Начало формы М.К. ГИЛЬМАНОВ МЕХАНИЗМЫ И МЕДИАТОРЫ
advertisement
М.К. ГИЛЬМАНОВ МЕХАНИЗМЫ И МЕДИАТОРЫ СИГНАЛЬНОЙ ТРАНСДУКЦИИ ЦИТОКИНИНОВ В РАСТЕНИЯХ (Институт молекулярной биологии и биохимии имени М.А.Айтхожина МОиН РК) Впервые был изучен механизм сигнальной трансдукции цитокининов. На основании собственных экспериментальных данных представляем основные звенья сигнальной трансдукции цитокинина. Цитокинин, воздействуя на орган, вызывает появление в нем медиатора по природе родственного фузикококцину. Медиатор, связываясь с внешними фузикокциновыми рецепторами вызывает повышение уровня цитозольного кальция. Повышение уровня цитозольного кальция приводит к активации протеинкиназы С. В свою очередь протеинкиназа С фосфорилирует НАДФ-ГДГ Изучение механизмов сигнальной трансдукции стало одной из горячих точек современной биологии. Ключевые свойства сигнальной трансдукции: специфичность и чувствительность, причем последняя повышается путем амплификации /1/. На наш взгляд также наиболее отличительными чертами сигнальной трансдукции являются иерархия сигналов, (сигнал высшего порядка вызывает появление сигнала низшего порядка, тогда как сигнал низшего порядка никогда не может вызвать сигнал высшего порядка); пространственная и временная разобщенность сигналов, которая приводит к эстафетному типу передачи сигналов, причем при каждой передаче эстафеты происходит смена шифра (пароля) сигнала, так что первый сигнал может включить только одно звено и не может включить ни одной из других последующих звеньев. Изучение путей сигнальной трансдукции облегчается некоторыми знаниями о специфичности сигналов, биохимической природе рецептора и специфичности ответов. Известно, что гормоны контролируют различные физиологические процессы в растениях. Механизмы, с помощью которых растительные клетки воспринимают и переносят гормональные сигналы, недостаточно изучены. Нами был вскрыт механизм сигнальной трансдукции цитокининов, одного из основных гормонов растительной клетки, на примере активации важного анаболического фермента НАДФ - специфичной глютаматдегидрогеназы (НАДФ-ГДГ). МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования служили 4-дневные проросшие зерна мягкой пшеницы сорта Саратовская-29. Зерно проращивали в стерильных условиях, в темноте при 250С. После проращивания у проросшего зерна отрезали зародышевую часть, не содержащую НАДФ-ГДГ, и беззародышевые половинки растирали на холоду в фарфоровой ступке в 0,05 М трисфосфатном буфере рН 7,8, взятого в четырехкратном объеме (мл) по отношению к навеске зерна (г). Гомогенат центрифугировали при 10000 x g в течение 10 мин. Полученный бесклеточный экстракт использовали для дальнейшей работы. Гистохимическое проявление зон НАДФ-ГДГ после электрофореза проводили в проявляющей смеси, концентрации ингредиентов которой были подобраны опытным путем. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Нами впервые обнаружено появление НАДФ-ГДГ в алейроновом слое пшеницы. Было установлено, что наиболее интенсивно зоны НАДФ-ГДГ проявляется на четвертый день прорастания. Была проведена очистка этого фермента методами ионообменной и аффинной хроматографии /2/. Очищенный фермент не содержал примесей НАД глютаматдегидрогеназы (НАД-ГДГ). Была определена константа Михаэлиса для хлористого аммония, оказавшаяся равной 5,0х104 М, что почти на два порядка меньше, чем таковая у НАД-ГДГ, выделенной нами ранее из этого же объекта, которая была равна 2,1х 10-2 М /3/. НАДФ-ГДГ из зерна пшеницы имеет довольно высокое сродство к аммонию. Поэтому со всей определенностью можно говорить о важной роли этого фермента в процессах ассимиляции минерального азота. Так как в процессах прорастания исключительно важную роль играют фитогормоны, явилось интересным изучить влияние фитогормонов на появление НАДФ-ГДГ. Для исследования индуцирующего влияния экзогенных фитогормонов на появление НАДФ-ГДГ зерно проращивали в стерильных условиях, при 25оС на средах, содержащих по 1 мМ фитогормонов - 6-бензиламинопурина, (6-БАП), кинетина, индолилуксусной кислоты (ИУК) и гибберелловой кислоты (ГК). Все растворы фитогормонов готовили на среде, содержащей 10 мМ KCL, 1 мМ CaCL2 в дистиллированной воде. После проращивания в течение определенного времени от 1 до 4 суток у прорастающих семян удаляли зародышевую часть. Навески беззародышевых половинок массой 5 г растирали в фарфоровой ступке в 25 мл 50 мМ трис-HCL буфере, рН 7,8 при 40. Гомогенат центрифугировали при 10000 х g в течение 10 минут. Бесклеточные экстракты каждого варианта подвергали диск-электрофорезу в столбиках 6% полиакриламидного геля, с последующим гистохимическим проявлением зон глютаматдегидрогеназ. Проращивание зерна пшеницы на средах, содержащих различные фитогормоны, показало, что под действием 6-БАП происходит активация НАДФ-ГДГ в течение 24-28 часов. В варианте с кинетином эта форма фермента обнаруживается через 4852 часа проращивания зерна. Во всех образцах, где проращивание семян вели с ГК, ИУК и контроле без фитогормонов, НАДФ-ГДГ обнаруживается только через 4-5 суток. Действие 6БАП на активацию НАДФ-ГДГ в прорастающем зерне обнаруживается в диапазоне концентраций этого вещества от 10 мкМ до 10 мМ /4/. Таким образом, добавление в среду проращивания зерна пшеницы синтетического аналога цитокинина 6-БАП в 4-5 раз ускоряет появление НАДФ-ГДГ. Можно предположить, что в прорастающем зерне пшеницы цитокинины активируют НАДФ-ГДГ. Перед нами встала задача - выяснить возможные механизмы активации НАДФ - глютаматдегидрогеназы цитокининами. Для решения этого вопроса мы использовали схему сигнальной трансдукции гормонов с участием инозитидов /6/. Необходимо было определить основные этапы сигнальной трансдукции действия цитокининов приводящих к активации НАДФ-ГДГ. С этой целью мы изучили отдельно каждый этап сигнальной трансдукции цитокининов. Первым вопросом явилось, может ли 6-БАП вызывать активацию НАДФ-ГДГ непосредственно в беззародышевой части зерна? С этой целью у покоящихся семян отделяли зародышевую часть и беззародышевые половинки зерна инкубировали на средах содержащих по 50 мкМ каждого фитогормона. После инкубации в течение 24 часов беззародышевые половинки гомогенизировали и получали бесклеточные экстракты при описанных выше условиях. Элекрофоретический анализ бесклеточных экстрактов варианта с 6-БАП показал, что зоны НАДФ-ГДГ в этих вариантах опыта не обнаруживаются даже через 4 суток. Так же, как и 6БАП, кинетин, ГК, ИУК не приводили к появлению НАДФ-ГДГ. Таким образом, в отдельных беззародышевых половинках появление НАДФ-ГДГ под действием 6-БАП не происходит. Из полученных результатов следует, что под влиянием цитокининов прорастающая зародышевая часть каким-то образом, пока не известным механизмом, но не через сам цитокинин, активирует НАДФ-ГДГ внезародышевой части зерна пшеницы. Исходя, из современных представлений о сигнальной трансдукции мы предположили, что цитокинин, действуя на зародыш, вызывает появление в нем какого-то медиатора, который, непосредственно выходя из зародыша, воздействует на алейроновый слой, запуская механизмы активации НАДФ-ГДГ. Необходимо было установить, образуется ли медиатор в зародыше под действием цитокинина? С этой целью у зерна отделяли зародыши и замачивали в среде содержащей 1мМ 6-БАП. Действительно, в течение 6 ч. образовывалось соединение экстрагирующее 70% этиловым спиртом и вызывающее активацию НАДФ-ГДГ в алейроновом слое через 24 ч. То есть цитокинины воздействуя на зародыш, вызывают появление медиатора, который способен вызывать активацию НАДФ глютаматдегидрогеназы в алейроновом слое зерна. Следующей задачей явилось, определить, какие природные вещества могут вызывать активацию НАДФ-ГДГ непосредственно, воздействуя на алейроновый слой. Было установлено, что из всех изученных природных веществ, обладающих фитогормональной активностью, только лишь один фузикокцин оказался способным вызывать появление зон активности строго НАДФ-ГДГ в алейроновом слое зерна пшеницы. Известно, что фузикокцин был выделен из грибка Fusicoccus amygdali, этот грибок сильно поражает молодые миндальные деревца /5/. Учитывая то, что как неизвестный медиатор, выделенный из зародышей, так и фузикокцин вызывали активацию НАДФ-ГДГ, возникла необходимость определить является ли этот медиатор, продуцируемый зародышем, веществом родственным фузикокцину /5/. С этой целью необходимо было получить большое количество неизвестного медиатора и очистить его. Этот медиатор был выделен и очищен по разработанной нами схеме /6/. Одним из физиологических проявлений очищенного медиатора является то, что он в отличие от цитокининов вызывает усиленный ризогенез черенков и листовых пластинок /7/. После очистки этого медиатора, можно было приступать к работе по сравнению его с фузикокцином. Наиболее чувствительным и наиболее точным методом для сравнительного анализа родственности гормональных медиаторов являлся метод - конкуренции двух сравниваемых гормонов за рецептор. Ранее в растительных мембранах были обнаружены особые фузикокцин-связы-вающие рецепторы. Это облегчило задачу сравнения нашего медиатора с фузикокцином. Брали мембраны из корней 5-ти дневных проростков кукурузы (Zea mays) сорта Наднепрянская-50. Выделенные, согласно прописи, мембраны инкубировали при 220С в течение часа в 200 мл 20 мМ раствором трис-MES буфером рН 7,3, содержащего 5 мМ MgSO4, и 3х10-9 М меченого 3,5-дигидрофузикокцина с удельной активностью 2110 bq/mmol. В опытную смесь, содержащую фузикокцин и мембрану, добавляли концентрированную аликвоту растворенного лиофилизированного медиатора после HPLC. Анализировалось связывание меченного фузикокцина с рецепторами /8/. Не наблюдалось специфического связывания меченного фузикокцина с рецепторами мембран корней кукурузы, которые были предварительно инкубированы с немеченным фузикокцином. Интересно было проверить влияние предъинкубации очищенного медиатора на связывание меченного фузикокцина с рецепторами мембран, выделенных из корней проростков кукурузы. После предварительной инкубации мембранных фракций с медиатором наблюдалось сильное ингибирование связывания добавленного меченного фузикокцина с рецепторами мембран. Фракции после HPLC не содержащие медиатор не ингибировали связывание меченного фузикокцина с рецепторами мембран корней проростков кукурузы /9/. Таким образом, получены веские доказательства того, что медиатор синтезируемый в зародыше после воздействия цитокинина связывается с теми же рецепторами мембран, что и фузикокцин, что говорит об их близости. Таким образом, нами был расшифрован первый этап сигнальной трансдукции цитокининов. Цитокинины воздействуют на зародыш, после чего в зародыше происходит появление медиатора, который по своей специфичности связывания с рецепторами, родственен с фузикокцином. Для изученного процесса характерны следующие черты: первое - цитокинин вызывает появление медиатора сходного с фузикокцином. При этом происходит смена шифра (пароля) сигналов и, самое главное, повышение чувствительности сигнала на два порядка. То есть налицо все элементы, характерные для сигнальной трансдукции. Далее стал вопрос о механизме действия медиатора. Мы предположили, что как медиатор, так и фузикокцин, воздействуя на беззародышевые половинки зерна, включают в действие механизмы инозитидных превращений, которые приводят к увеличению концентрации внутриклеточного кальция. Известно, что цитозольный Са2+ является универсальным и главным внутриклеточным мессенжером гормональных сигналов, который непосредственно запускает механизмы ковалентной модификации - фосфорилирования белков /10/. Для проверки этого предположения мы использовали для искусственного повышения концентрации Ca2+ в цитоплазме кальциевый антибиотик - ионофор А23187, который создает кальциевые каналы на внешних мембранах, через которые можно накачивать кальций извне или убирать его. Наши опыты показали, что искусственное увеличение концентрации внутриклеточного кальция с помощью ионофора действительно приводит к возникновению зон НАДФ-ГДГ. В то же время, если добавлять ионофор в присутствии EGTA, который вызывает сильный отток наружу цитозольного кальция, ни фузикокцин, ни очищенный нами медиатор не могли вызвать активацию НАДФ-ГДГ. Таким образом, становится совершенно ясным, что образование НАДФ-ГДГ связано с увеличением уровня цитозольного кальция под воздействием гормонального сигнала. Теперь необходимо было выяснить непосредственный механизм активации глютаматдегидрогеназы. Известно, что увеличение цитозольного кальция включает механизмы фосфорилирования белков. То есть нам необходимо было установить, действительно ли имеет место фосфорилирование НАДФ-ГДГ на последнем этапе сигнальной трансдукции цитокининов? Для решения этого вопроса мы проращивали семена пшеницы Саратовская-29 на среде, содержащей 1 мМ 6-БАП, 1 мМ CaCl2 и 25 нМ меченного /32P/-АТФ 0,1 мКи. После 26 часов проращивания беззародышевые части зерна гомогенизировали в 50 мМ трис-HCL буфере, рН 7,8. Гомогенаты центрифугировали при 10000 х g в течение 10 минут и бесклеточные экстракты подвергали аффинной хроматографии на колонке с 2,5-АДФ Сефарозе 4Б. Аффинноочищенные фракции НАДФ-ГДГ разделяли электрофорезом. Половина столбиков гели брали на радиоавтографию, а другую часть гели после электрофореза подвергали гистохимическому проявлению на активность НАДФ-ГДГ. Было установлено, что зоны строго НАДФ-ГДГ на зимограммах и радиоавтографах совпадают. Эти данные однозначно говорят о том, что активация НАДФ-ГДГ активности связано с фосфорилированием ее неактивного предшественника. Наиболее интересным вопросом при изучении механизмов, приводящих к активации НАДФГДГ, явилось выяснение природы ее неактивного предшественника. При поиске этого предшественника мы обратили внимание на то, что молекулярная масса субъединиц латентной НАД-ГДГ, локализованной на сферосомах, была равна около 55 кДа, и почти такую же массу субъединиц имеет активированная НАДФ-ГДГ. При этом следует учитывать и то, что активация НАДФ-ГДГ происходит в алейроновом слое зерна и в этом же алейроновом слое локализованы сферосомы. Исходя из всех вышеприведенных данных, логично было сделать предположение о том, что именно латентная глютаматдегидрогеназа сферосом служит неактивным предшественником для активации НАДФ-ГДГ путем ее фосфорилирования. Для решения этого вопроса необхо-димо было выделить активную протеинкиназу С из проросшего зерна пшеницы и про-вести фосфорилирование латентной глютаматдегидрогеназа сферосом. Для этого у 3-х дневных проросших семян удаляли зародыши и растирали семена в 0,05М трис-НСI буфере рН 7,4. Гомогенат центрифугировали, бесклеточный экстракт концентрировали и подвергали гельхроматографии на сефакриле S-300. Активность протеинкиназы С обнаруживалась в четвертом пике. Фракцию этого пика собирали и использовали для дальнейшей работы. Имея препарат протеинкиназы С мы смогли провести опыты по прямому фосфорилированию белка сферосом. С этой целью гомогенные сферосомы, выделенные из беззародышевых половинок покоящегося зерна, инкубировали с протеинкиназой С в присутствии 10 мМ АТФ и 10 мМ СаCl2 в течении 3 часов. После обработки сферосом протеинкиназой С мы подвергали инкубационную смесь электрофорезу в полиакриламидном геле с последующим гистохимическим проявлением активности НАДФ - и НАД - глютаматдегидрогеназы /2/. Инкубация сферосом с протеинкиназой С приводила к появлению НАДФ-ГДГ. Таким образом, не остается никаких сомнений, что именно латентная глютаматдегидрогеназа сферосом является предшественником НАДФ-ГДГ. Результаты этих опытов однозначно показали, что прямое фосфорилирование латентной НАД-ГДГ сферосом выделенной нами протеинкиназой С в присутствии АТФ приводит к активации НАДФ-ГДГ. Весьма интересным явилось определить, что произойдет с НАДФ-ГДГ, если провести ее дефосфорилирование. С этой целью мы обработали аффинноочищеную НАДФ-ГДГ препаратом щелочной фосфатазы из плаценты человека. После инкубации в течение 3 часов при температуре 370С обработанную НАДФ-ГДГ подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле. В результате, зоны с активностью НАДФ-ГДГ исчезли и появилась зона НАД-ГДГ активности. То есть произошла конверсия коферментной специфичности НАДФ-ГДГ. Теперь не оставалось никаких сомнений в том, что именно латентная глютаматдегидрогеназа сферосом является предшественником для НАДФ-ГДГ. Теперь, на основании собственных экспериментальных данных мы можем представить основные звенья сигнальной трансдукции цитокинина. Цитокинин, воздействуя на орган, вызывает появление в нем медиатора по природе родственного фузикококцину. Медиатор, выходя из этого органа, воздействует на орган-мишень, связываясь с внешними фузикокциновыми рецепторами. Связывание медиатора с внешними фузикокциновыми рецепторами вызывает включение механизмов повышения цитозольного кальция, что в свою очередь приводит к активации протеинкиназы С. Последним этапом сигнальной трансдукции является активация НАДФ-ГДГ путем фосфорилирования латентной глютаматдегидрогеназы сферосом. Медиатор цитокинина имеет большую перспективу для использования в клеточной инженерии и растениеводстве. ЛИТЕРАТУРА 1. Poovaiah B.W., Reddy A.S.N. Calcium and Signal Transduction in Plant // Critical Reviews in Plant Sci. 1993, v.12, 13, Р. 185-211. 2. Гильманов М.К., Фурсов О.В., Францев А.П. Методы очистки и изучения ферментов растений. Алма-Ата: Наука, 1981, С. 91. 3. Гильманов М.К., Цветкова Б.М. Очистка и изучение свойств глютаматдегидрогеназы пшеницы. // Ферменты и качество зерна, Алма-Ата: Наука Каз.ССР, 1987, С. 104-111. 4. Гильманов М.К., Султанбаев Б.Е. Цитокинины индуцируют появление НАДФ-специфичных глютаматдегидрогеназ в прорастающем зерне пшеницы // Физиология растений. 1989, т.36, вып.5, С. 1035-1037. 5. Marre E. Fusicoccin: a tool in plant physiology//Plant Physiol.1979, v.30,Р.273-278. 6. Гильманов М.К., Дильбарканова Р. Строение и функции сферосом растительной клетки. Монография. Алматы, Гылым, 1997. 7. Гильманов М.К., Ибрагимова С.А., Николенко Н.Г. Методы изучения сигнальной трансдукции в прорастающем зерне пшеницы. Из кн. "Методы молекулярной биологии, биохимии, иммунохимии и биотехнологии.", Алматы,1999 г. С. 107-113. 8. Abramycheva N.Yu., Babakov A.V., Bilushi E.E., Danilina S.V., Shevchenko V.P. Comparison of the biological activity of fusicoccin in higher plants with its binding to plasma membranes // Planta. 1991, v. 183, Р. 315-320. 9. Sultanbaev B.E., Gilmanov M.K., Abramycheva N.Y., Stolpakova V.V., Ginodman L.M., Muromtsev G.S. An embryonal factor and fusycoccin induce NADP-specific glutamate dehydrogenase in germinating wheat seed // Plant Sci. 1993, v. 88, Р. 19-24. 10. Sultanbaev B.E., Gilmanov M.K., Abramycheva N.Y., Stolpakova V.V., Ginodman L.M., Muromtsev G.S. An embryonal factor and fusycoccin induce NADP-specific glutamate dehydrogenase in germinating wheat seed // Plant Sci. 1993, v. 88, Р. 19-24. SUMMARY For the first time was investigated the mechanism of signal transduction of cytokinins. On the basis of own experimental data is represented the basic parts of signal transduction of cytokinins. Cytokinin, influencing on organ - target, causes occurrence in it mediator on a nature related fusycoccin. Mediator, contacting external fusycoccins receptors causes increase of a level cytosolic calcium. The increase of a level cytosolic calcium results in activation proteinkinasa C. In turn proteinkinasa C phosphorilation NADP-GDH.
