Рентгеноструктурное исследование неорганических

УДК 615.9(06)+577.3(06) Медицинская физика
Д.А. ИОНОВ, В.Р. САМЫГИНА1
Московский инженерно-физический институт (государственный университет)
1 Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН, Москва
РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
НЕОРГАНИЧЕСКИХ ПИРОФОСФАТАЗ ИЗ ПАТОГЕННЫХ
МИКРООРГАНИЗМОВ M. tuberculosis и V. cholerae
Целью данной работы являлось исследование структурно-функциональных
особенностей неканонических форм растворимых неорганических пирофосфатаз
(PPаз) из патогенных микроорганизмов Micobacterium tuberculosis (семейство PPаз
I) и Vibrio cholerae (семейство PPаз II) при помощи рентгеноструктурного анализа,
а также сравнению полученных в ходе работы результатов с другими
пирофосфотазами семейства I и II.
Неорганический пирофосфат образуется в ходе биосинтеза любых
клеточных биополимеров, например, в организме взрослого человека
вырабатывается до нескольких килограмм PPi в день. Это делает
абсолютно необходимым присутствие пирофосфатаз не только в клетках
человека, но и во всех известных организмах.
Растворимые пирофосфатазы в свою очередь делятся на два
негомологичных структурных семейства – I и II. Наиболее хорошо
изученными представителями семейства I являются РРазы
E.coli
(прокариотическая ветвь) и S. Cerevisiae (эукариотическая ветвь). Обе
ветви имеют практически одинаковую архитектуру активного центра и
разделяют общий механизм катализа. Однако два представителя РРаз из
патогенных бактерий M. tuberculosis и V. cholerae имеют существенные
отличия от канонической формы РРаз. Это делает их перспективными
мишенями для разработки антибактериальных препаратов, а поиск путей
специфического подавления активности этих ферментов требует
детального изучения их структурно-функциональных особенностей.
Для исследования неорганических пирофосфатаз в данной работе
применяется метод рентгеноструктурного анализа (РСА) белка. РСА
белка – это применение методов рентгеновской дифракции к кристаллам
одного из наиболее важных классов биологических молекул – белкам.
Белки можно закристаллизовать, причем, в подавляющем большинстве
случаев их пространственная конфигурация, а, следовательно, и
функционирование, при этом не изменится. Именно этот факт позволяет
воссоздать с большой степенью точности структуру белка по
рентгенограмме его кристаллов.
36
ISBN 978-5-7262-0883-1. НАУЧНАЯ СЕССИЯ МИФИ-2008. Том 3
УДК 615.9(06)+577.3(06) Медицинская физика
Первичная задача при исследовании новых белков – это выращивание
их кристаллических форм. Кристаллизация, в особенности таких сложных
биологических макромолекул как белки, процесс многопараметрический.
В частности, он зависит от ионной силы раствора, величины pH,
используемых противоионов, температуры, органических растворителей,
и т.д. Для образования кристаллов в раствор белков добавляют осадители
– вещества, уменьшающие их растворимость, конкурируя с водой за
образование водородных связей с растворенными белками. При этом
необходимо достигнуть точки пересыщения, когда начинается рост
кристаллов. Кроме того, очень важно вырастить монокристаллы
достаточной величины, поскольку интенсивность рентгеновской
дифракционной картины приблизительно пропорциональна объему
кристалла. В среднем, для анализа на современном рентгеновском
дифрактометре (1.54 A) монокристалл должен составлять порядка 0.1 мм
по всем
направлениям. Если в качестве источника используется
синхротрон (1 A), тогда размеры кристалла могут достигать 20 мкм.
Выращивание кристаллов неорганических пирофосфотаз в проведенной
работе производилось методом висячей капли за счёт вырвавнивания
осмотического давления пересыщенного раствора осадителя и капли
белкового раствора.
В работе использовались 5 наборов для скрининга кристаллизации
белков типа sparse matrix (разреженная матрица), выпущенных фирмами
Emerald Biosystems (наборы Wizard I и Wizard II) и Hampton Research
(наборы Crystal Screen 2, PEG/Ion Screen и Crystal Screen Lite).
В ходе проведенной работы было опробовано:
1. около 400 различных условий кристаллизации для неорганической
пирофосфатазы I-го семейства из V.cholerae;
2. около 250 различных условий кристаллизации для неорганической
пирофосфатазы II-го семейства из V.cholerae;
3. около 150 различных условий кристаллизации для неорганической
пирофосфатазы II-го семейства из M.tuberculosis.
На данный момент были получены кристаллы неорганической
пирофосфатазы M.tuberculosis размерами около 0.1 мм, дающие
разрешение около трех Ангстрем при рентгеноструктурном исследовании.
Такое разрешение не позволяет полностью вскрыть трёхмерную
структуру исследуемого белка, однако даёт представление об основных
особенностях его строения. В ходе последующих исследований будет
достигнуто разрешение около полутора Ангстрем и выращивание
ISBN 978-5-7262-0883-1. НАУЧНАЯ СЕССИЯ МИФИ-2008. Том 3
37
УДК 615.9(06)+577.3(06) Медицинская физика
кристаллов неорганических пирофосфатаз I-го и II-го семейств V.cholerae
кристаллографического качества, к чему есть достаточные предпосылки.
38
ISBN 978-5-7262-0883-1. НАУЧНАЯ СЕССИЯ МИФИ-2008. Том 3