м.Київ, вул.Васильківська 45 кор.2 к.410 тел.(044) 455-91-78 факс(044)455-70-77
advertisement
м.Київ, вул.Васильківська 45 кор.2 к.410 тел.(044) 455-91-78 факс(044)455-70-77 info@cld.in.ua www.cld.in.ua __________________________________________________________________________________ Генодиагностика папилломавирусной инфекции высокого канцерогенного риска. Количественный подход. Куевда Д.А., Шипулина О.Ю. ФГУН «Центральный НИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора В настоящее время не возникает сомнений в том, что генитальная папилломавирусная инфекция способна приводить к развитию рака шейки матки (РШМ). В многочисленных работах указывается на то, что длящаяся более одного года инфекция вирусом папилломы человека (ВПЧ) повышает вероятность развития онкологической патологии в 250-300 раз. Кроме того, в клетках цервикальной карциномы вирус выявляется практически в 100% случаев (Walboomers JM, 2003, Liaw KI, 1999, информационный бюллетень ВОЗ, 2001). Однако течение папилломавирусной инфекции имеет свои особенности, которые должны быть обязательно учтены при ведении пациентов. С одной стороны известно, что около 70-80% случаев инфекции ВПЧ спонтанно излечиваются в течение 9-15 месяцев от момента заражения без проведения дополнительных лечебных процедур, опасность представляет лишь персистентная форма инфекции. Инфекция протекает довольно медленно: переход между стадией латентной инфекции к легкой дисплазии и от легкой дисплазии к тяжелой обычно требует нескольких лет, а весь процесс от момента заражения до развития манифестной формы рака обычно занимает 15-20 лет (Monsonegro J., “Emerging issues on HPV infections: from science to practice”, 2006). С другой стороны, инфекция довольно часто является «скрытой», что характеризуется отсутствием беспокойства и жалоб у пациентов до стадии манифестации рака, а так же низкой частотой выявления стадии предрака при обычном визуальном осмотре без привлечения инструментальных и лабораторных методов. В связи с описанными особенностями инфекции основным предназначением тестов, выявляющих вирус папилломы человека (ВПЧ-тестов), является четкое определение группы риска развития рака шейки матки, с целью дальнейшего обследования выявленных лиц с использованием инструментальных методов на наличие предрака шейки матки. Лечение осуществляется только в случае выявления признаков диспластических изменений эпителия. В случае же отсутствия признаков онкологической патологии при положительном результате ВПЧ-тестирования необходимым является тщательное наблюдение за лицами из группы риска либо до исчезновения инфекции, либо появления признаков диспластических изменений эпителия. Другими словами современный взгляд на использование ВПЧ-тестов сводится к использованию их в качестве метода скринингового выявления предрака шейки матки или возможности его развития. Рядом международных организаций (ASCCP, ESIDOG, EUROGIN, ECOG, IARC WHO), а так же российской группой экспертов («Профилактика рака шейки матки», руководство для врачей, 2007) рекомендуется использование ВПЧ-тестов в скрининге в одном из трех возможных форматов: на первом этапе скрининга совместно с цитологией, на втором этапе после цитологии для разрешения неясных результатов (ASCUS) и, наконец, на первом этапе скрининга до проведения цитологии. Рекомендации использования ВПЧ-тестов так же даются специалистами, занимающимися вопросами цервикального скрининга в г. Москве: «Учитывая важнейшую этиологическую роль вируса папилломы человека в развитии предраковых заболеваний и рака шейки матки, врачам женской консультации рекомендуется проводить дополнительное обследование. Как известно, к ним относится обнаружение ДНК ВПЧ с помощью различных молекулярно-биологических методов» (Курцер М.А., Медведева П.И., 2005). Так же стоит отметить, что ВПЧ-тесты показали высокую эффективность и были рекомендованы к использованию в предсказании возможности рецидива тяжелой дисплазии (CIN2+) после проведенного хирургического вмешательства. Однако говоря о внедрении в практику ВПЧ-тестирования необходимо рассмотрение некоторых принципиальных вопросов. Во-первых, зачем внедрять ВПЧ-тестирование, если схема цервикального скрининга уже существует? Классической схемой скрининга считается проведение цитологического исследования на первом этапе с подтверждением положительного результата с использованием кольпоскопического и гистологического обследований (Прилепская В.Н., 2000). При этом, несмотря на то, что в целях ранней диагностики в России уже несколько десятилетий используется цитологический метод, выявляемость больных на третьей и четвертой стадиях РШМ превышает 40%. Так же считается, что около 30% случаев инвазивного РШМ являются результатом ошибок цервикального скрининга (Загайнова Е.В., 2004). «В настоящее время имеются веские основания утверждать об ограниченности классического цитологического теста по Папаниколау» (А. Сингер, 2005), что связано со следующими особенностями метода: сложность, необъективность, нестандартизованность, высокие требования к квалификации врача-цитолога, что в конечном итоге приводит к низкой чувствительности, в среднем составляющей 51%. В 12 обширных мультицентровых исследованиях, проведенных в разных странах, было показано, что чувствительность цитологического метода (для CIN) располагалась от 30 % до 87 % (в среднем 51 %), а специфичность составляла от 86% до 100% (А. Сингер, 2005; Wright, 2004). Кольпоскопическое обследование обладает рядом преимуществ по сравнению с цитологией. Однако, несмотря на это, смещение акцента в пользу кольпоскопии как метода первичного скрининга не вполне оправдано. Кольпоскопическое обследование требует работы квалифицированного специалиста (врач должен провести не менее 200 кольпоскопий под наблюдением высоко квалифицированного врача-кольпоскописта, чтобы начать самостоятельный кольпоскопический осмотр шейки матки), использования дорогостоящего оборудования, и имеет невысокую пропускную способность. Кроме того, данный метод может выявлять дисплазию эпителия шейки матки только в 75% случаев, около 50% результатов кольпоскопических исследований могут быть ложноположительными, а 25% тяжелых поражений эпителия при кольпоскопическом исследовании классифицируются как легкие. Наконец, результат гистологического исследования биоптата слизистой, взятого при кольпоскопии, может быть в 15% случаев ложноотрицательным (Buxton, 1991; Skehan, 1990; Denny, 1995). Ввиду этого возникла необходимость в дополнительном высокочувствительном методе скринингового исследования, а установление факта вирусной природы РШМ позволило использовать в качестве скрининговых тесты на ДНК ВПЧ. На сегодняшний день показана эффективность совместного применения цитологического исследования и тестов на ДНК ВПЧ при скрининге РШМ: повышение чувствительности до 99%-100%, возможность удлинения сроков повторного исследования с 1-3 лет до 5-7 лет и, как следствие, значительное снижение затрат (Dalstein, 2006; Petry, 2003; Saslow, 2002; Kim, 2002). Следующим является вопрос о том, каким критериям должен удовлетворять ВПЧ-тест, чтобы его диагностическая чувствительность была истинно высокой? В данном аспекте основным требованием к ВПЧ-тесту является его способность выявлять широкий спектр генотипов высокого риска. На сегодняшний день эпидемиологические исследования показали, что рак шейки матки может вызываться 18 типами вируса, из которых наиболее часто (94-98% случаев РШМ) встречаются следующие десять: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, 59. Следует особо подчеркнуть, что традиционное для России выявление всего двух высокоонкогенных генотипов 16 и 18 обладает не достаточно высокой диагностической чувствительностью (не более 72%-75%) (Киселев В.И. 2000, Munoz N, 2003, 2004). Наконец, одним из основных вопросов ВПЧ-тестирования является вопрос о диагностической специфичности исследования и способах ее повышения. Изначально данный вопрос неизбежно возникает в связи с тем, что в среднем четыре женщины из пяти инфицированных спонтанно излечатся от вируса и лишь у одной инфекция перейдет в персистентную форму и появятся признаки легкой дисплазии и/или кондиломатоза. Однако эпидемиологические исследования указывают, что подавляющая часть инфицирований происходит в первые годы после вступления в половую жизнь. Так длительное наблюдение за студентами в США, начиная с возраста 17 лет, показало, что в течение шести лет папилломавирусной инфекцией переболевало более 80% женщин (Winer 2003). Обычно выявление вируса через 7-10 лет после вступления в половую жизнь отражает случаи персистенции ВПЧ. Таким образом, важным требованием становится введение ограничений на возраст первого скринингового исследования с использованием ВПЧ-теса: либо проведение тестирования начиная с 25-30-летнего возраста, либо через 7-10 лет после начала половой жизни. Строго следуя этому правилу, в США удалось показать, что диагностическая специфичность ВПЧ-тестирования лишь на 2-3% уступает цитологическому методу (Dalstein, 2006). Вторым фактором, от которого может зависеть специфичность исследования является набор характеристик используемого ВПЧ-теста. Для получения максимальной диагностической специфичности в первую очередь ВПЧ-тест должен выявлять исключительно высокоонкогенные генотипы ВПЧ. На сегодняшний день охарактеризовано более 100 вирусов папилломы человека, которые, однако, являются достаточно гетерогенной группой. Среди всех ВПЧ выделяют подгруппы типов кожных (тропны к ороговевающему эпителию) и аногентиальных (тропны к эпителию слизистых оболочек). В ряду последних выделяют подгруппы низкого и высокого канцерогенного риска. Типы низкого риска вызывают развитие кондилом гениталий и папилломатоз гортани у детей. Кроме того, под воздействием вирусов данной группы могут развиваться дисплазии легкой степени, однако инфицирование ими практически никогда не приводит к развитию тяжелых дисплазий и карцином. В отличие от типов низкого риска, высокоонкогенные ВПЧ, наряду с генитальными кондиломами, способны приводить к развитию дисплазий средней и высокой степени тяжести, а так же способствовать раковому перерождению. Именно поэтому для более точной характеристики группы риска развития РШМ необходимо выявление только генотипов вируса высокого риска (Хансон К.П., 2002; Munoz, 2004). Еще одной важной способностью ВПЧ-теста, способствующей повышению специфичности исследования является необходимость определения количества вируса и введения порога клинической значимости вирусной нагрузки. Определение вирусной нагрузки является новым подходом в диагностике папилломавирусной инфекции, потому заслуживает особого внимания. Количественный подход в диагностике папилломавирусной инфекции. На сегодняшний день по данным литературы можно выделить следующие основания для определения вирусной нагрузки. Во-первых, показано, что вирусная нагрузка менее 100 тысяч геномов вируса в соскобе (при стандартном заборе материала цервикальной щеткой) или 3 логарифмов ВПЧ на 100 тысяч клеток является клинически малозначимым количеством вируса, практически не встречается в случае тяжелой дисплазии, а так же характеризуется минимальным риском развития дисплазии и почти 100% спонтанной регрессией. Считается, что при проведении скрининга на наличие онкологической патологии шейки матки выявление вируса в данном количестве является не оправданным, так как снижает специфичность исследования. Однако выявление малозначимого количества может быть необходимо при динамическом наблюдении вирусной нагрузки после проведенного хирургического лечения CIN2+. Более высокие, чем 3 логарифма на 100 тысяч клеток вирусные нагрузки считаются клинически значимыми. Таким образом порог в 100 тысяч геномов вируса в соскобе или 3 логарифма на 100 тысяч клеток обозначается как порог клинической значимости. Во-вторых, вирусная нагрузка более 5 логарифмов на 100 тысяч клеток обозначается как повышенное количество вируса и с большей вероятностью отражает наличие дисплазии или высокий риск ее развития и прогрессии. Этот порог обозначается как порог прогрессии. Наконец, снижение вирусной нагрузки на 1 логарифм за 6 месяцев является динамическим маркером транзиторной инфекции (Josefsson et al, 2000; van Duin et al, 2002; Dalstein et al, 2003; Snijders et al, 2003; Moberg et al, 2004, 2005). Вирусная нагрузка в диагностике ВПЧинфекции Копий/ 105 клеток 5lg Клинически значимое Количество вируса – хроническая инфекция, дисплазия или риск ее развития Высокая нагрузка – маркер дисплазии полохой прогноз Копий/ мл 107 Низкая нагрузка 105 3lg Клинически малозначимое количество вируса – транзиторная инфекция,регрессия,минимальный риск дисплазии. НО: определение оправдано после хирургического лечения С учетом вышеизложенных особенностей в Центральном НИИ Эпидемиологии была разработана методика количественного определения широкого спектра генотипов ВПЧ высокого канцерогенного риска, полностью соответствующая международным требованиям к ВПЧ-тестам. Данная методика задумывалась как аналог мирового стандарта ДНК диагностики папилломавирусной инфекции ВПЧ Digene®-теста. Использование для реализации теста современной технологии ПЦР в режиме реального времени позволило добиться показателей, сходных с ВПЧ Digene®-тестом, а по некоторым параметрам превзойти их. В частности, была предложена методика нормирования количества вируса на количество клеток человека, что является оправданным для внутриклеточных паразитов. Данный подход менее чувствителен к качеству забора материала, используемым цито-щеткам и транспортной среде. Метод ПЦР в режиме реального времени позволяет определять истинное количество вируса, в отличие от технологии Digene®, результаты которой выражены по условной и не привязанной к истинному количеству вируса шкале. Наконец метод Digene® выявляет лишь клинически значимое количество вируса. Разработанный метод, напротив, позволяет выявлять и дифференцировать как клинически значимое и повышенное, так и малозначимое количество вируса, что важно для мониторинга течения инфекции. Так же в Центральном НИИ Эпидемиологии были предложены варианты качественных ПЦР-ВПЧ-тестов, в которых, однако, так же учтено обязательное требование к выявлению клинически значимого количества вируса, проведена их сравнительная (с ВПЧ Digene®-тестом) валидация: совпадение результатов составило более 97%. На сегодняшний день продолжается апробация разработанных методик совместно с кафедрой акушерства и гинекологии МГМСУ (Шипулина О.Ю., Куевда Д.А., Минкина Г.Н.). Схема апробации включает проведение цитологического исследования (технология ThinPrep), кольпоскопии с биопсией (рассматриваются как золотой стандарт диагностики) и количественного обследования на ДНК ВПЧ. Общее количество обследованных пациенток превышает 3 тысячи. В ходе проведенных исследований было показано, что вирусная нагрузка в ВПЧ-позитивных образцах, полученных от пациенток, не имеющих цитологических и/или гистологических аномалий (N=198, медиана и процентили 2,5% и 97,5% 2,84 [0,29 – 6,31] логарифма на 100 тыс. клеток) достоверно отличается от вирусной нагрузки в случае тяжелой дисплазии и РШМ (N=129, 5,81 [3,27 – 7,58] логарифма на 100 тыс. клеток). lgВПЧ/ 100 тыс. кл. 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 Норма, ВПЧ+ N=198 H-SIL, РШМ N=129 Распределение вирусных нагрузок в образцах нормы и тяжелой дисплазии(H-SIL)/РШМ Кроме того, было подтверждено, что введение порога клинически значимого количества вируса на уровне 3 логарифмов ВПЧ на 100 тысяч клеток позволяет, при сохранении чувствительности выявления тяжелых дисплазии и РШМ на уровне 97,7% (было не выявлено 2 случая H-SIL: два образца были ВПЧ-негативными, один содержал вирусную нагрузку ниже порога: 2,8 lg/100 тыс./клеток), добиться увеличения специфичности исследования с 63,2% (при выявлении любых количеств вируса) до 85,7% (при введении порога). Характерно, что более половины (51%) всех случаев ВПЧ-позитивных образцов при сопутствующем нормальном результате цитологического и/или гистологического исследования имели вирусную нагрузку ниже порога. Заслуживает отдельного внимания тот факт, что при параллельном тестировании образцов методом жидкостной цитологии и выявлением ДНК ВПЧ диагностическая чувствительность по отношению к тяжелой дисплазии цитологического исследования составила 82,1%, определения ДНК ВПЧ – 98,4%, совместно двух методов – 99,2%. Анализ образцов с гистологическим диагнозом «тяжелая дисплазия» и цитологическим диагнозом «норма» или «реактивные изменения» показал, что все образцы содержали высокоонкогенные ВПЧ на уровне более 5 логарифмов на 100 тысяч клеток. С использованием разработанной методики количественного определения ВПЧ нам удалось провести мониторинг вирусной нагрузки у нескольких пациенток после проведенного лечения. Несмотря на то, что данных для статистически достоверных заключений недостаточно, была выявлена тенденция к постепенному снижению вирусной нагрузки и полному исчезновению вируса через 6-9 месяцев после хирургической процедуры у пациенток, выздоровевших в результате проведенного лечения. Напротив, у пациенток с рецидивом или неполным удалением диспластического очага наблюдалось снижение вирусной нагрузки непосредственно после проведенной хирургической процедуры (1-2 месяца) с дальнейшим неуклонным ростом вирусной нагрузки до прежних величин. Наконец в результате анализа всех образцов с повышенной вирусной нагрузкой (более 5 логарифмов на 100 тысяч клеток) было установлено, что в 94% случаев речь шла об образцах с дисплазиями, что указывает на информативность порога прогрессии. . В заключение хотелось бы еще раз подчеркнуть, что основными функциями проведения тестирования на высокоонкогенные вирусы папилломы являются возможность четкого выделения группы риска развития раковых изменений (скрининговая функция), предположения характера изменений при не ясной клинической картине и проведения мониторинга эффективности лечения. Однако получение высокочувствительных и высокоспецифичных результатов возможно только лишь строго соблюдая основные требования к ВПЧтестированию: введение возрастного ограничения на проведение исследования, выявление только высокоонкогенных генотипов вируса, выявление широкого спектра генотипов (более 10) и проведение количественной оценки.
