ИЗГОТОВЛЕНИЕ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ НАНОКОНТЕЙНЕРОВ КАК ТРАНСПОРТЕРОВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ Кремнева Г.М., Романова Л.В., Литвиненко И.Л., Оверченко В.В., Килинкарова Н.Н. ГБОУ ВПО Ставропольская государственная медицинская академия e-mail: [email protected] АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Эффективность использования лекарственных препаратов в ряде случаев оказывается невысокой из-за их токсичности, кратковременного пребывания в организме вследствие быстрой утилизации, выведения [2]. Эти недостатки можно устранить, используя липосомальные формы лекарственных препаратов. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Изготовить липосомальные лекарственные препараты для коррекции нарушенного гомеостаза. МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ, ОБСУЖДЕНИЕ. Некоторые фосфолипиды способны формировать в водной среде при определенных условиях липосомы, которые представляют собой бислойную жидкокристаллическую липидную мембрану, снаружи и в полости которой находится водная фаза. Существуют разнообразные методы, позволяющие получать липосомы различного размера, состава, структуры и процентного содержания включенных в них лекарственных препаратов. Наиболее часто используемые из них следующие: ТАБЛИЦА 1 № п/п Размер липосомальной везикулы в мкм 0,1÷0,085 Наименование метода 1 Инжекционный метод 2 Метод «выпаривания в обращенной Процент иммобилизации вещества До 2,5 0,1÷1,2 67 – 78 1÷50 До 98,8 фазе» 3 Метод «замораживания-оттаивания» Моноламеллярные липосомы различных размеров могут образовываться при впрыскивании (инжекции) в водную фазу растворенных в некоторых органических растворителях фосфолипидов. В качестве органических растворителей для этих целей используют вещества, которые имеют невысокую температуру кипения. Это позволяет их легко удалять из реакционной смеси под вакуумом или при незначительном нагревании. К ним относятся этанол, метанол, диэтиловый, петролейный, этилметиловый эфиры, дихлорфторметан, а также различные фреоны. Для осуществления этого метода яичный лецитин (фосфатидилхолин) или смесь липидов в количестве 50 мг растворяют в 1,0 мл 96% этанола, который набирают в шприц с иглой 0,4×30,0 мм и быстро впрыскивают в 15 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,5, в котором предварительно растворяют включаемый в липосомы материал. Полноценное образование бислойных везикул происходит при температуре водной фазы выше температуры фазового перехода фосфолипидов с постоянным перемешиванием на магнитной мешалке. При этом игла шприца должна быть максимально погружена в водную фазу. Образующиеся при этом моноламеллярные липосомы включают во внутренний объем около 2,5% растворенного в водной фазе материала, имея средний диаметр везикул 0,07 мкм. Размер формирующихся липосом зависит от концентрации фосфолипида и спирта [7]. Метод получения моноламеллярных липосом путем «выпаривания и обращения фаз» близок методу инжекции фосфолипидов в водную фазу. Примером конкретного осуществления может служить следующий способ. 30 мг фосфолипидов растворяют в 3 мл эфира или хлороформа, или в смеси эфира с хлороформом в соотношении 2:1 и вносят в круглодонную колбу роторного испарителя объемом 100 см3. Включаемый материал растворяют в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,5, добавляют к раствору фосфолипидов в органической фазе и обрабатывают ультразвуком 20 кГц, мощностью 200 Вт в течение нескольких минут. Таким образом, достигают образование эмульсии типа «вода в масле». Колбу с эмульсией присоединяют к роторному испарителю и при её вращении постепенно понижают давление в ней так, чтобы не происходило кипения органического растворителя. Об окончании выпаривания судят по образованию геля в колбе и исчезновению запаха органического растворителя. В процессе выпаривания поддерживают температуру смеси выше температуры фазового перехода фосфолипидов. Колбу снимают с испарителя и к образовавшемуся гелю добавляют 5 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,5 и встряхивают до образования гомогенной структуры липосом. Этим методом в липосомы удается иммобилизовать от 67 до 78% гидрофильных лекарственных препаратов [5]. В результате многократно повторяющихся циклов замораживания фосфолипидных дисперсий с последующим оттаиванием образуются липосомы с высоким процентным включением иммобилизируемых веществ. При этом происходит слияние липосом и увеличение их размеров [8]. К липидной пленке, которая состоит из фосфатидилхолина и холестерина (3:1), добавляют иммобилизируемое вещество в 0,14 М растворе маннита из расчета на 1 мл на 100 мг липидов. Смесь встряхивают и при охлаждении подвергают ультразвуковой обработке в течение 3 минут с частотой 22 кГц. Полученные липосомы быстро замораживают в жидком азоте, после чего оттаивают, погружая емкость с препаратом в воду комнатной температуры. Эту процедуру повторяют 6 раз. К размороженной готовой смеси добавляют 4х-кратный объем 0,14 М раствор хлорида натрия, в котором суспендируют полученные большие моноламеллярные липосомы. В некоторых случаях применяют предварительный метод получения липосом путем механического встряхивания водного раствора включаемого вещества в колбе, на стенках которой липиды находятся в виде тонкой пленки. Затем эту суспензию многократно замораживают в жидком азоте и оттаивают в горячей воде. В результате этого процесса формируются стабильные липосомы с иммобилизованным включаемым веществом [4;6]. Метод «замораживания – оттаивания» нашел широкое использование при получении различных липосомальных препаратов, благодаря простоте осуществления, максимально исключающий возможности нарушения стерильности препаратов, и способности формировать бислойные липидные везикулы с высокой степенью включаемости в них нативных иммобилизуемых веществ [3]. ВЫВОДЫ: Методы изготовления липосомальных наноконтейнеров свидетельствуют о реальности эффективного использования липосомальных препаратов для перорального введения. В настоящее время липосомальные препараты дошли до клинических испытаний и некоторые из них лицензированы [1;2]. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ. 1. Гуляев А.Е. Наночастицы как вектор направленного транспорта антибиотиков/ А. Е. Гуляев, Б. А.Ермекбаева, Г. Я.Кивман// Хим.-фармацевт. журн.- 1998.- №3.- С. 3-6. 2. Дудниченко, А.С. Липосомальные лекарственные препараты в эксперименте и клиники/ А. С. Дудниченко, Ю.М.Краснопольский, В.И. Швец.- Харьков., 2002. – 246с. 3. Ефременко, В. И. Иммобилизация в липосомы веществ различной химической природы. Стерилизация и стабилизация липосом/ В. И. Ефременко, Т. В.Таран, Л. М. Кузякова. – Ставрополь,2000.- 46с. 4. Каледин, В. И. Противоопухолевая эффективность свободного и заключенного в липосомы плаксанта у мышей линии А/Не с метастазами опухолей ГА-1 в печени/ В. И. Каледин, Н. А.Попова, А. И.Стеценко// Эксперим. онкология.- 1993.- №5.- С. 75-77. 5. Ротов, К.А. Получение и характеристика липосом, содержащих антибиотики/ К. А. Ротов, В.П. Васильев, Ю.В. Антонов // Микробиол. журн. – 1989. –№6. – С. 79-83. 6. Liposom Technology/ Ed. G. Gregoriadis.-New York,1986.- Vol.1.- 268p. 7. Nordilung, I. R. Transbilayer distribution of phosphatidylethanolamine in large and small unilamellar vesicles/ I. R. Nordilung, C. F. Schmidt, S. N.Dicken// Biochemistry.- 1981.-Vol. 20.- P. 3237-3241. 8. Pick, V. Liposomes with a large trapping capability prepared by freezing/V. Pick// Arch, Biochem. and Biophys.- 1981.-Vol. 212.- P. 186-194.