотелиальными клетками линии EA.hy926 и CD11a клетками линии ТНР-1. Повышение трансэндотелиальной миграции клеток линии ТНР-1 в присутствии факторов плацент беременных с гестозом по сравнению с физиологической беременностью сопровождается усилением экспрессии CD11b этими клетками. 6. Препарат на основе магния аспартата (ООО «НТФФ «Полисан») в разведении 1:2000 (концентрация магния аспарагината 2,5 мг/л) повышет количество эндотелиальных клеток линии EA.Hy926 в культуре (p<0,01). Список работ, опубликованных по теме диссертации: Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК России: 1. Степанова, О.И. Влияние препарата, содержащего магний, на пролиферативную и секреторную активность эндотелиальных клеток / 17 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 1. 2. О.И.Степанова, Н.В.Аманова, М.С.Зайнулина, Д.И.Соколов, С.А. Сельков // Журнал акушерства и женских болезней. – 2011. – Т.LX, №4. – С.98-103. Степанова, О.И. Влияние растворимых продуктов ткани плаценты на экспрессию адгезионных молекул эндотелиальными клетками EA.Hy926. / О.И.Степанова, Т.Ю.Львова, Е.Н.Пюрбеева, М.И.Мирашвили, М.С.Зайнулина, С.А.Сельков , Д.И.Соколов // Медицинская иммунология. – 2011. – Т.13,№6. – С.589-596. Степанова, О.И. Влияние секреторных факторов плаценты на продукцию цитокинов эндотелиальными клетками / О.И.Степанова, Н.Ю. Сафронова, К.Н.Фураева, Т.Ю. Львова, Д.И.Соколов, С.А. Сельков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2012. – Т. 154, № 9. – С. 361-364. Степанова, О.И. Влияние факторов, секретируемых тканью плаценты, на пролиферативную активность эндотелиальных клеток линии EA.hy926 / О.И.Степанова, К.Н.Фураева, И.П Николаенков., С.А.Сельков, Д.И. Соколов // Журнал акушерства и женских болезней. – 2012. – Т. LXI, №5. – С.80-84. Степанова, О.И. Изменение экспрессии поверхностных рецепторов на эндотелиальных клетках линии EA.Hy926 под влиянием факторов, секретируемых тканью плаценты / О.И.Степанова, Т.Ю.Львова, М.И.Мирашвили, К.Н.Фураева, Д.И.Соколов, С.А. Сельков // Медицинская иммунология. – 2012. – Т.14, №4-5. – С. 321-328. Степанова, О.И. Продукция секреторных вариантов поверхностных молекул sFas, sFasL, TRAIL тканью плаценты в норме и при гестозе / О.И.Степанова, М.В.Лесничия, М.А.Клюкина, О.Н.Аржанова, С.А. Сельков, Д.И.Соколов // Медицинский академический журнал - 2010. – Т.10, №1. – С.52-56. Степанова, О.И. Секреция ангиопоэтинов тканью плаценты при физиологическом развитии беременности и при гестозе / О.И.Степанова, М.В.Лесничия, Т.Ю Львова., Д.И.Соколов, С.А. Сельков // Журнал акушерства и женских болезней. – 2010. – Том LIX. - №6. – С.69-74. Степанова, О.И. Сравнительная оценка концентрации sVEGF-R1 и sVE-cadherin в сыворотке крови беременных и их продукции тканью плаценты / Степанова О.И., Лесничия М.В., Аржанова О.Н., Сельков С.А., Соколов Д.И. // Молекулярная медицина. – 2010. - №2. – С.43-47. Степанова, О.И. Сравнительная оценка концентрации секреторных вариантов молекул адгезии в сыворотке крови беременных и их продукции тканью плаценты / О.И. Степанова, Н.В. Аманова, М.С. Зайнулина, С.А. Сельков, Д.И. Соколов // Молекулярная медицина. – 2011. - №1. – с.48-53. Тезисы: Лесничия М.В., Степанова О.И., Мирашвили М.И. Клинико-иммунологические аспекты в оценке и прогнозировании гестоза // Материалы научной конференции молодых ученых «Репродуктивная медицина: взгляд молодых – 2010». – 2010. – С. 24-25. Степанова О.И., Львова Т.Ю. Секреция про- и анти-ангиогенных факторов тканью плаценты при физиологической беременности и при гестозе // Российский иммунологический журнал. – 2010. – Т.4(13), №4. – С. 384 18 3. Степанова О.И., Львова Т.Ю., Соколов Д.И. Нарушение пролиферативной активности эндотелиальных клеток при гестозе // Медицинский академический журнал. – 2010. – Т.10, №5. – С.219. 4. Степанова О.И., Соколов Д.И., Сельков С.А. Экспрессия PlGF и MMP клетками плаценты // Медицинская иммунология. – 2009. – Т.11. – С. 423. 5. Степанова, О.И. Влияние секреторных продуктов ткани плаценты на трансэндотелиальную миграцию моноцитоподобных клеток линии ТНР-1 / О.И. Степанова, Т.Ю.Львова, Н. Ю.Сафронова, К.Н.Фураева, С.А.Сельков, Д.И. Соколов // Медицинская иммунология. – 2011. – Т.13,№4-5. – С. 439-440. 6. Степанова, О.И. Влияние факторов, секретируемых тканью плаценты при физиологической беременности и при гестозе, на миграционную активность эндотелиальных клеток линии EA.hy926 / О.И.Степанова, Г.Р.Козонов, Т.У.Кузьминых, Д.И.Соколов // Российский иммунологический журнал. – 2012. – Т.6(14), №2. – С.162. 7. Фураева К.Н. Изменение пролиферации, миграции, образования трубок сосудов и секреции цитокинов эндотелиальными клетками линии . EA.Hy926 в присутствии факторов, секретируемых тканью плаценты / К.Н.Фураева, О.И. Степанова, Т.Ю.Львова, С.А.Сельков, Д.И.Соколов // Медицинский академический журнал. – 2012. – Т.12,№3. – С.67-69. 8. Stepanova O.I. Soluble forms of cell surface adhesion molecules in preeclampsia / O.I.Stepanova, N.V. Amanova, T.U. Lvova, D.I.Sokolov, M.S. Zainulina, S.A.Selkov // International Immunology meeting abstracts – 2010. – Vol.22, Suppl.1 Pt 4. – P. i181. 9. Stepanova O.I., Selkov S.A., Sokolov D.I. Characterictic of placental secretion of PlGF, MMP-2 and MMP-9 // European Journal of Immunology, Supplement 1/09. –2009. S.710. 10. Stepanova, O.I. Adhesion molecules contribution in placental tissue development during normal pregnancy and complicated with preeclampsia one / O.I. Stepanova, D.I. Sokolov, T.U. Lvova, K.N. Furaeva, E.N. Purbeeva, S.A.Selkov // Abtracts of ISCOM-2011. – 2011. – P.265. 19 Список сокращений: ЭТС – эмбриональная телячья сыворотка ЭК – эндотелиальные клетки Ang – ангиопоэтин bFGF - фактор роста фибробластов CD- кластер дифференцировки Fas - рецептор суперсемейства TNFα FasL – лиганд для рецептора Fas IL – интерлейкин MCP-1 - моноцитарный хемотактический протеин-1 MMP – металлопротеиназы матрикса PECAM-1 - тромбоцитарно-эндотелиальная адгезионная молекула-1 PlGF – плацентарный ростовой фактор RANTES – фактор, экспрессируемый и секретируемый Т-лимфоцитами после их активации TRAIL - TNF-подобный лиганд, инициирующий апоптоз VCAM-1 - сосудистая молекула клеточной адгезии-1 VE-cadherin - кадгерин эндотелия сосудов VEGF - фактор роста эндотелия сосудов VEGF-R – рецептор VEGF
