«Исследование иммунновоспалительных маркеров развития атеротромботического ишемического инсульта и механизмов реализации ишемического повреждения
реклама
На правах рукописи ШУРДУМОВА МАРИНА ХАСАНОВНА «Исследование иммунновоспалительных маркеров развития атеротромботического ишемического инсульта и механизмов реализации ишемического повреждения головного мозга» 14.01.11 - Нервные болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2011 1 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». Научный руководитель член – корр. РАМН, доктор медицинских наук профессор Скворцова Вероника Игоревна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор Спирин Николай Николаевич доктор медицинских наук профессор Камчатнов Павел Рудольфович Ведущая организация: Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского Департамента здравоохранения г. Москвы Защита состоится «28» февраля 2011 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 208.072.09 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1. Автореферат разослан «20 » января 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Л.В. Губский 2 Общая характеристика работы Актуальность темы исследования Согласно международным эпидемиологическим исследованиям ежегодно в мире регистрируется более 30 миллионов случаев инсульта, из них умирают 4,7 млн человек. По данным Росстата за 2009 г. смертность от инсульта в России составила 164,1 случая на 100 000 населения. Согласно Хельсингборгской декларации о европейских стратегиях в отношении инсульта (2006 г.), одним из приоритетных направлений научных исследований является разработка новых методов лечения ишемического инсульта, таких как нейропротекция и регенераторно-репаративная терапия, что требует изучения механизмов, реализующих формирование очага ишемии, в том числе связанных с вовлечением иммунной системы, реакциями врожденного иммунитета, локальным воспалительным ответом и других. Большое количество исследований, проведенных, в том числе, на кафедре фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии РГМУ, расширили представления об участии иммунного ответа, воспалительных реакций, генетических и молекулярных механизмов апоптоза в патогенезе ишемического инсульта. Было показано, что при формировании церебрального инфаркта имеется дисбаланс цитокинового статуса с дефицитом защитных противовоспалительных цитокинов и трофических факторов [Скворцова В.И. и соавт., 2000; Ефремова Н.М. и соавт., 2000], выраженность которого коррелирует с тяжестью и клиническим исходом инсульта; определена значимая роль аутоиммунных процессов в ишемическом повреждении головного мозга [Еремин И.И. и соавт., 2006]. Изучено влияние матриксной металлопротеиназы 9 (ММП-9) на развитие осложнений после проведения тромболитической терапии [Шамалов Н.А. и соавт., 2010]. Были проведены исследования, доказавшие влияние полиморфизма различных генов, в том числе индуктора апоптоза – гена Fas, на формирование очага церебральной ишемии [Скворцова В.И. и соавт., 2007]. В то же время, появляются новые сведения о роли врожденного иммунитета в формировании ответа головного мозга на ишемию. Так, продемонстрировано участие рецепторов врожденного иммунитета – Toll-подобных рецепторов 4 (TLR4), в развитии экспериментального церебрального инфаркта [Tang S.C. et al., 2007]. Активно исследуются значение различных медиаторов апоптоза, в том числе Fasлиганда (FasL), в патогенезе ишемического инсульта, возможное нейропротекторное действие белков теплового шока 70 (БТШ70) [Martin-Villalba A. et al., 2001; Zheng Z. et 3 al., 2005], а также роль металлопротеиназ в развитии инфаркта головного мозга. Требуют дальнейшего изучения причины разного течения заболевания у пациентов с ишемическим инсультом при изначально одинаковых степени тяжести и локализации сосудистого поражения, что обуславливает поиск новых методов диагностики и прогнозирования течения ишемического инсульта. Все это определяет актуальность настоящей работы, ее цель и задачи. Цель: Исследование иммунных, воспалительных процессов и параметров апоптоза у больных в остром периоде атеротромботического ишемического инсульта в зависимости от особенностей клинического течения заболевания. Задачи исследования: 1. Оценка уровня экспрессии поверхностных TLR4 клеток периферической крови (моноцитов и гранулоцитов), ее динамики и клинической значимости у больных с ишемическим атеротромботическим инсультом и в контрольной группе 2. Определение содержания и динамики изменений внутриклеточных БТШ70 мононуклеаров и нейтрофилов периферической крови у больных с ишемическим инсультом, определение взаимосвязи их концентраций с клиническими особенностями заболевания и размерами очага поражения головного мозга 3. Определение уровня и динамики сывороточного sFasL, фактора некроза опухоли α (ФНО-α) и интерлейкина 10 (ИЛ10) у больных в остром периоде атеротромботического ишемического инсульта в зависимости от его клинических особенностей и размеров очага поражения головного мозга 4. Изучение активности спонтанного апоптоза клеток периферической крови у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом в первый день заболевания и в динамике острого периода в зависимости от клинических особенностей течения заболевания, а также от уровня таких регуляторов, как БТШ70, sFasL, ФНО-α 5. Определение динамики концентрации циркулирующей ММП-9 у пациентов в остром периоде атеротромботического ишемического инсульта и оценка ее клинической значимости, сопоставление с размерами очага ишемического повреждения головного мозга. Научная новизна 1. Впервые был изучен уровень экспрессии ТLR4, отражающих состояние системы врожденного иммунитета, на моноцитах и гранулоцитах периферической крови пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом. Показано, что уровень экспрессии поверхностных TLR4 на моноцитах больных коррелирует со 4 степенью тяжести состояния пациентов в остром периоде заболевания (r=0,79; p=0,03), что, возможно, свидетельствует о клинической значимости активации экспрессии TLR4 моноцитов периферической крови в патогенезе ишемического инсульта. 2. Впервые исследован уровень активности спонтанного апоптоза клеток периферической крови у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом, выявлено его достоверное повышение по сравнению с контрольными значениями (р≤0,05) и максимальное нарастание к 7-м суткам заболевания с последующим снижением до исходного уровня к 14-м суткам. 3. Впервые исследовано содержание и динамика изменений внутриклеточных БТШ70 мононуклеаров и нейтрофилов периферической крови у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом. Определена обратная зависимость интенсивности спонтанного апоптоза клеток периферической крови пациентов с ишемическим инсультом и уровня внутриклеточного БТШ70, что отражает антиапоптотическую направленность этого шаперонного белка. 4. Проведена комплексная оценка иммунных, воспалительных маркеров и параметров апоптоза, изучено их клиническое значение у больных в остром периоде атеротромботического ишемического инсульта. Определена временная взаимосвязь между развитием воспалительной реакции и активацией системы апоптоза при атеротромботическом ишемическом инсульте, нарастающая к 7-м суткам заболевания и формирующая единый пул «отдаленных последствий ишемии». Научно-практическая значимость работы 1. Лейкоцитоз в 1-е сутки атеротромботического ишемического инсульта следует рассматривать как предиктор тяжести заболевания (r=0,47; р≤0,01) при отсутствии сопутствующей патологии, влияющей на данный показатель. 2. Достоверное различие концентрации сывороточной ММП-9 на 1-е и 7-е сутки заболевания у тяжелых и среднетяжелых пациентов, по сравнению с легкобольными (p≤0,006 и p≤0,01), а также наличие статистически значимой корреляционной зависимости между уровнем сывороточной ММП-9 и тяжестью инсульта на 1-е сутки (r=0,44; р≤0,03) позволяют рассматривать ММП-9 как показатель тяжести ишемического инсульта. 3. Связь экспрессии TLR4 на моноцитах периферической крови и уровня циркулирующей ММП-9 с тяжестью атеротромботического ишемического инсульта; а также подтверждение в клинических условиях антиапоптотических свойств внутриклеточного БТШ70 свидетельствуют о возможности разработки новых 5 нейропротекторов, действие которых будет направлено на представленные молекулярные мишени. Основные положения, выносимые на защиту 1. Установлена клиническая значимость активации экспрессии рецептора врожденного иммунитета – TLR4 моноцитов периферической крови в патогенезе ишемического инсульта, что выражается повышением уровня экспрессии поверхностных TLR4 на моноцитах больных с атеротромботическим ишемическим инсультом, по сравнению с контрольными значениями, и его корреляцией со степенью тяжести состояния пациентов в остром периоде заболевания (r=0,79; p≤0,03). 2. Показано, что уровень активности спонтанного апоптоза клеток периферической крови у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом достоверно выше контрольных значений (р≤0,05) в остром периоде заболевания, максимально нарастая к 7-м суткам и снижаясь до исходного уровня к 14-м суткам. Содержание индуктора апоптоза sFasL в сыворотке крови также достоверно нарастает к 7-м суткам (р≤0,05) у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом вне зависимости от тяжести заболевания. 3. Выявлено повышение уровня внутриклеточных белков теплового шока 70 в остром периоде атеротромботического ишемического инсульта, по сравнению с контрольными значениями (p≤0,05), и отрицательные корреляции их уровня с активностью спонтанного апоптоза периферических клеток крови (r=-0,75; р≤0,01), что, возможно, отражает антиапоптотические свойства этого шаперонного белка. 4. Показано, что уровень сывороточной ММП-9, обладающей деградирующими свойствами в отношении соединительнотканных структур, отражает тяжесть течения атеротромботического ишемического инсульта: достоверно повышается на 1-е (p≤0,01) и 3-е (p≤0,03) сутки заболевания, по сравнению с контрольными значениями, коррелируя со степенью тяжести заболевания по NIH (r=0,44; р≤0,03). 5. Проведенное комплексное клиническое и иммуннобиохимическое исследование маркеров временные развития атеротромботического взаимосвязи между ишемического инициацией и инсульта установило развертыванием процессов, участвующих в формировании отдаленных последствий ишемии (реакция системы врожденного иммунитета – TLR4, локальный воспалительный ответ – ФНО-α, апоптоз на примере спонтанного апоптоза клеток периферической крови и исследования индуктора апоптоза sFasL) и активацией компенсаторных защитных механизмов (синтез внутриклеточных БТШ70, регуляторных цитокинов – ИЛ10). 6 Внедрение в практику Основные положения диссертации внедрены в лечебную работу отделений неврологии и нейрореанимации ГКБ № 31 Департамента здравоохранения г.Москвы, научно-исследовательскую работу НИИ цереброваскулярной патологии и инсульта ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. Апробация диссертационной работы Апробация диссертации состоялась на конференции кафедры фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии и НИИ инсульта ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (протокол №12 от 04 июня 2010 года). Основные результаты исследования были доложены на научных конференциях кафедры фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии ГОУ ВПО РГМУ, II Российском международном конгрессе «Цереброваскулярная патология и инсульт» 17 сентября 2007 года, Российской научно-практической конференции "Нарушения мозгового кровообращения: диагностика, профилактика, лечение". Пятигорск, 20 мая 2010 года. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, включает 20 таблиц, 16 рисунков, 3 клинических случая. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания применяемых методов, 2 глав собственных результатов исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы состоит из 187 источника, включая 31 отечественных и 156 зарубежных. Материалы и методы исследования В период с 2007 по 2009 гг было обследовано 107 пациентов с церебральным ишемическим инсультом, из которых по критериям TOAST в исследование были включены 58 пациентов с атеротромботическим патогенетическим вариантом. Контрольную группу составили 20 пациентов без острых цереброваскулярных событий в анамнезе, сопоставимые по половозрастным признакам и сопутствующим заболеваниям с основной группой. В основную группу были включены пациенты с впервые возникшим атеротромботическим ишемическим инсультом, поступившие в клинику в течение 24 часов от начала развития заболевания. Средний возраст составил 68,55 ±11,2 лет. Мужчин было 35 (60,3%), женщин – 23 (39,7%). 7 Большая часть включенных в исследование больных в течение длительного времени страдала артериальной гипертонией, сахарным диабетом, ожирением различной степени. У части больных в анамнезе отмечались транзиторные ишемические атаки. Частота имевшихся фоновых заболеваний и основные характеристики пациентов представлены в таблице 1. Таблица 1.Фоновые заболевания обследованных больных Основная группа (n=58) Контрольная группа (n=20) 1. ТИА 10,3% 0% 2. ИБС 8,6% 35,7% 3. Сахарный диабет 22,4% 28,6% 4.Артериальная гипертензия 94,8% 95% 5. Ожирение 39,7% 42,8% муж 60,3% 55% жен 39,7% 45% 68,55 ±11,2 67,9±10,5 6.Пол 7.Возраст (лет) Для объективизации неврологического дефицита тяжести и состояния, оценки динамики выраженности клинических очагового показателей использовали шкалу инсульта National Institutes of Health (NIH) и оригинальную шкалу оценки неврологического статуса Е.И.Гусева, В.И.Скворцовой. Клинические исходы заболевания оценивали по модифицированной шкале Рэнкина (МШР) на 14 сутки. Лабораторные исследования включали в себя твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) с использованием коммерческих иммуноферментных наборов и тестсистем для определения содержания ММР-9, ИЛ10, ФНО-α, sFasL в сыворотке крови (n=37) и метод проточной цитофлоуриметрии для определения внутриклеточного БТШ70 и поверхностных TLR4 на клетках периферической крови, а также анализа интенсивности спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов (n=21). Кроме того, всем пациентам выполняли рутинные лабораторные исследования: общий анализ крови, общий анализ мочи, биохимический анализ крови, коагулограмму (АЧТВ – активированное частичное тромбопластиновое время, ПТИ – протромбиновый индекс, МНО – международное нормализованное соотношение, количество тромбоцитов). 8 Компьютерно-томографическое исследование головного мозга проводили при поступлении пациента в стационар и на 6-7-е сутки после развития инсульта. На томограммах определяли локализацию, характер и объем очага поражения головного мозга. С целью верификации патогенетического варианта ишемического инсульта всем пациентам выполняли ультразвуковое исследование: дуплексное сканирование магистральных артерий головы, транскраниальную допплерографию и Эхо-КГ. ЭхоКГ исследование выполняли с целью верификации наличия эмбологенной массы в полости сердца и других кардиологических нарушений, способных вызывать кардиоэмболический ишемический инсульт. Статистическая обработка данных Статистическую обработку данных проводили параметрическими и непараметрическими методами в зависимости от нормальности распределения признаков. Для оценки различий количественных показателей между группами использовали критерий суммы рангов Манна–Уитни. Для повторных измерений применялся математический парный тест Вилкоксона. Ассоциацию между непрерывными переменными оценивали с помощью коэффициента корреляции Спирмена. Выборочные параметры, приводимые далее в таблицах, имеют следующие обозначения: М - среднее, s - стандартное (среднеквадратичное) отклонение, m ошибка среднего, n - объем анализируемой подгруппы, р - достигнутый уровень значимости. Все вычисления проводили с использованием программного обеспечения STATISTICA for Windows 7.0. Значение вероятности <0,05 (двусторонняя проверка значимости) демонстрировало статистическую значимость. Результаты клинического исследования больных и их обсуждения Оценка неврологического статуса пациентов основной группы выявила следующие ведущие неврологические синдромы, к которым относились пирамидная недостаточность (93,1%), речевые расстройства (37,8% по типу афазии и 53,4% по типу дизартрии) и нарушение чувствительности (48,3%). У 10 (17,2%) пациентов имелись расстройства уровня сознания. Средний балл по шкале инсульта NIH на первые сутки заболевания составил 11,4±6,2, по оригинальной шкале оценки неврологического статуса – 37,7±5,8. Инсульт с легким неврологическим дефицитом наблюдался у 17 (29,3%) пациентов, у 20 (34,5%) пациентов – средней степени тяжести и у 21 (36,2%) – тяжелый инсульт. Средний возраст и пол пациентов статистически достоверно не различались в 9 зависимости от тяжести инсульта. Более значимая положительная динамика на 14-е сутки наблюдения была у пациентов с инсультом средней тяжести и тяжелым. При оценке восстановления неврологических функций по МШР на 14-е сутки заболевания благоприятные исходы чаще наблюдались у пациентов с инсультом с легким неврологическим дефицитом, по сравнению с пациентами, у которых состояние при поступлении в клинику оценивалось как среднетяжелое и тяжелое (р≤0,001). По результатам КТ головного мозга, все инсульты были полушарными: правополушарная локализация ишемического очага повреждения была выявлена у 27 (46,5%) пациентов, левополушарная – у 31 (53,4%) пациентов. При проведении КТ на 6-7-е сутки инсульта чаще всего ишемический очаг локализовался в теменно-височной области (41,7%) и в подкорковых структурах головного мозга (19,2%). Наблюдалась закономерная прямая достоверная корреляция между объемом очага и степенью тяжести пациентов (r=0,73; p≤0,05) и статистически значимые различия между объемом очага у легкобольных по сравнению со среднетяжелыми и тяжелыми пациентами (р≤0,01). Была выявлена прямая корреляция высокой степени достоверности между уровнем лейкоцитов в периферической крови на 1-е сутки заболевания и объемом очага ишемии (r=0,47; р≤0,01), что указывает на отрицательное значение бессимптомного лейкоцитоза на 1-е сутки ишемического инсульта и соответствует литературным данным [Yoon S.S. et al., 2005]. Ультразвуковое исследование магистральных артерий головы у всех пациентов основной группы выявляло гемодинамически значимые стенозы (более 50% согласно критериям TOAST) причинных сосудов на стороне поражения. Не было выявлено достоверных различий между степенью стеноза в зависимости от тяжести состояния пациентов, их пола и возраста. Результаты лабораторного исследования и их обсуждения Полученные ишемического экспериментальные инсульта определили данные о роли необходимость в патогенезе исследования рецептора TLR4 врожденного иммунитета TLR4 в клинических условиях [Tang S.C. et al., 2007; Xia Y. et al., 2006]. Известно, что TLR4 имеют практически повсеместную распространенность в организме человека, экспрессируются на клетках, осуществляющих первую линию защиты (нейтрофилы, макрофаги, дендритные клетки), на эндотелиальных и эпителиальных клетках слизистых тканей и др. [Armant M.A. et al., 2006], что делает 10 возможным исследование экспрессии TLR4 в клетках периферической крови при ишемическом инсульте. При исследовании экспрессии TLR4 на моноцитах и гранулоцитах у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом было выявлено, что экспрессия TLR4 на моноцитах основной группы была достоверно выше уровня экспрессии TLR4 на моноцитах группы контроля на 1-е сутки (р≤0,05) заболевания. Экспрессия гранулоцитарного TLR4 у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом на 1-е, 7-е и 14-е сутки достоверно не отличалась от таковой в группе контроля (табл. 2). Таблица 2. Значение экспрессии TLR4 на моноцитах и гранулоцитах периферической крови Экспрессия TLR4 на Контроль 1 сутки 7 сутки 14 сутки M±m M±m M±m M±m 60,33±6,59 94,25±13,46* 92,09±19,47 96,98±35,38 44,67±5,31 50,81±4,56 45,44±8,14 62,79±38,09 моноцитах (ед.) Экспрессия TLR4 на гранулоцитах (ед.) *- р≤0,05 по сравнению с группой контроля Было получено 2 типа экспрессии TLR4 на моноцитах в образцах крови, взятых у одних и тех же пациентов: достоверно высокая за весь наблюдаемый период (р≤0,000) и достоверно низкая (р≤0,001) по сравнению с контрольными значениями. Возможно, данное различие экспрессии TLR4 на моноцитах у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом объясняется наличием цикличности процесса экспрессии рецептора, при котором у части моноцитов уже запущены генетически-молекулярные программы, направленные на максимальную экспрессию рецептора, в то время как другая часть моноцитов еще не активирована. Кроме того, это может быть связано с естественным циклом синтеза/распада рецептора на поверхности моноцитов. Корреляционный анализ выявил статистически значимую достоверную прямую взаимосвязь между экспрессией TLR4 на моноцитах на 14-е сутки и степенью тяжести состояния пациентов по NIHSS на 1-е (r=0,74; р≤0,03), 7-е (r=0,75; p≤0,05) и 14-е (r=0,79, р≤0,03) сутки заболевания, что может указывать на клиническую значимость TLR4 в патогенезе атеротромботического ишемического инсульта. Вследствие церебральной ишемии возникает каскад сигнальных взаимодействий, вызывающих программированную клеточную гибель не только в 11 ткани головного мозга, но и в циркулирующих клетках иммунной системы [Nakajima H. et al., 2003], что объясняет интерес к изучению уровня спонтанного апоптоза клеток периферической крови при ишемическом инсульте. Исследование уровня спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов периферической крови у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом выявило достоверное повышение его уровня, по сравнению с контрольными значениями, на 1-е (р≤0,003), 7-е (р≤0,003) и 14-е (р≤0,01) сутки заболевания для моноцитов и на 1-е (р≤0,01) и 7-е сутки (р≤0,002) для гранулоцитов. К 7-м суткам уровень спонтанного апоптоза у пациентов с ишемическим инсультом достоверно повышался (р≤0,01), достигая максимальные значения за весь период наблюдения. К 14-му дню регистрируемый уровень спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов пациентов основной группы достоверно снижался (р≤0,05) (табл. 3). Таблица 3. Уровень спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов периферической крови у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом и группы контроля. Спонтанный апоптоз гранулоцитов, M±m основная контроль 1 сутки 7 сутки 14 15,13±1,96 Спонтанный апоптоз моноцитов, M±m р контроль группа 23,67±2,4 0,01 35,11±2,72* 0,002 19±2,83 0,36 5,59±0,68 основная р группа 15,83±2,95 0,003 30,89±2,94* 0,003 12,57±3,89 0,01 сутки *- р≤0,05 по сравнению с 1-ми и 14-ми сутками Исследование sFasL у пациентов с ишемическим инсультом выявило достоверное увеличение его уровня на 7-е (р≤0,000) сутки по сравнению с группой контроля. На 1-е и 3-и сутки уровень sFasL достоверно не отличался от контрольного, что подтверждает отсроченное действие факторов апоптоза в патогенезе ишемического инсульта. На 1-е сутки заболевания у тяжелых пациентов отмечалось незначимое повышение концентрации сывороточного sFasL, по сравнению с пациентами средней тяжести и легкобольными (р>0,05). В динамике у всех пациентов основной группы происходило увеличение концентрации sFasL к 7-м (р≤0,05) суткам заболевания, без значимых различий в зависимости от тяжести состояния, что отражает равную степень 12 реализации FasL –индуцированного апоптоза у пациентов с ишемическим инсультом независимо от степени тяжести (рис. 1). #- р≤0,05 по сравнению с 1-ми и 3-ми сутками своей группы Рисунок 1. Динамика концентрации FasL в зависимости от тяжести пациентов с ишемическим инсультом Сравнительный анализ спонтанного апоптоза клеток периферической крови и изучение уровня sFasL, как апоптозмодифицирующего фактора, показал, что концентрация sFasL в сыворотке крови у пациентов с ишемическим инсультом, также как и уровень спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов, нарастает к 7-му дню заболевания, по сравнению с 1-ми сутками. Оценивая результаты проведенного исследования, можно сделать вывод, что, несмотря на различные сигнальные пути индукции апоптоза в том или ином случае, апоптотические системы реализуют свое действие практически одновременно. Учитывая, что «доформирование» очага ишемического повреждения достигается путем апоптоза и апо-некроза, возникает необходимость поиска новых нейропротекторных веществ, обладающих, в том числе, антиапоптотической активностью. В последние годы резко возросло число исследований, нацеленных на оценку терапевтических приложений протективных свойств БТШ70, которые составляют молекулярные системы, необходимые всем живым клеткам для нормального функционирования и обладают шаперонной активностью. Согласно литературным данным, антиишемический эффект БТШ70 связан с вовлечением его в антиапоптозный, антинекротический и антиагрегационный механизмы [Giffard R.G. et al., 2004]. Для изучения возможных цитопротекторных свойств БТШ70 проведено исследование их уровня в моноцитах и гранулоцитах периферической крови, в сравнении со степенью активности спонтанного апоптоза тех же клеток, у пациентов с атеротромботическим инсультом. Содержание внутриклеточного БТШ70 в гранулоцитах на 1-е, 7-е и 14-е сутки ишемического инсульта было достоверно выше содержания БТШ70 в гранулоцитах 13 контрольной группы (p≤0,05, р≤0,05 и р≤0,005 соответственно). Уровень БТШ70 в моноцитах на 1-е и 14-е сутки заболевания был также достоверно выше контрольных значений (р≤0,001 и р≤0,01 соответственно). В динамике уровень внутриклеточного БТШ70 в моноцитах и гранулоцитах достоверно снижался к 7-м суткам заболевания (р≤0,05) и достоверно повышался к 14м суткам (р≤0,05), что может быть связано с истощением его содержания в клетке вследствие реализации им определенных функций при развитии ишемического повреждения, а также с выбросом БТШ70 во внеклеточное пространство и последующим его ресинтезом (рис 2). * - р≤0,05 по сравнению с группой контроля # - р≤0,05 по сравнению с 1 и 14 сутками Рисунок 2.Динамика БТШ70 в моноцитах и гранулоцитах периферической крови у пациентов с ишемическим инсультом Исследование взаимосвязи экспрессии БТШ70 в моноцитах и гранулоцитах пациентов с ишемическим инсультом и уровня спонтанного апоптоза в соответствующих клетках выявило, что статистически значимое снижение уровня БТШ70 (р≤0,05) сопровождалось достоверным повышением процентного содержания апоптозных клеток в анализируемых образцах крови в динамике к 7-м суткам (р≤0,01). Достоверное повышение уровня БТШ70 в моноцитах и гранулоцитах, происходящее на 14-е сутки заболевания (р≤0,01), сопровождалось достоверным снижением спонтанного апоптоза соответствующих клеток периферической крови (р≤0,05). Корреляционный анализ выявил наличие статистически значимых отрицательных корреляций между уровнем спонтанного апоптоза моноцитов и уровнем моноцитарного внутриклеточного БТШ70 на 14-е сутки заболевания (r=-0,81; р≤0,026); а также отрицательных корреляций высокой степени достоверности между 14 уровнем спонтанного апоптоза гранулоцитов и уровнем внутриклеточного БТШ70 на 1-е (r=-0,75; р≤0,012) и 7-е (r=-0,73;р≤0,023) сутки заболевания. В результате проведенного нами исследования, была выявлена обратная зависимость интенсивности спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов периферической крови у пациентов с ишемическим инсультом от уровня экспрессии этими клетками внутриклеточного БТШ70, что подтверждает антиапоптотические свойства БТШ70. Несмотря на наличие множества исследований, посвященных изучению роли цитокинов в формировании ишемического повреждения головного мозга, остается неразрешенным ряд вопросов о направленности действия цитокинов, их взаимодействии друг с другом и с медиаторами апоптоза, возможных механизмах реализации вызываемых ими эффектов, что делает интересным и актуальным их дальнейшее изучение. Исследование уровня ФНО-α у пациентов с ишемическим инсультом по сравнению с группой контроля, выявило достоверное повышение уровня ФНО-α в течение всего периода наблюдения (р≤0,05). При этом в динамике отмечалось достоверное нарастание уровня ФНО-α на 7-е сутки заболевания (р≤0,05), по сравнению с 1-ми и 3-ми сутками. На 3-и сутки заболевания отмечалось достоверное повышение уровня ФНО-α у тяжелых пациентов, по сравнению со среднетяжелыми (р≤0,01). В динамике отмечалось достоверное увеличение уровня ФНО-α у тяжелых пациентов к 7-м суткам заболевания (р≤0,05) (табл. 4). Таблица 4. Уровень ФНО-α в зависимости от тяжести состояния пациентов с ишемическим инсультом. Легкие Сутки ФНО-α M±m Тяжелые Средние р ФНО-α р M±m пг/мл пг/мл ФНО-α M±m пг/мл 1 сутки 10,3±4,42 ns 9,8±4,11 ns 8,5±2,62 3 сутки 11,5±3,85 ns 4,6±1,53 0,05 15,2±3,86 7 сутки 14±3,32 ns 14,2±4,5 ns 22,7±7,0* *- p≤0,05 по сравнению с уровнем ФНО-α на 1-е и 3-е сутки у тяжелобольных 15 В результате проведенного исследования не было выявлено достоверных корреляций уровня сывороточного ФНО-α у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом со степенью тяжести состояния больных, объемом очага поражения и степенью восстановления неврологических функций по шкале МШР на 14-е сутки заболевания. Однако значимое повышение уровня сывороточного ФНО-α у пациентов основной группы, по сравнению с группой контроля, с 1-х суток заболевания и достоверное нарастание его к 7-м суткам в группе пациентов в тяжелом состоянии, свидетельствуют в пользу провоспалительного характера данного цитокина. При проведении сравнительного анализа динамики уровня сывороточного ФНО-α, sFasL и степени спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов периферической крови у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом, было выявлено, что максимальное нарастание уровня ФНО-α по времени совпадает с максимальной концентрацией sFasL в сыворотке крови и степенью спонтанного апоптоза клеток периферической крови. При этом повышение уровня ФНО-α опережает повышение сывороточного уровня sFasL. Это подтверждает литературные данные о том, что ФНО-α способен выступать в качестве апоптозиндуцирующего фактора при атеротромботическом ишемическом инсульте. Исследование уровня ИЛ10 у пациентов с ишемическим инсультом на 1-е, 3-и и 7-е сутки заболевания, по сравнению с группой контроля, выявило достоверное повышение уровня ИЛ10 у пациентов с ишемическим инсультом на 3-и (р≤0,002) и 7-е (р≤0,05) сутки заболевания. В динамике уровень ИЛ10 достоверно повышался с 1-х по 3-и сутки (р≤0,001) (что соответствует данным исследований, ранее проведенных на нашей кафедре), и не зависел от степени тяжести пациентов. При этом было выявлено 2 типа реакции ИЛ10 на возникновение ишемического повреждения головного мозга: в первом случае значение сывороточного ИЛ10 было на уровне контрольных цифр и достоверно от них не отличалось, во втором отмечалось достоверное повышение уровня сывороточного ИЛ10 по сравнению с контрольными значениями на 1-е (р≤0,000), 3-и (р≤0,000) и 7-е (р≤0,000) сутки (табл. 5). Высокие значения сывороточного ИЛ10 отмечались только у пациентов с состоянием средней тяжести и тяжелым и не были определены ни в одном случае у легкобольных, тогда как низкие значения ИЛ10 встречались у пациентов независимо от степени тяжести состояния. Кроме того, у пациентов с высоким уровнем ИЛ10 отмечалась более выраженная положительная динамика по шкале NIH (р≤0,06) к 14-м суткам заболевания. 16 Таблица 5. Уровень ИЛ10 у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом при высоких и низких его значениях по сравнению с контролем Сутки Высокий Контроль уровень M±m р Низкий Контроль M±m уровень M±m пг/мл M±m пг/мл пг/мл 1 сутки 16,78±1,29 3 сутки 20,55±1,19 7 сутки 26,82±2,11 р пг/мл 1,23±0,28 0,000 0,75±0,11 0,000 1,8±0,21 0,000 1,2±0,22 ns 1,23±0,28 ns ns При проведении сравнительного анализа сывороточных уровней ИЛ10 с ФНОα и FasL было выявлено однонаправленное изменение их концентрации – постепенное нарастание их сывороточного уровня от 1-х к 7-м суткам. Кроме того, были установлены прямые статистически значимые корреляции между уровнем ИЛ10 на 1-е (r=0,45; р≤0,028), 3-и (r=0,43; р≤0,041) и 7-е (r=0,043; р≤0,046) сутки и уровнем сывороточного sFasL на 1-е сутки заболевания у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом. В отличие от ФНО-α, концентрация ИЛ10 достоверно нарастала к 3-м суткам заболевания и статистически значимо не отличалась у пациентов с состоянием разной степени тяжести; у пациентов с высокими значениями ИЛ10 в сыворотке крови имела место более выраженная положительная динамика в неврологическом статусе к 14-м суткам заболевания. Таким образом, результаты исследования взаимодействия про- и противовоспалительных цитокинов, а также индукторов апоптоза на примере ФНО-α, ИЛ10 и sFasL показали однонаправленную динамику изучаемых маркеров. При этом повышение уровня ФНО-α с 1-х суток заболевания, опережающее нарастание уровня sFasL, а также достоверный рост концентрации ФНО-α у тяжелобольных пациентов к 7-м суткам указывает на провоспалительную и проапоптотическую роль данного цитокина в патогенезе атеротромботического ишемического инсульта. Динамика уровня ИЛ10 и соотношение его концентраций со степенью восстановления неврологического дефицита может отражать модуляторные функции ИЛ10 при ишемическом процессе в головном мозге. Наряду с комплексным изучением про- и противовоспалительных факторов, индукторов апоптоза и антиапоптозных систем, элементов врожденного иммунитета, 17 был исследован уровень сывороточной ММП-9, обладающей деградирующей способностью в отношении почти всех компонентов внеклеточного матрикса, встречающихся в соединительных тканях, а также биологически активных пептидов. Исследование концентрации сывороточной ММП-9 в остром периоде атеротромботического ишемического инсульта выявило достоверное повышение ее значений на 1-е (p<0,01) и на 3-е (p<0,03) сутки заболевания по сравнению с группой контроля. На 1-е сутки заболевания было выявлено максимальное значение ММП-9 у пациентов основной группы, затем происходило достоверное снижение уровня к 7-м (р≤0,01) суткам. Было выявлено, что на 1-е (p≤0,006) и 7-е (p≤0,01) сутки заболевания концентрация ММП-9 была достоверно выше у пациентов с состоянием средней тяжести и тяжелым по сравнению с пациентами с минимальным неврологическим дефицитом (рис. 3). *-р≤0,05 по сравнению с легкобольными на 1 сутки #- р≤0,005 по сравнению с легкобольными на 7 сутки Рисунок 3. Динамика концентрации ММП-9 в зависимости от тяжести пациентов с ишемическим инсультом Корреляционный анализ выявил статистически значимую прямую зависимость между уровнем ММП-9 и тяжестью состояния пациентов по шкале инсульта NIH (r=0,436; р≤0,03) на 1-е сутки заболевания, что согласуется с литературными данными [Kelli P.G. et al., 2008]. Результаты исследования выявили однонаправленную динамику концентраций ИЛ10, ФНО-α и sFasL и обратную им динамику уровня ММП-9. Уровень ММП-9 достигал своего максимума на 1-е сутки заболевания, а затем последовательно снижался, в то время как происходило последовательное нарастание уровня ИЛ10, ФНО-α и sFasL. Наблюдаемое нами нарастание уровня ММП-9 к концу 1-х суток 18 ишемического атеротромботического инсульта закономерно и отражает многофакторность участия ММП-9 в этиопатогенезе заболевания: ремоделирование и повреждение покрышки атеросклеротической бляшки в инсульт-зависимой артерии, разрушение ГЭБ, разрушение и перестройка нейроваскулярного матрикса в очаге ишемии [Gladov S. et al., 1998; Fujimura M. et al., 1999]. Итак, настоящее атеротромботического врожденного исследование ишемического иммунитета, показало, инсульта воспалительного что в результате происходит ответа, развития активация запускаются систем программы, отвечающие за реализацию апоптоза и компенсаторный синтез антиапоптозных веществ в клетках периферической крови. Было впервые показано, что активное участие в патогенезе атеротромботического ишемического инсульта принимает моноцитарная экспрессия TLR4 периферической крови, которая достоверно повышается по сравнению с контрольными значениями и коррелирует с тяжестью состояния пациентов. Были исследованы динамика внутриклеточных БТШ70 и степень активности спонтанного апоптоза клеток периферической крови у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом. Выявлена антиапоптотическая роль внутриклеточных БТШ70, что может иметь большое значение для разработки новых стратегий цитопротекции. Изучена роль ФНО-α в патогенезе атеротромботического ишемического инсульта, показано наличие провоспалительных и проапоптотических свойств у данного цитокина. Коллагеназа ММП-9 определена как один из индикаторов тяжести течения заболевания, концентрация которой нарастает уже в острейшем периоде заболевания, в зависимости от тяжести инсульта. Полученные результаты, позволяющие наметить новые диагностические маркеры, а также цитопротекции, молекулярные делают терапевтические обоснованными дальнейшие мишени для исследования проведения в данном направлении с перспективой последующего клинического применения. ВЫВОДЫ: 1. Уровень экспрессии маркеров врожденного иммунитета – поверхностных TLR4 на моноцитах периферической крови достоверно повышается у больных с ишемическим атеротромботическим инсультом, начиная с 1-х суток заболевания (р≤0,05), по сравнению с контролем, и к 14-м суткам коррелирует с тяжестью состояния больных (r=0,8; р≤0,03). 2. Уровень спонтанного апоптоза клеток периферической крови (моноцитов и гранулоцитов) статистически значимо 19 повышается у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом, начиная с 1-х суток (р≤0,01), по сравнению с контролем, достигая своего максимума к 7-м суткам заболевания (р≤0,002). 3. Содержание одного из индукторов апоптоза sFasL в сыворотке крови достоверно нарастает к 7-м суткам ишемического инсульта (р≤0,05), при этом концентрация sFasL значимо не отличается у пациентов в зависимости от тяжести состояния, что, вероятно, отражает равную степень реализации FasL-индуцированного апоптоза при ишемическом инсульте разной степени тяжести. 4. Содержание внутриклеточных белков теплового шока 70 в клетках периферической крови в конце 1-х суток ишемического инсульта достоверно превышает контрольные значения (p≤0,05). Уровень белков теплового шока 70 на 1-е, 7-е и 14-е сутки инсульта обратно коррелирует с уровнем спонтанного апоптоза периферических клеток крови (r=-0,75; р≤0,01), что подтверждает антиапоптотические свойства внутриклеточного БТШ70. 5. Уровень ФНО-α у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом достоверно выше, чем в контроле, в течение всего острого периода заболевания. К 7-м суткам заболевания происходит достоверное нарастание концентрации сывороточного ФНО-α (р≤0,05) по сравнению с 1-ми сутками только в группе тяжелых инсультов, что отражает роль локального воспаления в патогенезе церебральной ишемии. 6. Сывороточный ИЛ10 у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом нарастает на 3-и сутки заболевания (р≤0,02), по сравнению с контрольными значениями, и проявляет модуляторные функции при ишемическом процессе в головном мозге: с одной стороны, положительно коррелируя с концентрацией индуктора апоптоза – sFasL (r=0,04; р≤0,05), а с другой – повышаясь у пациентов с более выраженной положительной динамикой восстановления неврологического статуса. 7. Уровень сывороточной ММП-9 у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом достоверно повышается на 1-е (p≤0,01) и 3-е (p≤0,03) сутки заболевания, по сравнению с контрольными значениями, и отражает тяжесть течения инсульта, значимо преобладая у пациентов с тяжелым и среднетяжелым состоянием, по сравнению с легкобольными (p≤0,006 и p≤0,01), и коррелируя со степенью тяжести заболевания по NIH (r=0,44; р≤0,03). 8. Уровень лейкоцитов на 1-е сутки заболевания статистически значимо коррелирует с объемом очага ишемии на 6-7-е сутки (r=0,47; р≤0,01) и тяжестью состояния в остром периоде заболевания (r=0,41; p≤0,01), что позволяет расценивать лейкоцитоз в периферической крови в 1-е сутки ишемического инсульта как предиктор тяжести 20 заболевания при отсутствии сопутствующей патологии, влияющей на данный показатель. 9. Проведенное комплексное клиническое и иммуннобиохимическое исследование маркеров развития временные атеротромботического взаимосвязи между ишемического инициацией и инсульта установило развертыванием процессов, участвующих в формировании отдаленных последствий ишемии (реакция системы врожденного иммунитета, компенсаторных воспалительный защитных механизмов ответ, (синтез апоптоз) и активацией внутриклеточных БТШ70, регуляторных цитокинов). ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. С целью прогнозирования течения атеротромботического ишемического инсульта целесообразно исследование в 1-е сутки заболевания уровня лейкоцитов периферической крови и концентрации сывороточной ММП-9, повышение которых предшествует утяжелению инсульта. 2. Учитывая полученные данные о клиническом значении экспрессии TLR4 на моноцитах периферической крови у пациентов с ишемическим инсультом, по сравнению с гранулоцитами, целесообразно дальнейшее изучение экспрессии рецептора на моноцитарных клетках. 3. Рекомендовано продолжить исследование уровня спонтанного апоптоза клеток периферической крови на большей выборке пациентов с различными патогенетическими вариантами ишемического инсульта для выявления возможной взаимосвязи активности апоптоза периферических клеток с апоптозом в очаге ишемического повреждения головного мозга, что может быть использовано в качестве диагностического маркера. 4. Учитывая результаты исследования, указывающие на антиапоптотические свойства внутриклеточного БТШ70, рекомендовано его дальнейшее клиническое изучение на большей выборке ишемического пациентов инсульта для с различными возможной нейропротекции. 21 патогенетическими разработки новых вариантами подходов к СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Скворцова В.И., Кольцова Е.А., Константинова Е.В., Шурдумова М.Х. Атеротромбоз каротидных и коронарных сосудов: особенности механизмов реализации ишемического повреждения // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С.Корсакова 2007;20:3-10. 2. Скворцова В.И., Константинова Е.В., Шурдумова М.Х., Еремин И.И., Ефремова Н.М. Провоспалительные цитокины у больных с острым ишемическим инсультом и инфарктом миокарда // Неврологический вестник (Журнал им. В.М.Бехтерева) 2007; 1;22-25. 3. Константинова Е.В., Шурдумова М.Х., Еремин И.И., Шостак Н.А., Скворцова В.И. Влияние перендоприла на уровень фактора некроза опухоли –α и матриксной металлопротеиназы - 9 периферической крови в остром периоде атеротромботического ишемического инсульта и инфаркта миокарда // Журнал неврологии и психиатрии им. Корсакова. 2008; 23:15-21. 4. Скворцова В.И., Шурдумова М.Х., Константинова Е.В. Значение Tollподобных рецепторов в развитии ишемического повреждения // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С.Корсакова 2010;4:12-17. 5. Константинова Е.В., Шурдумова М.Х., Еремин И.И., Ефремова Н.М. Скворцова В.И. Сравнительное изучение провоспалительных цитокинов при остром ишемическом инсульте и инфаркте миокарда // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С.Корсакова. Спецвыпуск 2007: 233 6. Скворцова В.И., Константинова Е.В., Кольцова Е.А., Шурдумова М.Х. Различия и общность механизмов формирования атеротромбоза и ишемического повреждения при атеротромботическом инсульте и инфаркте миокарда // Качество жизни 2007; 3(20): 8-13. 7. Скворцова В.И., Константинова Е.В., Шурдумова М.Х., Кольцова Е.А. Особенности атеросклеротического поражения в различных сосудистых бассейнах // Клиницист 2008; 4:7-10 8. Шурдумова М.Х., Константинова Е.В., Скворцова В.И., Еремин И.И., Шостак Н.А. Сравнительное изучение динамики уровня матриксной металлопротеиназы-9 и фактора некроза опухоли-альфа периферической крови в остром периоде атеротромботического ишемического инсульта и инфаркта миокарда // Труды I Национального Конгресса «Кардионеврология», А.В.Фонякина. Москва 2008: 325 22 под. ред М.А.Пирадова, 9. Константинова Е.В., Шурдумова М.Х., Еремин И.И., Шостак Н.А., Скворцова В.И. Исследование динамики уровня сывороточной матриксной металлопротеиназы-9 в остром периоде атеротромботического ишемического инсульта и инфаркта миокарда // Научно-практическая конференция. Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины. РГМУ. МБФ. Москва 2008: 58. 10. Шурдумова М.Х., Константинова Е.В., Еремин И.И., Скворцова В.И. Сравнительное изучение динамики уровня интерлейкина-10 и ФНО-А периферической крови в остром периоде атеротромботического ишемического инсульта // Материалы XVII Российского национального конгресса «Человек и Лекарство» 2010: 308-309. 11. Шурдумова М.Х., Константинова Е.В., Еремин И.И., Скворцова В.И. Исследование Fas-лиганда у больных с атеротромботическим ишемическим инсультом // Материалы Российской научно-практической конференции "Нарушения мозгового кровообращения: диагностика, профилактика, лечение". Пятигорск 2010:77-78. 23
