Дергунова Марина Александровна
advertisement
На правах рукописи Дергунова Марина Александровна Структурно-функциональные изменения лизосом печени при стимуляции и депрессии системы мононуклеарных фагоцитов 03.00.04 – биохимия 14.00.16 – патологическая физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Новосибирск - 2006 1 Работа выполнена в Государственном учреждении Научноисследовательском институте физиологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Короленко Татьяна Александровна Официальные оппоненты: доктор биологических наук Усынин Иван Федорович Доктор медицинских наук, профессор Цырендоржиев Дондок Дамдинович Ведущая организация: Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, г. Новосибирск Защита состоится 21 декабря 2006 г. в 10 час. на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 при Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (630117, г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Научно -исследовательского института биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (630117, г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2). Автореферат разослан 20 ноября 2006 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Г.С.Русских 2 Общая характеристика работы Актуальность темы. Одной из важных задач в изучении активации макрофагов является оценка состояния популяции и управления их поведением. Разрабатываемые иммуномодуляторы активно используются в качестве эффективного инструмента раскрытия механизмов иммуногенеза. Изменение активности СМФ после предварительной стимуляции полисахаридами дрожжевого и бактериального происхождения связано не только с активацией поглотительной и переваривающей функции макрофагов, но и секрецией макрофагами простагландинов, усиливающих микроциркуляцию, факторов стимулирующих гранулоцито- и эритропоэз, синтез фибронектина, компонентов комплемента, а также факторов естественной резистентности, таких как интерлейкин 1, интерферон α, β (Маянский Д.Н. с соавт., 1990; Kogan et al., 2004). Показана депрессия поглотительной функции макрофагов печени и протективное действие предварительной стимуляции СМФ зимозаном. Стимуляция зимозаном открыла новые возможности для лекарственного воздействия по управлению функционирования клеток СМФ при их депрессии. Однако, водонерастворимость зимозана и ряда других гликанов ограничивала их применение как стимуляторов макрофагов. В связи с вышеизложенным представляется актуальным исследование стимуляции СМФ новыми водорастворимыми соединениями, лишенными неблагоприятных особенностей действия водонерастворимых, связанных с формированием гранулематозных очагов, активацией неуправляемой пролиферации клеток, развитием внутрилизосомного накопления за счет усиления захвата и подавления деградации биополимеров. Модификаторы биологического ответа представляют большой интерес для клинической и экспериментальной медицины. Перспективно их использование в онкологии, хирургии, и других областях медицины, при лечении различных воспалительных заболеваний (инфекционной, паразитарной природы). 3 Последние годы разработана модель селективной депрессии макрофагов печени in vivo с помощью введения крысам хлористого гадолиния, обнаружено повреждающее действие хлористого гадолиния не только на макрофаги, но и на клетки печеночной паренхимы (электронномикроскопические данные) (Hardonk M.J. et al., 1995). Обнаружено нарушение стабильности лизосом гепатоцитов и макрофагов (по увеличению свободной активности маркерных ферментов этих клеток - катепсина L и катепсина В соответственно) (Korolenko et al., 1997; Короленко Т.А., Свечникова И.Г., 1998). В нашей лаборатории обнаружено, что на ранних сроках депрессии макрофагов печени (2 и 5 ч) происходит увеличение активности маркерных ферментов лизосом макрофагов в сыворотке крови (активность -гексозаминидазы) (Safina et al., 1992). Выявлено защитное действие хлористого гадолиния на модели воспаления, вызываемого зимозаном у крыс и мышей. Обнаружены лизосомотропные свойства хлористого гадолиния, которые, очевидно, представлены и у других лантаноидов – соединений лантана и иттрия. Модели с введением всех указанных соединений вызывают депрессию фагоцитоза частиц углерода макрофагами печени. (Короленко Т.А. с соавт., 2006). Цель исследования: Оценить биологическое действие новых водорастворимых β-(1→3)-Dгликанов как стимуляторов макрофагов и их эффект на лизосомы у интактных животных и при селективной депрессии макрофагов печени in vivo. Для решения этой цели поставлены следующие задачи: 1. Изучить особенности хитокарбоксиметилгликаном в сравнении с (1→3)-β – D-гликаном у интактных стимуляции макрофагов карбоксиметилированным животных (состав клеток периферической крови и клеток костного мозга, ультраструктурные признаки 4 стимуляции макрофагов печени, фагоцитоз коллоидного углерода, секреция ФНО-α и лизосомных ферментов). 2. Исследовать динамику накопления гадолиния в клетках печени при введении соединения мышам и оценить влияние этого соединения на активность ферментов и стабильность мембран лизосом клеток печени. 3. Изучить особенности хитокарбоксиметилгликаном и стимуляции макрофагов карбоксиметилированным печени β-(1→3)-D- гликаном на модели селективной депрессии макрофагов печени, вызываемой введением хлористого гадолиния. 4. Исследовать изменения сыворотки крови активности лизосомных ферментов (имеющих преимущественно макрофагальное происхождение) при совместном введении мышам β-(1→3)-D-гликанов и хлористого гадолиния. Научная новизна Впервые проведено сравнительное активности новой группы модификаторов исследование биологической биологического ответа – водорастворимых химически модифицированных β-(1→3)-D-гликанов как стимуляторов макрофагов. Показано, что гликаны увеличивали содержание лейкоцитов и моноцитов периферической крови мышей, увеличивали содержание клеток миелоидного ряда в костном мозге. Обнаружено, что исследованные гликаны оказывали защитное действие при депрессии макрофагов печени. Динамика накопления гадолиния в клетках печени (длительное выведение в течение 37 дней) сопровождалось нарушением стабильности мембран лизосом (по свободной активности кислой фосфатазы), что свидетельствует о наличии лизосомотропных свойств соединения. Максимальный захват и накопление гадолиния в течение 24-48 ч после введения с развитием депрессии фагоцитоза коллоидного углерода сопровождалось подавлением активности маркерного фермента макрофагов – хитотриозидазы. 5 Положения, выносимые на защиту: 1. Введение -1,3-D гликанов вызывает стимуляцию СМФ, увеличивает количество моноцитов периферической крови, миелоидных элементов в костном мозге мышей, увеличивает количество макрофагов печени и количество в них вторичных лизосом, повышает поглотительную способность макрофагов, повышает продукцию ФНО-α. 2. Предварительное введение -1,3-D-гликанов при введении хлористого гадолиния оказывает протективное действие, связанное с восстановлением числа макрофагов печени, активности их маркерного фермента хиториозидазы. 3. Усиление фагоцитоза при стимуляции -1,3-D-гликанами сопровождается увеличением числа макрофагов печении и вторичных лизосом, повышением секреции кислых гидролаз и маркерных ферментов макрофагов, что может быть одним из механизмов повышения неспецифической резистентности организма. Научно-практическая ценность Полученные данные могут служить основой для разработки применения новых водорастворимых иммуномодуляторов – модификаторов биологического ответа при коррекции иммунодепрессивных нарушений. Изучена модель депрессии макрофагов печени, вызываемая с помощью введения мышам хлористого гадолиния (ХГ), используемая в экспериментальных исследованиях. Показано, что максимальное накопление гадолиния в клетках печени совпадает с периодом наиболее выраженной депрессии макрофагов (по фагоцитозу коллоидного углерода). 6 Апробация работы Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на Молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины», (Новосибирск, 2000); на Рабочем совещании «Лизосомные болезни, модели, терапии» (с международным участием) (Новосибирск, 2000); 9-м международном симпозиуме по сахаридам, Словакия, Братислава, 2000; международной конференции микроскопического общества Канады (Ванкувер, 2003); 13-м Рабочем совещании Европейской группы по изучению лизосомных болезней (Голландия, Вудсхотен, 2001); 14-м Рабочем совещании Европейской группы по изучению лизосомных болезней (Чехия, Подебрады, 2003); на V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005); на Всероссийской научно-практической (Красноярск, 2005); на Конференции «Дни иммунологии в Сибири» I съезде терапевтов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2005), межлабораторном семинаре ГУ НИИ физиологии СО РАМН (2006). Публикации По материалом диссертации опубликовано 16 работ, из них - 6 статей. Объем и структура диссертации Материал диссертации изложен на 149 страницах машинописного текста, содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, обсуждение, выводы, список литературы. Диссертация включает 22 рисунка и 11 таблиц. Список цитируемой литературы состоит из 298 источников, из них 54 отечественных и 244 зарубежных авторов. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования проведены на 598 взрослых самцах мышей линии СВА, массой 20-25 г. (виварий Института цитологии и генетики СО РАН, 7 Новосибирск). Эксперименты на животных проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. №755). ХитоКМГ или КМГ (оба препарата производства Института химии Словацкой АН, Братислава, Словакия) вводили животным однократно, внутрибрюшинно или внутривенно, в дозе 25 мг/кг массы. Мышей забивали через 48 ч и 7 сут после введения препаратов, т.е. в период ожидаемой наибольшей функциональной активности СМФ. Контрольным животным соответственно, вводили внутрибрюшинно или внутривенно соответствующий объем физиологического раствора. Определяли общее количество лейкоцитов в периферической крови и оценку леикограмм проводили согласно рекомендациям (Меньшиков В.В., 1987). Рассчитывали абсолютное количество отдельных видов лейкоцитов крови, индекс ядерного сдвига Шиллинга (ИЯС). Подсчет общего количества миелокариоцитов и приготовление мазка костного мозга для подсчета миелограмм проводили согласно рекомендациям Гольдберга Е.Д. с соавт. (1992) . Общую поглотительную способность макрофагов in vivo определяли по способности очищать кровь от частиц коллоидного углерода по методу, предложенному Biozzy G. et. al. (1953) и Benaceraff B. et. al. (1957). Модель селективного подавления поглотительной активности купферовских клеток in vivo воспроизводили с помощью хлористого гадолиния GdCl36H2O (любезно предоставлен профессором Хардонком, Нидерланды). Препарат вводили в/в в дозе 7,5 мг/кг однократно. Для исследования накопления ХГ в ткани печени, препарат мышам однократно, внутривенно в хвостовую вену мг/кг массы. вводили в дозе 7,5 Контрольным животным, вводили внутри венно соответствующий объем физиологического раствора. 8 Исследовали динамику накопления гадолиния методом эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ОАО “Катализатор”, Новосибирск). Изучение функциональных свойств лизосом печени мышей Определение общей и свободной активности маркерных ферментов лизосом проводили по методу de Duve С. et al. (1963). Состояние мембран лизосом печени оценивали по соотношению свободной и общей активности кислой фосфатазы, маркерного фермента лизосом, и устойчивости мембран лизосом фракции лизосом печени к действию повреждающих агентов (гипотонического раствора сахарозы), используя в качестве субстрата использовали –глицерофосфат натрия (Wattiaux R., 1966). Активность -галактозидазы определяли по методу Барретта (Barrett,1972), с использованием в качестве субстрата метилумбеллиферил-D-галактопиранозида (КФ 3.2.1.23). Активность нового фермента лизосом макрофагов - хитотриозидазы свидетельствующего об активации макрофагов, проводили согласно методу Guo et al. (1995), используя флуоресцентный субстрат 4- метилумбеллиферил-хитотриозид (Sigma, США, любезно предоставлен проф. Wevers R., Голландия). Активность -глюкуронидазы определяли флюоресцентным метдом в сыворотке крови мышей (Barrett, 1981). Измеряли экстинцию раствора метилумбеллиферона, отщепленного в результате гидролиза от субстрата, 4метилуббеллиферил--D-глюкуронида (Sigma, США). Активность N-ацетил- - D-гексозаминидазы определяли флюоресцентным метдом в сыворотке крови мышей. Измеряли экстинцию раствора метилумбеллиферона, отщепленного в результате гидролиза субстрата, 4-метилуббеллиферил-2-ацетамида-2-диокси-- D- глюкопиранозида (Sigma, США). 9 ФНО-α определяли в супернатанте перитонеальных макрофагов мышей (СВА С57Bl/6) Fl через 7 суток после введения КМГ или ХитоКМГ (в/б, 25 мг/кг) (Flick D.A., Gifford G.E., 1984). Электронномикроскопические исследования срезов печени мышей проводили по общепринятым методам. Статистическую обработку результатов проводили с вычислением среднего арифметического (М) и ошибки среднего арифметического Достоверность (m). различий (p) экспериментальных данных рассчитывали с использованием t-критерия Стьюдента. (Лакин, 1990). Обработку результатов производили с использованием пакета компьютерных прикладных программ Statistica 5.0. Результаты исследования и их обсуждение При в/б введении КМГ и ХитоКМГ наблюдалась умеренная гепатоспленомегалия через 2 сут , а при в/в способе введения подобные изменения происходили раньше, через 1 сут. Достоверных отличий между между группами животных, которым ввели КМГ и ХитоКМГ не наблюдали. Увеличение массы органов произошли, видимо, за счет увеличения концентрации белка в этих органах, усиленного притока макрофагов в печень, а также усиления гемопоэза. При в/б и в/в способах введения КМГ и ХитоКМГ вызывали сходные изменения в картине периферической крови: увеличивали общее количество лейкоцитов (в основном нейтрофилов) и повышали количество моноцитов, при в/в введении гликанов, вышеописанные изменения более выражены. Достоверных отличий между группами животных, которым в/б вводили КМГ и ХитоКМГ не наблюдали, но при в/в способе введения гликанов влияние ХитоКМГ было более значительно, общее количество лейкоцитов увеличилось (в 2,1 и 2,5 раза соответственно), и количество моноцитов возросло (в 1,3 и 1,5 раза соответственно). 10 Изменения в картине периферической крови, полученные нами, согласовываются с данными литературы, где было показано, что -1,3-D гликаны, стимулируют макрофаги, которые выделяют интерлейкины -1, -6, колониестимулируещие факторы, регулирующие гранулоцитопоэз в костном мозге. Введение зимозана гранулоцитомонопоэз так, что растормаживало численность костномозговой грануломоноцитарных колониеобразующих единиц костного мозга у мышей через 2 суток после введения этого гликана возрастала в 2,2 раза. Нами показано, что повышение количества лейкоцитов в костном мозге при введение КМГ и ХитоКМГ было связано, преимущественно, с миелоидными элементами. Их количество было увеличено на протяжении всего периода наблюдения (1-14 сут). На 2-е сутки после введения КМГ абсолютное количество нейтрофильных лейкоцитов в костном мозге увеличивалось в 1,3 раза, а при введении ХитоКМГ – в 1,5 раза. Количество моноцитарных клеток в этот же период возросло в 2,1 и 2,5 раза соответственно. Возрос пул зрелых элементов (индекс созревания нейтрофилов снизился по сравнению с интактными), вероятно, ускорилось созревание клеток миелоидного ряда, и/или снизилась скорость выхода нейтрофильных лейкоцитов в периферическую кровь. (Табл. 1). 11 Таблица 1. Индекс животных во созревания нейтрофилов Миелокарио ующие нейтрофилы цитов * 10 6/б Контроль КМГ Лимфоциты Общее кол- Общее кол-во Пролиферир Моноциты Группы Эозинофилы Влияние КМГ и ХитоКМГ (25 мг/кг, в/в) на клеточный состав костного мозга бедренной кости мышей CBA/C57BL 21,8±1,29 8,22±0,56 2,73±0,3 3,01±0,28 1,25±0,07 0,51±0,01 2,01±0,12 2 42,12±3,24* 10,92±0,47 4,79±0,06* 2,24±0,12 1,2±0,09 1,1±0,04* 2,4±0,39 7 38,52±1,61* 10,75±0,29 4,56±0,42* 2,39±0,24 1,08±0,01 1,08±0,09* 2,2±0,21 44,5±3,14* 12,73±0,98* 5,56±0,21* 2,09±0,51 1,28±0,03 1,28±0,12* 2,9±0,39 38,82±2,41* 12,57±0,74* 5,68±0,39* 2,21±0,17 1,09±0,05 1,09±0,08* 2,7±0,26 сут. КМГ сут. ХитоКМГ 2 сут. ХитоКМГ 7сут. *P < 0,01 по сравнению с контролем. Число животных в контрольной группе – 10, в опытных – 8 - 10 12 Метод внутривенного введения чужеродных частиц – коллоидных частиц угля, латекса, меченные эритроциты и др. является одним из распространенных способов для оценки поглотительной способности СМФ и прежде всего, макрофагов печени). Стимуляция гликанами in vivo, приводила к увеличению клиренса углерода, что отражало усиление фагоцитарной активности макрофагов. Нами показано, что при в/б введении мышам КМГ в дозе 25 мг/кг массы поглотительная активность клеток печени повышена в 1,6 раза на 4 сут по сравнению с контрольной группой животных. Введение КМГ в/в в той же дозе вызывало более ранний и выраженный эффект на 1 сутки (в 1,8 раза по сравнению с в/б введением). ХитоКМГ (25 мг/кг) при в/б введении увеличивал клиренс углерода в 1,7 раза на 4 сутки по сравнением с контролем и при в/в введении оказывал более выраженную стимуляцию поглотительной способности клеток печени на 1 сутки (в 2 раза) по сравнению с контрольной группой животных. (Рис. 1). 13 Рисунок 1. Стимуляция макрофагов КМГ и ХитоКМГ (25 мг/кг) in vivo * 0,1 0,095 * 0,09 Индекс фагоцитоза, K 0,085 КМГ в/б * * 0,08 ХитоКМГ в/б КМГ в/в * * ХитоКМГ в/в 0,075 0,07 0,065 0,06 0,055 0,05 Контроль 1 сут 2 сут 4 сут 14 сут Клиренс углерода in vivo * P <0,05 по сравнению с контролем Число животных в каждой группе – 5 14 Таким образом, СМФ оказывают сходный эффект, -1,3-D гликаны стимулируют СМФ и активируя поглотительную способность макрофагов печени. Наиболее эффективым был в/в способ введения исследуемых соединений. Влияние однократного в/в введения мышам КМГ и ХитоКМГ и зимозана на ФНО-α . Обнаружено, что исследуемые гликаны увеличивали выработку ФНО-α , причем, при одинаковых дозах ХитоКМГ в 1,7 раза больше, чем КМГ . ХитоКМГ в дозе 25 мг/кг повышал уровень ФНО-α как и Зимозан в дозе 50 мг/кг. (Табл. 2). Таблица 2. Влияние КМГ, ХитоКМГ (25 мг/кг, в/в), зимозана (50 мг/кг, в/в) на ФНО- α сыворотки мышей CBA/C57BL Группы животных ФНО-α, пг/мл Контроль 333±50 КМГ 7сут, 25 мг/кг 831±42 * ХитоКМГ 7 сут, 25 мг/кг 1427±102 * § Зимозан 7 сут , 50 мг/кг 1560±160 * * -p<0,01- по сравнению с контролем §-p<0,05- по сравнению с серией КМГ -7 сут Число животных в каждой группе – 5 При морфометрическом электронномикроскопическом исследовании обнаружены признаки стимуляции макрофагов печени в сравнении с контрольными животными. Обнаружено, что оба исследуемые соединения проявляли сходный эффект, увеличивая численную плотность синусоидальных клеток печени (преимущественно макрофагов), увеличивая численную плотность вторичных лизосом (в последнем случае более выражен эффект у КМГ). (Табл. 3). 15 Таблица 3. Морфометрические показатели макрофагов печени при воздействии ХитоКМГ и КМГ Параметры Контроль КМГ-2 сут КМГ-7 сут ХитоКМГ-7 сут Численная пл-ть макрофагов (на 1 924.538.0 * *§ *# 1412.5±92.0 1782.8±57.3 1407.0±48.5 48.03±5.11 42.74±3.66 37.36±3.74 * * *# 1.05±0.14 1.19±0.08 2.34±0.41 * * # 19.51±2.72 16.43±1.66 7.05±1.45 * * *# 5.42±0.60 5.84±0.48 7.42±0.64 * * *# 9.73±1.13 7.18±0.74 3.52±0.70 мм2) S поперечного сечения цитоплазмы * 33.53.4 (мкм2) Относительный объем первичных 3.80.5 лизосом,% Относительный объем вторичных 6.11.3 лизосом,% Численная пл-сть первичных лизосом 18.80.7 (на 10 мкм2) Численная пл-сть вторичных лизосом 1.70.3 (на 10 мкм2) *-p<0,01 - по сравнению с контролем, § -p<0,05 - по сравнению с серией КМГ-2 сут, # - p<0,05 - по сравнению с серией КМГ-7сут 16 Свободная увеличена активность при карбоксиметилглюкана кислой воздействии (1 сут, 7 фосфатазы гомогената печени хитокарбоксиметилглюкана сут) в одинаковой степени, и что свидетельствует о лабилизации лизосом вследствие преобладания вторичных лизосом в популяции частиц. (Рис.2). 17 Рисунок 2. Свободная активность кислой фосфатазы в гомогенате печени мышей CBA/C57BL при введении КМГ и ХитоКМГ 240,00 Контроль * 220,00 1 сут 7 сут 200,00 % от контроля (100 %) 180,00 160,00 * * * 140,00 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 КМГ ХитоКМГ * P < 0,05 по сравнению с контролем Число животных в каждой группе – 10 Свободная активность кислой фосфатазы выражена в процентах от общей активности 18 Синтез и секреция макрофагами фермента хитотриозидазы является одним из показателей биологической активности макрофагов. Нами показано, что активность хитотриозидазы сыворотки крови повышена при воздействии обоих исследуемых соединений. (Табл. 4). Таблица 4. Активность хитотриозидазы сыворотки крови мышей при введении КМГ и ХитоКМГ. Группы животных Активность, нмоль/мл в час Контроль 386,9±30,4 КМГ, 2 сут 738,7±67,7 * КМГ, 7 сут 833,5±103,6 * ХитоКМГ, 2 сут 479,0±30,7 * ХитоКМГ, 7 сут 588,4±78,0 * * -p < 0,01-по сравнению с контролем Число животных в группе 8-10 Полученные нами данные свидетельствуют о способности КМГ и ХитоКМГ стимулировать макрофаги печени, при этом измерение активности хитотриозидазы отражает стимуляцию макрофагов. Можно заключить, что оба препарата проявляют сходную биологическую активность, стимулируя макрофаги in vivo, и являются перспективными для разработки основ применения в клинической медицине. 19 В настоящее время ХГ широко используется в качестве модели селективной депрессии макрофагов печени. При внутривенном введении препарат селективно элиминирует субпопуляцию больших купферовских клеток, cнижает продукцию ТНФ- и ИЛ1, увеличивает синтез ИЛ-6. ХГ ингибирует опосредованный эндоцитоз и фагоцитоз рецепторно- частиц углерода в макрофагах печени. Вероятно, накопление ХГ внутри лизосом происходит подобно другим лизосомотропным соедине ниям и вызывает лабилизацию частиц в результате внутрилизосомного накопления препарата. Недостаточно изученными остаются последствия накопления ХГ (после 24-48 ч) и не известно – в какой степени связи с изменения лизосом связаны с накоплением ХГ. В широким использованием ХГ в экспериментальной медицине (как селективного депрессора ма крофагов печени) и клинической медицине последние годы (и спользование гадолинийсодержащих соединений при магнитно -ядерном резонансе) изучение клеточных механизмов действия Х Г и его последствий накопления являются важными. В настоящей работе изучали динамику накопления ХГ в печени и его влияние на стабильность и повреждаемость лизосом (свободная активность кислой фосфатазы, при обработке в гипотонической среде), активность -N–ацетилгексозаминидазы (удельная активность фермента в макрофагах печ ени более значительна по сравнению с гепатоцитами) и -D–глюкуронидазы (легкосолюбилизируемый сыворотке препарата. крови мышей Исследовали фермент на лизосом разных активность клеток сроках -D после – печени) в введения галактозидазы сыворотки крови как наиболее ранний и чувс твительный (по 20 сравнению с повреждения определением клеток печени. активности АЛТ) Подавление пок азатель функци ональной активности Купферовских клеток п ечени оценивали также по изменению активности в сыворотке крови нового фермента макрофагов – хитотриозидазы. При определении захвата хлористого гад олиния клетками печени и концентрации в них препарата максимальные значения наблюдались через 60 минут после внутривенного введения ХГ, в течение суток эти показатели оставались на высоком уровне. Затем наблюдается постепенное снижение процента захвата ХГ клетками постепенно печени и соответственно концентрация гадолиния снижается (Рис.3). Это свидетельствует о быстром накоплении основной массы гадолиния в ткани печени, в дальнейшем оставшаяся часть ХГ поглощается, видимо, новыми макрофагами и медленно выводится (до 37 сут). 21 Рисунок 3. Захват гадолиния клетками печени после однократного введения хлористого гадолиния (7,5 мг/кг массы) мышам CBA/C57BL. * 90 80 % захвата Gd (M±m) 70 60 50 40 30 20 10 0 5 мин 15 мин 30 мин 60 мин 1 сут 5 сут 7 сут 14 сут 30 cут 37 cут По оси абсцисс – время после введения м ышам хлористого гадолиния; по оси ординат – захват печенью гадолиния (в процентах от введенной дозы). У интактных животных (число мышей 20) – гадолиний в ткани печени не обнаружен. Число животных в каждой груп пе с введением препарата – 10. * р < 0,001 по сравнению с данными, полученн ыми через 5 мин после введения хлор истого гадолиния. 22 Согласно исследования данным введение электронномикроскопического мышам ХГ значительно снижает численную плотность и размеры макрофагов печени. Так, если в контроле наиболее характерны клетки Купфера, имеющие площадь поперечного сечения от 10 до 40 мкм 2 , то на вторые сутки после введения ХГ размеры клеток не превышали 20 -30 мкм 2 . В большинстве своем относительно ровную несколько большей, макрофаги имели поверхность. чем обычно, Их овальную форму цитоплазма электронной и обладала плотностью. Относительные объемы первичных и вторичных лизосом оказались сниженными по сравнению с контролем. (Табл. 5). 23 Таблица 5. Морфометрические показатели макрофагов печени мышей при воздействии хлористого гадолиния Контроль (n=10) Показатель ХГ, 1 сут после введения (n=10) Численная плотность 1053,060,50 788,069,10 макрофагов (на 1 мм 2) Площадь поперечного 31,702,93 сечения цитоплазмы 19,52,50 (мкм2) Относительный объем 4,300,44 3,60,39 объем 4,000,37 2,70,22 митохондрий (%) Относительный первичных лизосом (%) Относительный объем 7,601,08 1,70,64 вторичных лизосом (%) - P0,01- по сравнению с контролем - P0,001- по сравнению с контролем 24 Общее количество лейкоцитов после введения хлористого гадолиния мышам не изменено. Начиная с 7 по 37 сутки изменился клеточный состав периферической крови, число ПМЯ увеличилось в 2 раза, уменьшилось число лимфоцитов в 2 раза, увеличилось в 2-3 раза число моноцитов. Наблюдаемые нейтрофильный лейкоцитоз и лимфопения, моноцитоз возможно являются признаками хронической инфекции. Увеличение в 2,5 раза количества моноцитов по сравнению с группой интактных животных, начиная с 7 и по 37 сутки, видимо отражает дефицит тормозных факторов моноцитопоэза, на фоне селективной элиминации МФ печени. Свободная активность кислой фосфатазы в гомогенате печени увеличена при внутривенном введении ХГ: 2-3 сутки – в 1,5 раза, на 5-19 сутки – в 2 раза; отмечено увеличение свободной активности кислой фосфатазы при обработке гомогената в гипотонической среде, что особенно выражено на 5-8 сутки после введения ХГ (Рис.4). Увеличение этих показателей указывает на развитие вторичных изменений мембран лизосом при перегрузке частиц хлористым гадолинием. 25 Рисунок 4. Стабильность и повреждаемость лизосом печени в гипотонической среде при введении мышам хлористого гадолиния (по освобождению кислой фосфатазы) 90 ** Свободная активность КФ, % 80 70 ** 60 * * 50 40 * 30 * * 20 10 19 сутки 8 сутки 5 сутки 4 сутки 3 сутки 2 сутки Интактные 0 Сутки после введения ХГ По оси абсцисс – сроки после введения хлористого гадолиния (сутки); по оси ординат – свободная активность кислой фосфатазы, в процентах от общей активности фермента. Светлые столбики – свободная активность кислой фосфатазы, темные столбики – тот же показатель после обработки гомогената в гипотонической среде (0 С, 0,15 М сахароза, 30 мин). Число животных в группах – 7 –10. * р < 0,05, ** р < 0,001 по сравнению с интактными 26 В более отдаленные сроки активность -D-глюкуронидазы сыворотки увеличена через трое суток в 2 раза в сравнении с интактными животными. Сходные изменения обнаружены при изучении активности -D-галактозидазы сыворотки – показатель также увеличен в 2 раза через 3 сут после введения ХГ; аналогичное повышение сохранялась на таком уровне до конца срока наблюдения (19 сутки). Увеличение активности этих двух ферментов на третьи и последующие сутки наблюдения связано, видимо, с внедрением нового пула макрофагов после депрессии (24-48 ч) и элиминации перегруженных клеток. Следует заметить, что активность -D- галактозидазы считается более чувствительным показателем повреждения клеток печени при ишемии, чем активность трансаминаз (Kono H. et al , 2002). Наблюдалась тенденция к снижению активности макрофагального маркера N – ацетил - -D– гексозаминидазы уже через 24 часа после введения ХГ, что отража ет депрессию макрофагов, вызванную введением ХГ (Рис.5). 27 Рисунок 5 Активность -D-глюкуронидазы, -Dгалактозидазы, N – ацетил - -D– гексозаминидазы в сыворотке крови мышей после введения хлористого гадолиния в дозе 7,5 мг/кг. Активность ферментов лизосом в % от контроля 300 250 * * 200 2 * * * 150 1 100 3 50 0 1 сутки 2 сутки 3 сутки 5 сутки 7 сутки 19 сутки Сутки после введения GdCl 3 Результаты выражены в процентах от контроля (100 %). Число интактных мышей – 14., в остальных группах число животных – 7. Условные обозначения: 1- -D-глюкуронидаза, 2 - -Dгалактозидаза, 3 - N – ацетил - -D– гексозаминидаза. * р < 0,05, ** р < 0,001 по сравнению с и нтактными. 28 В последнее время отмечен значительный интерес к недавно открытому ферменту лизосом макрофагов – хитотриозидазе, который является маркером активности макрофагов. Ранее нами показано увеличение активности этого фермента при стимуляции макрофагов печени зимозаном. В данной работе определяли активность хитотриозидазы при депрессии купферовских клеток печени, вызванной введением ХГ. Активность хитотриозидазы снижена в четыре раза через 2 сут в сравнении с интактной группой. В последующие сроки наблюдения (4-37 сут) изменения активность хитотриозидазы сыворотки крови не отмечено. (Табл.6). Это свидетельствует о депрессии макрофагов печени в раннем периоде воздействия ХГ (24-48ч, судя по клиренсу углерода), что согласуется и с данными электронно-микроскопического исследования. 29 Таблица 6. Активность хитотриозидазы в сыворотке крови мышей после введения хлористого гадолиния в дозе 7,5 мг/кг. Группы животных Активность фермента нмоль MUF/мл в час Контроль 282,9±23,72 ХГ 2 сут 61,6±19,47 ХГ 4 сут 290,8±23,72 ХГ 5 сут 260,7±17,66 ХГ 7 сут 217,5±23,42 ХГ 19 сут 304,0±26,86 ХГ 30 сут 257,5±28,94 * р < 0,001- по сравнению с интактными. Число животных в группе 8-10 30 Предварительное введение β-1,3-гликанов (за 24 ч) мышам ускоряло процесс захвата гадолиния клетками печени, увеличивая концентрацию гадолиния в ткани печени, как абсолютную (рассчитанную в микрограммах гадолиния на грамм ткани печени), так и относительную (захват хлористого гадолиния, рассчитанный в проценте от введенной дозы этого соединения). Наиболее значительны различия в захвате гадолиния печенью спустя 30 и 60 мин после введения мышам ХГ, через 24 ч изменения не наблюдали (Рис.6). 31 Рисунок 6 Влияние введения зимозана (50 мг/кг, в/б) и ХитоКМГ (25 мг/кг, в/б) на захват гадолиния клетками печени (в процентах от введенной дозы) 100 90 ** * * % захвата гадолиния 80 70 ││ ││ ││ 60 Гадолиний ХитоКМГ, 1 сут + Гадолиний Зимозан, 1 сут + Гадолиний 50 40 30 20 10 0 0 минут ││ 5 минут 30 минут 60 минут 24 часа Время после введения хлористого гадолиния * р < 0,05, ** р < 0,001 по сравнению с и нтактными 32 Таким образом, предварительное введение мышам как КМГ, так и Хито-КМГ существенно предотвращает депрессию макрофагов печени при воздействии хлористого гадолиния. Механизм защиты в значительной степени связан с тем, что увеличение числа и функциональной активности макрофагов печени при предварительном введении мышам КМГ и ХитоКМГ происходят до депрессивного воздействия ХГ, так что число макрофагов печени существенно не снижается (вероятно, как и их эндоцитозная активность). Остается невыясненым, какая популяция макрофагов печени подвергается элиминации при воздействии ХГ на стимулированные полисахаридами макрофаги. Известно, что биологический эффект водонерастворимых β-1,3-гликанов, одних из основных компонентов зимозана, осуществляется за счет взаимодействия их с β-гликановыми рецепторами макрофагов; недавно обнаружены новые типы рецепторов – дектиновые, которые важны в проявлении биологического действия этих полисахаридов. При карбоксиметилирования химической получают модификации водорастворимые или путем частично водорастворимые β-1,3-гликаны, которые взаимодействуют с указанными выше рецепторами, а также, возможно со скавенджер-рецепторами макрофагов. Действие водорастворимых β-1,3-гликанов (перспективных для клинической медицины) как стимуляторов макрофагов отличается от водонерастворимых β-1,3-гликанов с той же структурой и молекулярной массой. Существенное отличие состоит в том, что введение водорастворимых β-1,3-гликанов не вызывает образования гранулем в печени, наблюдаемых 33 при воздействии зимозана и водонерастворимых (нежелательные побочный эффект). Согласно полученным работе данным водорастворимые КМГ и β-1,3-гликанов в настоящей Хито-КМГ способны предотвращать депрессию макрофагов печени и, следовательно, могут быть использованы при и при других состояниях как стимуляторы макрофагов. Защитное действие β-1,3-гликанов не отмечено нами в экспериментах, если использовали последующее (после хлористого гадолиния) введение мышам КМГ и ХитоКМГ. Очевидно, репопуляция макрофагов печени при воздействии β-1,3-гликанов при депрессии макрофагов печени имеет особенности, которые требуют дальнейшего исследования. Показано восстановление сниженной активности хитотриозидазы при терапии β-1,3-гликанами депрессии макрофагов печени. (Табл. 7). 34 Таблица 7. Влияние предварительного введения КМГ на активность хитотриозидазы в сыворотке крови мышей с селективной депрессией макрофагов печени Группы животных Активность хитотриозидазы, нмоль/мл в час Контроль (интактные) 282,9 ± 23,72 ХГ, 2 сут 121,5 ± 12,20* КМГ, 1 сут.+ХГ 2 сут 384,7±18,42 * КМГ, 1 сут.+ХГ 7 сут 296,0±28,86 * р < 0,05 в сравнении с контролем Число животных в контрольной группе – 15, в опытных – 8 – 10. Данные, полученные в настоящей работе, поддерживают гипотезу о важности макрофагов в развитии повреждения печени и проявлении токсичности различных гепатотропных соединений. Они свидетельствуют о том, что модель селективной депрессии макрофагов печени, вызываемая с помощью ХГ, может быть использована для оценки эффективности ряда стимуляторов макрофагов, особенно новых модификаторов биологического ответа полисахаридной природы, предлагаемых в настоящее время. 35 Выводы 1.Водорастворимые карбоксиметилированный -1,3–D-гликан хитокарбоксиметилгликан (25 мг/кг) проявляли сходную и биологическую активность, как стимуляторы макрофагов: а) повышают клиренс частиц углерода in vivo; б) увеличивают число моноцитов периферической крови и миелоидных элементов в костном мозге мышей, что указывает на преимущественную стимуляцию миелоидного ростка. 2. Внутривенный способ введения исследуемых гликанов более эффективен, чем внутрибрюшинный. При наличии сходных свойств более выраженные признаки стимуляции макрофагов отмечены при использовании хитокарбоксиметилгликана по сравнению с - 1,3 – D –гликаном. 3.Введение - 1,3 – D –гликанов проводит увеличению числа макрофагов печени и численной плотности вторичных лизосом, по данным электронномикроскопического исследования. 4. Биохимически стимуляция макрофагов гликанами характеризовалось: а) увеличинием выработки ФНО-α перитонеальными макрофагами; б) повышением свободной активности кислой фосфатазы в гомогенатах печени (лабилизация мембран лизосом); в) повышала активность хитотриозидазы сыворотки крови. 6. На модели депрессии макрофагов показано, что максимальное накопление гадолиния происходит через 1ч и сохраняется 1 сутки с последующем выведением соединения через 37 суток, что указывает на лизосомотропные свойства гадолиния. При накоплении гадолиния в лизосомах отмечена лабилизация лизосом клеток печени и повышенная секреция ферментов лизосом в кровь. 7. Предварительное введение - 1,3 – D – гликанов (за 24 часа) мышам ускоряло процесс захвата гадолиния клетками печени, увеличивая концентрацию гадолиния в ткани печени. 36 Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Дергунова М.А., Жанаева С.Я., Фаламеева О.В., Филюшина Е.Е., Бузуева И.И., Филатова Т.Г., Короленко Т.А., Шандула Д. Стимуляция макрофагов новым химически модифицированным полисахаридом хитокарбоксиметилгликаном. //Бюллетень СО РАМН. – 1999. - №3-4 (93-94). – С.87-90. 2. Дергунова полисахарида М.А. Исследование химически хитокарбоксиметилгликана макрофагов. //Мат. как модифицированного нового стимулятора Молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины». Новосибирск, 2000. – С.11-12. 3. Дергунова М.А., Филюшина Е.Е., Бузуева И.И., Макарова О.П. Сравнительное исследование действия хитокарбоксиметилгликана и карбоксиметилгликана на лизосомы макрофагов печени мышей. //Тез. Докл. Рабочего совещания «Лизосомные болезни, модели, терапии» (с международным участием). – Новосибирск, 2000. – С.29. 4. Дергунова М.А., Филатова Т.Г., Свечникова И.Г. Нейтропения, вызванная циклофосфаном у мышей, и защитное действие предварительного введения стимулятора макрофагов хитокарбоксиметилгликана. //Тез. Докл. Рабочего совещания «Лизосомные болезни, модели, терапии» (с международным участием). – Новосибирск, 2000. – С.31. 5. Дергунова М.А., Филюшина Е.Е., Бузуева И.И., Филатова Т.Г., Короленко Т.А., Макарова О.П., Шандула модифицированного полисахарида Д.. Исследование химически хитокарбоксиметилгликана как нового стимулятора макрофагов. //Бюллетень СО РАМН. – 2000. - №3-4(97-98). – С.58-61. 6. Дергунова М.А., Жанаева С.Я., Филюшина Е.Е., Филатова Т.Г. Биологические свойства нового иммуномодулятора хитокарбоксиметилгликана. // Тез. Докл.. V Сибирского физиологического 37 съезда. Бюллетень Сибирской медицины. – 2005. – том 4, Приложение 1. – С.96. 7. Дергунова М.А., Филюшина Е.Е., Филатова Т.Г., Короленко Т.А. Иммуномодулирующая активность нового химически модифицированного полисахарида хитокарбоксиметилгликана. //Тез. Докл. Всероссийской Научно-практ. Конференции «Дни иммунологии в Сибири». – Красноярск, 2005.- С.128-129. 8. Дергунова М.А., Короленко Т.А., Филюшина Е.Е. Новые подходы по предупреждению селективной депрессии макрофагов печени и нарушений лизосом с помощью гликанов // Тез. докл. I съезда терапевтов Сибири и Дальнего Востока. Бюллетень Сибирской медицины. – 2005. – том 4, Приложение 1. – С. 96. 9. Дергунова М.А., Жанаева С.Я., Филюшина Е.Е., Бузуева И.И., О.П. Колeсникова О.П., Коган Г., Короленко Т.А.. Характеристика новых химически модифицированных β-1,3-D-гликанов как стимуляторов макрофагов. //Бюллетень СО РАМН. – 2006. - №1 (119). – С.77-81. 10. Жанаева С.Я., Короленко Т.А., Никитенко Е.В., Алексеенко Т.В., Дергунова М.А., Ильницкая С.И., Каледин В.И., Плотникова Г.И., Петрова Е.А. Влияние депрессии макрофагов печени на развитие внутрипечночных метастазов опухоли НА-1 у мышей //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2004. – Том. 137, №4. – С. 660-663. 11. Короленко Т.А., Дергунова М.А., Алеексеенко Т.В., Жанаева С.Я., Филюшина Е.Е., Филатова Т.Г.. Внутрилизосомное накопление гадолиния и повреждение лизосом при селективной депрессии макрофагов печени in vivo. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2006. – Том. 142, №10. – С.369-373. 12. Korolenko T.A., Dergunova M.A., Filatova T.G., Djanayeva S. Ya., Kaledin V.I., Shandula J. Chemically modified glucans as macrophage stimulators and antitumor effect. //Abstract. 9 Bratislava Symposium on Saccharides. - 2000. – P.60. 38 13. Korolenko T.A., Djanayeva S. Ya., Filjushina E.E., Buzueva I.I., Dergunova M.A., Mikhajlova T., Korolenko Ts. P., Plotnicova G.I., Petrova E.A. Macrophage depletion by gadolinium chloride as a new approach for treatment of experimental lysosomal storage syndrome. // Microscopical Society of Canada. – 2003. - Vol.30. – P.58-59. 14. Korolenko T.A., Filjushina E.E., Levina O.A., Falameeva O.V., Djanayeva S. Ya., Dergunova M.A., Paul G., Plotnicova G.I., Petrova E.A. Overloaded macrophage depletion by gadolinium chloride as a new approach for treatment of experimental lysosomal storage syndrome. //Abstract. 13 Europen Study Group on lysosomal diseases ESGLD Workshop. - 2001. – P.110. 15. Korolenko T.A., Levina O.A., Falameeva O.V., Djanayeva S. Ja., Filjushina E.E., Dergunova M.A. The role of macrophage stimulation and depression in inflammation models. //Abstract. Clinical Microbiology and Infection. – 2001. – Vol. 7, supplement 1. – P.394. 16. Korolenko T.A., Zhanaeva S.Ya., Alexeenko T.A., Dergunova M.A., Filjushina E.E., Buzueva I.I. Cosequencesal accumulation of gadolinium chloride in liver macrophage and effect during lysosomal storage in mice. //Abstract. 14 Europen Study Group on lysosomal diseases ESGLD Workshop. - 2003. – P.53. 39 40
