Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медикобиологического агентства России На правах рукописи ЛЁДОВ ВЛАДИМИР АЛЕКСЕЕВИЧ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МОДИФИЦИРОВАННОГО ЛИПОПОЛИСАХАРИДА SHIGELLA FLEXNERI 2A И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ШИГЕЛЛЁЗНОЙ КАНДИДАТНОЙ ВАКЦИНЫ 03.03.03 – иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: Апарин Пётр Геннадьевич доктор медицинских наук Москва – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1. Список использованных сокращений ……………………………... 7 2. ВВЕДЕНИЕ ………………………………………………............... 8 2.1. Актуальность темы исследования …………………………………. 8 3. Цель исследования ………………………………………………….. 11 4. Задачи исследования ………………………………………….......... 11 5. Научная новизна работы …………………………………………… 12 6. Теоретическая и практическая значимость ………………….......... 12 7. Объем и структура диссертации …………………………………… 14 8. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ …………………………........................... 15 8.1. Врождённый иммунный ответ на S. flexneri 2а …………………… 15 8.2. Адаптивный иммунный ответ на S. flexneri 2а ……………………. 21 8.2.1. Клеточно-опосредованный адаптивный иммунный ответ ………. 21 8.2.2. Гуморальный адаптивный иммунный ответ ……………………… 23 8.3. Основные подходы к разработке вакцин против S. flexneri 2а …... 27 8.3.1. Химические шигеллёзные вакцины ………………………….......... 28 8.3.2. Инактивированные шигеллёзные вакцины …………………......... 30 8.3.3. Живые шигеллёзные вакцины ……………………………………... 31 8.3.3.1. Неинвазивные живые вакцины …………………………………….. 32 8.3.3.2. Инвазивные живые шигеллёзные вакцины ………………….......... 34 8.3.4. Векторные шигеллёзные вакцины ………………………………… 36 8.3.5. Стратегии по созданию ассоциированных (мультисеротипных) шигеллёзных вакцин …………………............................................... 36 9. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ……............... 41 9.1. Методы получения нативного ЛПС S. flexneri 2а и его производных ………………………………………………………… 41 9.1.1. Штамм кишечной бактерии ………………………………………... 41 9.1.2. Выделение и очистка ЛПС …………………………………………. 41 2 9.2. Определение химической структуры нативного ЛПС S. flexneri 2а и его производных …………………………………… 41 9.3. Постановка метода непрямого твёрдофазного иммуноферментного анализа для определения специфичности нЛПС S. flexneri 2а и его производных ……..................................... 42 9.4. Методика определения пирогенности у кроликов на введение нЛПС S. flexneri 2а и его производных ……………......................... 43 9.5. Определение гуморального ответа у мышей, иммунизированных образцами, содержащими нЛПС S. flexneri 2а с преобладанием короткоцепных, длинноцепных фракций или без явного преобладания какой-либо из фракций .............................................. 44 9.5.1. Методика интраперитонеальной иммунизации мышей и отбора биоматериала …………………………………………....................... 44 9.5.2. Постановка нТИФА для определения IgG и IgM у мышей, иммунизированных образцами, содержащими нЛПС S. flexneri 2а с преобладанием короткоцепных, длинноцепных фракций или без явного преобладания какой-либо из фракций .... 44 9.6. Определение гуморального ответа у мышей, иммунизированных образцами с пониженными показателями пирогенности, отличающихся по содержанию ЛПС с разной длиной ПС цепи ……………………………….................................. 45 9.7. Определение антител у мышей, иммунизированных образцами, содержащими д/ц ЛПС S. flexneri 2а и отличающимися по строению липида А …………………………………………………. 45 9.8. Методы, используемые для характеристики гуморального иммунного ответа у мышей (CBA x C57 Bl/6) F1, иммунизированных образцами, содержащими преимущественно длинноцепные 3-ацильные производные ЛПС S. flexneri 2а …...... 45 9.8.1. Методика иммунизации мышей образцом 3,4-ац д/ц мЛПС и отбора биоматериала ………………………………………….......... 46 3 9.8.1.1. Методика интраперитонеальной иммунизации мышей образцом 3,4-ац д/ц мЛПС и отбора биоматериала ………………………….. 46 9.8.1.2. Методика подкожной иммунизации мышей образцом 3,4-ац д/ц мЛПС и отбора биоматериала ……………………………………... 46 9.8.1.3. Методика интраназальной иммунизации мышей образцом 3,4-ац д/ц мЛПС и отбора биоматериала ……………………..................... 46 9.8.2. Определелие сывороточных агглютинивов методом РПГА …….. 47 9.8.3. Постановка нТИФА для характеристики изотипов и субизотипов IgG сывороточных антител и антител на слизистой у мышей (CBA x C57 B1/6) F1, иммунизированных 3,4-ац д/ц мЛПС …….. 47 9.9. Определение протективной активности 3,4-ац д/ц мЛПС в опыте по экспериментальному заражению …………………..................... 48 9.9.1. Определение ИД50 и ИД100 вирулентного штамма S. flexneri 2a 1605 у морских свинок …………………………............................... 48 9.9.2. Постановка кератоконъюнктивальной пробы …………………….. 48 9.10. Определение перекрёстной активности сывороточных антител у мышей после иммунизации 3,4-ац д/ц мЛПС …………………….. 49 9.10.1. Методика иммунизации мышей для определения перекрёстной активности сывороточных Ат ……………………………………… 49 9.10.2. Оценка бактериолитических свойств мышиных сывороток .......... 49 9.11. Клиническое исследование кандидатной вакцины против дизентерии Флекснера 2а «Флексвак» ……………………………. 50 9.11.1. Цель и задачи исследования кандидатной вакцины «Флексвак» .. 50 9.11.2. Состав исследуемого препарата …………………………………… 51 9.11.3. Дизайн исследования ………………………………………….......... 51 9.11.4. Отбор участников исследования …………………………………... 52 9.11.5. График обследования и процедур у добровольцев, принявших участие в исследованиии препарата «Флексвак»…………………. 53 9.11.6. Оценка безопасности кандидатной вакцины «Флексвак» ….......... 56 4 9.11.7. Определение специфического иммунного ответа у добровольцев, иммунизированных препаратом «Флексвак» …………………….. 57 9.11.7.1. Постановка РПГА для определения О-специфических анти-S. flexneri 2а антител в сыворотках добровольцев ……….... 58 9.11.7.2. Постановка нТИФА для определения О-специфических анти-S. flexneri 2а антител в сыворотках добровольцев ………… 58 9.12. Методы статистической обработки полученных результатов …... 58 10. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ …………………….............. 59 10.1. Характеристика структур ЛПС S. flexneri 2а, используемых для формирования исследовательских панелей ……………................. 59 10.2. Исследование влияния структурного полиморфизма ЛПС S. flexneri 2a на его О-специфическую антигенную активность с использованием моно- и поливалентных шигеллёзных сывороток …………………………………………………………… 63 10.3. Изучение условий индукции пирогенной реакции у кроликов производными нЛПС S. flexneri 2а ………………………………… 66 10.4. Исследование гуморального ответа у мышей к пирогенным нЛПС S. flexneri 2а, отличающихся по длине О-ПС цепи ….......... 68 10.5. Исследование гуморального ответа у мышей к низкопирогенным и апирогенным ЛПС с различной длиной цепи О-ПС ….………... 73 10.6. Изучение влияния структуры липида А на иммуногенность длинноцепного ЛПС S. flexneri 2а у мышей ………………………. 75 10.7. Системный гуморальный иммунный ответ и иммунный ответ на слизистых у мышей (CBA x C57 B1/6) F1, иммунизированных длинноцепными 3-ацильные производными ЛПС S. flexneri 2а … 77 10.8. Исследование протективной активности образца 3,4-ац д/ц мЛПС S. flexneri 2а ………………………………………………….. 81 10.9. Перекрёстная бактериолитическая активность сывороточных антител мышей, полученных при иммунизации образцом длинноцепного 3-ацильного производного ЛПС S. flexneri 2а ...... 83 5 10.10. Исследование кандидатной вакцины против дизентерии Флекснера 2а с участием здоровых добровольцев, по результатам I фазы клинических исследований …………….......... 85 10.10.1. Оценка безопасности кандидатной вакцины «Флексвак» ….......... 87 10.10.2. Оценка иммуногенности кандидатной вакцины «Флексвак» для добровольцев ………………………………………………………... 92 11. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ……………………………….. 96 12. ВЫВОДЫ ………………………………………………………….. 114 13. Список литературы …………………………………………………. 115 6 1. Список использованных сокращений Ат – антитело Аг – антиген КТ – конечный титр ЛПС – липополисахарид нТИФА – непрямой твёрдофазный иммуноферментный анализ О-ПС – О-полисахарид РПГА – реакция прямой гемагглютинации 7 2. ВВЕДЕНИЕ 2.1. Актуальность темы исследования Дизентерия относится к числу тех немногих инфекционных заболеваний, которые не только были известны человечеству со времен античности, но и до сих пор сохранили свое первоначальное название. Дизентерия (шигеллез) — острый инфекционный колит, вызываемый бактериями рода Shigella. Термин «дизентерия» образовался из двух греческих слов — dys (нарушение) и епteron (кишечник) — и был предназначен для описания поноса, сопровождающегося слизистым калом с примесью крови, болью, тенезмами, лихорадкой [22]. Только в 1898 г. японский исследователь Киоши Шига выделил из испражнений больных бациллу, которая была признана возбудителем бактериальной дизентерии. Ввиду установления различной этиологии дизентерии, в первой половине ХХ столетия в медицинской литературе использовали термины «бациллярная» и «амебная» дизентерия. С 1930 г. бациллы, выделяемые от больных дизентерией, официально были объединены в род Shigella, семейство Enterobacteriaceae. В настоящее время под дизентерией понимаются только заболевания, вызванные шигеллами [10]. Шигеллы — тонкие неподвижные грамотрицательные палочки, принадлежащие к трибе Escherichieae семейства Enterobacteriacae. Отличить шигелл от Escherichia coli не удается даже с помощью олигонуклеотидных зондов, так как они находятся в тесном родстве. Было бы правильнее считать шигелл особой патогенной разновидностью Escherichia coli [22]. Идентификация шигелл осуществляется по их биохимическим и антигенным свойствам (О — антигенам), в соответствии с чем выделяют четыре вида шигелл: Shigella dysenteriae (группа A) - 15 серотипов; Shigella flexneri (группа B) - 14 серотипов и подсеротипов; Shigella boydii (группа C) - 20 серотипов; и Shigella sonnei (группа D) имеет единственный серотип [41]. 8 Шигеллы — антропофильные бактерии, они патогенны только для человека и нескольких видов обезьян. Для возникновения болезни у клинически здорового взрослого человека достаточно небольшого количества возбудителей (нескольких тысяч или даже сотен) [22]. В основе патогенеза дизентерии лежит проникновение шигелл в клетки эпителия толстой кишки и дальнейшее их горизонтальное межклеточное распространение. Ежегодно повсеместно в мире регистрируется 164,7 млн. случаев дизентерии, из них 163,2 млн. случаев приходится на развивающиеся страны (с 1,1 млн. смертельных исходов) и 1,5 млн. случаев на индустриальные. При этом заболеваемость и смертность детей младше 5 лет составляет соответственно 69% общих случаев и 61% общих смертей. Заболеваемость по отдельным видам шигелл S. flexneri, S. sonnei, S. boydii, S. dysenteriae составляет соответственно 60%, 15%, 6%, 6% в развивающихся странах и 16%, 77%, 2%, 1% в индустриальных. Доминирующим возбудителем дизентерии Флекснера как в развивающихся, так и в индустриальных странах является S. flexneri 2а. Также определены другие эпидемически значимые серотипы шигелл Флекснера: 1b, 3a, 4a и 6 [37]. Удельный вес дизентерии в структуре заболеваемости ОКИ в Российской Федерации с 2007 года остаётся стабильно высоким. Из, примерно, 700 тысяч человек с симптомами ОКИ у 20% выявлена дизентерия и у, примерно, 60% этиология ОКИ не установлена. Заболеваемость детей до 14 лет дизентерией существенно превышает заболеваемость взрослых [12]. Вероятно, это связано с эпидемической заболеваемостью дизентерией в местах массовых скоплений детей [17]. У дизентерии множество форм и вариантов течения, зависящих от состояния макроорганизма, вида и вирулентности шигелл, дозы возбудителя, срока начала заболевания и т.д. Наиболее распространена острая форма. Выраженные клинические проявления заболевания (такие как, субфибрильная лихорадка, 9 частый жидкий стул, боль в животе) угасают к 7-10 дню, но полное выздоровление, включая репарацию повреждённой слизистой кишечника, требует от месяца. Также возможно и бактерионосительство, и хроническая форма, и системное течение болезни. В указанных случаях больной является высококонтагиозным носителем инфекции. Постановка диагноза значительно затруднена, из-за отсутствия выраженных клинических проявлений [14]. Следовательно, рациональное лечение либо не проводится, либо проводится на поздних стадиях заболевания. Значительные трудности в терапии бактериальных ОКИ создает повсеместное появление и распространение полирезистентных к антибиотикам штаммов [6, 12]. В связи с чем, согласно Отечественным и Европейским рекомендациям [11, 74], энтеропатогены (шигеллы, сальмонеллы, эшерихии и др.) входят в группу микроорганизмов, требующих постоянного мониторинга за их чувствительностью к антимикробным препаратам. По результатам многоцентрового исследования чувствительности шигелл, проведённого за период 1998-2000 годы, наибольшей резистентностью отличались штаммы S. flexneri, которые практически полностью были устойчивы к аминопенициллинам, ко-тримоксазолу, тетрациклину и хлорамфениколу, с незначительными вариациями в различных центрах. Все штаммы Shigella spp. были чувствительны к ципрофлоксацину, норфлоксацину, налидиксовой кислоте (исключение изотипы в г. Москва, где 2,3% штаммов были устойчивы) и цефотаксиму [2, 7]. В 2006 году в г. Санкт - Петербурге было проведено более подробное исследование 834 штаммов шигелл Флекснера на предмет их чувствительности к антимикробным препаратам. Чувствительность определялась к ампициллину, цефтазидиму, цефотаксиму, меропенему, хлорамфениколу, ципрофлоксацину, гентамицину, амикацину, канамицину, стрептомицину, тобрамицину, тетрациклину. Доля полирезистентных штаммов среди изученных шигелл 10 Флекснера с абсолютным преобладанием S. flexneri 2a (56 ± 5,7 %) и S. flexneri 3a (38 ± 5,6 %) составила 94 ± 1,7 %. Один из штаммов шигелл Флекснера 2а (Shigella flexneri 2a 861) был, как и подавляющее большинство других шигелл, резистентным к ампициллину, тетрациклину и хлорамфениколу, но в дополнение к этому оказался резистентным ко всем изученным аминогликозидам и цефтазидиму [6]. Хотя шигеллы Флекснера и являются важными этиологическими факторами эпидемий инфекционной диареи во всём мире, коммерческого вакцинного препарата против дизентерии Флекснера до настоящего времени не разработано. 3. Цель исследования Доказать возможность применения модифицированного липополисахарида S. flexneri 2a в качестве кандидатной вакцины против дизентерии Флекснера. 4. Задачи исследования: 1. Исследовать влияние длины цепи О-полисахарида и количества остатков высших жирных кислот в липиде А нативного и модифицированного липополисахарида S. flexneri 2a на пирогенную реакцию и гуморальный иммунный ответ у экспериментальных животных. 2. Определить модифицированного наиболее иммуногенный липополисахарида S. flexneri апирогенный 2a для вариант включения в кандидатную вакцину против дизентерии Флекснера и провести его развернутое иммунологическое исследование. 3. Исследовать механизмы иммунной защиты на слизистых и перекрестную серологическую активность иммуногенного апирогенного модифицированного липополисахарида S. flexneri 2a. 4. Провести I фазу клинических исследований кандидатной вакцины «Флексвак» на основе модифицированного липополисахарида S. flexneri 2a. 11 5. Научная новизна работы Разработаны фундаментальные основы иммунопрофилактики дизентерии Флекснера, заключающиеся в доказательстве возможности активации адаптивного мукозального иммунного ответа при парентеральном введении модифицированных липополисахаридов. Выяснены механизмы иммунологического распознавания модифицированных липополисахаридов. Показано, что увеличение длины цепи О-полисахарида повышает иммуногенность, а уменьшение количества остатков жирных кислот в липиде А до двух снижает иммуногенность липополисахарида S. flexneri 2а. Установлено формирование иммунной памяти в ответ на введение различных структурных вариантов модифицированных липополисахаридов. Доказано, что апирогенный и иммуногенный липополисахарид S. flexneri 2а включает триацильный липид А и длинноцепной О-полисахарид. Установлены особенности формирования иммунной защиты от инфицирования вирулентным штаммом S. flexneri 2а при иммунизации триацильным длинноцепным модифицированным липополисахаридом. Проведена I фаза клинических испытаний кандидатной вакцины «Флексвак». Впервые в клинических исследованиях доказана безопасность, хорошая переносимость и выраженная иммуногенность кандидатной вакцины «Флексвак», на основе модифицированного липополисахарида S. flexneri 2а. 6. Теоретическая и практическая значимость Теоретическая значимость работы обоснована тем, что доказаны положения, вносящие значительный вклад в понимание молекулярных механизмов активации мукозального иммунитета с применением модифицированных апирогенных липополисахаридов S. flexneri 2а. Изложены доказательства возможности модификации липополисахарида с сохранением его иммуногенности и достижением апирогенности. Изучено и установлено, что увеличение количества 12 остатков жирных кислот в липиде А и/или длины цепи О-полисахарида S. flexneri 2а повышает способность к индукции адаптивного иммунного ответа. Раскрыта неизвестная ранее проблема появления иммуносупрессирующего эффекта модифицированного липополисахарида S. flexneri 2а при увеличении содержания модернизация в препарате фракции экспериментальной диацильных модели для производных. определения Проведена протективной активности препарата при кератоконъюнктивальном заражения животных S. flexneri 2а, заключающаяся в использовании парентерального способа иммунизации. Основным имеющим значением для практики результатом работы является создание нового вакцинного препарата против дизентерии Флекснера 2а «Флексвак». Активным веществом препарата является модифицированный липополисахарид S. flexneri 2а. Разработаны предложения по использованию парентерального введения как эффективного способа применения липополисахаридных дизентерийных вакцин. Результаты изучения безопасности препарата для парентерального введения «Флексвак» в I фазе клинических исследований с участием здоровых добровольцев свидетельствуют о хорошей переносимости, низкой реактогенности кандидатной вакцины при использовании выбранных доз. Определены перспективы клинического применения кандидатной вакцины «Флексвак» для профилактики дизентерии в группах риска. Создан проект фармацевтической статьи предприятия для кандидатной вакцины против дизентерии Флекснера 2а «Флексвак». Представлены рекомендации по получению липополисахаридов в качестве основы для создания вакцин. Полученные данные могут быть использованы в образовательном процессе медицинских и биологических высших учебных заведений, а также в системе последипломного образования. 13 7. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы, 24 рисунка. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, список литературы. Библиография включает 171 источник, в том числе 23 отечественных и 148 зарубежных. 14 8. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8.1. Врождённый иммунный ответ на S. flexneri 2а Врождённый иммунный ответ обеспечивает раннюю защиту против бактериальной инфекции, служит для ограничения инфекционного процесса и регулирования последующего адаптивного иммунного ответа. Многие типы клеток, такие как фагоциты (моноциты, макрофаги и дендритные клетки), лимфоциты (натуральные киллеры (NK) и γδТ- клетки), а также растворимые протеины, цитокины (преимущественно, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12, фактор некроза опухоли - α (ФНО-α), интерферон-γ (ИНФ-γ) и производимые печенью белки плазмы, такие как компоненты комплемента, вносят свой вклад во врождённый иммунный ответ. Помимо классических компонентов иммунокомпетентные - эпителиальные клетки кишечника иммунитета не также отвечают за контроль бактериальной инвазии, производя хемокины, которые привлекают и активируют иммунокомпетентные клетки [108]. Конечным результатом сложного взаимодействия этих факторов является острое воспаление. В вызванной S. flexneri воспалительной реакции можно выделить две фазы: первичное воспаление, локализованное в месте проникновения шигеллы и, более позднее, вторичное воспаление, для которого характерно образование больших зон эпителиальной деструкции и изъязвления слизистых, распространяющихся далеко от места первичной инвазии бактерии [128]. Так как шигеллы неспособны проникнуть в энтероциты с апикального полюса, они использует М-клетки - специализированные эпителиальные клетки в фолликул ассоциированном эпителии, который располагается над лимфоидной тканью. В подэпителиальном пространстве шигеллу фагоцитируют резидентные макрофаги и дендритные клетки [63]. После поглощения шигеллы происходит лизис фагоцитарной вакуоли и быстрая смерть инфицированной клетки путём апоптоза [171]. Апоптоза не было отмечено среди клеток, поглотивших штаммы без плазмид вирулентности, что в дальнейшем привело к индентификации протеина IpaB – медиатора клеточной смерти, закодированного в плазмиде 15 вирулентной шигеллы [170]. IpaB проникает в цитозоль, где он связывается с каспазой-1 и активирует её [101]. Апоптоз обычно рассматривают как иммунологически бесшумный процесс клеточной гибели, протекающий без воспаления, однако, в случае каспазы-1 зависимого апоптоза это не так. Каспаза-1 также рассматривается как ИЛ-1 – превращающий фермент, и поэтому активирует провоспалительные цитокины ИЛ-1b и высвобождаемого из инфицированных ИЛ-18 [94]. апоптотических Влияние ИЛ-1, макрофагов, было исследовано на патогномоничной кроличьей модели. Введение антагониста рецептора ИЛ-1, до инфицирования вирулентным штаммом шигеллы, значительно уменьшало воспаление и деструкцию ткани в лимфоидных фолликулах [75]. Таким образом, ранняя фаза воспаления, вследствие действия хемоаттрактантов, преимущественно ИЛ-1, обусловлена первичным притоком нейтрофилов в область лимфоидных фолликул [76]. Помимо ИЛ-1 существенная роль в рекрутировании нейтрофилов на первой фазе шигеллёзного воспаления отводится ИНФ-γ. Влияние ИНФ-γ и ФНО-α было исследовано на модели шигеллёза в лёгком грызуна [124, 161]. В этой модели дикие штаммы шигелл вводятся интраназально, где они, проникая в трахеобронхиальное дерево, вызывают бронхо-, трахео-альвеолит [109]. Местная продукция ФНО-α и ИНФ-γ происходит в течение первых 24 часов от момента инфицирования. Инъекция сублетальной дозы шигелл ИНФ-γ0 - нокаутным мышам приводит к выраженной местной пролиферации бактерий и гибели животных. У обычных же мышей было отмечено постепенное снижени числа бактерий в лёгких [165]. Гистологическое исследование лёгких нокаутных мышей показало облитерирущий нейтрофильный бронхиолит, выявив неспособность нейтрофилов, при отсутствии ИНФ-γ, обеспечить клиренс инфекции. Активированные Т-лимфоциты (CD 8+, γδТ - клетки) и NK-клетки способны к «быстрой» продукции ИНФ-γ на моделях по экспериментальному интраназальному заражению мышей дикими штаммами шигелл [79]. Известно что, дендритные клетки (ДК) также секретируют ИНФ-γ при их активации in vitro и последующим инфицировании in vivo, например, такой 16 бактерией как Listeria monocytogenes [160]. Вместе с тем было установлено, что алимфоидные, но содержащие ДК – Rag0 γc0, как и ИНФ-γ0 - нокаутные мыши одинаково восприимчивы к инфицированию шигеллой. Таким образом, ДК самостоятельно оказались неспособны обеспечить защиту от данной инфекции. На беспородных мышах было установлено, что NK-клетки и αβТ-клетки секретируют ИНФ-γ в ответ на инфицирование шигеллой. Мыши, имеющие только NK- клетки (Rag0) и мыши только с αβ Т-клетками (αβ Т-восстановленные Rag0 γc0) способны подавить шигеллёзную инфекцию и выжить [40]. Вероятно, у ИНФ-γ несколько функций в рамках врождённого противошигеллёзного ответа: ограничение бактериальной пролиферации в эпителиальных клетках [165], увеличение активности макрофагов и ингибирование апоптоза макрофагов, вызванного S. flexneri [102]. В результате развития раннего воспаления происходит обособление инфицированного участка и дестабилизация эпителия кишечника. Потеря целостности эпителиального барьера позволяет большему количеству бактерий попасть в подэпителиальное пространство, где открыт доступ к базолатеральному полюсу, через который шигелла может легко попасть в энтероциты [133]. Вторая фаза воспаления возникает на некотором удалении от лимфоидных фолликулов и инициируется провоспалительными цитокинами, преимущественно ИЛ-8, секретируемыми инфицированными эпителиальными клетками [152]. В патогномоничной модели замкнутой петли подвздошной кишки кролика было обнаружено, что моноклональные нейтрализующие анти-ИЛ-8 АТ значительно уменьшают приток нейтрофилов в кишечные ворсинки и ослабляют последующую деструкцию эпителия. Исследования in vitro показали, что продукция эпителиальными клетками ИЛ-8 опосредует миграцию нейтрофилов через монослой поляризованных энтероцитов, и что для активации этого процесса достаточно адгезии липополисахарида (ЛПС) к базолатеральной поверхности энтероцита, не зависимо от того произошла инвазия S. flexneri или нет [77, 130]. Влияние длины ЛПС на способность шигелл к интернализации энтероцитов и привлечению нейтрофилов было изучено с помощью ЛПС-дефективных (rfc, rfaL, 17 gal) и дикого штаммов. Штаммы, продуцирующие высокомолекулярные ЛПС (дикий и rfc штаммы) имеют больший процент адгезий и способны опосредовать трансмиграцию нейтрофилов через монослой поляризованных энтероцитов в отличие от штаммов с R-формами ЛПС (rfaL, gal штаммы). Кроме того, при добавлении противовоспалительного антагониста ЛПС - RsDPLA [142] у дикого штамма S. flexneri значительно снижается способность к инвазии (около 50%) [116]. Быстрое развитие воспаления в отдалении от лимфоидных фолликулов также связано с межклеточным распространением шигелл, что подтверждается опытом экспериментального S. flexneri 2а, заражения способным макак-резус проникать в мутантным энтероцит штаммом без ∆icsА последующего межклеточного распространения [153]. Неправильное позиционирование IcsА также препятствует межклеточному распространению шигелл. Белок IcsА должен располагаться униполярно для формирования актинового мостика и, в конечном счёте, протрузии в соседнюю клетку. Для зтого необходима активная продукция штаммами шигелл S-форм ЛПС. В то время как на бактериях с R-формами ЛПС (rfe, galU) наблюдается его диффузное расположение распространяться по [62]. Неспособность эпителиальному слою мутантных ограничивает штаммов высвобождение хемокинов, тем самым уменьшая зону воспаления. Существенный вклад в развитие воспаления, в особенности в локусах, удалённых от места инвазии шигелл, принадлежит эндотоксической составляющей не связанного с поверхностью бактерии ЛПС – липиду А [3]. Липид A S. flexneri построен из двух остатков глюкозамина, соединенных β(1-6)-гликозидной связью. С1 восстанавливающего остатка глюкозамина и С4' невосстанавливающего фосфорилированы, а гидроксильные и аминогруппы обоих остатков могут нести до шести остатков высших жирных кислот с углеводородными цепями разной длины [90]. Распознавание ЛПС эффекторными клетками обеспечивается через toll-подобные рецепторы 4 типа (TLR-4). Транспорт растворимого ЛПС к TLR-4 в 18 межклеточном пространстве осуществляется с помощью липид-связывающего белка (ЛСБ). ЛСБ осуществляет демицелирование ЛПС конгломерата, нейтрализует его эндотоксическую активность и участвует в распознавании ЛПС, т.к. комплекс ЛПС с ЛСБ гораздо эффективнее взаимодействует с клеточными рецепторами СD-14 и TLR-4 [97]. Рецептор CD-14 не имеет внутриклеточной части, нужной для проведения активационного сигнала. Его функция сводится к связыванию ЛПС и формированию высокоаффинного рецепторного комплекса вместе с TLR-4. CD14 существует и в растворимой форме, не утрачивая способности взаимодействия с ЛПС. Адаптерная молекула MD2, обеспечивает стабильность всего комплекса. Проведение активационного сигнала после связывания ЛПС взаимодействия обеспечивают с внутриклеточные внутриклеточным домены адаптерным TLR-4, белком путем MyD88 и фосфорилированием с участием киназ IRAK-1 и IRAK-4. Вслед за этим происходит активация внутриклеточного фактора TRAF-6, расщепление димерного комплекса IKKa/IKKb, освобождение и транслокация в ядро транскрипционного фактора NFkB, что приводит к началу экспрессии генов цитокинов, NO-синтетазы и генов других медиаторов, ферментов и регуляторных молекул воспаления [16, 36]. В результате происходит активация секреции интерлейкинов - ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10 ФНО-α, интерферона I типа. Как показали исследования, проведённые с участием здоровых добровольцев, количество жирных кислот в липиде А S. flexneri 2а влияет на степень активации медиаторов. TLR-4, следовательно и на уровень провоспалительных Степень активации TLR-4 пента- и тетраацильными ЛПС S. flexneri 2а значительно ниже, чем гексаацильными [59]. Представленные данные являются дополнительным свидетельством роли липида А в индукции врождённого иммунного ответа человека при шигеллёзе. Результаты приведённых исследований указывают на важность свободного и клеточно-ассоциированного ЛПС в реализации позднего воспаления. Миграции нейтрофилов является следствием действия хемокинов и служит для ограничения бактериальной инфекции [152]. Нейтрофилы 19 способны обезвредить опсонизированную шигеллу in vitro [126], а нейтрофильный воспалительный ответ ограничивает шигеллы в эпителиальном слое. Блокирование притока нейтрофилов приводит к уменьшению эпителиальной деструкции, указывая на то, что повреждение слизистой в большей степени обусловлено воздействием нейтрофилов, чем шигелл [141, 152, 154]. Однако при этом шигеллы мигрирует глубже в собственную пластинку и мезентериальные сосуды. Проникновение шигеллы в подэпителиальное пространство индуцирует воспалительный каскад, который является основным патогенетическим механизмом шигеллёза. Более того даже после элиминации возбудителя уровень провоспалительных цитокинов остаётся высоким достаточно долго. Было проведено исследование биоптатов прямой кишки добровольцев больных шигеллёзом в острый и реконвалесцентный периоды (30 день от начала диареи). Уровень клеток, продуцирующих ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ФНО-α, ФНО-β и ИНФ-γ на 30 день остаётся по-прежнему высоким, а число ИЛ-1 и ТРФ-β - продуцирующих клеток увеличилось [61]. Пролонгированное воспаление способствует развитию постинфекционного синдрома раздражённого кишечника (ПСРК) у предрасположенных лиц. Так из 750 больных с ПСРК, длительностью 1,5-2,5 года, у 62% были обнаружены АГ ОКИ с доминированием АГ дизентерии Флекснера при отсутствии роста патогенных энтеробактерий на обогащённых средах. В крови у больных ПСРК была выявлена гиперплазия ростка CD4+5+ Т-клеток, секретирующих провоспалительные цитокины, в частности ТРФ-β [13]. Таким образом, врождённый иммунный ответ, с одной стороны, необходим для формирования противошигеллёзной защиты, а с другой, обуславливает клиническое течение дизентерии, формируя механизм длительно персистирующей воспалительной реакции. Это приводит к развитию таких форм заболевания как хроническая дизентерия и ПСРК. 20 Адаптивный иммунный ответ на S. flexneri 2а 8.2. Во время инфицирования шигеллы персистируют внеклеточно и внутриклеточно, поэтому для эффективного противошигеллёзного иммунитета требуется инициация как гуморального, так и клеточного адаптивных ответов [50]. 8.2.1. Клеточно-опосредованный адаптивный иммунный ответ Запуск клеточно-опосредованного, цитотоксического ответа обусловлен не попаданием шигелл в организм как таковых или выделением ими растворимых продуктов, а инфицированием этими агентами собственных клеток организма [23, 100, 115]. При этом презентация антигена СD4+ Т-хелперам осуществляется обычным путем — макрофагами или дендритными клетками через представление АГ детерминант в комплексе с молекулами МНС II класса. Те же антиген презентирующие клетки (АПК) обусловливают активацию цитотоксических СD8+ Т-лимфоцитов, причем АГ на поверхности АПК должен быть ассоциирован с молекулами МНС I класса. Активированные СD8+-клетки могут осуществлять цитотоксическую функцию после взаимодействия TCR с комплексом антигена и молекулы МНС I класса на поверхности инфицированной клетки-мишени [23, 86]. Zwillich S.H. и соавторами были описаны клоны специфичных Т-клеток после заболевания шигеллёзом [169]. Позднее из крови больных шигеллёзом были выделены активированные Т-клетки [106, 107]. Интересно, что СD8+ Т-лимфоциты не принимают участия в формировании протективного иммунитета при кишечной инфекции, вызванной бактериями вида Shigella, несмотря на то, что Ipa- протеины, активно секретируемые шигеллами в клетки хозяина, подвергаются процессингу и презентируются СD8+-клеткам. Для определения способности шигеллы стимулировать АГ-специфический СD8+ Т-клеточный ответ был разработан штамм S. flexneri, вырабатывающий через секреторную систему третьего типа гетерогенный вирусный СD8+ Т-клеточный эпитоп. Т-клеток, специфичных к вирусному эпитопу не было зафиксировано ни у мышей, ни в культурах клеток, заражённых этим штаммом [33]. То есть 21 ингибирование СD8+ цитотоксического ответа не связано с продуктами секреции шигеллы. Обширное воспаление и низкий уровень цитокинов Th1 и Th2-клеток, наблюдаемые после инфекции шигеллой у лабораторных животных, могут расцениваться как факторы, способствующие индукции первичного Th17 клеточного ответа [88]. Установлено, что Th17-клетки вовлекаются в иммунный ответ при бактериальном заражении, а также патогенетически связаны с развитием хронических воспалительных заболеваний. На лабораторных животных было исследовано влияние цитокинов на формирование клеточноопосредованного адаптивного ответа. Для адекватной работы эффекторных Th17-клеток, как и для регуляторных Тh-клеток необходимо наличие ТРФ-β, экспрессия которого при остром шигеллёзном воспалении не изменяется. Уровень ИЛ-6 сильно последующую повышается во дифференцировку время шигеллёзной регуляторных инфекции, Т-клеток и блокируя стимулируя Th17-клетки [168]. ИЛ-23, секретируемый активированными дендритными клетками, не влияет на уровень специфических Th17-клеток при первичном контакте с инфекцией [64], но стимулирует Th17-клетки памяти, увеличивая секрецию ИЛ-17 при повторном инфицировании [24]. ИЛ-17 повышает нейтрофильный хемотаксис, а также стимулирует выработку ИЛ-6, ИЛ-8, Г- КСФ, циклоокигеназы - 2 и NO. В ряде исследований продемонстрировано, что в острую фазу заболевания при некоторых инфекциях, помимо Th17-клеток, ИЛ-17 могут секретировать не специфичные γδТ-клетки, NK- клетки и клетки миелоидного ряда [99, 103, 147, 155]. Однако, при заболевании шигеллёзом NK-клетки, СD11+ макрофаги/моноциты и полиморфно-ядерные клетки, в отличие от γδТ-клеток, не секретируют ИЛ-17. Продукция ИЛ-17 γδТ-клетками зависит от ИЛ-12, ИЛ-23, не зависит от ИЛ-6, презентации АГ через MHC-II типа и резко возрастает при взаимодействии с TLR-2/TLR-1 лигандами [64, 123, 127]. Основная АГ структура шигелл - ЛПС является TLR-4 лигандом. Вероятно, низкий уровень ИЛ-17 при 22 первичном контакте с шигеллой связан с не TLR зависимой стимуляцией γδТ-клеток. Таким образом, литературные данные позволяют считать, что специфического клеточно-опосредованного ответа при первичном контакте с шигеллой не происходит. Однако индуцируются Th17-позитивные клетки памяти. При повторном контакте специфичные Th17-клетки секретируют ИЛ-17 и ИЛ-22, способствуя элиминации бактерий через активацию нейтрофилов [167]. 8.2.2. Гуморальный адаптивный иммунный ответ Исследования больных дизентерией людей и опыты на лабораторных животных свидетельствуют о том, что основным элементом защиты организма от S. flexneri является именно гуморальный иммунный ответ. Несмотря на то, что рекрутирование и активация Т-клеток происходит локально, активное участие этих клеток в протективном ответе не установлено [104, 105, 144]. В опытах по внутрилёгочному заражению C57BL/6 инбредных мышей Т-клетки, в отличие от В-клеток, не обеспечивали защиту от реинфекции шигеллой [57, 73]. Протективный иммунный ответ серотип-специфический, направленный на О-антигенную полисахаридную (О-ПС) часть ЛПС клеточной стенки О-ПС [28, 30-32, 91, 148]. Иммунохимические исследования показали, что вид S. flexneri включает 13 подсероваров: 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4a, 4b, 5a, 5b, 6, X, Y. О-ПС серотипа Y состоит из повторяющихся тетрасахаридных блоков (три остатка рамнозы и один остаток Иммуноспецифичность N-ацетил-D-глюкозамина). остальных подсеротипов, кроме 6, является результатом присоединерия ацетильных и/или глюкозильных групп к основной Y цепи (табл. 1). Основой типовых Аг, по которым происходит разделение на серовары, служат сахаридные остатки, связанные с основной цепью (серовары X и Y не имеют типовых Аг). Дополнительные сахара или конформация химической структуры формируют групповые Аг (табл. 2) [69]. 23 Серовар Табл. 1. Химическая структура О-Аг S. flexneri [54, 55, 156]. 1a Типовой/ групповой антигены Структура -D-Glcp I: 4 OAc 1 | 3,4 4 I 2)--L-Rhap-(12)--L-Rhap-(13)--L-Rhap-(13)--D-GlcpNAc-(1 1b -D-Glcp I: 6 OAc OAc | | 3,4 2 1 I 6 4 2)--L-Rhap-(12)--L-Rhap-(13)--L-Rhap-(13)--D-GlcpNAc-(1 2a -D-Glcp II: 3,4 OAc 1 II OAc (60%) | | 3,4 4 6 2)--L-Rhap-(12)--L-Rhap-(13)--L-Rhap-(13)--D-GlcpNAc-(1 2b II: 7,8 -D-Glcp 1 -D-Glcp 7,8 1 3 4 II 2)--L-Rhap-(12)--L-Rhap-(13)--L-Rhap-(13)--D-GlcpNAc-(1 3a III: 6, 7,8 -D-Glcp 1 7,8 OAc | 3 2 OAc (40%) III: 6 | 6 2)--L-Rhap-(12)--L-Rhap-(13)--L-Rhap-(13)--D-GlcpNAc-(1 3b OAc III: 3,4, 6 | III: 6 2 2)--L-Rhap-(12)--L-Rhap-(13)--L-Rhap-(13)--D-GlcpNAc-(1 4a -D-Glcp IV: 3,4 PEtN 1 | 3 6 IV 2)--L-Rhap-(12)--L-Rhap-(13)--L-Rhap-(13)--D-GlcpNAc-(1 24 4b -D-Glcp IV: 6 OAc | 1 IV 6 2 6 2)--L-Rhap-(12)--L-Rhap-(13)--L-Rhap-(13)--D-GlcpNAc-(1 5a -D-Glcp V: 3,4 OAc 1 | 3,4 3 V 2)--L-Rhap-(12)--L-Rhap-(13)--L-Rhap-(13)--D-GlcpNAc-(1 5b -D-Glcp V: 7,8 1 -D-Glcp 7,8 1 3 3 V 2)--L-Rhap-(12)--L-Rhap-(13)--L-Rhap-(13)--D-GlcpNAc-(1 6 OAc VI | 3,4 2)--L-Rhap-(12)--L-Rhap-(14)--D-GalpA-(13)--D-GalpNAc-(1 X -: 7,8 -D-Glcp 1 7,8 3 2)--L-Rhap-(12)--L-Rhap-(13)--L-Rhap-(13)--D-GlcpNAc-(1 Y OAc -: 3,4 OAc | | 3,4 6 2)--L-Rhap-(12)--L-Rhap-(13)--L-Rhap-(13)--D-GlcpNAc-(1 Табл. 2. Химическая структура известных О-Аг эпитопов S. flexneri [156]. Фактор Структура I α–Glc-(14)-β-GlcNAc- II α–Glc-(14)-α-Rha- III 2-O-Ac-α-Rha-(13)- β-GlcNAc- IV α–Glc-(16) - β-GlcNAc- V α–Glc-(13)-α-Rha-(13)-Rha- 25 6 2-O-Ac-α-Rha- 7,8 α–Glc-(13)-Rha-(12)-GlcNAc - Несмотря на то, что при инфицировании шигеллы, как правило, поражают слизистую оболочку кишечника человека, у переболевших людей были выявлены не только секреторный IgА, но и сывороточные IgА, IgG и IgМ, направленные, преимущественно, против О-ПС. Минорная фракция АТ, указанных классов, специфична к эффекторным протеинам шигелл [85, 105, 137]. Анти-О-ПС секреторные IgА были обнаружены также в материнском молоке и способны обеспечить защиту новорожденных от дизентерии [83]. Кроме того, у переболевших шигеллёзом людей были выявлены анти-О-ПС IgG, IgА антителосекретирующие клетки [27, 38, 138]. Исследование роли секреторного IgА в противошигеллёзной защите были проведены на мышах с использованием лёгочной модели. Моноклональные секреторные анти-О-ПС IgА, продуцируемый из имплантированной в область спины BALB/c мышам подкожной гибридомы, обеспечивают защиту против заражения летальной дозой бактерий [58]. Также in vitro было показано, что ЛПС шигелл, может быть перенесён через поляризованный эпителий кишечника секреторными IgА, следовательно может быть презентирован в виде иммунологически активной формы [78]. Однако опыты in vivo ограничены тем фактом, что у мышей IgА ответ на шигеллы не выражен. Вместе с тем, мыши с дефицитом IgА демонстрируют высокую выживаемость при экспериментальном заражении, доказывая протективную эффективность сывороточных IgG и IgМ [73, 161]. В ряде экспериментов на мышах линии C57BL/6, у которых Т-клетки имели дефекты TCR по типу CD0 либо TCR-β0 TCR-δ0 была зарегистрирована высокая выживаемость после инфицирования и элиминация бактерий, за счёт ЛПС специфичных IgМ [64, 72]. Имея Аг детерминанты кассетного типа, ЛПС способен непосредственно, без участия T-клеток, стимулировать пролиферацию В-лимфоцитов. То есть, ЛПС являются тимус - независимым антигеном 1 типа. 26 Ат, продуцируемые активированными таким образом В-лимфоцитов, относятся преимущественно к IgM классу. В опытах на крысах было установлено, что тимус-независимые Аг 1 типа способны вызывать вторичный иммунный ответ [166]. Вплоть до третьей недели после инфицирования, IgM, секретируемые по Т-независимому механизму, способны обеспечить защиту мышей. Позднее на смену им приходят Т-зависимая секреция IgG и Тh 17- клетки памяти [64, 72, 73]. Гуморальный ответ является основным механизмом защиты против шигелл. Таким образом, шигеллезная кандидатная вакцина любого типа должна быть мощным индуктором карбогидрат - специфического иммунного ответа, направленного к О-Аг шигелл [1]. Основные подходы к разработке вакцин против Shigella flexneri 2а 8.3. Конструирование шигеллёзных вакцин стало возможным благодаря новым методам тонкого химического изучения антигенных структур возбудителя, патогенеза и характера формирующегося иммунитета при естественном течении инфекции. Наблюдения за больными дизентерией людьми позволяют заключить, что после перенесённого заболевания вырабатывается непродолжительный типоспецифический иммунитет. Переболевшие однажды дизентерией при повторном заражении гомологичным штаммами болеют реже [20, 30, 41]. На основании этих данных было сделано предположение, что для формирования напряжённого иммунитета необходимо многократное повторное заражение гомологичным штаммом. Задачей разработчиков вакцин должны стать разумное решение проблем и создание вакцинирующих препаратов, удовлетворяющих необходимым критериям [21]: вакцина не должна быть источником побочной биологической опасности, вакцина не должна индуцировать патологические иммунные процессы, 27 вакцина должна эффективно индуцировать протективный иммунный ответ и обеспечивать продолжительную защиту, 8.3.1. Химические вакцины Химические шигеллёзные вакцины содержат Аг компоненты, извлеченные из микробной клетки, т.е. они являются субмикробными вакцинами. Основными Аг, которые определяют иммуногенные характеристики S. flexneri, являются секретируемые ею эффекторные Ipa - протеины и эндотоксин клеточной стенки ЛПС. В последние годы с участием добровольцев были исследованы конъюгированные с белками О-ПС и комплексная ЛПС - протеосомальная шигеллёзные вакцины. Эти препараты способны индуцировать специфический гуморальный иммунный ответ. Реактогенность ЛПС вакцины многократно выше по сравнению с ПС вакцинами (табл. 3). Другие современные субмикробные дизентерийные кандидатные вакцины пока не прошли клинические исследования. На лабораторных животных удалось добиться устойчивости к инфекции S. flexneri 2а при иммунизации Аг комплексом Invaplex (IpaB, IpaC, IpaD и ЛПС). Выживаемость мышей BALB/cByJ при лёгочной модели заражения через 3 недели после трёхкратной интраназальной иммунизации (0, 14, 28 дн.) двумя сериями данного препарата составила 64% и 80%, по сравнению с контроля - 12%. Концентрация специфических Ат, после группой трёхкратной иммунизации комплексом invaplex существенно увеличилась, причём, к ЛПС преобладают IgA, а к вирулентному штамму S. flexneri 2а - IgG [68]. Исследование адъювантной активности invaplex показало, что при введение мышам BALB/cByJ смеси invaplex с овальбумином, препарат способствует повышению титра Ат к овальбумину по сравнению с группой контроля привитых только овальбумином [112]. Рибосомальная шигеллёзная вакцина способна обеспечить протективный иммунитет на морских свинках и обезьянах [122]. Иммунный ответ, индуцированный подобной вакциной развивается, преимущественно к О-ПС 28 (L-гаптену) [121]. В настоящее время ведутся разработки О-Аг рибосомальной вакцины (SRV). Двукратное интраназальное или подкожное введение препарата BALB/c мышам с двух недельным интервалом индуцирует 4-16 кратный прирост титра IgG и IgA в сыворотке и на слизистых (забор биоматериала через неделю после вторичной иммунизации). Подкожная иммунизация препаратом приводит к повышению титра IgG в сыворотке и незначительно в лёгочном смыве, уровень IgA повышен только в вагинальном смыве. При интраназальной иммунизации титр IgG, также повышен, в сыворотке и, незначительно, в лёгочном смыве. Уровни IgA достоверно выше в смыве из носа, вагины, в слюне и фекалиях, как при интраназальном введении SRV так и при введении аттенуированного штамма S. flexneri 2а SC602. Концентрация IgA антителобразующих клеток достоверно выше в селезёнке, иммунизированных лёгких, поднижнечелюстном интраназально SRV вакциной лимфоузле [65]. мышей, Существенными недостатками такой вакцины являются непостоянная, трудно контролируемая концентрация О-АГ в рибосомах и трудоёмкое производство [34]. Табл. 3. Субмикробные S. flexneri 2a вакцины, исследованные с участием добровольцев. Вакцина Описание безопасность иммуногенность коммента рии S. flexneri 2arEPAsucc О-ПС S. flexneri 2a конъюгированн ый с сукцинилирова нным экзотоксином А Pseudomonas aeruginosa Примерно у 10% добровольцев выявлены местные реакции (покраснение в месте инъекции, лимфаденопатия), у 5% - общие реакции (диарея, крапивница) Уровень IgG максимально вырос на 4 неделю после иммунизации – у 93% добровольцев выявлен ≥ 4-кратный прирост. Сероконверсии по IgA, IgM не зарегистрировано Низкая [140] реактоген ность, отсутству ет сероконве рсия IgA Ат S. flexneri 2a-rEPA О-ПС S. flexneri 2a конъюгированн ый с экзотоксином Приблизительно у 4,5% детей зарегистрирована боль в месте инъекции, у 5,5% Средний прирост титра IgG - 2,7 после двукратной иммунизации. Эффективность Низкая реактоген ность, низкая эффектив 29 источ ник [53] А Pseudomonas aeruginosa повышение температуры ≥ 380С. вакцины (дети 1 -4 года) = 7,9% ность Низкая реактоген ность, отсутству Прочие побочные эффекты (припухлость, покраснение, тошнота, рвота) менее 1% S. flexneri 2aCRM9succ Proteosom eS. flexneri 2a О-ПС S. flexneri 2a конъюгированн ый с Примерно у 10% добровольцевыявлен ы местные реакции(покраснени Уровень IgG максимально вырос на 4 неделю после иммунизации – у 88% сукцинилирова нным токсином Corinebacteriu m diphtheriae е в месте инъекции, лимфаденопатия), у 5%- общие реакции (диарея, крапивница) добровольцев выявлен ет ≥ 4-кратный прирост. сероконве Сероконверсии по рсия IgA IgA, IgM не зарегистрировано ЛПС S. flexneri 2a в комплексе с протеосомой протеином наружной мембраны менингококка Ринорея зафиксирована у 40% - 90% добровольцев (интраназальное введение). Недомогание, головная боль, миалгия у 37%; диарея у 30%. Симптомы имели лёгкую и среднюю степень тяжести Пик титра АТ приходится на 23 день. IgA ≥ 4-кратный прирост зафиксирован у 30% добровольцев. IgG ≥4-кратный прирост у 40% добровольцев. IgM ≥ 4-кратный прирост у 30% добровольцев [140] Высокая [93] реактоген ность. Зафиксир овано повышен ие титра IgG и IgА. Сероконв ерсия < 50% 8.3.2. Инактивированные вакцины Инактивированные цельноклеточные вакцины получают путем воздействия на микроорганизмы химическим путем или нагреванием. Такие вакцины являются достаточно стабильными и безопасными, так как не могут вызвать реверсию вирулентности. Они часто не требуют хранения в условиях холодовой цепи, что удобно в практическом использовании. Однако у этих вакцин имеется и 30 ряд недостатков, в частности, они стимулируют более слабый иммунный ответ и требуют применения нескольких доз введения (бустерные иммунизации). Первые попытки создания невосприимчивости к дизентерии были предприняты ещё в 1898г., когда Шига и Крузе ввели себе под кожу убитые нагреванием дизентерийную культуру. Этот опыт вызвал у обоих экспериментаторов настолько сильную общую и местную реакцию, что они вынуждены были сразу же отказаться от дальнейшего применения препарата. Вскоре Шига приготовил новую вакцину для специфической профилактики дизентерии, состоящую из убитых нагреванием дизентерийных бактерий (половина петли) в смеси с 0,5 мл. дизентерийной сыворотки. Реакция на введение сыворотки была менее выражена [158]. На протяжении всего двадцатого века предпринимались многочисленные попытки создать эффективную противошигеллёзную инактивированную цельноклеточную вакцину, но ни один препарат не получил всеобщего признания. Высокая реактогенность у добровольцев была отмечена практически всеми исследователями. Вызывали определенные сомнения незначительная эффективность некоторых препаратов, а также большая сложность и дороговизна их приготовления [4, 19, 92, 111, 146]. Более поздние исследования, проведённые на морских свинках показывают, что при многократном введении больших доз «убитых» штаммов S. flexneri 2a возможно добиться выработки протективных Ат [82, 134]. 8.3.3. Живые вакцины Живые вакцины получают путем искусственного аттенуирования (ослабления штамма), либо путём отбора естественных авирулентных штаммов. Бактерии, в составе таких вакцин не утрачивают способность размножаться в организме, вызывая вакцинальный процесс и формируя невосприимчивость. Анализируя свойства живых вакцин, положительные, так и отрицательные качества [8]. 31 следует выделить как их Положительные стороны: по механизму действия на организм напоминают "дикий" штамм, продуцируют достаточно эффективный клеточный и гуморальный иммунитет. Вакцинный штамм может приживаться в организме и длительно сохранять иммунитет, вытесняя "дикий" штамм. Для вакцинации используются небольшие дозы, и поэтому она является не дорогой. Отрицательные стороны: живая вакцина является корпускулярной, поэтому содержит 99 % балласта. Такой препарат обычно бывает достаточно реактогенным, кроме того, он способен вызывать мутации клеток организма (хромосомные аберрации). Живые вакцины могут содержать вирусы-загрязнители (контаминанты). Нельзя исключить и реверсии вакцинных штаммов в вирулентную форму, что может стать причиной заболевания вакцинируемого. По этой причине живые вакцины должны быть тщательно контролируемы. Живые вакцины трудно дозируются и поддаются биоконтролю, легко чувствительны к действию высоких температур и требуют неукоснительного соблюдения холодовой цепи. Пациентам с иммунодефицитами (получающим иммуносупрессивную терапию, при СПИДе и опухолях) противопоказано вакцинироваться такими вакцинами [18]. Среди S. flexneri 2a живых вакцин можно выделить неинвазивные и инвазивные живые вакцины. 8.3.3.1. Неинвазивные живые вакцины Штаммы с практически любыми мутациями хромосом или плазмид вирулентности S. flexneri могут быть использованы для создания неинвазивных живых вакцинных штаммов [34]. Некоторые такие штаммы безопасны для людей и способны индуцировать протективные Ат (табл. 4). Например, S. flexneri 2а Istati T32-штамм на 100% безопасен для людей и эффективен на 85%. Однако, для формирования протективного иммунитета необходима реиммунизация каждые 6 месяцев большой дозой (1х1011 КОЕ) препарата, что дорого и сложно в организационном плане. 32 Исследования на BALB/cJ мышах штаммов S. flexneri 2а ΔmsbB1 (WR10), ΔmsbB2 (WR20), ΔmsbB1и2 (WR30), с мутацией гена, кодирующего ацетилтрансферазу демонстрируют возможность стимулирования секреции ИЛ-5, ИНФ-γ, ИЛ-1α, ИЛ-12, ИЛ-6, ИЛ-13 и ФНО-α не хуже, чем вирулентный штамм 2457Т и значительно выше по сравнению с группой контроля, привитой физиологическим раствором. Мутантные msbB штаммы способны к индукции протективных антител не хуже чем вирулентный штамм [60]. Табл. 4. Неинвазивные живые оральные S. исследованные на обезьянах и с участием добровольцев. Вакцина Описание безопасность S. flexneri 2a 2457О Авирулентны й штамм со спонтанной мутацией в гене virG Реверсия вирулентного штамма у людей S. flexneri 2aстрептомицин чувствительн ые штаммы. Штаммы со спонтанными мутациями, не способные расти в присутствии стрептомици на S. flexneri 2а Istati T32 Спонтанная делеция ipa BCDA, invA, icsA(virG) flexneri иммуногенность Индуцирует выработку протективных АТ у обезьян. Вызывает дизентерию у 34% добровольцев Реверсия в Протективная стрептомицинэффективность устойчивые 40, 90% при формы у многократной добровольцев. вакцинации по Диарея и рвота у данным разных 15-35% клинических добровольцев исследований 10 (5х10 КОЕ). Низкий уровень Протективная нежелательных эффективность эффектов у около 80% после добровольцев пятикратной 11 (2х10 КОЕ) иммунизации добровольцев 33 2a вакцины, комментарии Реактогенна на людях Реактогенна, неустойчивый штамм, противоречивы е данные клинических исследований источ ник [28, 49, 92] [28, 42, 48] Непродолжите [47, льная защита (6 70] мес.), многократная иммунизация 8.3.3.2. Инвазивные живые вакцины Стратегия разработки оральных инвазивных шигеллёзных вакцинных штаммов основана на способности инвазивных штаммов доставлять Аг иммунной системе слизистых, провоцируя сильный иммунный ответ [34]. В качестве инвазивных вакцин используются аттенуированные штаммы с любыми мутациями в генах вирулентности, которые необходимы для патогенеза шигелл после стадии проникновения в клетку; или в генах, ответственных за метаболизм бактерий, тем самым ограничивая её репликацию и распространение в организме после инвазии. Данные по безопасности и иммуногенности штаммов с подобными мутациями, прошедших клинические исследования приведены в табл. 5. На мышах BALB/c было проведено исследование изначально не инвазивного S. flexneri 2а мутантного штамма - ΔipaB наделённого геном инвазии от Yersinia pseudotuberculosis - pIRR1 (ΔipaB/inv) [80], в сравнении с мутантными штаммами ΔipaB (ген инвазии) и ΔvirG (ген межклеточного перемещения). При двукратной, на 0 и 21 день, внутриназальной иммунизации BALB/c мышей, ΔipaB/inv и ΔipaB не активируют продукцию ИЛ-1β, ИЛ-18, в отличие от ΔvirG мутантного штамма. ΔipaB/inv не вызывает некроз-опосредованную гибель макрофагов и обладает более высокими характеристиками протективности и иммуногенности, чем традиционный ΔvirG мутантный штамм [66]. Табл. 5. Инвазивные живые оральные S. flexneri 2a вакцины, исследованные с участием добровольцев. Вакцина Описание безопасность иммуногенность комментарии источ ник S. flexneri Пуриновый При вакцинации 1- При трёхкратной Частая [44, пероральной вакцинации, с интервалом 1-2 дня, Ат выявлены в копрофильтратах через 3 мес. у иммунизация, низкая иммуногенность 45, 87] 2a vc77 ауксотрофн ый мутант (Pur-), устойчив к рифампицин у. 9 3х10 КОЕ у взрослых и детей серьёзных нежелательных явлений не выявлено 34 70%, через 6 мес. у 30% добровольцев S. flexneri 2a SFL1070 Делеция aroD Лёгкие симптомы дизентерии у добровольцев, иммунизированных дозой 1х1071х108КОЕ. Выраженные - от 1х109КОЕ На обезьянах протективен на 85%, после четырёх кратной иммунизации дозой 1х1011КОЕ Частая ревакцинация. Низкий порог реактогенности [113, 114] S. flexneri Делеции При однократной Сероконверсия Низкая [51, 2a CVD 1203 гена плазмиды virG и aroA – гена хромосомы. дозе иммунизации 1х106КОЕ побочных эффектов не зарегистрировано. С повышением дозы до 1,5х108КОЕ побочные эффекты у 18%; 1,5х109КОЕ – у 72% IgA зарегистрирована максимально у 40%, IgG у 45%, привитых дозой 1,5х108КОЕ иммуногенность. 52, Низкий порог 118] реактогенности S. flexneri 2a CVD 1207 Делеции virG, sen, set и guaAB Побочных эффектов не зарегистрировано при однократной иммунизации дозой 1х108КОЕ Сероконверсия IgA зарегистрирована у 11%, IgG- у 17%, привитых дозой 1091010КОЕ Низкая [39, иммуногенность. 136] Низкий порог реактогенности S. flexneri 2a SC602 Делеции icsA гена и локуса iuc Лёгкая степень диареи и повышение температуры у 2 из 15 привитых 1х104 КОЕ. Вызывает шигеллёз при приёме 3х108 и 2х106КОЕ При контролируемом заражении добровольцев вирулентным штаммом, у 3 из 7 вакцинируемых развивается дизентерия и у 3 диарея лёгкой степени Обеспечивает частичную защиту от инфекции. Низкий порог реактогенности 35 [25, 27] 8.3.4. Векторные шигеллёзные вакцины Векторные вакцины получены методами генной инженерии. Гены вирулентного микроорганизма, отвечающие за синтез протективных Аг, встраивают в геном какого-либо безопасного микроорганизма, который при культивировании накапливает и продуцирует соответствующий Аг. Ранние попытки по созданию кандидатной вакцинны на основе E. coli, экспрессирующей шигеллёзные антигены, приводили к созданию реактогенных, не защищающих добровольцев штаммов [29, 43]. Штамм E. coli K12, содержащий 140 MDa плазмиду вирулентности S. flexneri 5 и экспрессирующий на своей поверхности групповые и типовые антигены S. flexneri 2а, был протестирован с участием добровольцев. Первый вариант вакцины, содержащей этот штамм, (EcSf2a -1) оказался реактогенным и не обеспечивал защиту от заболевания. Позднее, был использован аттенуированный штамм E. coli K12 с делецией гена aro-D (EcSf2a -2). Поствакцинальный иммунитет, сформировавшийся при трёхкратной пероральной иммунизации дозой 1,2-2,5 х 109 КОЕ, обеспечивает защиту от экспериментально вызванного заболевания у 36 % (Р=0,17) добровольцев [38, 119]. При однократной вакцинации в дозе 2,5х109 КОЕ, у 17% субъектов были выявлены побочные реакции, такие как лихорадка и диарея, при вакцинации- 1,8х1010 КОЕ, у 2 из 4 субъектов была выявлена дизентерия. 8.3.5. Стратегии по созданию ассоциированных (мультисеротипных) шигеллёзных вакцин Высокий уровень структурного сходства ЛПС различных серотипов S. flexneri, имеющих общую базовую Y-цепь, создаёт определённые проблемы в серологической диагностике шигеллёзов, так как Ат, образующиеся при инфицировании одним серотипом, могут перекрёстно реагировать с другими серотипами шигелл. С другой стороны, наличие перекрёстных О-специфических Ат предопределяет создание вакцин против нескольких серотипов S. flexneri c использованием меньшего количества серотипов [69]. 36 Исследования, проведённые с участием людей, переболевших дизентерией в естественных условиях и добровольцев, подвергнутых контролируемому заражению, демонстрируют спектр перекрёстной активности специфических анти-ЛПС Ат. Razolofo-Razanamparany V. и соавторами [145] были проведены исследования перекрёстной активности анти-ЛПС IgA антителосекретирующих клеток (IgA АСК) у людей, инфицированных естественным путём S. flexneri 2а, 1а, 4а и 3а. В образцах венозной крови S. flexneri 1а - инфицированных людей обнаружили перекрёстно реагирующие IgA АСК к 2а, 3а и 4а серотипам; у S. flexneri 2а - инфицированных людей к 1а, 3а и 4а серотипам. У людей инфицированных S. flexneri 3а и 4а перёкрёстно реагирующих IgA АСК не выявлено. У всех инфицированных также отсутствовала перекрёстная активность к ЛПС S. sonnei и S. dysenteriae 1. Van De Verg L. L. и соавторами [69] были проведены исследования IgG и IgA ответа в сыворотках добровольцев, заражённых «диким» штаммом S. flexneri 2а и иммунизированных векторной вакциной EcSf2a -2. В качестве основы для ТИФА использовали панель ЛПС гомо- и гетерологичных серотипов S. flexneri. Добровольцев перорально заражали ИД50 (1х103 КОЕ) полевого штамма S. flexneri 2а. Забор крови осуществляли до и через 21 день после инфицирования. Наиболее высокая концентрация Ат к ЛПС S. flexneri 2а выявлена именно при заражении что, возможно, обусловлено воспалением и продукцией цитокинов, сопутствующих инфицированию [135]. У 65% добровольцев был зафиксирован положительный двух- и более кратный прирост S. flexneri 2а анти-ЛПС IgA, у 50% добровольцев анти-ЛПС IgG. Оба изотипа иммуноглобулинов были повышены у 35% добровольцев, изолированое повышение IgA зафиксировано у 28%, изолированное повышение IgG у 14%. Превалирование IgA над IgG, возможно, связано с более широким репертуаром карбогидрат-специфических резидентных IgA-секретирующих В-лимфоцитов в слизистой кишечника человека [110]. 37 IgА перекрёстно-реагирующие с ЛПС других серотипов S. flexneri, содержащих II типовой (S. flexneri 2b) или 4/3,4 групповой Аг (S. flexneri 1a, 3b, 4a, 5a, Y), были зафиксированы у половины добровольцев, ответивших на ЛПС S. flexneri 2а. Уровень IgG значительно ниже. Распределение уровней Ат на II типовой и 4/3,4 групповой Аг ЛПС происходила не равномерно. Примерно у 80% добровольцев был зафиксирован двух и более кратный прирост Ат к ЛПС S. flexneri 1а; ≈ у 70% добровольцев - к ЛПС S. flexneri 5а; ≈ у 50% добровольцев к ЛПС S. flexneri Y. Ат к ЛПС S. flexneri 2b, 3b и 4a были выявлены лишь у 10% добровольцев на каждый серотип. Авторы это объясняют разной доступностью Аг эпитопов у серотипов, их содержащих [69]. У некоторых добровольцев, заражённых штаммом S. flexneri 2а, были выявлены Ат против гетерологичных вариантов ЛПС, не содержащих II типовой или 4/3,4 групповой Аг, или против ЛПС всех серотипов S. flexneri. У большинства (около 40% добровольцев) это Ат к ЛПС S. flexneri 1b. Авторы считают, что такое возможно при наличии у всех или у некоторых серотипов S. flexneri общих О-антигенных эпитопов [69]. Так же, Van De Verg L. L. и соавторами [69] была исследована перекрёстная активность анти-ЛПС S. flexneri 2а Ат в сыворотках обезьян и морских свинок животных, которые используются в модели патогенеза шигеллёзной инфекции. Макаки - резус были заражены перорально 1,1х109 КОЕ S. flexneri 2а. Перекрёстная активность IgG наблюдалась на все серотипы S. flexneri, а также на ЛПС P. shigelloides (серологически идентичен О-Аг S. sonnei) у 5/9 обезьян. Морских свинок иммунизировали через глаз 2-4х108 КОЕ вакциной EcSf2a-2 пятикратно (на 0, 2, 4, 14 и 15 день). Забор крови осуществлялся до и на 13 день после последней иммунизации. Все свинки позитивны по IgA и IgG к ЛПС S. flexneri 2а. У 14% выявлены перекрёстно реагирующие IgA к ЛПС серотипа 2b. Более 50% свинок положительны к 4/3,4 ЛПС, с преобладанием IgA (кроме ЛПС S. flexneri 1а). 38 В настоящее время разработка мультисеротипных шигеллёзных вакцин ведётся в двух направлениях: комбинированное использованпие нескольких штаммов S. flexneri и конструирование штамма, содержащено Аг разных серотипов. Noriega F.R. и соавторы [136] продемонстрировали в исследованияях на лабораторных животных перспективы комбинированного использования двух серотипов S. flexneri для создания более широкого противошигеллёзного протективного иммунитета. Для исследования они использовали аттенуированные штаммы S. flexneri 2а CVD 1207 (ΔguaB-A ΔvirG Δset1 Δsen) и 3а CVD 1211 (ΔguaB-A ΔvirG Δsen). Морских свинок иммунизировали интраназально 1010КОЕ каждого штамма, разведённых в 100 мкл PBS, забор крови проводили до иммунизации и через 30 дней после последней иммунизации. Двукратная иммунизации дивалентной S. flexneri 2а/3а кандидатной вакциной стимулировала секрецию перекрёстно реагирующих сывороточных IgG к ЛПС Аг серотипов 1а и 1b. Сывороточные IgA обладали более широкой перекрестной активностью, реагируя с ЛПС 1а, 1b, 2b, 4b, 5b и Y серотипов. Также была исследована способность дивалентной 2а/3а кандидатной вакцины стимулировать секрецию кератоконъюнктивальном Sereny- перекрёстных тесте. протективных Заражение «диким» Ат в штаммом происходило на 5 день после последней иммунизации. Наиболее высокая перекрёстная протективная эффективность (92,5%) была выявлена к серовару S. flexneri 2b, у которого есть общие как с 2а (типовой Аг- II) так и с 3а (групповой Аг- 7,8) Аг эпитопы. При этом уровни IgG и IgA к S. flexneri 2b были одними из самых низких. Протективная эффективность дивалентной вакцины, оцениваемая как процент защиты от остальных серотипов S. flexneri, выглядела следующим образом: Y - 80%, 5b - 64%, 1b - 56%, 1a - 42%, 4b - 20% и 6 - 4%. Ряд исследований посвящён разработке другого подхода создания мульти - серотипных шигеллёзных вакцин. Целью разработчиков является конструирование штамма, содержащего 39 О-Аг нескольких серотипов. Ауксотрофный ΔaroD штамм S. flexneri Y (SFL124) содержит серотип - конвертирующие гены бактериофагов SFII и SFV. В результате штамм содержит 3,4 групповой фактор, II и V типовые факторы, вызывает индукцию серотип специфического иммунного ответа к 2а и 5а серотипам у лабораторных животных [34, 35, 149]. Rui X. и соавторами [151] был сконструирован штамм S. flexneri 2а - Т32, который содержит в гене кластеры, кодирующие О-Аг другого вида шигелл S. sonnei. На мышах была доказана его способность защищать как от S. flexneri 2а, так и от S. sonnei. Разработка мультисеротипной шигеллёзной вакцины является наиболее актуальным подходом, в том числе и потому, что позволяет решить проблемы бактериальной микстинфекции и реинфицирования в рамках одной эндемичной области. Критерии конструирования такого препарата понятны. Это, прежде всего использование эпидемически актуальных серотипов шигелл. ВОЗ в отчётах 2009 года выделил пять серовариантов S. flexneri c наибольшим эпидемиологическим значением: 2а, 1b, 3a, 4a, 6. Таким образом, сложность создания такого препарата носит, прежде всего, биотехнологический характер. Если соответствующий биотехнологический подход будет разработан, то такая мультисеротипная вакцина может обеспечить заболеваемости, вызванной полевыми штаммами шигелл. 40 надёжный контроль 9. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 9.1. Методы получения нативного ЛПС S. flexneri 2а и его производных 9.1.1. Штамм кишечной бактерии Для получения нативного ЛПС и его производных был использован штамм S. flexneri 2a 1605. Морфологические, биохимические, серологические характеристики используемого штамма соответствуют данным, характерным для бактерий этого вида. Была разработана питательная среда, предназначенная для повышения выхода биомассы вакцинного штамма Shigella flexneri 2a 1605 и лучшего выделения из нее ЛПС. 9.1.2. Выделение и очистка ЛПС Нативный ЛПС S. flexneri 2a и его производные были получены в лаборатории препаративной биохимии №16 института иммунологии под руководством Львова В.Л. Методы и условия получения препаратов варьировались в широком диапазоне. Основные технологические приемы выделения и очистки ЛПС S. flexneri 2a включают экстракцию ЛПС фракции, очистку ЛПС от основных примесей (белков и нуклеиновых кислот), фракционирование по молекулярной массе, очистку от примесей солей, ионов металлов. 9.2. Определение химической структуры нативного ЛПС S.flexneri 2а и его производных Для характеристики структуры нативного ЛПС S.flexneri 2а и его производных был установлен качественный и полуколличественный состав опытных образцов по липиду А с использованием метода масс-спектрометрии и по О-ПС с использованием электрофореза в полиакриламидном геле. Масс-спектроскопию высокого разрешения с ионизацией электрораспылением и регистрацией ионов с помощью ион-циклотронного резонанса выполняли на спектрометре Bruker Daltonics модели Apex II с магнитом 7 (Tesla). 41 Электрофорез проводили в денатурирующих условиях. Для разделения использовали disk-электрофорез, с концентрацией фокусирующего геля 3,7% и разделяющего геля 12%. Толщина геля составляла 0,75 мм. ЛПС и его производные вносили в лунку по 3 мкг в 5 мкл раствора. При подготовке проб использовали 5-кратный диссоциирующий буфер. Растворы антигенов (Аг) смешивали с диссоциирующим буфером в соотношении 4:1 и прогревали 20 мин. на кипящей водяной бане. 9.3. Постановка метода непрямого твёрдофазного иммуноферментного анализа для определения специфичности нЛПС S. flexneri 2а и его производных Для постановки непрямого твёрдофазного иммуноферментного анализа (нТИФА) опытные образцы в концентрации 40 мкг/мл сорбировали на полистироловых планшетах («Greiner») в 0,05 М растворе карбонат- бикарбонантного буфера рН 9,5, внося по 100 мкл раствора Аг в лунку. Выдерживали 2 часа при температуре 37 0 С. После окончания инкубации содержимое лунок трижды отмывали от неосевших АГ на вошере фирмы «Pasteur» в растворе 0,01 М фосфатно-солевого буфера (0,45М NaCl) pH 7,2, содержащего 0,05% Твин-20 (ФСБ-Т), внося в каждую лунку не менее 300 мкл раствора. Планшеты подсушивали, постукивая по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге. Свободные сайты в лунке забивали 200 мкл раствора ФСБ и 1 % бычьего сывороточного альбумина (ФСБ-А). Выдерживали 12 часов при температуре 8 °С. После окончания инкубации процедуры отмывки и подсушки повторяли. Готовили ряд последовательных двоичных разведений коммерческих кроличьих сывороток («Агнолла» серия №49-1209) в растворе ФСБ-АТ. Образцы вносили по 100 мкл в лунку, и выдерживали 12 часов при 8 °С. После окончания инкубации процедуры отмывки и подсушки повторяли. В качестве детектирующего реагента использовали конъюгат белок А – пероксидаза хрена (ПХ) («Sigma - Aldrich»), обладающий высокой аффиностью ко всем классам иммуноглобулинов кролика. Конъюгат в рабочем разведении на ФСБ-А вносили по 100 мкл в лунку. Инкубировали 2 часа при 37 °С. После этого лунки 42 вновь промывали и подсушивали, реакцию проявляли внесением в каждую лунку раствора ортофенилендиамина в цитрат-фосфатном буфере («Sigma - Aldrich») рН 5,1 в концентрации 8 мг/10 мл. Развитие ферментативной реакции останавливали после появления выраженного градиента окраски, внося в каждую лунку 100 мкл 10% раствора серной кислоты. Учет реакции производили с помощью спектрофотометра «iMark» (Bio-Rad) при длинах основной/возвратной волн 490/630 нм. 9.4. Методика определения пирогенности у кроликов на введение нЛПС S. flexneri 2а и его производных Пирогенный тест ставили на кроликах породы Шиншилла массой 2,80-3,05 кг. Каждого кролика содержали в клетке на полноценном пищевом рационе, ограждая от раздражающих воздействий. Перед испытанием проводили осмотр животных и отбирали здоровых кроликов одного пола, которые не теряли в массе в течение предыдущей недели. Образцы разводили апирогенным 0,9 % раствором натрия хлорида так, чтобы 1 мл раствора содержал по 25 нг исследуемого образца. Перед опытом, с интервалом не менее 30 минут, у каждого кролика дважды измеряют температуру тела. Образцы вводили парентерально через ушную вену из расчета 1 мл раствора образца на 1 кг массы животного. После введения образца измеряли ректальную температуру кроликов с интервалом не более 30 мин в течение 3 часов. Образцы признавали апирогенными, если суммарное изменение температуры у 3 кроликов после инъекции не превышает 1,2 ºС и ни у одного из кроликов не было повышения температуры больше 0,5 ºС. Условия по содержанию кроликов и подготовке их к испытанию, а также система учёта результатов, соответствовали критериям, приведённым в Государственной фармакопеи РФ XII-ОФС 42-0061-07 [5]. 43 9.5. Определение гуморального ответа у мышей, образцами, содержащими нЛПС S. flexneri 2а иммунизированных с преобладанием короткоцепных, длинноцепных фракций или без явного преобладания какой-либо из фракций Были проведены исследования продукции ЛПС-специфических сывороточных IgG и IgM у мышей (CBA x C57 B1/6) F1, иммунизированных образцами д/ц, к/ц и смесью д/ц+к/ц нЛПС с различной длиной О-ПС цепи (табл. 10. а, б, в). Исследуемые образцы нЛПС S. flexneri 2а содержали неизменённый, 3-6-ацильный, липид А. 9.5.1. Методика интраперитонеальной иммунизации мышей и отбора биоматериала Использовали мышей самок или самцов (CBA x C57 BI/6) F1 весом 18-20 г. Животных имунизировали опытными образцами интраперитонеально двукратно с интервалом в 14 дней. Опытные образцы были использованы в дозах 10 и 50 мкг, растворённые в 0,5 мл. физиологического раствора. Кровь забирали из передней полой вены через 14 дней после повторной иммунизации. Сыворотки выделяли при использовании центробежного осаждение форменных элементов крови на 1500 об/мин 20 мин. Контрольные сыворотки получали от интактных животных. 9.5.2. Постановка нТИФА для определения IgG и IgM у мышей, иммунизированных образцами, содержащими нЛПС S. flexneri 2а с преобладанием короткоцепных, длинноцепных фракций или без явного преобладания какой-либо из фракций Образцы 3-6-ац д/ц нЛПС, 3-6-ац к/ц нЛПС и 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС в концентрации 40 мкг/мл сорбировали на полистироловых планшетах («Greiner») в 0,05 М растворе карбонантно - бикарбонантного буфера рН 9,5, внося по 100 мкл раствора Аг в лунку. Последующие этапы постановки нТИФА описаны в пункте 2.3. В качестве детектирующего реагента использовали меченые пероксидазой хрена антитела козы против IgG, IgM мыши («Sigma - Aldrich» или «Merc»). Развитие ферментативной реакции останавливали после появления выраженного 44 градиента окраски, внося в каждую лунку 100 мкл 10% раствора серной кислоты. Учет реакции производили с помощью спектрофотометра «iMark» (Bio-Rad) при длинах основной/возвратной волн 490/630 нм. 9.6. Определение гуморального ответа у мышей, иммунизированных образцами с пониженными показателями пирогенности, отличающихся по содержанию ЛПС с разной длиной ПС цепи Для данного исследования были использованы образцы 3,4-ац д/ц нЛПС, 3,4-ац д/ц мЛПС и 3,4-ац к/ц мЛПС отличаются по условиям получения. Образец 3,4-ац д/ц нЛПС является 3,4-ацильной фракцией нативного ЛПС, а образцы 3,4-ац д/ц мЛПС и 3,4-ац к/ц мЛПС – модифицированные ЛПС, полученный с помощью химических методов. Методика иммунизации мышей и получение сывороток описаны в пункте 2.5.1. IgG и IgM определяли с помощью метода нТИФА по протоколу, описанному в пункте 9.5.2. В качестве детектирующего Аг, адсорбируемого в лунки микропланшетов, был использован 3-6-ац д/ц нЛПС. 9.7. Определение антител у мышей, иммунизированных образцами, содержащими д/ц ЛПС S. flexneri 2а и отличающимися по строению липида А В исследовании были использованы образцы: 3-6-ац д/ц нЛПС, 4,3-ац д/ц мЛПС, 3,4-ац д/ц мЛПС, 3-ац д/ц мЛПС и 2,3-ац д/ц мЛПС. Методика иммунизации мышей и получение сывороток не отличалась от предыдущих исследований и описана в пункте 2.5.1. IgG и IgM определяли с помощью метода нТИФА по протоколу, описанному в пункте 9.5.2. В качестве детектирующего Аг, адсорбируемого в лунки микропланшетов, был использован 3-6-ац д/ц нЛПС. 9.8. Методы, используемые для характеристики гуморального иммунного ответа у мышей (CBAxC57Bl/6)F1, иммунизированных образцами, содержащими преимущественно длинноцепные 3-ацильные производные ЛПС S. flexneri 2а 45 Для характеристики гуморального иммунного ответа у мышей (CBA x C57 Bl/6) F1, иммунизированных 3,4-ац д/ц мЛПС, были определены антитела в сыворотках крови и на слизистых лёгких. Сывороточные Ат определяли у мышей как после первичной, так и после вторичной иммунизации образцом 3,4-ац д/ц мЛПС, с использованием реакции прямой гемагглютинации (РПГА) и нТИФА. 9.8.1. Методика иммунизации мышей образцом 3,4-ац д/ц мЛПС и отбора биоматериала Использовали мышей самок или самцов (CBA x C57 BI/6) F1 весом 18-20 г. Животных иммунизировали опытными образцами интраперитонеально, подкожно и интраназально. 9.8.1.1. Методика интраперитонеальной иммунизации мышей образцом 3,4-ац д/ц мЛПС и отбора биоматериала Методика интраперитонеальной иммунизации мышей и отбора биоматериала описана в пункте 9.5.1. Кровь забирали из передней полой вены через 14 дней после первичной и через 14 дней после повторной иммунизации. 9.8.1.2. Методика подкожной иммунизации мышей образцом 3,4-ац д/ц мЛПС и отбора биоматериала Подкожная иммунизация использовалась в исследовании субизотипов IgG Ат, секретируемых после введения 3,4 ац д/ц мЛПС. Мышей (CBA x C57 Bl/6) F1 иммунизировали двукратно в холку, с интервалом в 14 дней. Последующие этапы методики описаны в пункте 9.5.1. 9.8.1.3. Методика интраназальной иммунизации мышей образцом 3,4-ац д/ц мЛПС и отбора биоматериала Интраназальная иммунизация была применена в исследовании гуморального иммунного ответа у мышей на слизистых. 46 Интраназальная иммунизация осуществлялась под действием эфирной анестезии. Мыши были иммунизированы двукратно 50 мкг исследуемого образца, растворённого в 20 мкл физиологического раствора, с интервалом в 14 дней. Перед процедурой забора биоматериала мыши умервщлялись. Было проведено рассечение грудинно-рёберного сочленения по грудинной линии с последующим вскрытием грудной клетки и выделением бронхолёгочного аппарата. Бронхолёгочный аппарат измельчали и помещали в 2 мл охлаждённого физиологического раствора. Для определения Ат на слизистых мышей использовали бронхолёгочный лаваж. Контрольные смывы получали от не иммунизированных животных. 9.8.2. Определелие сывороточных агглютинивов методом РПГА Для постановки реакции готовят двукратные разведения сывороток в 0,9 % растворе натрия хлорида в объеме 100 мкл, начиная с разведения сывороток 1:4 в полистироловых круглодонных планшетах. В каждую из лунок добавляют по 25 мкл эритроцитарного диагностикума против шигелл Флекснера 1-5 (Микроген серия № 101110). Планшеты встряхивают и оставляют на два часа при комнатной температуре. Агглютинины определяли в сыворотках мышей, иммунизированных интраперитонеально как однократно, так и двукратно. 9.8.3. Постановка нТИФА для характеристики изотипов и субизотипов IgG сывороточных антител и антител на слизистой у мышей (CBA x C57 B1/6) F1, иммунизированных 3,4-ац д/ц мЛПС Были исследованы сывороточные антитела и антитела на слизистых у мышей, иммунизированных 3,4-ац д/ц мЛПС. Протокол постановки нТИФА описан в пункте 9.5.2. На фазу адсорбировали 3-6-ац д/ц нЛПС. Для исследования первичного и вторичного системного гуморального ответа у мышей, иммунизированных 3,4-ац д/ц мЛПС, а также антител на слизистых использовали меченые пероксидазой хрена антитела козы против IgA, IgG, IgM мыши («Sigma - Aldrich» или «Merc»). Для определения субизотипов 47 IgG Ат использовали конъюгированные с пероксидазой хрена антитела козы против IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 Ат мыши («Sigma - Aldrich»). 9.9. Определение протективной активности 3,4-ац д/ц мЛПС в опыте по экспериментальному заражению Перед определением протективной активности производных ЛПС S. flexneri 2a необходимо определить 50% и 100 % инфицирующую дозу (ИД50 и ИД100) у морских свинок для используемого в опыте вирулентного штамма S. flexneri 2a 1605. 9.9.1. Определение ИД50 и ИД100 вирулентного штамма S. flexneri 2a 1605 у морских свинок Для определения ИД50 и ИД100 вирулентных штаммов S. flexneri 2a 1605 проводили заражение морских свинок в конъюнктиву глаз указанным штаммом дозами по 107, 2х107, 5х107 микробных клеток (табл. 6). Табл. 6. Схема определения ИД50 и ИД100 штамма S. flexneri 2a 1605 Штамм S. flexneri 2a 1605 Заражающая доза Кол-во животных 107 3 2х107 3 5х107 3 9.9.2. Постановка кератоконъюнктивальной пробы Для оценки протективных свойств производных ЛПС S. flexneri 2а была разработана кератоконъюнктивальная проба, которая является модифицированным тестом Sereny [157] для инфекции S. flexneri 2а (рис. 1). Иммунизация морских свинок осуществлялась дозами 25 мкг и 50 мкг подкожно в область спины двукратно с интервалом в 10 дней. На 10 день после повторной иммунизации проводили заражение в конъюнктиву глаза штаммом S. flexneri 2a 48 1605 дозами, соответствующими ИД50 и ИД100. Иммуногенность препарата оценивали на третьи сутки по количеству здоровых глаз. 10 дней 10 дней Иммунизация в область Введение в конъюнктиву спины п/к Повторная глаза вирулентного штамма производными ЛПС вакцинация теми же S. flexneri 2а 1605 в дозах, S. flexneri 2а в дозах 25 и дозами близких к ИД50 и ИД100 50 мкг Рис. 1. Схема опыта по постановке кератоконъюнктивальной пробы. 9.10. Определение перекрёстной активности сывороточных антител у мышей после иммунизации 3,4-ац д/ц мЛПС Для определения перекрёстной активности антител мышей, иммунизированных образцом 3,4-ац д/ц мЛПС, была проведена оценка бактериолитических свойств мышиных сывороток по отношению к культурам гомологичной серогруппы S. flexneri 2а и гетерологичных серотипов и серогрупп S. flexneri 1a, 1b, 2b, 3a, 4a, 5a, 5b, X, Y. 9.10.1. Методика иммунизации мышей для определения перекрёстной активности сывороточных Ат Методика иммунизации мышей и получения биоматериала описана в пункте 2.5.1. Доза иммунизации опытными образцами составляла 10 мкг. 9.10.2. Оценка бактериолитических свойств мышиных сывороток Для выявления бактериологических свойств сывороток in vitro непрогретые сыворотки в разведения: 1:100 в объеме 0,1 мл вносили в лунки полистироловых пластинок для макрогемаглютинации. Затем в каждую лунку вносили 0,1 мл смыва 49 18-часовой агаровой культуры в концентрации 105 микробных клеток в 1 мл и помещали в термостат при 37 °С на 1,5 часа. Выявление бактериолитических свойств, происходило для каждой мышиной сыворотки индивидуально. В качестве контроля служила сыворотка, взятая от интактных мышей. После инкубации в каждую лупку добавляли 1,8 мл физиологического раствора и по 0,1 мл высевали на 2 чашки с твердой питательной средой. Посевы культивировали при 37°С и на следующие сутки регистрировали число колоний, выросших на чашках. Бактериолитический эффект оценивали по индексу эффективности (ИЭ): отношение числа колоний на контрольных чашках к числу колоний на опытных чашках. Считается, что сыворотка обладает выраженным бактсриолихическнм эффектом при индексе эффективности 2-3. 9.11. Клиническое исследование кандидатной вакцины против дизентерии Флекснера 2а «Флексвак» Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития было разрешено проведение I фазы клинических исследований (КИ) кандидатной вакцины против дизентерии Флекснера 2а «Флексвак» (разрешение № 04-16507/09 от 2009 года). Исследование проводилось как открытое на базе Федерального государственного учреждения здравоохранения «Центральная медико-санитарная часть №8 Федерального медико-биологического агенства», Калужская область, г. Обнинск. Главным исследователем была Хржановская И.Н. 9.11.1. Цель и задачи исследования кандидатной вакцины «Флексвак» Целью проведения клинических исследований было изучение безопасности и иммуногенности кандидатной вакцины «Флексвак» на ограниченном контингенте добровольцев. В исследовании были поставлены следующие задачи: Выявить местные и общие реакции на введение препарата «Флексвак», Определение изменений в общих и биохимических показателей крови на введение препарата «Флексвак», 50 Оценить продукцию специфического гуморального иммунного ответа на введение препарата «Флексвак». 9.11.2. Состав исследуемого препарата Кандидатная вакцина против дизентерии Флекснера 2а имеет торговое название «Флексвак». Активным веществом препарата «Флексвак» является длинноцепной 3,4- ацильный модифицированный ЛПС (мЛПС) S. flexneri 2a, полученный химическим путём. Структура активного вещества была установлена с помощью методов электрофореза и масс-спектрометрии. В исследовании применялся препарат «Флексвак» в растворе для инъекций, содержащем 100, 50 или 25 мкг активного вещества в ампуле, растворённого в объёме 0,5 мл. Препарат предназначен для подкожных или внутримышечных инъекций. Серия вакцины, используемая в испытаниях, была проконтролирована в ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора. 9.11.3. Дизайн исследования Было проведено простое слепое неконтролируемое рандомизированное исследование реактогенности и иммуногенности дизентерийной вакцины против шигелл Флекснера «Флексвак®», 1 фаза. Всего в исследовании приняли участие 26 добровольцев от 18 до 55 лет, подошедшие под критерии включения, которые были распределены по 3 группам независимо от возраста и пола (табл. 7). Добровольцы в каждой группе были иммунизированы одной дозой препарата «ФЛЕКСВАК®» подкожно в верхнюю треть плеча. Табл. 7. Схема формирования групп добровольцев. Препарат Флексвак № группы Доза иммунизации, мкг Количество человек 1 25 8 2 50 8 3 100 10 51 9.11.4. Отбор участников исследования Всего в исследовании приняли участие 26 добровольцев от 18 до 55 лет, подошедшие под критерии включения и не исключённых из исследования на основании критериев исключения (табл. 8). Табл. 8. Критерии отбора добровольцев на участие в клиническом исследовании. Критерии включения. Критерии исключения. Все участники для включения в исследование должны соответствовать информированное согласие на участие в следующим критериям: исследовании или на выполнение требований Добровольцы, которые, по мнению исследования. исследователей, могут и будут следовать требованиям протокола (т.е. Участие добровольца в любом другом заполнять исследовании. дневники, приходить на визиты). Невозможность или нежелание дать согласие Информированное Беременные и кормящие женщины. Обострение добровольца. заболеваний. Мужчины и женщины от 18 до 55 лет. Отсутствие лабораторном в анамнезе исследовании Отсутствие острых и заболеваниями которые в могут на проведение исследования (органические поражения центральной системы, декомпенсированная сердечно-сосудистой системы, обострения больные с любыми проявлениями почечной или острой печеночной недостаточностью, Отсутствие обострения хронических онкологические заболевания). заболеваний сердечно- сосудистой, бронхо- лёгочной, мочеполовой, Наличие медицинских показаний или желудочно- возникновение кишечной, опорно-двигательной, нервной и которые иммунной систем. с декомпенсации, патология хронических очаговых инфекций. при стадии Отсутствие обострения аллергических нервной заболеваний. Добровольцы дизентерии повлиять Флекснера. и аллергических нежелательных могут быть явлений, расценены как связанные с приемом Флексвака. Отрицательный тест на беременность Несоблюдение добровольцем режима по крови или моче (для женщин детородного приема Флексвака. возраста) не более чем за 24 часа до получения первой дозы Доброволец может быть исключен из исследуемого исследования по усмотрению исследователя, 52 препарата. если тот считает, что продолжение исследования наносит вред испытуемому. Причины выхода из исследования должны регистрироваться в соответствующем разделе индивидуальной регистрационной каты. Индивидуальная непереносимость Флексвака. 9.11.5. График обследования и процедур у добровольцев, принявших участие в исследованиии препарата «Флексвак» Добровольцы, решившие принять участие в исследовании, проходили обследование согласно схеме, представленной в табл. 9. Табл. 9. Схема прохождения процедур добровольцами. Анализ / процедура Информ. согласие Проверить по критериям включения Проверить по критериям исключения Скрининг Вак. Пост-вак. Завершение День 0 День 1 День 30 День 60 Визит 1 Визит 2 Визит 3 Визит 4 х х х х х х Медицинский анамнез х Общий осмотр х х х Термометрия х х х Клин. анализ крови х х х Биохим. анализ крови х х х Тест на беременность х RW, ВИЧ, HCV, HBs-Ag. х Образец крови для определения х х 53 х АТ к S. Flexneri 2а Проверка дневника х самонаблюдения Введение Флексвака х Подробное описание процедур по дням: Скрининг: День 0, визит 1 Получение письменного информированного согласия участника исследования до включения в исследование, Проверка по критериям включения, Проверка по критериям исключения, Сбор анамнеза, Общий осмотр, Термометрия перед вакцинацией (в подмышечной впадине), Взятие образца крови для проведения общего, биохимического анализов, выявления RW, ВИЧ, HCV, HbS-Аг, а также для определения АТ к S. flexneri 2а. Суммарный объём цельной крови не менее 10 мл, из них не менее 5 мл для определения АТ к S. flexneri. Проведение теста на беременность, Тест на запах алкоголя в выдыхаемом воздухе, Тест на наркотические и сильнодействующие средства. Вакцинация: День 1, Визит 2 Проверка по критериям исключения, Общий осмотр, Термометрия перед вакцинацией (в подмышечной впадине), Вакцинация препаратом «Флексвак» в верхнюю треть плеча подкожно. Вакцинированный должен находиться под тщательным наблюдением (12 часов) с подготовленным необходимым оборудованием для возможного оказания медицинской помощи в случае возможной редкой анафилактической реакции после применения вакцины. 54 Через 6 часов после иммунизации взятие образца крови для проведения общего, биохимического анализов. Суммарный объём цельной крови не менее 10 мл. Участники исследования должны быть проинструктированы о необходимости немедленно связаться с исследователем в случае проявления любых признаков или симптомов, расцениваемых ими как серьёзные, Выдача участникам исследования дневников самонаблюдения, Проведение инструктажа по ведению дневника самонаблюдения. Пост-вакцинация: День 30, Визит 3 Проверка по критериям исключения, Взятие образца крови для проведения общего, биохимического анализов, а также для определения АТ к S. flexneri 2а. Суммарный объём цельной крови не менее 10 мл, из них не менее 5 мл для определения АТ к S. flexneri 2а. Исследователь должен собрать заполненные дневники самонаблюдения и проверить их. Завершение исследования: День 60, Визит 4 Проверка по критериям исключения, Взятие образца крови для определения АТ к S. flexneri 2а, не менее 5 мл. Завершение исследования. Таким образом, за весь период исследования вакцины «Флексвак» у добровольцев берут образцы венозной крови 4 раза: Забор венозной крови до иммунизации - скрининг (общий анализ крови, биохимический анализ крови, специфический иммунный ответ), Через 6 часов после иммунизации (общий анализ крови, биохимический анализ крови). Забор венозной крови на 30 день после иммунизации (общий анализ крови, биохимический анализ крови, специфический иммунный ответ), Забор венозной крови на 60 день после иммунизации (специфический иммунный ответ). 55 9.11.6. Оценка безопасности кандидатной вакцины «Флексвак» Параметрами оценки безопасности кандидатной вакцины «Флексвак» являлось определение нежелательных определяется как любой явлений (НЯ). неблагоприятный Нежелательное признак явление (включая (НЯ) отклонение лабораторного показателя от нормы), симптом или медицинское состояние, произошедшее после начала приема препарата исследования, даже если явление не было сочтено связанным с препаратом исследования. НЯ оценивали как общие и местные реакции организма. Медицинские состояния/заболевания, присутствовавшие до начала терапии исследования только в том случае считаются нежелательными явлениями, если они ухудшились после начала терапии исследования. Насколько это возможно, каждое НЯ также было описано следующим образом: • исход; • его продолжительность (дата и время начала и окончания); • интенсивность (легкое, умеренное, тяжелое); • его связь с препаратом исследования (вероятна, возможна, маловероятна, недостаточно признаков, не связано); • предпринятые меры. Интенсивность не отражает клинической серьезности явления, только уровень или степень вреда или проявления, и не отражает связи с препаратом исследования. Интенсивность нежелательного явления: Слабая: НЯ незначительной интенсивности, не мешает привычной деятельности; Умеренная: НЯ значительной интенсивности, мешает привычной деятельности; Сильная: НЯ приводит к невозможности осуществлять привычную деятельность; Причинная связь нежелательного явления с препаратом исследования: Вполне вероятно: реакция имеет обоснованную временную связь с введением препарата исследования, соответствует известной или предполагаемой картине ответа на препарат; подтверждается улучшением после прекращения приема или 56 снижения дозировки препарата, и не может быть убедительно объяснена известными характеристиками клинического состояния добровольца. Возможно: реакция имеет обоснованную временную связь с введением препарата исследования, соответствует известной или предполагаемой картине ответа на препарат, но может быть обусловлена рядом других факторов. Маловероятно: реакция не имеет обоснованной временной связи с введением препарата исследования и легче объясняется не связанными с препаратом факторами, хотя причинная связь с препаратом исследования без сомнения не может быть исключена. Недостаточно признаков: заключение о связи с препаратом исследования невозможно. Имеющиеся причины недостаточны для бесспорного утверждения. Не связано: любое явление, для которого имеется достаточная и убедительная информация, что оно не связано с препаратом исследования. Оценка серьезности НЯ осуществляется изначально исследователем или клиническим соисследователем. Серьезное нежелательное явление (СНЯ) определяется как неблагоприятный признак, симптом или медицинское состояние, которые: - привело к смерти; - представляет собой угрозу для жизни; - требует госпитализации или её продления; - привело к стойкой или значительной нетрудоспособности или инвалидности Серьезным нежелательным явлением не считается: - неотложное амбулаторное лечения по поводу явления, если оно не удовлетворяет любому из данных выше определений серьезности. 9.11.7. Определение специфического иммунного ответа у добровольцев, иммунизированных препаратом «Флексвак» Иммуногенность оценивали как увеличение концентрации О-специфических антител к ЛПС S. flexneri 2а. Уровни антител определяли путём постановки РПГА и нТИФА с использованием парных порций сывороток добровольцев, полученной от всех привитых до иммунизации через 30 и через 60 дней после иммунизации. 57 9.11.7.1. Постановка РПГА для определения О-специфических анти-S. flexneri 2а антител в сыворотках добровольцев Для постановки реакции готовили двукратные разведения сывороток в 0,9 % растворе натрия хлорида в объеме 100 мкл, начиная с разведения сывороток 1:4 в полистироловых круглодонных планшетах. В каждую из лунок добавляли по 25 мкл эритроцитарного диагностикума против шигелл Флекснера 1-5 (ФГУП «НПО Микроген» № 6-153). Планшеты встряхивали и оставляли на полтора - два часа при комнатной температуре. Результат оценивали по степени сероконверсии. 9.11.7.2. Постановка нТИФА для определения О-специфических анти-S. flexneri 2а антител в сыворотках добровольцев Специфичный высокоактивный Аг 3-6-ац д/ц нЛПС в концентрации 40 мкг/мл сорбировали на полистироловых планшетах («Greiner») в 0,05 М растворе карбонантно - бикарбонантного буфера рН 9,5, внося по 100 мкл раствора Аг в лунку. Последующие этапы постановки нТИФА описаны в пункте 2.3. В качестве детектирующего реагента использовали меченые пероксидазой хрена антитела козы против IgA, IgG, IgM человека («Sigma - Aldrich»). Конъюгат в рабочем разведении на ФСБ-А вносили по 100 мкл в лунку. 9.12. Методы статистической обработки полученных результатов Для математической обработки полученных данных использовалась программа Excell («Microsoft»). Результаты в работе были представлены как среднегеометрический (СГ) показадель выборки. Для оценки вариабельности использовалось стандартное отклонение (СО). Сравнение выборок осуществлялось с помощью t- критерия при р<0,05. 58 10. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 10.1. Характеристика структур ЛПС S. flexneri 2а, используемых для формирования исследовательских панелей ЛПС S. flexneri 2а является одной из наиболее гетерогенных по структуре биомолекул [1]. Разнообразие структурных вариантов ЛПС S. flexneri 2а выражается в разном количестве остатков жирных кислот - ацилов (ац) в липиде А, наличием или отсутствием ацетильной группы на цепи О-ПС в положении 3,4 и в различной длине цепи О-ПС (рис. 2). О - полисахарид кор липид А Рис. 2. Схема строения ЛПС S. flexneri 2a. Формирование исследовательской панели ЛПС S. flexneri 2а для последующих иммунологических исследований осуществлялось в соответствии с данными структурных параметров (табл. 10). Одним из первых был получен образец 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС, содержащий смесь нативных ЛПС S. flexneri 2а (нЛПС) без разделения по фракциям (табл. 10, а). ЛПС, его составляющие, имели длину О-ПС цепи преимущественно от 1 до 15 тетрасахаридных блоков (рис. 3, а) с ацетильной группой в положении 3,4 и липид А, содержащий от 3 до 6 остатков высших жирных кислот (рис. 4, а). 59 Табл. 10. Группы образцов ЛПС S. flexneri 2а. № Наименование образца. Количество остатков Длина О-ПС цепи жирных кислот в (количество липиде А. тетрасахаридных блоков). Ацетильная группа в положении 3,4. а 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС 3-6 1-15 + б 3-6-ац д/ц нЛПС 3-6 10-15 + в 3-6-ац к/ц нЛПС 3-6 1-7 + г 4,3-ац д/ц мЛПС 4,3 10-15 - д 3,4-ац к/ц мЛПС 3,4 1-7 - е 3,4-ац д/ц мЛПС 3,4 10-15 - ж 3,4-ац д/ц нЛПС 3,4 10-15 + з 3-ац д/ц мЛПС 3 10-15 - и 2,3-ац д/ц мЛПС 2,3 10-15 - к д/ц ПС - 10-15 - Последующее разделение нЛПС позволило получить образцы 3-6-ац д/ц нЛПС и 3-6-ац к/ц нЛПС, которые отличались длиной цепи О-ПС (табл. 10. б, в). Короткая цепь О-ПС образца 3-6-ац к/ц нЛПС содержала преимущественно 1-7 тетрасахаридных блоков (рис. 3 в). Длинная цепь О-ПС 3-6-ац д/ц нЛПС содержала в основном 10-15 тетрасахаридных блоков (рис. 4 б). Образцы 4,3-ац д/ц мЛПС, 3,4-ац к/ц мЛПС, 3,4-ац д/ц мЛПС, 3-ац д/ц мЛПС и 2,3-ац д/ц мЛПС (табл. 10. г, д, е, ж, з, и) были получены с помощью методов химической обработки [117] и относились к модифицированным ЛПС S. flexneri 2а (мЛПС). Они отличались количеством остатков жирных кислот в липиде А. Также, в исследованиях был использован образец, содержащий О-ПС S. flexneri 2а – д/ц ПС (табл. 10 к), полученный при классической кислотной деградации нЛПС [4]. 60 В нативном ЛПС S. flexneri 2а в положении 3 примерно в 60%, а в положении 4 примерно в 25% случаев, находится О-ацетильная группа [54, 56]. Методы химической модификации, способные повлиять на жирнокислотный состав липида А, приводят к её удалению. Распределение фракций ЛПС S. flexneri 2а с определённой длиной О-ПС цепи в образцах было исследовано с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 3). Строение липида А определяли методом масс-спектрометрии (рис. 4). а б в г Рис. 3. Электрофорез полиакриламидном геле. д опытных а е ж образцов ЛПС б 61 з S. и flexneri 2а в в г д е ж з 62 и На Рис. 3 и Рис. 4: а. 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС; б. 3-6-ац д/ц нЛПС; в. 3-6-ац к/ц нЛПС; г. 4,3-ац д/ц мЛПС; д. 3,4-ац к/ц мЛПС; е. 3,4-ац д/ц мЛПС; ж. 3,4-ац д/ц нЛПС; з. 3-ац д/ц мЛПС; и. 2,3-ац д/ц мЛПС. Рис. 4. Масс-спектры с ионизацией электрораспылением опытных образцов ЛПС S. flexneri 2а. 10.2. Исследование влияния структурного полиморфизма ЛПС S. flexneri 2a на его О- специфическую антигенную активность с использованием моно- и поливалентных шигеллёзных сывороток. Для исследования специфической активности модифицированных и нативных ЛПС S. flexneri 2а были использованы коммерческие сыворотки, содержащие моновалентные гомологичные Ат к группоспецифическому - 3,4 или типоспецифическому - II антигену О-ПС цепи ЛПС S. flexneri 2а (табл. 1). Также, в панель сывороток были включены: моновалентные гетерологичные сыворотки (группоспецифическая - 7,8 специфичная к ЛПС S. flexneri 2b, 3a, 5b, X и типоспецифическая - I сыворотка специфичная к ЛПС S. flexneri 1a и 1b) и, часто используемая в диагностическая клинической сыворотка. практике, Данные по поливалентная S. сравнительному flexneri 1-5 исследованию О-специфической активности образцов ЛПС S. flexneri 2а представлены на рис. 5. 63 6400 7000 6400 6400 6400 6400 6400 6400 6400 6000 конечный титр 5000 3200 4000 3200 3200 3200 3000 1600 800 2000 1000 0 0 0 3-4 ац. д/ц мЛПС 0 0 2-3 ац. д/ц мЛПС 1.-5. 400 0 0 0 II 3,4 0 0 I 0 7,8 д/ц ПС 3-6 ац д/ц нЛПС 3-6 ац к/ц нЛПС Рис. 5. Влияние особенностей строения О-специфическую серологическую активность. ЛПС S. flexneri 2а на Как показано на рис. 5 длинноцепные мЛПС: 3,4-ац д/ц мЛПС, 2,3-ац д/ц мЛПС, а также д/ц ПС активно связывают Ат гомологичных моновалентных сывороток 3,4; II и поливалентной сыворотки 1-5 в конечном титре не ниже 3200, что сравнимо с активностью длинноцепного нативного ЛПС – 3-6-ац д/ц нЛПС. Следовательно, применяемые методы химической модификации ЛПС S. flexneri 2а не повреждают антигенные детерминанты цепи О-ПС ЛПС S. flexneri 2а и они доступны для связывания с Ат. Серологическая активность д/ц О-ПС и д/ц ЛПС как в нативной, так и в модифицированной форме, существенно не отличается. То есть, присутствие в молекуле ЛПС липида А не оказывает существенного влияния на специфическую активность длинноцепных ЛПС S. flexneri 2а. Кроме того влияние методов химической модификации ЛПС S. flexneri 2а, таких как частичное деацитилирование липида А, не приводит к изменению серологической активности д/ц мЛПС S. flexneri 2а. 64 Однако серологическая активность к/ц нЛПС была существенно ниже по сравнению с д/ц нЛПС, и д/ц ПС (рис. 5 и 6), что, по-видимому, обусловлено существенно более низким удельным содержанием О-Аг детерминант в образце к/ц ЛПС. OD 0,9 0,8 3-6 ац к/ц нЛПС 0,7 3-6 ац д/ц нЛПС 0,6 д/ц ПС 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 50 100 200 400 800 титр 1600 3200 6400 Рис. 6. Взаимодействие 3-6-ац к/ц ЛПС, 3-6-ац д/ц ЛПС и д/ц ПС с моновалентной типовой сывороткой II. Следует отметить, что в нЛПС S. flexneri 2а в положении 3 и 4 примерно в 60% и 25% случаев, соответственно, находится О-ацетильная группа [54, 56]. Методы химической модификации, способные повлиять на жирнокислотный состав липида А, приводят к её удалению. Вместе с тем, отсутствие О-ацетата в положении 3,4 не приводит к потере способности ЛПС S. flexneri 2а связывать гомологичные АТ из диагностических сывороток II, 3,4 и 1-5. Все полученные образцы вне зависимости от длины цепи О-ПС, наличия или отсутствия липида А, количества остатков жирных кислот в липиде А, а также наличия или отсутствия О-ацетильной группы связывают Ат сывороток 3,4, II и 1-5 и не реагируют с сывороткой 7,8 и I (рис. 6). Таким образом, представленные образцы обладают О-Аг специфичностью, характерной для ЛПС S. flexneri серогруппы 2а. 65 10.3. Изучение условий индукции пирогенной реакции у кроликов производными нЛПС S. flexneri 2а Пирогенная реакция является одним из наиболее чувствительных методов оценки эндотоксичности. Тест пирогенности на кроликах широко применяется для оценки эндотоксичности вакцин, прежде всего бактериальных и включен в целый ряд иммунологических и международных фармакопей. Методика определения пирогенной реакции у кроликов была одинакова для всех исследованных образцов (пункт 2.4). Пирогенность определяли при внутривенном введении кроликам 25 нг. каждого исследуемого образца на килограмм веса кролика, растворённых в 1 мл изотонического раствора (табл. 11). Табл. 11. Исследование пирогенности образцов нЛПС и мЛПС S. flexneri 2a. Образец 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС 3-6-ац д/ц нЛПС 3-6-ац к/ц нЛПС 4,3-ац д/ц мЛПС 3,4-ац к/ц мЛПС 3,4-ац д/ц мЛПС 3,4-ац д/ц нЛПС Изменение температуры у кроликов после инъекции (∆tºС). +1,6 +1,5 +1,1 +1,7 +1,5 +1,5 +1,7 +1,7 +0,3 +1,0 +0,2 +0,4 +0,6 +0,4 -0,4 -0,2 +0,3 +0,3 +0,3 Суммарное изменение температуры у кроликов после инъекции (∑Δ tºС) Количество кроликос с Δ t больше 0,5ºС (Δ t > 0,5ºС) +4,2 3 +3,2 2 +4,9 3 +1,5 1 +1,4 1 -0,6 0 +0,9 0 66 3-ац д/ц мЛПС 2,3-ац д/ц мЛПС +0,5 +0,2 +0,2 +0,3 +0,2 +0,7 0 +0,7 0 Исследуемые образцы, по результатам пирогенной реакции кроликов на их внутривенное введение (табл. 11), можно разделить на 3 группы: пирогенные ∑Δt ≥ 3 ºС; низкопирогенные – 1,2 ºС < ∑Δ t < 3 ºС и апирогенные – ∑Δt ≤ 1,2 ºС. Апирогенные образцы оценивались в соответствии со стандартами фармакопеи РФ, где вещества признают апирогенными, если суммарное изменение температуры у 3 кроликов после инъекции не превышает 1,2 ºС и ни у одного из кроликов не было обнаружено повышения температуры больше 0,5 ºС [5]. Разделение опытных образцов на 3 группы позволяет выявить переходные закомонерности отличающие низкопирогенные образцы, как от пирогенных, так и от апирогенных образцов. В группу пирогенных образцов были включены ЛПС S. flexneri 2a с неизменённым липидом А. В эту группу вошли образцы: 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС, 3-6-ац д/ц нЛПС, 3-6-ац к/ц нЛПС. Низкопирогенными были следующие образцы: 4,3-ац д/ц мЛПС, 3,4-ац к/ц мЛПС. Главным отличием пирогенных от низкопирогенных образцов является наличие в составе пирогенных образцов пента- и гексаацильных производных ЛПС S. flexneri 2a. Длина цепи О-ПС, в данном случае, не влияет на степень пирогенной реакции, т.к. пирогенными являются и длинноцепной (3-6-ац д/ц нЛПС) и короткоцепной (3-6-ац к/ц нЛПС) образцы с одинаковыми липидами А. В группу апирогенные были включены препараты, соответствующие критериям апирогенности, описанным в фармакопеи РФ [5]: 3,4-ац д/ц мЛПС, 3,4ац д/ц нЛПС, 3-ац д/ц мЛПС, 2,3-ац д/ц мЛПС. Апирогенные образцы могут содержать ди-, три- и тетраацильные производные ЛПС S. flexneri 2a так же как и низкопирогенные. Однако для 67 апирогенных образцов присутствие тетраацильных производных допустимо в минимальных количествах и только в составе длинноцепных фракций ЛПС. Так, образцы 3,4-ац д/ц мЛПС и 3,4-ац к/ц мЛПС содержат примерно одинаковое соотношение три- и тетраацильных ЛПС S. flexneri 2a в составе, однако длинноцепной образец апирогенен для кроликов, а короткоцепной мЛПС может быть отнесён только к низкопирогенным (∑Δt = 1,4ºС). Таким образом, на данном этапе изучения иммуногенности ЛПС S. flexneri 2a наиболее важным представляется факт получения апирогенных образцов ЛПС S. flexneri 2a вследствие химической модификации, удовлетворяющих по этому параметру требования Фармакопеи РФ XII. 10.4. Исследование гуморального ответа у мышей к пирогенным нЛПС S. flexneri 2а, отличающихся по длине О-ПС цепи Были проведены сывороточных антител исследования у мышей продукции (CBAxC57B1/6)F1, ЛПС-специфических иммунизированных препаратами д/ц, к/ц нЛПС с различной длиной О-ПС цепи и смесью д/ц+к/ц нЛПС (рис. 3 а, б, в). Исследуемые образцы нЛПС S. flexneri 2а содержат неизменённый, 3-6-ацильный, липид А (рис. 4 а, б, в), а потому являются классическими эндотоксинами. Внутривенное введение кроликам данных образцов приводило к возникновению сильной пирогенной реакции (табл. 11). Специфичные IgG, IgM определяли у мышей опытных и контрольных групп, используя в качестве детектирующих антигенов, адсорбируемых на твёрдой фазе полистироловых планшетов, те же самые образцы нЛПС S. flexneri 2а, какими были иммунизированы мыши. Таким образом, были определены конечные титры Ат в сыворотках мышей как на Аг, используемый для иммунизации мышей данной группы так и параллельных групп (табл. 12). Антитела в мышиных сыворотках определяли с помощью нТИФА после двукратной иммунизации исследуемыми образцами. 68 Табл. 12. Определение конечных титров Ат в сыворотках мышей, иммунизированных препаратами д/ц, к/ц нЛПС с различной длиной О-ПС цепи и смесью д/ц+к/ц нЛПС, при адсорбции на твёрдой фазе образца 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС. Опытный образец доза имм. (мкг) Контрольная 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС группа __ 10 50 3-6-ац д/ц нЛПС 3-6-ац к/ц нЛПС 10 50 10 50 IgG 348,22± 2111,21± 263,90± 2111,21± 1600,00± 2111,21± 1212,57± (СГТ ± СО) 609,92 1131,37 141,42 1131,37 1200,00 2234,28 2488,37 IgM 400,00± 800,00± 918,96± 1055,61± 800,00± 303,14± 400,00± (СГТ ± СО) 219,09 438,18 357,77 438,18 0,00 109,54 219,09 (СГТ ± СО) – среднее геометрическое титра ± стандартное отклонение. Статистически достоверные изменения КТ IgG были зарегистрированы в сыворотках мышей после иммунизации дозой 10 мкг образца 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС - 2111,21±1131,37, а также после иммунизации дозами 10 и 50 мкг образца 3-6-ац д/ц нЛПС - 2111,21±1131,37 и 1600,00±1200,00, соответственно (табл. 12). Статистически достоверные подъёмы КТ IgM были выявлены в группах мышей после иммунизации 50 мкг образца 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС - 918,96±357,77, и после иммунизации дозами 10 и 50 мкг образца 3-6-ац д/ц нЛПС - 1055,61±438,18 и 800,00±0,00, соответственно. Табл. 13. Определение конечных титров Ат в сыворотках мышей, иммунизированных препаратами д/ц, к/ц нЛПС с различной длиной О-ПС цепи и смесью д/ц+к/ц нЛПС, при адсорбции на твёрдой фазе 3-6-ац д/ц нЛПС. образец контроль 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС 3-6-ац д/ц нЛПС 3-6-ац к/ц нЛПС доза имм. __ 10 50 10 50 10 50 (мкг) IgG 229,74± 824,68± 1392,88± 1212,57± 4313,62± 3752,43± 350,16± (СГТ ± СО) 124,83 89,44 606,63 979,80 438,18 2262,74 2146,63 IgM 348,22± 1055,61± 918,96± 4850,29± 3675,83± 1055,61± 2111,21± (СГТ ± СО) 230,94 438,18 536,66 1752,71 1431,08 438,18 876,36 (СГТ ± СО) – среднее геометрическое титра ± стандартное отклонение. 69 С использованием в качестве детектирующего Аг 3-6-ац д/ц нЛПС (табл. 13) статистически достоверные изменения КТ IgG были зарегистрированы после иммунизации каждой из двух доз образцов 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС и 3-6-ац д/ц нЛПС. Изменения КТ IgM были выявлены у мышей, иммунизированных каждым из исследуемых образцов дозами 10 и 50 мкг. Табл. 14. Определение конечных титров Ат в сыворотках мышей, иммунизированных препаратами д/ц, к/ц нЛПС с различной длиной О-ПС цепи и смесью д/ц+к/ц нЛПС, при адсорбции на твёрдой фазе 3-6-ац к/ц нЛПС. образец контроль 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС 3-6-ац д/ц нЛПС 3-6-ац к/ц нЛПС доза имм. __ 10 50 10 50 10 50 (мкг) IgG 527,80± 1600,00± 800,00± 1837,92± 800,00± 1600,00± 1600,00± (СГТ ± 219,09 2575,27 2400,00 0,00 426,52 0,00 0,00 СО) IgM 918,96± 4222,43± 3675,83± 4222,43± 3200,00± 1212,57± 3675,83± (СГТ ± 536,65 438,17 2262,74 2146,62 2262,74 2862,16 1431,08 СО) (СГТ ± СО) – среднее геометрическое титра ± стандартное отклонение. Жирным шрифтом отмечены статистически достоверные результаты при р≤0,05. И при адсорбции микропланшетов 3-6-ац к/ц нЛПС (табл. 14) статистически достоверные изменения КТ IgG были зарегистрированы после иммунизации мышей дозой 10 мкг образца 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС - 1600,00±426,52 и в группах мышей, иммунизированных дозами 10 и 50 мкг образца 3-6-ац к/ц нЛПС, где КТ составил 1600,00±0,00 независимо от дозы иммунизации. Изменения КТ IgM были выявлены у мышей, иммунизированных каждой из доз образцов 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС и 3-6-ац д/ц нЛПС, а в группе иммунизированной 50 мкг образца 3-6-ац к/ц нЛПС. Данные, представленные в табл. 12, 13 и 14 показывают, что наименее низкие значения КТ фоновых Ат в сыворотках интактных мышей, а также наибольшее количество статистически достоверных повышений КТ Ат в сыворотках мышей опытных групп были зарегистрированы при адсорбции в лунки планшетов 3-6-ац д/ц нЛПС. Это позволяет рассматривать образец 3-6-ац д/ц нЛПС как 70 наиболее эффективный детектирующий Аг, дающий максимальное разрешение метода. Для более подробного сравнительного исследования иммуногенности образцов нами были определены кратности прироста КТ Ат в группах мышей, иммунизированных исследуемыми образцами по сравнению с животными контрольной группы (рис. 7). ^ *+ **++ 18,77 ^ *+ **++ 13,93 20 18 16 кратность 14 12 ^ * 6,06 10 8 6 ^ 3,03 4 2 1 ^ *+ **++ 16,33 IgG IgM ^ + ++ 10,56 ^ 6,06 ^ 5,28 ^ 3,03 1,52 ^ 2,64 1 3,59 0 __ контроль 10мкг 50мкг 3-6 ац д/ц+к/ц нЛПС 10мкг 50мкг 3-6 ац д/ц нЛПС 10мкг 50мкг 3-6 ац к/ц нЛПС ^ - статистически достоверное увеличение КТ относительно КТ группы контроля (р≤0,05). * - статистически достоверное увеличение КТ относительно КТ группы иммунизированной 3-6-ац к/ц нЛПС в той же дозе, что и сравниваемая группа ** - статистически достоверное увеличение КТ относительно КТ группы иммунизированной 3-6-ац к/ц нЛПС с наиболее высоким КТ + - статистически достоверное увеличение КТ относительно КТ группы иммунизированной 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС в той же дозе, что и сравниваемая группа ++ - статистически достоверное увеличение КТ относительно КТ группы иммунизированной 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС с наиболее высоким КТ Рис. 7. Определение кратности прироста конечных титров Ат в сыворотках мышей, при адсорбции на твёрдой фазе образца 3-6-ац д/ц нЛПС. Кратность прироста IgG в группах мышей иммунизированных 10 и 50 мкг образца 3-6-ац к/ц нЛПС составила 1,52 и 3,59 соответственно. Кратность прироста IgM в тех же группах составила 3,03 и 6,06 соответственно. Достоверное 71 увеличение КТ относительно показателя контрольной группы (р ≤ 0,05), было зарегистрировано в обеих опытных группах, но только для IgM Ат. В группах мышей, иммунизированных 10 мкг и 50 мкг образца 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС, кратность прироста IgG составила 6,06 и 5,28 соответственно. Прирост IgM в тех же группах, иммунизированных мышей, составил 3,03 и 2,64 соответственно. В обеих группах мышей, иммунизированных 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС КТ IgG и IgM статистически достоверно (р≤0,05) выше, чем в контрольной группе. В группе, иммунизированной 10 мкг образца 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС, КТ IgG статистически достоверно выше, чем этот показатель в группе мышей, иммунизированной дозой 10 мкг 3-6-ац к/ц нЛПС. В группах мышей, иммунизированных 10 мкг и 50 мкг образца 3-6-ац д/ц нЛПС, кратность прироста IgG составила 18,77 и 16,33 соответственно. Прирост IgM в тех же группах мышей составил 13,93 и 10,56, соответственно. В обеих группах мышей КТ IgG и IgM статистически достоверно выше, чем в контрольной группе (р≤0,05). Кроме того, в группе мышей, иммунизированной 10 мкг образца 3-6-ац д/ц нЛПС, КТ IgG и IgM достоверно выше (р≤0,05), чем в группах мышей, иммунизированных аналогичными дозами образцов 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС и 3-6-ац к/ц нЛПС. Более того, в данной группе КТ IgG и IgM достоверно выше (р≤0,05) чем наиболее высокие показатели КТ Ат в группах, иммунизированных 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС и 3-6-ац к/ц нЛПС. В группе, иммунизированной 50 мкг образца 3-6-ац д/ц нЛПС, КТ IgG достоверно выше (р≤0,05), чем в группах, иммунизированных такими же дозами образцов 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС и 3-6-ац к/ц нЛПС, а также чем наиболее результативные показатели КТ IgG в этих группах. Показатель КТ IgM в группе, иммунизированной 50 мкг образца 3-6-ац д/ц нЛПС, достоверно выше (р≤0,05), чем в группе, иммунизированной 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС. 72 10.5. Исследование гуморального ответа у мышей к низкопирогенным и апирогенным ЛПС с различной длиной О-ПС цепи В дополнение к предыдущему разделу исследований, было проведено сравнительное исследование кратности прироста Ат у групп мышей, иммунизированных образцами, которые содержали 3,4-ацильные ЛПС и отличались преобладанием в составе короткоцепной или длинноцепной О-ПС фракции ЛПС (рис. 8). Образцы 3,4-ац д/ц нЛПС и 3,4-ац д/ц мЛПС отличаются по условиям получения. Образец 3,4-ац д/ц нЛПС является 3,4-ацильной фракцией нативного ЛПС, а образец 3,4-ац д/ц мЛПС – модифицированный ЛПС, полученный с помощью химических методов. Кроме того, образцы 3,4-ац д/ц нЛПС и 3,4-ац д/ц мЛПС апирогенны, а их короткоцепной аналог – 3,4-ац к/ц мЛПС низкопирогенен (табл. 11). Как показано на рис. 8 при иммунизации мышей 3,4-ац к/ц мЛПС дозой 10 мкг, КТ IgG и IgM, относительно показателей в контрольной группе, увеличился в 2,38 и 2,64 раз соответственно, а при введении 50 мкг - в 6,72 и 6,28 раз соответственно. Статистически достоверные показатели КТ IgG и IgM (р ≤ 0,05) были выявлены в группе мышей, иммунизированной 10 мкг 3,4-ац к/ц мЛПС. В группах мышей, иммунизированных 10 мкг и 50 мкг образца 3,4-ац д/ц мЛПС кратность прироста IgG составила 25,11 и 12,55 соответственно. Прирост IgM в тех же группах составил 21,11 и 10,57 соответственно. В обеих группах мышей КТ IgG и IgM статистически достоверно выше, чем в контрольной группе (р ≤ 0,05). В группе мышей, иммунизированной дозой 10 мкг образца 3,4-ац д/ц мЛПС КТ IgG и IgM достоверно выше, чем в группах иммунизированных 3,4-ац к/ц мЛПС (р ≤ 0,05). 73 35 30 ^* ^* ** ** 21,86 21,11 кратность 25 ^* ** 28,84 ^* ** 21,11 ^* ** ^* 25,11 ** 21,11 IgG IgM 20 ^ 12,55 ^ 10,57 15 10 5 1 1 ^ ^ 2,38 2,64 6,72 6,28 0 __ 10мкг контроль 50мкг 10мкг 3-4 ац к/ц мЛПС 50мкг 3-4 ац д/ц нЛПС 10мкг 50мкг 3-4 ац д/ц мЛПС ^ - статистически достоверное увеличение КТ относительно КТ группы контроля (р≤0,05). * - статистически достоверное увеличение КТ относительно КТ группы иммунизированной 3,4-ац к/ц мЛПС в той же дозе, что и сравниваемая группа ** - статистически достоверное увеличение КТ относительно КТ группы иммунизированной 3,4-ац к/ц мЛПС с наиболее высоким КТ Рис. 8. Определение кратности прироста конечных титров Ат в группах мышей, иммунизированных 3,4-ацильными образцами, при адсорбции на твёрдой фазе образца 3-6-ац д/ц нЛПС. В группах мышей, иммунизированных дозами 10 мкг и 50 мкг образца 3,4-ац д/ц нЛПС кратность прироста IgG составила 21,86 и 28,84 соответственно. Прирост IgM в тех же группах был 21,11-кратным. В этих группах КТ IgG и IgM в сыворотках мышей статистически достоверно выше, чем в контрольной группе (р ≤ 0,05). Следует отметить, что уровень IgG и IgM у мышей на 3,4-ац д/ц нЛПС классов достоверно выше, чем в группах мышей, иммунизированных 3,4-ац к/ц мЛПС (р ≤ 0,05). В связи с тем, что не было выявлено достоверных различий между КТ IgG и IgM в группах мышей, иммунизированных образцами 3,4-ац д/ц нЛПС и 3,4-ац д/ц мЛПС, можно сделать вывод, что используемые методы химической модификации не уменьшают иммуногенность ЛПС S. flexneri 2a (р ≤ 0,05). Результаты, представленные на рис. 7 и 8 свидетельствуют о значительной разнице в иммуногенности между короткоцепными и длинноцепными ЛПС, с одинаковыми 3,4-ацильными липидами 74 А. Вероятно, более высокая иммуногенность длинноцепных образцов обусловлена большим содержанием ОАг детерминант в цепи О-ПС. 10.6. Изучение влияния структуры липида А на иммуногенность длинноцепного ЛПС S. flexneri 2а у мышей В связи с более высоким уровнем продукции Ат у мышей на ЛПС S. flexneri 2а с длинной цепью О-ПС, особое внимание было уделено изучению иммуногенности структурных вариантов длинноцепного ЛПС S. flexneri 2а с разными липидами А (табл. 10 б, г, е, з, и). Структурные характеристики исследуемых образцов представлены на рис. 3 и 4 (б, г, е, з, и). Было установлено, что исследуемые образцы отличались по степени пирогенности на кроликах. Так, образец 3-6-ац д/ц нЛПС пирогенен, образец 4,3-ац д/ц мЛПС низкопирогенен и образцы: 3,4-ац д/ц мЛПС, 3-ац д/ц мЛПС, 2,3-ац д/ц мЛПС – апирогенны (табл. 11). Для сравнения иммуногенности были определены КТ IgG и IgM у мышей опытных групп, иммунизированных исследуемыми образцами в дозах 10 мкг и 50 мкг и контрольной группы не иммунизированных мышей (рис. 9). ^* 26,55 30 25 кратность 20 ^* 23,10 ^* 16,00 ^* 12,13 15 ^* 25,99 ^* 18,38 ^* 17,15 ^* 14,93 5 1,00 ^* 21,11 ^* 13,00 ^* 10,57 ^* 8,00 10 IgG ^* 21,11 ^* 8,57 IgM ^* 18,38 ^* 7,46 1,00 1,74 0,93 1,87 0,87 10мкг 50мкг 0 __ 10мкг 50мкг контроль 3-6 ац д/ц нЛПС 10мкг 50мкг 4-3 ац д/ц мЛПС 10мкг 50мкг 3-4 ац д/ц мЛПС 10мкг 50мкг 3 ац д/ц мЛПС 2-3 ац д/ц мЛПС ^ статистически достоверное увеличение КТ относительно КТ группы контроля (р≤0,05). * статистически достоверное увеличение КТ относительно КТ группы иммунизированной 2,3-ац д/ц мЛПС в той же дозе, что и сравниваемая группа Рис. 9. Сравнение гуморального ответа д/ц ЛПС S. flexneri 2а, отличающихся строением липида А. 75 Как представлено на рис. 9., КТ IgG и IgM в сыворотках мышей, иммунизированных 2,3-ац д/ц нЛПС, практически не отличаются от контрольных значений. При иммунизации дозой 10 мкг образца 2,3-ац д/ц нЛПС КТ IgG и IgM составили 1,74 и 0,93, а при иммунизации дозой 50 мкг 0,87 и 1,87 соответственно. В группах мышей, иммунизированных 3-6-ац д/ц нЛПС, кратность прироста IgG и IgM после иммунизации дозой 10 мкг составила 26,55 и 16,00 соответственно, а после иммунизации дозой 50 мкг 23,10 и 12,13 соответственно. В группах мышей, иммунизированных 4,3-ац д/ц мЛПС, кратность прироста IgG и IgM после иммунизации дозой 10 мкг составила 14,93 и 18,38 соответственно, а после иммунизации дозой 50 мкг 17,15 и 8,00 соответственно. Кратность прироста IgG и IgM в группах мышей, иммунизированных 3,4-ац д/ц мЛПС дозой 10 мкг составила 25,11 и 21,11 соответственно, а после иммунизации дозой 50 мкг 13,00 и 10,57 соответственно. В группах мышей, иммунизированных образцом 3-ац д/ц мЛПС, кратность прироста IgG и IgM после иммунизации дозой 10 мкг составила 8,57 и 21,11 соответственно, а после иммунизации дозой 50 мкг 7,46 и 18,38 соответственно. В группах мышей, иммунизированных образцами 3-6-ац д/ц нЛПС, 4,3-ац д/ц мЛПС, 3,4-ац д/ц мЛПС, 3-ац д/ц мЛПС КТ IgG и IgM были статистически достоверно выше, чем в контрольной группе, независимо от дозы иммунизации (р ≤ 0,05). И у мышей указанных групп КТ IgG и IgM достоверно выше, чем таковые в группах, иммунизированных 2,3-ац д/ц мЛПС (р ≤ 0,05). Результаты данного исследования свидетельствуют, что иммуногенность ЛПС S. flexneri 2а достоверно снижается с присутствием в составе опытного образца существенных количеств 2-ацильных производных ЛПС. Между тем, опытные образцы, содержащие 3-, 4-, 5- и 6-ацильные производные ЛПС продемонстрировали достоверно высокие уровни КТ IgG и IgM у мышей. Таким образом, учитывая данные по пирогенности и результаты исследования гуморального ответа можно сделать вывод, что апирогенный и 76 высокоиммуногенный образец должен содержать длинноцепные 3-ацильные, возможно с небольшой примесью 4-ацильных, производные ЛПС S. flexneri 2а. 10.7. Системный гуморальный иммунного ответа и иммунный ответ на слизистых у мышей, иммунизированных длинноцепными 3-ацильные производными ЛПС S. flexneri 2а Для характеристики гуморального иммунного ответа у мышей (CBAxC57B1/6)F1, иммунизированных 3,4-ац д/ц мЛПС, были определены КТ антител в сыворотке крови и на слизистой лёгких. Сывороточные Ат определяли у мышей как после первичной, так и после вторичной иммунизации образцом 3,4-ац д/ц мЛПС, с использованием методов РПГА и нТИФА. Постановку РПГА проводили с использованием широко распространённого в клинической лабораторной диагностике агглютиногена – диагностикума поливалентного S. flexneri 1-5. Отрицательным контролем послужили сыворотки мышей интактной группы. Также были определены агглютинины в сыворотках мышей, иммунизированных нативным образцом - 3-6-ац д/ц нЛПС (рис. 10). 27,2 30 24 конечный титр 25 20 16 12 15 II имм 10 5 I имм 0 0,4 0 1,2 0 0 0 __ контроль 10мкг 50мкг 10мкг 3-6 ац д/ц нЛПС 50мкг 3,4 ац д/ц мЛПС Рис. 10. Титры агглютининов сывороток мышей, иммунизированных 3-6-ац д/ц нЛПС и 3,4-ац д/ц мЛПС. 77 Как показано на рис. 10 в сыворотках мышей контрольной группы, как и в сыворотках мышей однократно иммунизированных образцами 3-6-ац д/ц нЛПС и 3,4-ац д/ц мЛПС, агглютининов к специфическому диагностикуму не выявлено. В группах мышей, двукратно иммунизированных дозами 10 мкг и 50 мкг образца 3-6-ац д/ц нЛПС, КТ агглютининов составил 24 и 16, соответственно. В группах мышей, двукратно иммунизированных дозами 10 мкг и 50 мкг образца 3,4-ац д/ц мЛПС, КТ агглютининов составил 27,2 и 12, соответственно. Статистически достоверных отличий между КТ агглютининов в сыворотках мышей иммунизированных 3-6-ац д/ц нЛПС и 3,4-ац д/ц мЛПС не зафиксировано. В сыворотках мышей методом нТИФА были определены IgA, IgG, IgM, после однократного и двукратного введения образца 3,4-ац д/ц мЛПС в, как показано ранее (рис. 9), иммуногенной дозе 10 мкг (рис. 11). 7000 контроль 6000 конечный титр ^ 6400,0 3,4 ац д/ц мЛПС I имм 5000 ^ 4222,4 3,4 ац д/ц мЛПС II имм 4000 3000 2000 1000 303,1 ^ 606,3 459,5 229,7 162,5 303,1 174,1 0 IgA IgG IgM Рис. 11. Конечные титры IgA, IgG, IgM в сыворотках мышей после однократной и двукратной иммунизации 3,4-ац д/ц мЛПС. Данные, представленные на рис. 11 показывают, что однократная иммунизации образцом 3,4-ац д/ц мЛПС приводила к достоверному повышению (р≤0,05) КТ IgG в сыворотках мышей до 606,3±219,1 (КТ IgG в контрольной группе 162,5±121,2). В группах мышей двукратно иммунизированных образцом 3,4-ац д/ц мЛПС регистрировалось повышение (р≤0,05) КТ сывороточных IgG и IgM до 78 4222,4±1752,7 и 6400,0±0 соответственно (КТ IgG и IgM в контрольной группе 162,5±121,2 и 303,1±103,3 соответственно). Исследование субклассов сывороточных IgG (рис. 12) показало, что при двукратной иммунизации образцом 3,4-ац д/ц мЛПС в дозе 2,5 мкг как при внутрибрюшинном, так и при подкожном введении доминирует субкласс IgG3. Кратность прироста КТ IgG3 субкласса относительно показателей контрольной группы составила 12,7 независимо от способа введения образца. ^ ^ 12,7 12,7 14 12 конечный титр 10 8 в/б п/к 6 4 2 1,59 1 1,59 1,59 2 1,59 0 IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 Рис. 12. Кратность прироста конечных титров субклассов IgG в группах мышей, иммунизированных 2,5 мкг 3,4-ац д/ц мЛПС. С целью оценки гуморального ответа на слизистых, особенно важного для иммунитета против шигелл, были определены мукозальные IgA, IgG, IgM в лёгочном лаваже мышей, иммунизированных двукратно интраназально образцом 3,4-ац д/ц мЛПС дозой 50 мкг (рис. 13). 79 450 контроль 400 конечный титр 350 3-4 ац д/ц мЛПС ^ 252,0 300 ^ 200,0 250 200 150 100 50,0 50,0 50,0 50,0 50 0 IgA IgG IgM Рис. 13. Конечные титры IgA, иммунизированных 3,4-ац д/ц мЛПС. IgG, IgM на слизистой мышей, Как представлено на рис. 13 уровни КТ мукозальных IgA и IgG у мышей, иммунизированных 3,4-ац д/ц мЛПС, был достоверно (р≤0,05) выше, по сравнению с КТ Ат в контрольной группе, и составили 252,0 и 200,0, соответственно. КТ IgА и IgG в контрольной группе не превышали 50. Уровень IgМ Ат на слизистых иммунизированных мышей и мышей контрольной группы не отличался и составил 50. Исследования профиля адаптивного гуморального ответа у мышей, иммунизированных образцом 3,4-ац д/ц мЛПС устанавило, что системный иммунный ответ мышей представлен в основном IgМ и IgG классами (рис. 11). Среди сывороточных IgG доминирует субкласс IgG3 (рис. 12). Сывороточные Ат мышей, иммунизированных 3,4-ац д/ц мЛПС, агглютинируют эритроциты, сенсибилизированные специфическими для S. flexneri 1-5 антигенами, не хуже Ат в сыворотках мышей, иммунизированных нативным образцом – 3-6-ац д/ц нЛПС (рис. 10). Также, исследование мукозального гуморального ответа установило возможность индукции IgA и IgG у мышей при интраназальной иммунизации образцом 3,4-ац д/ц мЛПС (рис. 13). 80 10.8. Исследование протективной активности образца 3,4-ац д/ц мЛПС S. flexneri 2а Для исследования протективной активности образца, содержащего преимущественно длинноцепные 3-ацильные производные ЛПС S. flexneri 2а, была проведена двукратная иммунизация морских свинок образцом 3,4-ац д/ц мЛПС, с последующим их заражением в конъюнктиву глаза вирулентным штаммом S. flexneri 2a (модифицированный Sereny тест). Отсутствие развития кератоконъюнктивита у иммунизированных морских свинок свидетельствовало о формировании протективной эффективности используемых образцов. В качестве сравнения протективной активности мукозального иммунитета, другая группа морских свинок была проиммунизирована главным протективным Аг S. flexneri 2а нативным ЛПС – 3-6-ац д/ц нЛПС. Морских свинок, иммунизированных образцами, инфицировали вирулентным штаммом S. flexneri 2a в дозе, вызывающей кератоконъюнктивит у 100% интактных морских свинок - ИД100. Для определения ИД100 проводили подтитровку инфицирующей дозы вирулентного штамма S. flexneri 2a на интактных морских свинках (табл. 15.). Табл. 15. Подтитровка заражающей дозы вирулентного штамма S. flexneri 2a. Штамм Заражающая доза (микр кл) Кол-во животных Заражено глаз Результат. Заболело/всего S. flexneri 2a 107 2х107 5х107 3 3 3 6 6 6 4/6 6/6 6/6 Данные из табл. 15 показывают, что для используемого в исследовании вирулентного штамма S. flexneri 2a минимальная ИД100 равна 2х107 микробных клеток. Иммунизация морских свинок образцами 3,4-ац д/ц мЛПС и 3-6-ац д/ц нЛПС происходила подкожно в область спины дозами по 25 мкг и по 50 мкг (табл. 16). 81 Табл. 16. Определение протективной эффективности мЛПС S. flexneri 2a при заражении вирулентным штаммом S. flexneri 2a. Доза Доза Результат Эффективность зараж. Кол-во Образец иммунизации (поражено (% здоровых (микр. животных (мкг) глаз/всего) глаз) кл.) 40 25 2х107 5 6/10 3,4-ац д/ц мЛПС 60 50 2х107 5 4/10 3-6-ац д/ц нЛПС 25 2х107 5 8/10 20 50 2х107 5 3/10 70 контроль - 2х107 5 10/10 0 Протектиная эффективность при парентеральной иммунизации образцами эффективность (% здоровых глаз) морских свинок была оценена по количеству непоражённых глаз (рис. 14). 80 70 70 60 60 50 40 40 30 20 20 10 0 0 25мкг 50мкг 3-4 ац д/ц мЛПС 25мкг 50мкг 3-6 ац д/ц нЛПС контроль Рис. 14. Сравнительное исследование протективной эффективности мЛПС S. flexneri 2a при заражении вирулентным штаммом S. flexneri 2a. Как показано на рис. 14 у морских свинок, иммунизированных двукратно образцом 3,4-ац д/ц мЛПС дозами 25 мкг и 50 мкг, протективная эффективность составила 40% и 60% соответственно. А у морских свинок, иммунизированных образцом 3-6-ац д/ц нЛПС дозами 25 мкг и 50 мкг, уровень защиты глаз морских свинок составил 20% и 70%, соответственно. Существенных отличий между 82 показателя протективной эффективности между модифицированным и нативным ЛПС S. flexneri 2a не выявлено. Также, для обоих образцов можно отметить, увеличение протективной эффективности при увеличении дозы иммунизации с 25 мкг на 50 мкг. 10.9. Перекрёстная бактериолитическая активность сывороточных антител мышей, полученных при иммунизации образцом длинноцепного 3-ацильного производного ЛПС S. flexneri 2а Для исследования перекрёстной активности антител мышей, иммунизированных образцом 3,4-ац д/ц мЛПС, была проведена оценка бактериолитических свойств мышиных сывороток по отношению к гомо- и гетерологичным серогруппам и серотипам шигелл Флекснера. Всего в исследовании было использовано 10 серогрупп и серотипов шигелл, среди которых гомологичной была культура клеток серогруппы S. flexneri 2а, а гетерологичными- S. flexneri 1a, 1b, 2b, 3a, 4a, 5a, 5b, X, Y. Выявление бактериолитических свойств, происходило для каждой мышиной сыворотки индивидуально. В качестве контроля служила сыворотка, взятая от интактных мышей (табл. 17). Табл. 17. Исследование перекрёстной бактериолитической активности сывороток мышей, иммунизированых 3,4-ац д/ц мЛПС. сыворотка № серогруппа 1a 1b 2a 2b 3a 4a 5a 5b X Y 1 кол-во колоний 2 ИЭ 1518 1,2 824 1,3 712 2,1 670 2,08 1424 1 444 3,7 310 3,9 760 0,9 950 1,1 970 1,5 3 4 кол-во колоний ИЭ кол-во колоний ИЭ 1998 484 412 648 1088 1326 888 480 1032 196 0,9 2,2 3,4 2,2 1,3 1,2 1,4 1,6 1 7,2 1452 716 532 600 1232 672 906 448 1040 1040 1,3 1,6 2,6 2,3 1,2 2,4 1,3 1,6 1 1,4 83 кол-во колоний контроль 5 ИЭ 1770 0,95 840 1,3 203 6,8 626 2,2 1600 0,9 642 2,7 687 1,8 632 1,2 896 1,2 372 3,8 кол-во колоний ИЭ 1980 0,94 940 1,2 312 4,5 810 1,7 800 1,8 540 3 1062 1,1 188 6,4 1008 1 360 3,9 кол-во колоний ИЭср 1870 1110 1398 1900 1440 1640 1200 752 1240 1416 1,06 1,5 3,88 2,1 1,24 2,6 2 2,34 1,1 3,56 Параметром оценки бактериолиза шигелл являлся индекс эффективности, который определяли как отношение числа колоний на контрольных чашках к числу колоний на опытных чашках. Считается, что сыворотка обладает выраженным бактериолитическим эффектом, если её индекс эффективности (ИЭ) больше или равен 2. Средний индекс эффективности по каждой из используемых колоний представлен на рис. 15. 1a ИЭср 4 Y 3,56 1b 3 2 X 1,1 Порог ИЭ 1,06 1 2a 3,88 1,5 0 5b 2,34 1,24 2,1 2b 2 5a 2,6 3a 4a Рис. 15. Сравнительная бактериолитическая активность сывороток мышей, иммунизированых образцом 3,4-ац д/ц мЛПС, в отношении к разным серотипам и серогруппам S. flexneri. Данные, представленные на рис. 15, показывают, что индекс эффективности сывороток мышей, иммунизированных образцом 3,4-ац д/ц мЛПС, ≤ 2 в отношении серогрупп 1a, 1b, 3a, 5а и серотипа X. Индекс эффективности ≥ 2 в отношении серогрупп 2а, 2b, 4а, 5b и серотипа Y. Таким образом, сыворотки мышей, иммунизированных образцом 3,4-ац д/ц мЛПС, демонстрируют выраженный бактериолитический эффект гомологичной серогруппы 2а. Наибольшая перекрёстная активность против гетерологичных шигелл Флекснера была выявлена по отношению к серогруппам 2b, 4а, 5b и серотипу Y. 84 10.10. Исследование кандидатной вакцины против дизентерии Флекснера 2а с участием здоровых добровольцев, по результатам I фазы клинических исследований В 2009 году Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития было разрешено проведение 1 фазы клинических исследований (КИ) кандидатной вакцины против дизентерии Флекснера 2а – «Флексвак» (разрешение № 04-16507/09). Активным действующим веществом кандидатной вакцины «Флексвак» был 3,4-ац д/ц мЛПС S. flexneri 2a. Всего прошли исследование 26 добровольцев, подошедшие под критерии включения и подписавшие согласие на участие в клиническом исследовании (рис. 16). Рис. 16. Профиль клинического исследования кандидатной вакциной «Флексвак». Добровольцы были разделены на группы независимо от возраста и пола, каждую из которых вакцинировали одной из трёх доз препарата «Флексвак» - 25 мкг, 50 мкг и 100 мкг. Вакцинация препаратом осуществлялась однократно подкожно. Венозную кровь для общих и биохимических анализов брали у добровольцев до вакцинации, через 6 часов после вакцинации и на 30 сутки после вакцинации. Кровь для 85 иммунологических исследований забирали до вакцинации, через 30 и через 60 дней после вакцинации (рис. 17). После проведения вакцинации добровольцы находились под наблюдением врача на протяжении 5 дней. В первые сутки наблюдения каждые 2 часа, трижды они проходили медицинское обследование. Рис. 17. Схема иммунизации добровольцев «Флексвак» и взятия образцов венозной крови. кандидатной вакциной Согласно протоколу, целью 1 фазы клинического исследования было изучение безопасности и иммуногенности кандидатной вакцины «Флексвак» на ограниченном контингенте добровольцев. 10.10.1. Оценка безопасности кандидатной вакцины «Флексвак» Для оценки безопасности препарата «Флексвак» были определены НЯ в том числе НЯ не связанные с применением вакцины «Флексвак» и СНЯ. НЯ может представлять собой любой неблагоприятный симптом (включая отклонение лабораторного показателя от нормы), жалобу или заболевание, время возникновения которого не исключает причинно-следственной связи с применением вакцины «Флексвак» вне зависимости от наличия или отсутствия такой связи. НЯ оценивали как общие и местные реакции организма. Из проявлений местной реакции учитывали болезненность, покраснение и припухлость в месте введения препаратов, возникновение инфильтратов, болезненность и увеличение регионарных лимфоузлов. В структуре общих реакций подлежали учету температура тела, повышение артериального давления, учащение пульса, недомогание, головная боль, тошнота, рвота, жидкий стул, его кратность и консистенция, боль в животе и другие симптомы, а также клинические и биохимические анализы крови. 86 Также подлежали учёту НЯ не связанные с применением вакцины «Флексвак». СНЯ - любое неблагоприятное медицинское событие, которое вне зависимости от дозы лекарственного продукта: - привело к смерти; - представляет собой угрозу для жизни; - требует госпитализации или её продления; - привело к стойкой или значительной нетрудоспособности или инвалидности. Местные и общие поствакцинальные реакции наблюдали у добровольцев от момента непосредственно после вакцинации препаратом «Флексвак» и в течение трёх дней, когда они находились в стационаре под присмотром врачей. По истечению трёх дней добровольцы были выписаны из стационара и вели дневники самонаблюдения, где записывали изменения в самочувствии. Из местных поствакцинальных реакций у 2 добровольцев, была зарегистрирована гиперемия лёгкой степени интенсивности в месте введения препарата, образовавшаяся в интервале 2 часов после инъекции и длившаяся 1020 мин. Болезненности, образования инфильтратов, увеличения регионарных лимфоузлов выявлено не было за весь период наблюдения ни у одного из добровольцев (табл. 18, рис. 18). В структуре общих реакций подлежали учету повышение температуры тела более 37,1 0С, повышение артериального давления более 140/100 мм.рт.ст., учащение пульса более 90 уд. в мин., тошнота, рвота, понос, головная боль, боль в животе, а также изменения в общем клиническом и биохимическом анализах крови. Общее самочувствие добровольцев после вакцинации - без изменений. Жалоб на недомогание, головную боль, тошноту, рвоту, понос, боль в животе не предъявляли. По данным инструментальных отрицательной динамики не выявлено (табл. 18, рис. 19). 87 методов исследования Табл. 18. Местные и общие реакции у добровольцев на введение кандидатной вакцины «Флексвак». Общие реакции Местные реакции Общее количество добровольцев 26 человек. Абсолютный Тип Проявление Признак показатель Продолжительность реакции реакции (человек) Болезненность 0 -Покраснение 2 10-20 мин. Инфильтраты 0 -Увеличение регионарных 0 -лимфатических узлов Повышение температуры 0 -0 более 37,1 С Повышение артериального 0 -НЯ давления более 140/100 мм.рт.ст. Ускорение частоты сердечных 0 -сокращений чаще 90 уд.мин. Тошнота 0 -Понос 0 -Рвота 0 -Головная боль 0 -Боль в животе 0 -СНЯ (- привело к смерти; - представляет собой угрозу для жизни; - требует госпитализации или её 0 -продления; - привело к стойкой или значительной нетрудоспособности или инвалидности). 88 Интенсивность -лёгкое --- -- -- -- ------ -- Относительный показатель (%) 100 80 60 40 20 0 0 Болезненность 8 0 Покраснение Инфильтраты 0 Увеличение регионарных лимфатических узлов Относительный показатель (%) Рис. 18. Местные реакции у добровольцев на введение кандидатной вакцины «Флексвак». 100 75 50 25 0 Рис. 19. Общие реакции у добровольцев на введение кандидатной вакцины «Флексвак». Кровь на общий и биохимический анализы забирали у добровольцев до вакцинации, через 6 часов и через 30 дней после вакцинации. Как видно по данным, представленным в табл. 20 и 21, отклонений от норм биохимических и общих показателей крови не зарегистрировано. 89 Табл. 19. Биохимическое исследование крови у вакцинированных кандидатной вакциной «Флексвак». Показатели До вакцинации Через 6 ч. 30 сутки добровольцев, Норма АЛТ (Ед/л) 21±12 29±17 17±14 5-40 АСТ (Ед/л) 24±14 31±16 19±12 5-40 108±22 119±20 113±17 70-130 4,6±3,1 4,7±4,1 3,9±2,8 3,38-8,32 325±128 340±142 290±118 240-500 4,6±3,5 5,1±4,2 4,1±3,8 3,5-6,1 Креатинин (Мкмоль/л) Мочевина (Моль/л) Мочевая кислота (Мкмоль/л) Глюкоза (моль/л) ср знач ± стан откл Табл. 20. Показатели общего анализа крови у вакцинированных кандидатной вакциной «Флексвак». Показатели До вакцинации Через 6 ч. 30 сутки Эритроциты добровольцев, нормы 5,0±0,6 4,9±0,4 4,7±0,7 4,5-5,0 159±24 154±28 142±33 130-160 0,96±0,06 0,96±0,06 0,9-1,1 (х1012/л) Гемоглобин (гр/л) Цветовой показатель 0,97±0,05 (09-1,1) Лейкоциты (х109/л) 5,6±1,2 5,8±1,4 9,0±3,2 4,5-9,5 Сегментоядерные 69±11 71±3 70±5 50-72 Лимфоциты (в%) 26±14 23±15 25±17 18-38 Моноциты (в%) 5±2 5±2 7±2 2-10 СОЭ (мм/час) 4±2 3±2 3±2 1-5 (в%) 90 Таким образом, результаты изучения общих и местных постпрививочных реакций свидетельствуют о хорошей переносимости, низкой реактогенности кандидатной вакцины «Флексвак» при использовании выбранных доз. Также следует отметить, что за весь период исследования у добровольцев не было зарегистрировано СНЯ. 10.10.2. Оценка иммуногенности кандидатной вакцины «Флексвак» для добровольцев Иммуногенность кандидатной вакцины оценивали по разнице концентраций О-специфических анти-S. flexneri 2а Ат в сыворотках крови добровольцев до вакцинации на 30 сутки и на 60 сутки после вакцинации кандидатной вакциной «Флексвак». Уровни антител до и после иммунизаций определяли методами: РПГА и нТИФА. Результаты исследования в РПГА сывороток крови привитых дизентерийной кандидатной вакциной с коммерческим поливалентным диагностикумом S. flexneri 1-5 представлены в табл. 21 и на рис. 20. Табл. 21. Сероконверсия S. flexneri – специфических агглютининов у добровольцев. Количество добровольцев с Количество добровольцев с сероконверсией ≥ 2 Препарат Доза 30 сутки 60 сутки 30 сутки после 60 сутки после первой первой после первой вакцинации вакцинации вакцинации 6/7 (86%) 5/5 (100%) 3/7 (43%) 5/5 (100%) 8/8 (100%) 4/4 (100%) 7/8 (88%) 4/4 (100%) 6/9 (67%) 4/4 (100%) 2/9 (22%) 3/4 (75%) (мкг) после первой вакцинации 25 Флексвак 50 100 сероконверсией ≥ 4 91 Данные представленные в табл. 22 показывают, что на 30 сутки после вакцинации препаратом «Флексвак» в дозах 25, 50 и 100 мкг сероконверсия в 2 и более раз была выявлена у 86%, 100% и 67% добровольцев соответственно; сероконверсия в 4 и более раз на 30 день составила 43%, 88% и 22% соответственно. На 60 сутки сероконверсия агглютининов в 2 и более раз среди добровольцев составила 100%, независимо от используемой дозы иммунизации препаратом «Флексвак». Сероконверсия в 4 и более раз при вакцинации дозами 25, 50 и 100 мкг была определена у 100%, 100% и 75% добровольцев соответственно. 120 100 кратность 80 * 49,5 60 50 мкг 100 мкг 40 20 25 мкг * 8,43 * 8,75 * 6,4 2,56 * 6,0 0 30 сутки 60 сутки * - статистически достоверное увеличение КТ (р≤0,05) Рис. 20. Кратность прироста агглютининов специфичных к S. flexneri 1-5 у добровольцев. Как показано на рис. 20, статистически достоверное (р≤0,05) увеличение среднего значения КТ Ат на 30 день были зарегистрированы в группах добровольцев, вакцинированных дозами 25 и 50 мкг, с кратностью подъёма уровней КТ в 8,43±11,63 и 8,75±10,36 соответственно. На 60 сутки после вакцинации достоверный прирост КТ выявлен во всех трёх группах добровольцев, вакцинированных дозами по 25, 50 и 100 мкг, кратность подъёма КТ агглютининов составила 6,4±5,37, 6,0±2,31 и 49,5±59,72 соответственно. 92 Основные классы специфических анти-S. flexneri Ат определяли с использованием нТИФА, используя анти-lgA, анти-lgG и анти-lgM, конъюгированные с ПХ. Для исследования Ат, специфичных к S. flexneri 2а, на дно полистиролового разрешающей планшета способностью сорбировали – 3-6-ац Аг д/ц с нЛПС наиболее S. высокой flexneri 2а (табл. 22, рис. 21). 60 сутки после вакцинации Доза (мкг) Флексвак Препарат 30 сутки после вакцинации Не ответивших Табл. 22. Сероконверсия S. flexneri 2а – специфических антител у добровольцев. IgA IgG IgM IgA IgG IgM IgA IgG IgM IgA IgG IgM 25 4/7 5/7 1/7 3/7 3/7 1/7 4/5 5/5 2/5 2/5 2/5 0/5 0\8 57% 71% 14% 43% 43% 14% 80% 100% 40% 40% 40% 7/8 6/8 4/8 3/8 2/8 4/4 2/4 2/4 3/4 1/4 0/8 88% 75% 50% 38% 75% 25% 100% 100% 50% 50% 75% 25% 5/9 7/9 2/9 4/9 0/9 0/4 56% 78% 22% 44% 22% 50 100 Титр ≥ 2 Титр ≥ 4 6/8 2/9 Титр ≥ 2 4/4 Титр ≥ 4 2/4 3/4 2/4 1/4 2/4 50% 75% 50% 25% 50% 2/10 На 30 сутки после иммунизации наиболее высокий показатель частоты определения сероконверсии в 2 и более раз IgA была зарегистрирована в группе добровольцев, вакцинированных 50 мкг препарата «Флексвак» и составил 88%. Сероконверсия в 4 и более раз IgA была зарегистрирована примерно у 40% добровольцев независимо от используемой дозы препарата. Количество сероконверсий в 2 и более раз IgG было высоким во всех группах иммунизированных и колебалось в пределах от 71% (25 мкг) до 78% (100 мкг). Максимальное количество сероконверсий в 4 и более раз IgG было зарегистрировано в группе добровольцев, иммунизированных 50 мкг и составило 75%. 93 Наиболее высокое количество сероконверсий в 2 и более раз IgМ было зарегистрировано у группы добровольцев, иммунизированной 50 мкг препарата и составило 50%. Количество сероконверсий в 4 и более раз IgМ также больше в группе добровольцев, иммунизированной 50 мкг препарата и составило 25%. На 60 сутки после иммунизации сероконверсия Ат исследуемых классов остаётся высокой с сохранением тенденций в количествах сероконверсий у добровольцев иммунизированных препаратом «Флексвак» дозами по 25, 50 и 100 мкг. 30,0 кратность 25,0 30 сутки 60 сутки 20,0 15,0 * 10,0 10,0 5,0 * 3,4 2,4 * * 3,6 2,6 А G * 7,5 * 4,3 * 5,1 1,41,4 2,52,0 2,42,0 * 4,8 2,2 М А G 1,21,5 М 0,0 М А G 25 мкг 50 мкг 100 мкг * - статистически достоверное увеличение КТ (р≤0,05) Рис. 21. Средние значения анти-S. flexneri 2а IgA, IgG, IgM. конечных титров О-специфических В соответствии с данными, представленными на рис. 21 у добровольцев, иммунизированных препаратом «Флексвак» в дозе 25 мкг средний прирост КТ IgA составил на 30 сутки 2,4±1,5, на 60 сутки 3,4±2,8, статистически достоверными являются изменения КТ на 60 сутки. Кратность подъёма КТ IgG, примерно, такая же: на 30 сутки 2,6±1,4; на 60 сутки 3,6±2,6, однако, изменения достоверны в обоих случаях. У добровольцев, иммунизированных препаратом «Флексвак» в дозе 50 мкг средний прирост КТ IgA составил на 30 сутки 5,1±5,2, на 60 сутки 10,0±14,7, на 94 обоих сроках забора крови данные статистически достоверны. Кратность подъёма IgG составила 4,2±2,7 на 30 сутки и 7,5±6,2 на 60 сутки, изменения достоверны на обоих сроках. У добровольцев, иммунизированных препаратом «Флексвак» в дозе 100 мкг средний прирост КТ IgA составил на 30 сутки 2,4±1,5, на 60 сутки 2,0±1,4. Кратность подъёма IgG составила 2,2±1,1 на 30 сутки и 4,7±3,8 на 60 сутки, изменения титра достоверны (р≤0,05) на 60 сутки. IgМ на выбранных сроках забора крови определяются в незначительном количестве независимо от дозы введения препарата. Таким образом, в группах добровольцев, иммунизированных кандидатной вакциной «Флексвак», зарегистрирована высокая частота выявления 4-кратных сероконверсий агглютининов, специфичных к S. flexneri 1-5. У большинства добровольцев, иммунизированных кандидатной вакциной «Флексвак», была зарегистрирована сероконверсия в 4 и более раз анти-S. flexneri 2а IgG и IgA, играющих основополагающую роль в формировании адаптивного противошигеллезного иммунного ответа. Отдельно следует отметить, что на 60 сутки после иммунизации у добровольцев сохраняются высокие уровни специфических Ат. 95 11. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Несмотря на высокую эпидемическую значимость дизентерии Флекснера и существенную прогрессирующую резистентность к антибиотикам, лицензированного вакцинного препарата против S. flexneri пока не разработано. Как показывают эпидемиологические наблюдения за больными дизентерией людьми, после перенесённого заболевания вырабатывается непродолжительный типоспецифический иммунитет. Переболевшие дизентерией однажды при повторном заражении гомологичным штаммами шигелл болеют реже [20, 30, 41]. На основании этих данных были сделаны первые предположения о природе противодизентерийного иммунитета. Также было выяснено, что для формирования напряжённого иммунитета необходимо многократное повторное заражение гомологичным штаммом [34]. Первые попытки разработать дизентерийную вакцину были предприняты еще в 1898 г., когда Шига и Крузе ввели себе под кожу убитую нагреванием дизентерийную культуру. Однако этот опыт спровоцировал у исследователей сильную общую и местную воспалительную реакцию, и они были вынуждены сразу же отказаться от дальнейшего использования препарата. Вскоре Шига разработал новую вакцину для специфической профилактики дизентерии, состоящую из половины петли, убитых нагреванием, дизентерийных бактерий в смеси с 0,5 мл противодизентерийной сыворотки [158]. Воспалительная реакция на введение такой вакцины была менее острой. Конструирование современных шигеллёзных вакцин стало возможным благодаря новым методам тонкого химического изучения антигенных структур возбудителя, иммунитета молекулярного при патогенеза естественном течении и характера инфекции. иммунопатогенеза шигеллёзов представлены на рис. 22 и 23. 96 формирующегося Основные этапы Рис. 22. Иммунопатогенез шигеллёзной инфекции. Развитие воспалительной реакции кинечника в месте первичного проникновения шигелл. Рис. 23. Иммунопатогенез шигеллёзной инфекции. Разлитое воспаление кишечника. 97 Как показывают исследования больных дизентерией людей и опыты на лабораторных животных, основным элементом защиты организма от S. flexneri является гуморальный иммунный ответ [163]. Несмотря на то, что установлено рекрутирование и активация Т-клеток в месте инвазии бактерий, активное участие этих клеток в протективном иммунном ответе не подтверждено [104, 105, 144]. В опытах по внутрилёгочному заражению инбредных мышей линии C57BL/6, Тклетки, в отличие от В-клеток, не обеспечивали защиту от шигеллой реинфекции [57, 73]. Исключением из этого правила являются Th17-клетки, которые при первичном контакте с шигеллой образуют Th17-позитивные клетки памяти, способные при повторном контакте секретировать ИЛ-17 и ИЛ-22, способствуя элиминации бактерий у мышей через активацию нейтрофилов [167]. В-клеточный протективный иммунный ответ серотип-специфический, направленный на О-ПС часть ЛПС клеточной стенки [28, 30-32, 91, 148]. В настоящее время с помощью метода С13 ЯМР спектроскопиии определено 47 вариантов структур ЛПС S. flexneri, которые отличаются по строению цепи ПС [46]. Однако, используемая серологическая классификация, основанная на О-Аг, разделяет бактерий вида Shigella flexneri на 13 серогрупп: 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4a, 4b, 5a, 5b, 6, X, Y [89], отличающихся между собой строением и составом типовых, групповых эпитопов (рис. 24). Рис. 24. Типовые и групповые антигены S. flexneri [89]. 98 ЛПС, полученный из эпидемически наиболее значимого серотипа шигелл Флекснера - S. flexneri 2a [37], состоит из трёх компонентов: О-ПС (до 11-17 повторяющихся тетрасахаридных блоков), кора (наружнего, внутреннего), липида А (содержит 5,6 остатков жирных кислот). Гидрофильный О-ПС несет две серологически определяемые антигенные детерминанты: типовую - II, дисахарид состава α–Glc-(14)-α-Rha-, и групповую - 3,4, структура, которой до сих по не идентифицирована [156]. В данной работе были использованы как нативные ЛПС S. flexneri 2a так и модифицированные, которые отличались между собой по строению липида А и по длине цепи О-ПС (табл. 10). Получение мЛПС сопряжено с использованием методов химической обработки [117]. Поэтому молекулярные характеристики всех полученных образцов ЛПС верифицировали методами электрофорез и массспектр (рис. 3 и 4). Первоочередной задачей исследований стало определение влияния химических воздействий, необходимых для получения мЛПС, на сохранность эпитопов молекулы ЛПС S. flexneri 2a в мЛПС. С этой целью было проведено исследование специфической активности опытных образцов методом нТИФА с использованием сывороток, содержащих моновалентные гомологичные антитела к группоспецифическому - 3,4 и типоспецифическому - II антигену ЛПС S.flexneri 2а. Также, в панель сывороток были включены: моновалентные гетерологичные сыворотки (группоспецифическая 7,8 специфичная к ЛПС S. flexneri 2b, 3a, 5b, X и типоспецифическая I сыворотка, специфичная к ЛПС S. flexneri 1a и 1b) и, часто используемая в клинической практике, поливалентная S. flexneri 1-5 диагностическая сыворотка. Результаты исследования специфической активности, представленные на рис. 5, позволяют сделать вывод, что даже самая жёсткая химическая обработка нативных ЛПС S. flexneri 2а при которой был получен образец д/ц ПС, не влияло на серологическую активность образцов. Все опытные образцы, подвергшиеся 99 химической модификации, связывают Ат гомологичных сывороток 3,4; II и 1-5 и не реагируют с гетерологичными, контрольными сыворотками 7,8 и I. Следует отметить, что в нативном ЛПС S. flexneri 2а в положении 3 и 4 примерно в 60% и 25% случаев, соответственно, находится О-ацетильная группа [54, 56]. В модифицированных препаратах ЛПС О-ацетильная группа была удалена. Вместе с тем, отсутствие О-ацетата в положении 3,4 не приводло к снижению способности ЛПС S. flexneri 2а связывать гомологичные АТ из диагностических сывороток II, 3,4 и 1-5 [56]. В работе Theillet F. X. и соавторов 2011 года [67] исследуемые ЛПС S. flexneri 2а содержали нестехиометрическую О-ацетильную группу в положении 3 и 4 в 20% и 10% случаев соответственно. Кроме того, в 10% случаев в используемых ими образцах О-ацетильная группа располагалась в положении 6. Авторами было установлено, что содержащие О-ацетильные группы эпитопы не являются главной мишенью для Ат против S. flexneri 2а, а следовательно и главными факторами защиты от бактериальной инвазии. Аналогичные наблюдения были описаны в работах других авторов [95, 139]. Установление закономерностей между строением и составом ЛПС, входящих в опытные образцы и степенью эндотоксичности in vivo, оцененной по пирогенной реакции у кроликов. Постановка методики и отбор апирогенных образцов осуществлялись в соответствии с рекомендациями, приведёнными в Государственной фармапеи РФ XII, где вещества признают апирогенными, если суммарная ∆t на 3 кроликах не превышает 1,2 ºС и ни у одного из кроликов не было повышения температуры больше 0,5 ºС [5]. ЛПС является одним из главных факторов вирулентности бактерий S. flexneri 2a. В свободном состоянии ЛПС опосредует быстрое развитие воспаления благодаря липиду А. Секреция провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10 ФНО-α, запускается при взаимодействии липида А с TLR-4 клеток макроорганизма [36, 96]. 100 По результатам исследования пирогенной реакции, приведённым в табл. 11, опытные образцы были разделены на 3 группы: пирогенные, где ∑Δ t ≥ 3 ºС; низкопирогенные, где 1,2 ºС < ∑Δ t < 3 ºС и апирогенные, где ∑Δ t ≤ 1,2 ºС. Анализ структур ЛПС в образцах, вошедших в каждую из групп, позволил выявить структурные характеристики, определяющие образование пирогенной реакции разной степени интенсивности. Главным отличием пирогенных от низкопирогенных образцов является наличие в составе пирогенных образцов пента- и гексаацильных производных ЛПС S. flexneri 2a. Длина цепи О-ПС, в данном случае, не влияет на степень пирогенной реакции, т.к. пирогенными являются и длинноцепной (3-6-ац д/ц нЛПС) и короткоцепной (3-6-ац к/ц нЛПС) образцы с одинаковыми липидными составляющими. Апирогенные образцы могут содержать ди-, три- и тетраацильные производные ЛПС S. flexneri 2a так же как и низкопирогенные. Однако для апирогенных образцов тетраацильные производные допустимы в минимальных количествах и только в составе длинноцепных фракций ЛПС. Так, образцы 3,4-ац д/ц мЛПС и 3,4-ац к/ц мЛПС содержат одинаковые пропорции три- и тетраацильных ЛПС S. flexneri 2a (рис. 3), но длинноцепной образец апирогенен, а короткоцепной уже нет (∑Δ t= 1,4ºС). Влияние степени ацилирования липида А на токсические свойства ЛПС также было отмечено в некоторых других работах. В работах Rallabhandi P. и соавт. 2008 г. и Rossi O. и соавт. 2014 г., в опытах in vitro было показано что пентаацильные ЛПС шигелл стимулируют секрецию провоспалительных медиаторов мононуклеарами периферической крови, полученной от добровольцев значительно ниже, чем гексаацильные [59, 150]. ЛПС бактерий Francisella tularensis содержат тетраацильный липид А [162] и не обладает эндотоксической активностью. Превентивное интраназальное введение синтетического агониста TLR-4 увеличивает выживание мышей в модели экспериментальной пневмонии, вызванной Francisella tularensis [120]. 101 Бактерии Helicobacter pylori также продуцирует тетраацильный ЛПС, активность воздействия которого на TLR-4 существенно ниже, чем ЛПС Escherichia coli [125]. Причём, на более ранних этапах синтеза, ЛПС H. pylori гексаацильный. Позже, под воздействием ферментов бактерии, в том числе деацилазы, ЛПС H. pylori модифицируется на финальных стадиях до тетраацильного [159]. ЛПС Porphyromonas gingivalis является главным фактором вирулентности этого вида бактерий. Липид А ЛПС P. gingivalis имеют разнообразную структуру. Они могут быть не фосфорилированы, моно- и дифосфорилированы и содержать от четырёх до пяти жирнокислотных остатков [84, 143]. Таким образом, ЛПС P. gingivalis являются слабыми агонистами и сильными антагонистами TLR-4 [129]. Как уже неоднократно отмечалось, макроорганизму для формирования защиты против S. flexneri 2a необходимо наличие специфических Ат, направленных против наиболее значимого фактора вирулентности бактерии – ЛПС. Поэтому для сравнительного исследования адаптивного иммунного ответа, индуцированного нашими опытными образцами, отличающимися строением и составом ЛПС, была использована методика иммунизации гибридных мышей (CBAxC57Bl/6)F1, с последующим получением сывороток для определения титров специфических Ат. На начальном этапе исследования гуморальной активности образцов был определён детектирующий Аг для выявления специфических Ат, используемый в нТИФА. Образец 3-6-ац д/ц нЛПС обладал высокой степенью адсорбции в лунках планшетов и при его использовании в качестве детектирующего Аг были зафиксированы наименее низкие КТ фоновых Ат в сыворотках мышей контрольных групп, а также наибольшее количество статистически достоверных изменений КТ Ат в сыворотках мышей опытных групп, иммунизированных образцами 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС, 3-6-ац д/ц нЛПС, 3-6-ац к/ц нЛПС (табл. 12, 13, 14). 102 Когда ЛПС связан с клеточной стенкой бактерии, его вирулентность обусловлена ПС доменом. Так бактерии с R-формами ЛПС (rfe, galU) являются авирулентными, так как не способны к униполярному позиционированию белка IcsА, выполнение этого условия необходимо для формирования актинового мостика и протрузии бактерии в соседнюю клетку [62]. В работах Morona R. 2003 были описаны штаммы S. flexneri 2a, продуцирующие ЛПС определённой длины. Штаммы с делециями генов wzzpHS2 и wzzSF продуцируют только S-ЛПС (11-17 тетрасахаридных блоков) или только VL-ЛПС (>90 тетрасахаридных блоков), соответственно. Штаммы S. flexneri 2a с аллогенной транслокацией генов WzzO139 от Vibrio cholerae O139 и WzzST от Salmonella enterica серовар Typhimurium продуцируют только VS-ЛПС (2-7 тетрасахаридных блока) или только L-ЛПС (19-35 тетрасахаридных блоков), соответственно. При этом было показано, что наиболеее вирулентны штаммы продуцирующие ЛПС S. flexneri 2a с длиной ПС цепи не менее 2 и не более 18 тетрасахаридных блоков, т.е. штаммы продуцирующие VS-ЛПС или S-ЛПС. У штаммов продуцирующих только L-ЛПС и VL-ЛПС было обнаружено меньшее количество белка IcsА и дефекты в формировании актинового мостика. Используемый ими нативный штамм S. flexneri 2a продуцировал S-ЛПС и VL-ЛПС обладал выраженной вирулентностью [132]. Исследование гуморального ответа мышей на образцы, содержащие нативные ЛПС S. flexneri 2a с разной длиной О-ПС цепи и не отличающиеся по липид А домену, показало, что после иммунизации образцами, содержащими в основном д/ц фракции ЛПС (3-6-ац д/ц нЛПС), КТ IgG и IgM достоверно выше, чем после иммунизации образцами, содержащими в основном к/ц фракции ЛПС, такими как 3-6-ац к/ц нЛПС и 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС (рис. 7). Подобная тенденция была установлена и после иммунизации образцами, содержащими мЛПС (рис. 8). Образцы, содержащие 3,4-ац д/ц ЛПС независимо от способа получения (мЛПС или нЛПС) одинаково хорошо индуцируют секрецию IgG и IgM с КТ достоверно выше, чем после иммунизации образцами, содержащими 3,4-ац к/ц мЛПС. 103 Вероятно, увеличение гуморальной активности обусловлено большим количеством эпитопов в ЛПС с длинной цепью О-ПС. В некоторых работах других авторов также было показано, что соединения, содержащие большее число олигосахаридных блоков в составе цепи О-ПС, индуцируют больше специфических Ат у мышей [26, 71]. Гидрофобный липид А является основным структурным компонентом, ответственным за токсичность и пирогенность ЛПС [81, 164]. Липид A S. flexneri построен из двух остатков глюкозамина, соединенных β(1-6)-гликозидной связью. С1 восстанавливающего остатка глюкозамина и С4' невосстанавливающего фосфорилированы, а гидроксильные и аминогруппы обоих остатков могут нести до шести остатков высших жирных кислот с углеводородными цепями разной длины [156]. Схема строения ЛПС S. flexneri 2a представлена на рис. 2. Нами проведены исследования влияния изменений структуры ЛПС на гуморальную активность образцов, отличающихся преобладанием фракций ЛПС S. flexneri 2а содержащих разный липид А и не отличающиеся по длине О-ПС цепи. Нами показано, что гуморальный ответ у мышей снижается при доминировании в составе опытного образца 2-ацильных производных ЛПС. Между тем, образцы, содержащие 3-, 4-, 5- и 6-ацильные производные ЛПС продемонстрировали более высокие КТ IgG и IgM у мышей, независимо от преобладания какой-либо из этих фракций (рис. 9). Таким образом, учитывая данные пирогенности и результаты исследования гуморальной активности можно сделать вывод, что апирогенный и высокоактивный образец должен содержать длинноцепные 3-ацильные молекулы ЛПС, возможно с небольшим содержанием 4-ацильных, производных ЛПС S. flexneri 2а. Охарактеризовать гуморальный иммунный ответ у мышей на образец 3,4-ац д/ц мЛПС позволило развёрнутое исследование Ат в сыворотках и на слизистых. 104 Сывороточные Ат, специфичные к ЛПС S. flexneri 2а, определяли у мышей как после первичной, так и после вторичной иммунизации образцом 3,4-ац д/ц мЛПС, с использованием методов РПГА и нТИФА. Постановка РПГА происходила с использованием широко распространённого в клинической диагностике диагностикума поливалентного S. flexneri 1-5 (рис. 10). Результаты, полученные в сыворотках мышей, иммунизированных образцом 3,4-ац д/ц мЛПС, сравнивали с КТ агглютининов в сыворотках мышей, иммунизированных образцом 3-6-ац д/ц нЛПС. После первичной иммунизации КТ агглютининов не превысил показатели у интактных мышей контрольной группы. Повторная иммунизация привела к резкому подъёму КТ у мышей в опытных группах, причём достоверных отличий в показателях КТ между группами, иммунизированными 3,4-ац д/ц мЛПС и 3-6-ац д/ц нЛПС не выявлено. Исследование классов Ат в сыворотках мышей после однократной иммунизации образцом 3,4-ац д/ц мЛПС показало лишь незначительное увеличение титра IgG. Уровни IgA и IgМ не отличались от показателей в контрольной группе интактных мышей (рис. 11). Однако после повторной иммунизации КТ IgG и IgM в опытных группах мышей значительно возрасли и составили 4222,4±1752,7 и 6400,0±0 соответственно против КТ Ат аналогичных классов в контрольной группе 162,5±121,2 и 303,1±103,3 соответственно. Субклассы IgG определяли с использованием двух моделей иммунного ответа, отличающихся по месту иммунизации мышей - внутрибрюшинно и подкожно. Полученные результаты показывают, что независимо от места введения опытного образца- 3,4-ац д/ц мЛПС преобладает IgG3 субкласс (рис. 12). Как правило, именно увеличение концентрации IgG3 субкласса Ат связывают с формированием эффективной защиты против ПС-содержащих антигенов у мышей [131]. Достоверного прироста IgA в ответ на иммунизацию мышей (СВАХС57Вl/6)F1 образцом 3,4-ац д/ц мЛПС в сыворотках не зарегистрировано, 105 что коррелирует с ранее опубликованными данными о низкой продукции IgA в ответ на экспериментальное инфицирование мышей бактерией S. flexneri 2a [73]. Заражение дизентерией Флекснера происходит по фекально – оральному механизму [14], поэтому в первую очередь контактируют с бактерией Ат на слизистой кишечника. При этом у переболевших людей были выявлены не только секреторный IgА, но и сывороточные IgА, IgG и IgМ, направленные, преимущественно против О-ПС. Минорная фракция АТ, указанных классов, специфична к эффекторным протеинам шигелл [85, 105, 137]. Анти-О-ПС секреторные IgА были обнаружены также в материнском молоке и способны обеспечить защиту новорожденных от дизентерии [83]. Кроме того, у переболевших шигеллёзом людей были выявлены анти-О-АГ IgG, IgА антителосекретирующие клетки [27, 38, 138]. Для определения специфических к О-Аг S. flexneri 2a Ат на слизистых мышей (СВАХС57Вl/6)F1, иммунизированных образцом 3,4-ац д/ц мЛПС была использована модель адаптивного иммунного ответа с интраназальной иммунизацией и последующим определением Ат в бронхолёгочном лаваже. С помощью этой модели было доказано, что у мышей после иммунизации образцом 3,4-ац д/ц мЛПС, повышается титр специфических IgA и IgG на слизистых (рис. 13). Доказательство наличия анти-S. flexneri 2a Ат на слизистых является важным фактором, позволяющим прогнозировать эффективность защиты у иммунизированных образцом 3,4-ац д/ц мЛПС животных от развития инфекции. Исследование протективной активности субстанций, способных предотвратить развитие дизентерии, имеет широко известные трудности, обусловленные тем, что животные не болеют дизентерией, исключением являются несколько видов обезьян [22]. Наибольшее признание в экспериментальных исследованиях шигеллезов получила модель дизентерийного кератоконъюнктивита на морских свинках - Sereny тест. Однако Sereny тест чаще всего применяется для контроля авирулентности разрабатываемых вакцинных штаммов, которые должны быть неинфекционными при инокуляции [15]. Как 106 тест активной защиты он был адаптирован для оценки иммуногенности пероральных живых вакцин. При этом вакцинный штамм вводился per os [98]. Из-за частых неудач при такой схеме иммунизации M. Levine с соавт., принимая во внимание концепцию корпатментализации MALT, сблизили сайты индуктивной и продуктивной фазы иммунного ответа, предложив модификацию теста с интраназальной вакцинацией живыми вакцинам [51, 136]. В предложенном нами варианте постановки теста сайты запуска иммунного ответа и продукции протективных антител разнесены кардинальным образом. Иммунизация морских свинок происходит в область спины, подкожно и таким образом принципиально отличается от общепринятой мукозальной [1]. Исследование протективной активности апирогенного образца 3,4-ац д/ц мЛПС на модели кератоконъюнктивального теста, продемонстрировало его высокую эффективность (табл. 16). При двукратной иммунизации дозой 50 мкг образца 3,4-ац д/ц мЛПС уровень защиты глаз морских свинок при заражении дозой ИД100 вирулентного штамма S. flexneri 2a составил 60%. В то время как протективная эффективность пирогенного образца 3-6-ац д/ц нЛПС, введённого в той же дозе, составила 70%. Таким образом, существенных отличий между показателями протективной эффективности исследуемых образцов не выявлено. Также, у обоих образцов можно наблюдать, увеличение протективной эффективности с увеличением дозы иммунизации с 25 мкг на 50 мкг. Высокий уровень структурного сродства ЛПС различных серотипов S. flexneri, имеющих общую базовую Y-цепь, создаёт определённые проблемы в серологической диагностике шигеллёзов, так как Ат, образующиеся при инфицировании одним серотипом, могут перекрёстно реагировать с другими серотипами шигелл. С другой стороны, наличие перекрёстных О-специфических Ат предопределяет создание вакцин против нескольких серотипов S. flexneri c использованием меньшего количества серотипов [69]. Исследование перекрёстной активности антител у мышей, иммунизированных образцом 3,4-ац д/ц мЛПС, проводилось с помощью метода, 107 оценивающего бактериолитические свойства сывороток по отношению к гомо- и гетерологичным серогруппам и серотипам шигелл. Всего в исследовании было использовано 10 серогрупп и серотипов шигелл, среди которых гомологичной была культура клеток серогруппы S. flexneri 2а, а гетерологичными S. flexneri 1a, 1b, 2b, 3a, 4a, 5a, 5b, X, Y. Согласно общепринятой классификации шигелл, основанной на разном наборе типовых и групповых О-Аг у бактерий, ЛПС S. flexneri 2а имеет общий типовой Аг - II с серогруппой 2b и общий групповой Аг - 3,4 с серогруппами 1а, 3b, 4a, 5a, Y (табл. 1). Однако, результаты исследования показали, что сыворотки мышей, иммунизированных образцом 3,4-ац д/ц мЛПС, демонстрируют выраженный бактериолитический эффект гомологичной серогруппы S. flexneri 2а, и при этом перекрёстно эффективны против гетерологичных серогрупп: 2b, 4а, 5b и серотипа Y. То есть, бактериолитический эффект опытных сывороток не выражен по отношению к серогруппам 1а и 5а, имеющих с S. flexneri 2а общий групповой Аг – 3,4. Более того, такие сыворотки тормозят рост культуры серогруппы S. flexneri 5b, не имеющей общих Аг детерминант с S. flexneri 2а (рис. 15). Результаты подобные этим можно увидеть и в работах других авторов, описывающих перекрёстную активность Ат, специфичных к S. flexneri 2а. В работе Van De Verg L. L. и соавторы была исследована перекрёстная активность анти-ЛПС S. flexneri 2а Ат в сыворотках обезьян и морских свинок - животных, которые используются в модели патогенеза шигеллёзной инфекции [69]. Макаки-резус были заражены перорально 1,1х109 КОЕ S. flexneri 2а. Перекрёстная активность IgG наблюдалась на все серотипы S. flexneri, а также на ЛПС P. shigelloides (серологически-идентичен О-Аг S. sonnei) у 5/9 обезьян. Все морские свинки были серопозитивны по обоим классам Ат - IgA и IgG к ЛПС S. flexneri 2а. У 14% выявлены перекрёстно реагирующие IgA к ЛПС 108 серотипа 2b. Более 50% свинок положительны к 4/3,4 ЛПС, с преобладанием IgA, кроме ЛПС S. flexneri 1а. Таким образом, исследования, проведённые на лабораторных животных, доказали возможность использования апирогенных мЛПС S. flexneri 2а в качестве иммуногенов, чьи показатели, оценивающие степень гуморального ответа не ниже, чем у нативных ЛПС S. flexneri 2а. Так же, Van De Verg L. L. и соавторами были проведены исследования перекрёстной активности IgG и IgA ответа в сыворотках добровольцев, заражённых «диким» штаммом S. flexneri 2а [69]. IgА перекрёстно-реагирующие с ЛПС других серотипов S. flexneri, содержащих II типовой (S. flexneri 2b) или 4/3,4 групповой Аг (S. flexneri 1a, 3b, 4a, 5a, Y), были зафиксированы у половины добровольцев, ответивших на ЛПС S. flexneri 2а. Уровень IgG значительно ниже. Распределение уровней Ат на II типовой и 4/3,4 групповой Аг ЛПС происходила не равномерно. Примерно у 80% добровольцев был зафиксирован двух и более кратный прирост Ат к ЛПС S. flexneri 1а; ≈ у 70% добровольцев - к ЛПС S. flexneri 5а; ≈ у 50% добровольцев - к ЛПС S. flexneri Y. Ат к ЛПС S. flexneri 2b, 3b и 4a были выявлены лишь у 10% добровольцев на каждый серотип. Авторы это объясняют разной доступностью Аг эпитопов у серотипов, их содержащих. У некоторых добровольцев, заражённых штаммом S. flexneri 2а, были выявлены Ат против гетерологичных вариантов ЛПС, не содержащих II типовой или 4/3,4 групповой Аг, или против ЛПС всех серотипов S. flexneri. У большинства (около 40% добровольцев) это Ат к ЛПС S. flexneri 1b. Авторы считают, что такое возможно при наличие у всех или у некоторых серотипов S. flexneri общих О-антигенных эпитопов [69]. На следующем этапе изучения мЛПС S. flexneri 2а было проведено клиническое исследование апирогенного и иммуногенного, по резыльтатам исследований на лабораторных животных, образца 3,4-ац д/ц мЛПС уже в качестве кандидатной вакцины с участием здоровых добровольцев. Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития было 109 разрешено проведение I фазы клинических исследований (КИ) кандидатной вакцины против дизентерии Флекснера 2а – «Флексвак» (разрешене № 04-16507/09 от 2009 года). Исследование проводилось как открытое на базе Федерального государственного учреждения здравоохранения «Центральная медико-санитарная часть №8 Федерального медико-биологического агенства», Калужская область, г. Обнинск. Главным исследователем была Хржановская И.Н. Целью проведения клинических исследований было изучение безопасности и иммуногенности кандидатной вакцины «Флексвак» на ограниченном контингенте добровольцев. В исследовании были поставлены следующие задачи: Выявить местные и общие реакции на введение препарата «Флексвак», Определение изменений в общих и биохимических показателей крови на введение препарата «Флексвак», Оценить продукцию специфического гуморального иммунного ответа на введение препарата «Флексвак». В первой фазе клинического исследования кандидатной вакцинны «Флексвак», где активным веществом является 3,4-ац д/ц мЛПС, приняло участие 26 добровольцев, отобранных на основании критериев включения и критериев невключения в исследование. Добровольцы были разбиты на группы, каждую из которых иммунизировали препаратом «Флексвак» однократно в верхне-заднюю треть плеча одной из трёх исследуемых доз 25 мкг, 50 мкг и 100 мкг (рис. 16). После проведения вакцинации добровольцы находились под наблюдением врача на протяжении 5 дней. В первые сутки наблюдения каждые 2 часа, трижды они проходили медицинское обследование. Оценивали выявленные местные, общие реакции организма на введение кандидатной вакцины, а также изменения в общем и биохимическом клинических анализах крови. Общий и биохимический анализы крови брали у добровольцев до вакцинации, через 6 часов и через 30 дней после вакцинации (рис. 17). 110 Из местных постпрививочных реакций на вакцинацию у трёх добровольцев, привитых кандидатной вакциной, была зарегистрирована незначительная гиперемия в месте введения препарата в течение 2 часов после инъекции. Общих реакций организма на введение препарата не зарегистрировано. Не зарегистрировано отклонений от нормальных показателей и в общем и биохимическом клинических анализах крови добровольцев. То есть, результаты изучения общих и местных постпрививочных реакций свидетельствуют о хорошей переносимости, низкой реактогенности кандидатной вакцины «Флексвак» при использовании выбранных доз препарата (табл. 18 - 20). Оценка иммуногенности кандидатной вакцины осуществлялась по результатам определения количества добровольцев с ≥ 2 и ≥ 4 кратной сероконверсией, по конечному титру Ат и по кратности подъёма Ат на 30 и на 60 день относительно до вакцинальных показателей. Результаты исследований парных сывороток добровольцев были получены с использованием методов РПГА и нТИФА. В работе с сыворотками добровольцев, так же как и с сыворотками лабораторных животных, используемых для доклинического исследования, в методике постановки РПГА применяли поливалентной диагностикум S. flexneri 1-5, широко распространённый в клинической диагностике дизентерии. Определение в сыворотках добровольцев уровней противошигеллёзных агглютининов количество показало, добровольцев что с после иммунизации сероконверсией резко кандидатной возросло. В вакциной группах добровольцев, иммунизированных 25 мкг и 50 мкг препарата, количество ≥ 4 кратных сероконверсий на 60 сутки после введения составило 100% (табл. 21). Средняя кратность подъёма КТ агглютининов в этих группах равна 6,4±5,37 и 6,0±2,31 соответственно (рис. 20). При этом в каждой группе было зарегистрировано статистически достоверное увеличение титра специфических агглютининов. 111 Сывороточные Ат, специфичные к ЛПС S. flexneri 2а, у добровольцев после иммунизации кандидатной вакциной представлены всеми основными классами: IgA, IgG и IgM, обеспечивающими противомикробную защиту (рис. 21). Сероконверсия IgA, IgG и IgM Ат ≥ 4 раз зафиксирована у 50%, 75% и 25% добровольцев соответственно на 60 сутки после иммунизации дозой 50 мкг кандидатной вакцины (табл. 22). Среди развивающихся на данный момент направлений по разработке профилактических противошигеллёзных препаратов перспективными являются создание цельноклеточных живых, химерных и субмикробных химических вакцин, некоторые из которых доведены до клинических исследований. Живые инвазивные, неинвазивные и химерные вакцинные штаммы S. flexneri 2а при испытаниях с участием добровольцев оказались весьма реактогенными. При понижении вакцинирующей дозы до безопасной, для достижения достаточного для защиты уровня антител необходима частая реиммунизация [27, 38, 39, 47, 51, 70, 136]. Антигенные полисахарид- шигеллёзные и/или кандидатные белок-содержащих вакцинны биомолекул, построены из извлекаемых из бактериальной клетки, полученных с помощью химических подходов [30, 91, 148]. Основными антигенами, определяющими иммуногенные характеристики S. flexneri, являются бактериальный эндотоксин - ЛПС и эффекторные Ipa-протеины [28]. В последние годы с участием добровольцев были исследованы конъюгированные с белками О-ПС (S. flexneri 2a-rEPAsucc, S. flexneri 2a-rEPA, S. flexneri 2a-CRM9succ) и комплексная ЛПС-протеосомальная (Proteosome S. flexneri 2a) шигеллёзные кандидатные вакцины. Эти препараты способны индуцировать у добровольцев специфический гуморальный иммунный ответ к серогруппе S. flexneri 2a. Однако, оказалось что при иммунизации ЛПС протеосомальным препаратом частота и интенсивность нежелательных эффектов многократно выше по сравнению с конъюгированными О-ПС кандидатной 112 вакцинной [53, 93, 140]. Таким образом, создание иммуногенов, индуцирующих иммунный ответ к главному антигену S. flexneri - О-ПС рассматривается сегодня как один из самых перспективных подходов в разработке вакцин против S. flexneri [9]. Наши исследования подходов к использованию ЛПС S. flexneri 2а в качестве препарата, способного обеспечить защиту от инфицирования бактерией, позволили сформулировать основные требования к составу и структуре активного вещества. Исследования на лабораторных животных показало оптимальное строение и состав мЛПС S. flexneri 2а в опытном образце, введение которого в организм не приводит к развитию системного воспаления, но при этом индуцирует гуморальный иммунный ответ с показателями КТ не ниже, чем после иммунизации нативным ЛПС вирулентного штамма S. flexneri 2а. Образец 3,4-ац д/ц мЛПС содержит ЛПС S. flexneri 2а, полученные химическим путём и состоящие преимущественно из длинной О-ПС цепи и 3 остатков высших жирных кислот в липиде А. Результаты 1 фазы клинических исследований кандидатной вакцинны «Флексвак», содержащего в качестве активного вещества 3,4-ац д/ц мЛПС, показали хорошую переносимость препарата среди добровольцев. Серьёзные нежелательные явления отсутствуют, общие воспалительные реакции организма человека на введение препарата отсутствуют, местные – единичны. В сыворотках добровольцев, иммунизированных кандидатной вакциной «Флексвак» были зафиксированы специфичные Ат, которые являются основной защитой организма от развития дизентерии. Таким образом, можно предположить, что препараты на основе мЛПС S. flexneri 2а способны обеспечить защиту у людей от развития дизентерии Флекснера 2а. Для более подробного исследования требуется продолжение проведения клинических исследований. 113 12. ВЫВОДЫ 1. Разработан принципиально новый подход к иммунопрофилактике дизентерии Флекснера, состоящий в одновременной активации мукозального и системного иммунного ответа с помощью парентеральной вакцинации. 2. Разработан оригинальный вакцинный иммуноген модифицированный ЛПС S. flexneri 2a, безопасный для парентерального введения человеку. 3. Модифицированный ЛПС S. flexneri 2a, содержащий преимущественно три остатка высших жирных кислот в липиде А и длинноцепной О-полисахарид, является одновременно апирогенным и иммуногенным. 4. На модели кератоконъюнктивального заражения морских свинок показано, что парентеральная иммунизация апирогенным модифицированным ЛПС обеспечивает высокий уровень мукозальной защиты от заражения вирулентным штаммом S. flexneri 2a, сравнимый по протективному эффекту с введением пирогенного нативного ЛПС. 5. Иммунизация модифицированным ЛПС приводит к увеличению титров специфических IgG, IgМ в сыворотках и IgA, IgG на слизистой поверхности лёгких у мышей. Доминирующим субклассом IgG в сыворотках является IgG3. 6. Установлен бактериолитический эффект сывороточных антител мышей, иммунизированных модифицированным ЛПС S. flexneri 2а против шигелл Флекснера гомологичной серогруппы 2а и их существенная перекрёстная активность против гетерологичных серогрупп − 2b, 4а и 5b и серотипа Y. 7. В клинических исследованиях I фазы продемонстрирована безопасность и хорошая переносимость модифицированного ЛПС кандидатной S. flexneri вакцины 2а в «Флексвак» сочетании с на основе выраженной иммуногенностью при подкожном введении добровольцам в дозах 25, 50 и 100 мкг. Отчёт принят Министерством здравоохранения Российской Федерации. Обоснованным является включение препарата «Флексвак» во II фазу клинических исследований. 114 13. Список литературы 1. Апарин П. Г. Полисахаридные вакцины против бактериальных кишечных инфекций // Монография. ‒ 2004. 2. Ахметова Л. И. Чувствительность к антимикробным препаратам штаммов шигелл и сальмонелл, выделенных в Екатеринбурге // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. ‒ 2000. ‒ T. 3. 3. Бондаренко В. М., Рябиченко, Е.В., Веткова, Л.Г. Молекулярные аспекты повреждающего действия бактериальных липополисахаридов. // Журн. микробиол. ‒ 2004. ‒ T. 3. ‒ C. 98-105. 4. Габричевский Г. Н. Об иммунизации через пищеварительный канал. // Харьковский мед. журнал. ‒ 1906. ‒ T. 1, № 5. ‒ C. 383-392. 5. Гoсударственная фармакопея Российской Федерации // Издательство "Научный центр экспертизы средств медицинского применения". ‒ 2008. ‒ T. XII. 6. Егорова С. А. Клинико-микробиологическая характеристика сальмонеллеза и шигеллеза в Санкт-Петербурге // MEDLINE.RU ‒2006. ‒ T. 7, № 1. ‒ C. 531-540. 7. Иванов А. С., Кречикова, О.И., Сухорукова, М.В., Аксенова, Г.В., Шахмарданов, М.З., Кветная, А.С., Страчунский, Л.С. Мониторинг антибиотикорезистентности шигелл в России // Юбилейная научно-практическая конференция, посвященная 80-летию образования кафедры инфекционных болезней ММА им. И.М. Сеченова «Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе. Клинико-лабораторное обеспечение инфектологии», тезисы докладов. Москва. ‒ 2003. ‒ C. 86. 8. Костинов М. П. Новое в клинике, диагностике и вакцинопрофилактике управляемых инфекций. // M. ‒ 1997. ‒ C. 110. 9. Лёдов В. А., Апарин, П.Г., Каира, А.Н. К вопросу о разработке вакцины против дизентерии Флекснера. // Санитарный врач. ‒ 2012. ‒ T. 10. ‒ C. 013-020. 10. Малов В. А., Горобченко, А.Н. . Шигеллёз (дизентерия). // Лечащий врач. ‒ 2003. ‒ T. 5. 11. Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам // Минздрав России, Москва. ‒ 2004. 12. Миндлина А. Я. Заболеваемость кишечными инфекциями в России. // Вестник Российской Академии медицинских наук. ‒ 2010. ‒ T. 11. ‒ C. 30-33. 115 13. Парфенов А. И., Ручкина, И.Н., Атауллаханов, Р.И. Постинфекционный синдром раздраженного кишечника. Особенности патогенеза, диагностики и лечения. // Болезни органов пищеварения. ‒ 2009. ‒ T. 2. ‒ C. 66-71. 14. Покровский В. И., Пак, С.Г., Брико, Н.И., Данилкин, Б.К. Инфекционные болезни и эпидемиология. // ГЭОТАР-Медицина. ‒ 2003. ‒ C. 249-253. 15. Сергеев В. В., Солодовников, Ю.П., Елкина, С.И., Шустер, Б.Ю. Эффективность энтеральной иммунизации живой дизентерийной вакциной в полевых опытах. // Acta. Microbiol. Acad. Sci. Нung. ‒ 1976. ‒ T. т. 22. ‒ C. с.6-9. 16. Симбирцев А. С., Громова, А.Ю. Функциональный полиморфизм генов регуляторных молекул воспаления // Цитокины и воспаление ‒ 2005. ‒ T. 1. 17. Солодовников Ю. П., Иваненко, А.В., Зыкова, Н.А., Ефремова, Н.В., Зазулин, В.А. Эпидемиологическая диагностика вспышки острых кишечных инфекций в детском дошкольном учреждении. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. ‒ 2007. ‒ T. 3. ‒ C. 117-120. 18. Таточенко В. К., Озерецковский, Н. А. Вакцинопрофилактика. // M. ‒ 1994. ‒ C. 179. 19. Троицкий В. Л. О принципах изготовления дизентерийных энтеральных вакцин. // Журн. микробиол. ‒ 1943. ‒ T. 6. ‒ C. 23-24. 20. Учайкин В. Ф., Шамшева, О.В. . Руководство по клинической вакцинологии // ГЭОТАР-Медицина. ‒ 2006. ‒ C. 395-402. 21. Хаитов Р. М., Игнатьева, Г. А., Сидорович, И. Г. Иммунология. Норма и патология. // Москва «Медицина». ‒ 2010. ‒ C. 627-630. 22. Харрисон Т. Р. Внутренние болезни. // Москва «Медицина». ‒ 2002. ‒ C. 11651168. 23. Ярилин А. А. Основы иммунологии // Изд. Медицина. ‒ 1999. ‒ C. 339-341. 24. Aggarwal S., Ghilardi N., Xie M. H., de Sauvage F. J., Gurney A. L. Interleukin-23 promotes a distinct CD4 T cell activation state characterized by the production of interleukin-17 // J. Biol Chem. ‒ 2003. ‒ T. 278, № 3. ‒ C. 1910-4. 25. Barzu S., Fontaine A., Sansonetti P., Phalipon A. Induction of a local anti-IpaC antibody response in mice by use of a Shigella flexneri 2a vaccine candidate: implications for use of IpaC as a protein carrier // Infect Immun. ‒ 1996. ‒ T. 64, № 4. ‒ C. 1190-6. 26. Benaissa-Trouw B., Lefeber D. J., Kamerling J. P., Vliegenthart J. F., Kraaijeveld K., Snippe H. Synthetic polysaccharide type 3-related di-, tri-, and tetrasaccharide116 CRM(197) conjugates induce protection against Streptococcus pneumoniae type 3 in mice // Infect Immun. ‒ 2001. ‒ T. 69, № 7. ‒ C. 4698-701. 27. Coster T. S., Hoge C. W., VanDeVerg L. L., Hartman A. B., Oaks E. V., Venkatesan M. M., Cohen D., Robin G., Fontaine-Thompson A., Sansonetti P. J., Hale T. L. Vaccination against shigellosis with attenuated Shigella flexneri 2a strain SC602 // Infect Immun. ‒ 1999. ‒ T. 67, № 7. ‒ C. 3437-43. 28. DuPont H. L., Hornick R. B., Snyder M. J., Libonati J. P., Formal S. B., Gangarosa E. J. Immunity in shigellosis. II. Protection induced by oral live vaccine or primary infection // J. Infect Dis. ‒ 1972. ‒ T. 125, № 1. ‒ C. 12-6. 29. Falkow S., Schneider H., Baron L. S., Formal S. B. Virulence of EscherichiaShigella Genetic Hybrids for the Guinea Pig // J Bacteriol. ‒ 1963. ‒ T. 86. ‒ C. 1251-8. 30. Ferreccio C., Prado V., Ojeda A., Cayyazo M., Abrego P., Guers L., Levine M. M. Epidemiologic patterns of acute diarrhea and endemic Shigella infections in children in a poor periurban setting in Santiago, Chile // Am J. Epidemiol. ‒ 1991. ‒ T. 134, № 6. ‒ C. 614-27. 31. Gangarosa E. J., Perera D. R., Mata L. J., Mendizabal-Morris C., Guzman G., Reller L. B. Epidemic Shiga bacillus dysentery in Central America. II. Epidemiologic studies in 1969 // J. Infect Dis. ‒ 1970. ‒ T. 122, № 3. ‒ C. 181-90. 32. Herrington D. A., Van de Verg L., Formal S. B., Hale T. L., Tall B. D., Cryz S. J., Tramont E. C., Levine M. M. Studies in volunteers to evaluate candidate Shigella vaccines: further experience with a bivalent Salmonella typhi-Shigella sonnei vaccine and protection conferred by previous Shigella sonnei disease // Vaccine. ‒ 1990. ‒ T. 8, № 4. ‒ C. 353-7. 33. Jehl S. P., Doling A. M., Giddings K. S., Phalipon A., Sansonetti P. J., Goldberg M. B., Starnbach M. N. Antigen-specific CD8(+) T cells fail to respond to Shigella flexneri // Infect Immun. ‒ 2011. ‒ T. 79, № 5. ‒ C. 2021-30. 34. Jennison A. V., Verma N. K. Shigella flexneri infection: pathogenesis and vaccine development // FEMS Microbiol Rev. ‒ 2004. ‒ T. 28, № 1. ‒ C. 43-58. 35. Jennison A. V., Roberts F., Verma N. K. Construction of a multivalent vaccine strain of Shigella flexneri and evaluation of serotype-specific immunity // FEMS Immunol Med Microbiol. ‒ 2006. ‒ T. 46, № 3. ‒ C. 444-51. 36. Jerala R. Structural biology of the LPS recognition // Int J. Med Microbiol. ‒ 2007. ‒ T. 297, № 5. ‒ C. 353-63. 117 37. Kotloff K. L., Winickoff J. P., Ivanoff B., Clemens J. D., Swerdlow D. L., Sansonetti P. J., Adak G. K., Levine M. M. Global burden of Shigella infections: implications for vaccine development and implementation of control strategies // Bull World Health Organ. ‒ 1999. ‒ T. 77, № 8. ‒ C. 651-66. 38. Kotloff K. L., Losonsky G. A., Nataro J. P., Wasserman S. S., Hale T. L., Taylor D. N., Newland J. W., Sadoff J. C., Formal S. B., Levine M. M. Evaluation of the safety, immunogenicity, and efficacy in healthy adults of four doses of live oral hybrid Escherichia coli-Shigella flexneri 2a vaccine strain EcSf2a-2 // Vaccine. ‒ 1995. ‒ T. 13, № 5. ‒ C. 495-502. 39. Kotloff K. L., Noriega F. R., Samandari T., Sztein M. B., Losonsky G. A., Nataro J. P., Picking W. D., Barry E. M., Levine M. M. Shigella flexneri 2a strain CVD 1207, with specific deletions in virG, sen, set, and guaBA, is highly attenuated in humans // Infect Immun. ‒ 2000. ‒ T. 68, № 3. ‒ C. 1034-9. 40. Le-Barillec K., Magalhaes J. G., Corcuff E., Thuizat A., Sansonetti P. J., Phalipon A., Di Santo J. P. Roles for T and NK cells in the innate immune response to Shigella flexneri // J Immunol. ‒ 2005. ‒ T. 175, № 3. ‒ C. 1735-40. 41. Levine M. M., Kotloff K. L., Barry E. M., Pasetti M. F., Sztein M. B. Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road // Nat Rev Microbiol. ‒ 2007. ‒ T. 5, № 7. ‒ C. 540-53. 42. Levine M. M., Gangarosa E. J., Werner M., Morris G. K. Shigellosis in custodial institutions. 3. Prospective clinical and bacteriologic surveillance of children vaccinated with oral attenuated shigella vaccines // J Pediatr. ‒ 1974. ‒ T. 84, № 6. ‒ C. 803-6. 43. Levine M. M., Woodward W. E., Formal S. B., Gemski P., Jr., DuPont H. L., Hornick R. B., Snyder M. J. Studies with a new generation of oral attenuated shigella vaccine: Escherichia coli bearing surface antigens of Shigella flexneri // J. Infect Dis. ‒ 1977. ‒ T. 136, № 4. ‒ C. 577-82. 44. Linde K., Randhagen B., Beer J., Dentchev V., Marinova S., Vassilev T., Bratoyeva M. Shigella flexneri 2a and sonnei I vaccine with two attenuating markers: construction, tolerability and immunogenicity in 143 children aged 3-17 years // Vaccine. ‒ 1993. ‒ T. 11, № 2. ‒ C. 197-9. 45. Linde K., Dentchev V., Bondarenko V., Marinova S., Randhagen B., Bratoyeva M., Tsvetanov Y., Romanova Y. Live Shigella flexneri 2a and Shigella sonnei I vaccine candidate strains with two attenuating markers. I. Construction of vaccine candidate 118 strains with retained invasiveness but reduced intracellular multiplication // Vaccine. ‒ 1990. ‒ T. 8, № 1. ‒ C. 25-9. 46. Liu B., Knirel Y. A., Feng L., Perepelov A. V., Senchenkova S. N., Wang Q., Reeves P. R., Wang L. Structure and genetics of Shigella O antigens // FEMS Microbiol Rev. ‒ 2008. ‒ T. 32, № 4. ‒ C. 627-53. 47. Meitert T., Pencu E., Ciudin L., Tonciu M. Vaccine strain Sh. flexneri T32-Istrati. Studies in animals and in volunteers. Antidysentery immunoprophylaxis and immunotherapy by live vaccine Vadizen (Sh. flexneri T32-Istrati) // Arch Roum Pathol Exp Microbiol. ‒ 1984. ‒ T. 43, № 3-4. ‒ C. 251-78. 48. Mel D. M., Terzin A. L., Vuksic L. Studies on vaccination against bacillary dysentery. 3. Effective oral immunization against Shigella flexneri 2a in a field trial // Bull World Health Organ. ‒ 1965. ‒ T. 32, № 5. ‒ C. 647-55. 49. Mills J. A., Venkatesan M. M., Baron L. S., Buysse J. M. Spontaneous insertion of an IS1-like element into the virF gene is responsible for avirulence in opaque colonial variants of Shigella flexneri 2a // Infect Immun. ‒ 1992. ‒ T. 60, № 1. ‒ C. 175-82. 50. Nagata T., Koide Y. Induction of Specific CD8 T Cells against Intracellular Bacteria by CD8 T-Cell-Oriented Immunization Approaches // J. Biomed Biotechnol. ‒ 2010. ‒ T. 2010. ‒ C. 764542. 51. Noriega F. R., Losonsky G., Lauderbaugh C., Liao F. M., Wang J. Y., Levine M. M. Engineered deltaguaB-A deltavirG Shigella flexneri 2a strain CVD 1205: construction, safety, immunogenicity, and potential efficacy as a mucosal vaccine // Infect Immun. ‒ 1996. ‒ T. 64, № 8. ‒ C. 3055-61. 52. Noriega F. R., Wang J. Y., Losonsky G., Maneval D. R., Hone D. M., Levine M. M. Construction and characterization of attenuated delta aroA delta virG Shigella flexneri 2a strain CVD 1203, a prototype live oral vaccine // Infect Immun. ‒ 1994. ‒ T. 62, № 11. ‒ C. 5168-72. 53. Passwell J. H., Ashkenzi S., Banet-Levi Y., Ramon-Saraf R., Farzam N., LernerGeva L., Even-Nir H., Yerushalmi B., Chu C., Shiloach J., Robbins J. B., Schneerson R. Age-related efficacy of Shigella O-specific polysaccharide conjugates in 1-4-year-old Israeli children // Vaccine. ‒ 2010. ‒ T. 28, № 10. ‒ C. 2231-5. 54. Perepelov A. V., L'Vov V L., Liu B., Senchenkova S. N., Shekht M. E., Shashkov A. S., Feng L., Aparin P. G., Wang L., Knirel Y. A. A similarity in the O-acetylation pattern of the O-antigens of Shigellaflexneri types 1a, 1b, and 2a // Carbohydr Res. ‒ 2009. ‒ T. 344, № 5. ‒ C. 687-92. 119 55. Perepelov A. V., L'Vov V L., Liu B., Senchenkova S. N., Shekht M. E., Shashkov A. S., Feng L., Aparin P. G., Wang L., Knirel Y. A. A new ethanolamine phosphatecontaining variant of the O-antigen of Shigella flexneri type 4a // Carbohydr Res. ‒ 2009. ‒ T. 344, № 12. ‒ C. 1588-91. 56. Perepelov A. V., Shekht M. E., Liu B., Shevelev S. D., Ledov V. A., Senchenkova S. N., L'Vov V L., Shashkov A. S., Feng L., Aparin P. G., Wang L., Knirel Y. A. Shigella flexneri O-antigens revisited: final elucidation of the O-acetylation profiles and a survey of the O-antigen structure diversity // FEMS Immunol Med Microbiol. ‒ 2012. ‒ T. 66, № 2. ‒ C. 201-10. 57. Phalipon A., Sansonetti P. J. Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival? // Immunol Cell Biol. ‒ 2007. ‒ T. 85, № 2. ‒ C. 119-29. 58. Phalipon A., Sansonetti P. Live attenuated Shigella flexneri mutants as vaccine candidates against shigellosis and vectors for antigen delivery // Biologicals. ‒ 1995. ‒ T. 23, № 2. ‒ C. 125-34. 59. Rallabhandi P., Awomoyi A., Thomas K. E., Phalipon A., Fujimoto Y., Fukase K., Kusumoto S., Qureshi N., Sztein M. B., Vogel S. N. Differential activation of human TLR4 by Escherichia coli and Shigella flexneri 2a lipopolysaccharide: combined effects of lipid A acylation state and TLR4 polymorphisms on signaling // J. Immunol. ‒ 2008. ‒ T. 180, № 2. ‒ C. 1139-47. 60. Ranallo R. T., Kaminski R. W., George T., Kordis A. A., Chen Q., Szabo K., Venkatesan M. M. Virulence, inflammatory potential, and adaptive immunity induced by Shigella flexneri msbB mutants // Infect Immun. ‒ 2010. ‒ T. 78, № 1. ‒ C. 400-12. 61. Raqib R., Lindberg A. A., Wretlind B., Bardhan P. K., Andersson U., Andersson J. Persistence of local cytokine production in shigellosis in acute and convalescent stages // Infect Immun. ‒ 1995. ‒ T. 63, № 1. ‒ C. 289-96. 62. Sandlin R. C., Lampel K. A., Keasler S. P., Goldberg M. B., Stolzer A. L., Maurelli A. T. Avirulence of rough mutants of Shigella flexneri: requirement of O antigen for correct unipolar localization of IcsA in the bacterial outer membrane // Infect Immun. ‒ 1995. ‒ T. 63, № 1. ‒ C. 229-37. 63. Sansonetti P. Host-pathogen interactions: the seduction of molecular cross talk // Gut. ‒ 2002. ‒ T. 50 Suppl 3. ‒ C. III2-8. 64. Sellge G., Magalhaes J. G., Konradt C., Fritz J. H., Salgado-Pabon W., Eberl G., Bandeira A., Di Santo J. P., Sansonetti P. J., Phalipon A. Th17 cells are the dominant T 120 cell subtype primed by Shigella flexneri mediating protective immunity // J. Immunol. ‒ 2010. ‒ T. 184, № 4. ‒ C. 2076-85. 65. Shim D. H., Chang S. Y., Park S. M., Jang H., Carbis R., Czerkinsky C., Uematsu S., Akira S., Kweon M. N. Immunogenicity and protective efficacy offered by a ribosomal-based vaccine from Shigella flexneri 2a // Vaccine. ‒ 2007. ‒ T. 25, № 25. ‒ C. 4828-36. 66. Suzuki T., Yoshikawa Y., Ashida H., Iwai H., Toyotome T., Matsui H., Sasakawa C. High vaccine efficacy against shigellosis of recombinant noninvasive Shigella mutant that expresses Yersinia invasin // J. Immunol. ‒ 2006. ‒ T. 177, № 7. ‒ C. 470917. 67. Theillet F. X., Simenel C., Guerreiro C., Phalipon A., Mulard L. A., Delepierre M. Effects of backbone substitutions on the conformational behavior of Shigella flexneri Oantigens: implications for vaccine strategy // Glycobiology. ‒ 2011. ‒ T. 21, № 1. ‒ C. 109-21. 68. Turbyfill K. R., Hartman A. B., Oaks E. V. Isolation and characterization of a Shigella flexneri invasin complex subunit vaccine // Infect Immun. ‒ 2000. ‒ T. 68, № 12. ‒ C. 6624-32. 69. Van De Verg L. L., Bendiuk N. O., Kotloff K., Marsh M. M., Ruckert J. L., Puryear J. L., Taylor D. N., Hartman A. B. Cross-reactivity of Shigella flexneri serotype 2a O antigen antibodies following immunization or infection // Vaccine. ‒ 1996. ‒ T. 14, № 11. ‒ C. 1062-8. 70. Venkatesan M., Fernandez-Prada C., Buysse J. M., Formal S. B., Hale T. L. Virulence phenotype and genetic characteristics of the T32-ISTRATI Shigella flexneri 2a vaccine strain // Vaccine. ‒ 1991. ‒ T. 9, № 5. ‒ C. 358-63. 71. Vulliez-Le Normand B., Saul F. A., Phalipon A., Belot F., Guerreiro C., Mulard L. A., Bentley G. A. Structures of synthetic O-antigen fragments from serotype 2a Shigella flexneri in complex with a protective monoclonal antibody // Proc Natl Acad Sci U S A. ‒ 2008. ‒ T. 105, № 29. ‒ C. 9976-81. 72. Way S. S., Borczuk A. C., Goldberg M. B. Thymic independence of adaptive immunity to the intracellular pathogen Shigella flexneri serotype 2a // Infect Immun. ‒ 1999. ‒ T. 67, № 8. ‒ C. 3970-9. 73. Way S. S., Borczuk A. C., Goldberg M. B. Adaptive immune response to Shigella flexneri 2a cydC in immunocompetent mice and mice lacking immunoglobulin A // Infect Immun. ‒ 1999. ‒ T. 67, № 4. ‒ C. 2001-4. 121 74. European Committee for Clinical Laboratory Standards. Standards for quality assurance. Part I: Terminologi and general principles. // ECCLS Document. ‒ 1985. ‒ T. 2(1). 75. Adam T., Arpin M., Prevost M. C., Gounon P., Sansonetti P. J. Cytoskeletal rearrangements and the functional role of T-plastin during entry of Shigella flexneri into HeLa cells // J. Cell Biol. ‒ 1995. ‒ T. 129, № 2. ‒ C. 367-81. 76. Arondel J., Singer M., Matsukawa A., Zychlinsky A., Sansonetti P. J. Increased interleukin-1 (IL-1) and imbalance between IL-1 and IL-1 receptor antagonist during acute inflammation in experimental Shigellosis // Infect Immun. ‒ 1999. ‒ T. 67, № 11. ‒ C. 6056-66. 77. Beatty W. L., Sansonetti P. J. Role of lipopolysaccharide in signaling to subepithelial polymorphonuclear leukocytes // Infect Immun. ‒ 1997. ‒ T. 65, № 11. ‒ C. 4395-404. 78. Beatty W. L., Meresse S., Gounon P., Davoust J., Mounier J., Sansonetti P. J., Gorvel J. P. Trafficking of Shigella lipopolysaccharide in polarized intestinal epithelial cells // J. Cell Biol. ‒ 1999. ‒ T. 145, № 4. ‒ C. 689-98. 79. Bendelac A., Bonneville M., Kearney J. F. Autoreactivity by design: innate B and T lymphocytes // Nat Rev Immunol. ‒ 2001. ‒ T. 1, № 3. ‒ C. 177-86. 80. Bolin I., Wolf-Watz H. Molecular cloning of the temperature-inducible outer membrane protein 1 of Yersinia pseudotuberculosis // Infect Immun. ‒ 1984. ‒ T. 43, № 1. ‒ C. 72-8. 81. Bondarenko V. M., Likhoded V. G., Vorob'ev A. A. [Immunoregulation of the population of intestinal gram-negative microflora] // Zh. Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. ‒ 2004. № 4. ‒ C. 90-3. 82. Chakrabarti M. K., Bhattacharya J., Bhattacharya M. K., Nair G. B., Bhattacharya S. K., Mahalanabis D. Killed oral Shigella vaccine made from Shigella flexneri 2a protects against challenge in the rabbit model of shigellosis // Acta Paediatr. ‒ 1999. ‒ T. 88, № 2. ‒ C. 161-5. 83. Clemens J. D., Stanton B., Stoll B., Shahid N. S., Banu H., Chowdhury A. K. Breast feeding as a determinant of severity in shigellosis. Evidence for protection throughout the first three years of life in Bangladeshi children // Am. J. Epidemiol. ‒ 1986. ‒ T. 123, № 4. ‒ C. 710-20. 84. Coats S. R., Jones J. W., Do C. T., Braham P. H., Bainbridge B. W., To T. T., Goodlett D. R., Ernst R. K., Darveau R. P. Human Toll-like receptor 4 responses to P. 122 gingivalis are regulated by lipid A 1- and 4'-phosphatase activities // Cell Microbiol. ‒ 2009. ‒ T. 11, № 11. ‒ C. 1587-99. 85. Cohen D., Block C., Green M. S., Lowell G., Ofek I. Immunoglobulin M, A, and G antibody response to lipopolysaccharide O antigen in symptomatic and asymptomatic Shigella infections // J. Clin Microbiol. ‒ 1989. ‒ T. 27, № 1. ‒ C. 162-7. 86. Delamarre L. a. M., I. Cell biology of antigen processing and presentation. Fundamental Immunology, // Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa, USA, 6th edition. ‒ 2008. ‒ C. 614-630. 87. Dentchev V., Marinova S., Vassilev T., Bratoyeva M., Linde K. Live Shigella flexneri 2a and Shigella sonnei I vaccine candidate strains with two attenuating markers. II. Preliminary results of vaccination of adult volunteers and children aged 2-17 years // Vaccine. ‒ 1990. ‒ T. 8, № 1. ‒ C. 30-4. 88. Dong C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming // Nat Rev Immunol. ‒ 2008. ‒ T. 8, № 5. ‒ C. 337-48. 89. Ewing W. H., Carpenter K. P. Recommended designations for the subserotypes of Shigella flexneri serotypes. // Int J Syst Bacteriol. ‒ 1966. ‒ T. 16. ‒ C. 145-149. 90. Ferguson A. D. Siderophore-Mediated Iron Transport: Crystal Structure of FhuA with Bound Lipopolysaccharide // Science. ‒ 1998. ‒ T. 282, № 5397. ‒ C. 2215-2220. 91. Formal S. B., Hale T. L., Kapfer C., Cogan J. P., Snoy P. J., Chung R., Wingfield M. E., Elisberg B. L., Baron L. S. Oral vaccination of monkeys with an invasive Escherichia coli K-12 hybrid expressing Shigella flexneri 2a somatic antigen // Infect Immun. ‒ 1984. ‒ T. 46, № 2. ‒ C. 465-9. 92. Formal S. B., Labrec E. H., Palmer A., Falkow S. Protection of Monkeys Against Experimental Shigellosis with Attenuated Vaccines // J Bacteriol. ‒ 1965. ‒ T. 90, № 1. ‒ C. 63-8. 93. Fries L. F., Montemarano A. D., Mallett C. P., Taylor D. N., Hale T. L., Lowell G. H. Safety and immunogenicity of a proteosome-Shigella flexneri 2a lipopolysaccharide vaccine administered intranasally to healthy adults // Infect Immun. ‒ 2001. ‒ T. 69, № 7. ‒ C. 4545-53. 94. Ghayur T., Banerjee S., Hugunin M., Butler D., Herzog L., Carter A., Quintal L., Sekut L., Talanian R., Paskind M., Wong W., Kamen R., Tracey D., Allen H. Caspase-1 processes IFN-gamma-inducing factor and regulates LPS-induced IFN-gamma production // Nature. ‒ 1997. ‒ T. 386, № 6625. ‒ C. 619-23. 123 95. Gudlavalleti S. K., Lee C. H., Norris S. E., Paul-Satyaseela M., Vann W. F., Frasch C. E. Comparison of Neisseria meningitidis serogroup W135 polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccines made by periodate activation of O-acetylated, non-Oacetylated and chemically de-O-acetylated polysaccharide // Vaccine. ‒ 2007. ‒ T. 25, № 46. ‒ C. 7972-80. 96. Gutsmann T., Haberer N., Carroll S. F., Seydel U., Wiese A. Interaction between lipopolysaccharide (LPS), LPS-binding protein (LBP), and planar membranes // Biol Chem. ‒ 2001. ‒ T. 382, № 3. ‒ C. 425-34. 97. Gutsmann T., Muller M., Carroll S. F., MacKenzie R. C., Wiese A., Seydel U. Dual role of lipopolysaccharide (LPS)-binding protein in neutralization of LPS and enhancement of LPS-induced activation of mononuclear cells // Infect Immun. ‒ 2001. ‒ T. 69, № 11. ‒ C. 6942-50. 98. Hale T. L., Keren D. F. Pathogenesis and immunology in shigellosis: applications for vaccine development // Curr Top Microbiol Immunol. ‒ 1992. ‒ T. 180. ‒ C. 117-37. 99. Happel K. I., Zheng M., Young E., Quinton L. J., Lockhart E., Ramsay A. J., Shellito J. E., Schurr J. R., Bagby G. J., Nelson S., Kolls J. K. Cutting edge: roles of Toll-like receptor 4 and IL-23 in IL-17 expression in response to Klebsiella pneumoniae infection // J. Immunol. ‒ 2003. ‒ T. 170, № 9. ‒ C. 4432-6. 100. Hess J., Schaible U., Raupach B., Kaufmann S. H. Exploiting the immune system: toward new vaccines against intracellular bacteria // Adv Immunol. ‒ 2000. ‒ T. 75. ‒ C. 1-88. 101. Hilbi H., Moss J. E., Hersh D., Chen Y., Arondel J., Banerjee S., Flavell R. A., Yuan J., Sansonetti P. J., Zychlinsky A. Shigella-induced apoptosis is dependent on caspase-1 which binds to IpaB // J Biol Chem. ‒ 1998. ‒ T. 273, № 49. ‒ C. 32895-900. 102. Hilbi H., Chen Y., Thirumalai K., Zychlinsky A. The interleukin 1beta-converting enzyme, caspase 1, is activated during Shigella flexneri-induced apoptosis in human monocyte-derived macrophages // Infect Immun. ‒ 1997. ‒ T. 65, № 12. ‒ C. 5165-70. 103. Ishigame H., Kakuta S., Nagai T., Kadoki M., Nambu A., Komiyama Y., Fujikado N., Tanahashi Y., Akitsu A., Kotaki H., Sudo K., Nakae S., Sasakawa C., Iwakura Y. Differential roles of interleukin-17A and -17F in host defense against mucoepithelial bacterial infection and allergic responses // Immunity. ‒ 2009. ‒ T. 30, № 1. ‒ C. 10819. 104. Islam D., Christensson B. Disease-dependent changes in T-cell populations in patients with shigellosis // APMIS. ‒ 2000. ‒ T. 108, № 4. ‒ C. 251-60. 124 105. Islam D., Veress B., Bardhan P. K., Lindberg A. A., Christensson B. Quantitative assessment of IgG and IgA subclass producing cells in rectal mucosa during shigellosis // J. Clin Pathol. ‒ 1997. ‒ T. 50, № 6. ‒ C. 513-20. 106. Islam D., Wretlind B., Lindberg A. A., Christensson B. Changes in the peripheral blood T-Cell receptor V beta repertoire in vivo and in vitro during shigellosis // Infect Immun. ‒ 1996. ‒ T. 64, № 4. ‒ C. 1391-9. 107. Islam D., Bardhan P. K., Lindberg A. A., Christensson B. Shigella infection induces cellular activation of T and B cells and distinct species-related changes in peripheral blood lymphocyte subsets during the course of the disease // Infect Immun. ‒ 1995. ‒ T. 63, № 8. ‒ C. 2941-9. 108. Jung H. C., Eckmann L., Yang S. K., Panja A., Fierer J., Morzycka-Wroblewska E., Kagnoff M. F. A distinct array of proinflammatory cytokines is expressed in human colon epithelial cells in response to bacterial invasion // J. Clin Invest. ‒ 1995. ‒ T. 95, № 1. ‒ C. 55-65. 109. K. V.-Y. M. V. V.-Y. M. Experimental pneumonia caused by bacteria of the Shigella group // Acta Morphol. ‒ 1961. ‒ T. XI. ‒ C. 440-454. 110. Kagnoff M. F. Immunology of the intestinal tract // Gastroenterology. ‒ 1993. ‒ T. 105, № 5. ‒ C. 1275-80. 111. Kambarova O. I., Sel'kina L. E., Shpiliuk G. F., Bodazhkova K. N., Dudkina M. I. [Reactivity and immunogenicity of the Sonne dysentery detergent monovaccine] // Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. ‒ 1975. № 12. ‒ C. 34-8. 112. Kaminski R. W., Turbyfill K. R., Oaks E. V. Mucosal adjuvant properties of the Shigella invasin complex // Infect Immun. ‒ 2006. ‒ T. 74, № 5. ‒ C. 2856-66. 113. Karnell A., Cam P. D., Verma N., Lindberg A. A. AroD deletion attenuates Shigella flexneri strain 2457T and makes it a safe and efficacious oral vaccine in monkeys // Vaccine. ‒ 1993. ‒ T. 11, № 8. ‒ C. 830-6. 114. Karnell A., Li A., Zhao C. R., Karlsson K., Nguyen B. M., Lindberg A. A. Safety and immunogenicity study of the auxotrophic Shigella flexneri 2a vaccine SFL1070 with a deleted aroD gene in adult Swedish volunteers // Vaccine. ‒ 1995. ‒ T. 13, № 1. ‒ C. 88-99. 115. Kaufmann S. H. E. Immunity to intracellular bacteria in Fundamental Immunity // Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa, USA, 5th edition. ‒ 2003. ‒ C. 12291261. 125 116. Kohler H. Shigella flexneri Interactions with the Basolateral Membrane Domain of Polarized Model Intestinal Epithelium: Role of Lipopolysaccharide in Cell Invasion and in Activation of the Mitogen-Activated Protein Kinase ERK // Infect Immun. ‒ 2002. ‒ T. 70, № 3. ‒ C. 1150-1158. 117. Kondakova A. N., Vinogradov E. V., Shekht M. E., Markina A. A., Lindner B., L'Vov V L., Aparin P. G., Knirel' Iu A. [Structure of the oligosaccharide region (core) of the lipopolysaccharides of Shigella flexneri types 2a and 5b] // Bioorg Khim. ‒ 2010. ‒ T. 36, № 3. ‒ C. 429-32. 118. Kotloff K. L., Noriega F., Losonsky G. A., Sztein M. B., Wasserman S. S., Nataro J. P., Levine M. M. Safety, immunogenicity, and transmissibility in humans of CVD 1203, a live oral Shigella flexneri 2a vaccine candidate attenuated by deletions in aroA and virG // Infect Immun. ‒ 1996. ‒ T. 64, № 11. ‒ C. 4542-8. 119. Kotloff K. L., Herrington D. A., Hale T. L., Newland J. W., Van De Verg L., Cogan J. P., Snoy P. J., Sadoff J. C., Formal S. B., Levine M. M. Safety, immunogenicity, and efficacy in monkeys and humans of invasive Escherichia coli K12 hybrid vaccine candidates expressing Shigella flexneri 2a somatic antigen // Infect Immun. ‒ 1992. ‒ T. 60, № 6. ‒ C. 2218-24. 120. Lembo A., Pelletier M., Iyer R., Timko M., Dudda J. C., West T. E., Wilson C. B., Hajjar A. M., Skerrett S. J. Administration of a synthetic TLR4 agonist protects mice from pneumonic tularemia // J. Immunol. ‒ 2008. ‒ T. 180, № 11. ‒ C. 7574-81. 121. Levenson V. I., Egorova T. P. Polysaccharide nature of O antigen in protective ribosomal preparations from Shigella: experimental evidence and implications for the ribosomal vaccine concept // Res Microbiol. ‒ 1990. ‒ T. 141, № 6. ‒ C. 707-20. 122. Levenson V. I., Chernokhvostova E. V., Lyubinskaya M. M., Salamatova S. A., Dzhikidze E. K., Stasilevitch Z. K. Parenteral immunization with Shigella ribosomal vaccine elicits local IgA response and primes for mucosal memory // Int Arch Allergy Appl Immunol. ‒ 1988. ‒ T. 87, № 1. ‒ C. 25-31. 123. Lochner M., Peduto L., Cherrier M., Sawa S., Langa F., Varona R., Riethmacher D., Si-Tahar M., Di Santo J. P., Eberl G. In vivo equilibrium of proinflammatory IL17+ and regulatory IL-10+ Foxp3+ RORgamma t+ T cells // J. Exp Med. ‒ 2008. ‒ T. 205, № 6. ‒ C. 1381-93. 124. Mallett C. P., VanDeVerg L., Collins H. H., Hale T. L. Evaluation of Shigella vaccine safety and efficacy in an intranasally challenged mouse model // Vaccine. ‒ 1993. ‒ T. 11, № 2. ‒ C. 190-6. 126 125. Mandell L., Moran A. P., Cocchiarella A., Houghton J., Taylor N., Fox J. G., Wang T. C., Kurt-Jones E. A. Intact gram-negative Helicobacter pylori, Helicobacter felis, and Helicobacter hepaticus bacteria activate innate immunity via toll-like receptor 2 but not toll-like receptor 4 // Infect Immun. ‒ 2004. ‒ T. 72, № 11. ‒ C. 6446-54. 126. Mandic-Mulec I., Weiss J., Zychlinsky A. Shigella flexneri is trapped in polymorphonuclear leukocyte vacuoles and efficiently killed // Infect Immun. ‒ 1997. ‒ T. 65, № 1. ‒ C. 110-5. 127. Martin B., Hirota K., Cua D. J., Stockinger B., Veldhoen M. Interleukin-17producing gammadelta T cells selectively expand in response to pathogen products and environmental signals // Immunity. ‒ 2009. ‒ T. 31, № 2. ‒ C. 321-30. 128. Mathan M. M., Mathan V. I. Morphology of rectal mucosa of patients with shigellosis // Rev Infect Dis. ‒ 1991. ‒ T. 13 Suppl 4. ‒ C. S314-8. 129. Matsuura M. Structural Modifications of Bacterial Lipopolysaccharide that Facilitate Gram-Negative Bacteria Evasion of Host Innate Immunity // Front Immunol. ‒ 2013. ‒ T. 4. ‒ C. 109. 130. McCormick B. A., Siber A. M., Maurelli A. T. Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium // Infect Immun. ‒ 1998. ‒ T. 66, № 9. ‒ C. 4237-43. 131. McLay J., Leonard E., Petersen S., Shapiro D., Greenspan N. S., Schreiber J. R. Gamma 3 gene-disrupted mice selectively deficient in the dominant IgG subclass made to bacterial polysaccharides. II. Increased susceptibility to fatal pneumococcal sepsis due to absence of anti-polysaccharide IgG3 is corrected by induction of antipolysaccharide IgG1 // J Immunol. ‒ 2002. ‒ T. 168, № 7. ‒ C. 3437-43. 132. Morona R. Genetic modulation of Shigella flexneri 2a lipopolysaccharide O antigen modal chain length reveals that it has been optimized for virulence // Microbiology. ‒ 2003. ‒ T. 149, № 4. ‒ C. 925-939. 133. Mounier J., Vasselon T., Hellio R., Lesourd M., Sansonetti P. J. Shigella flexneri enters human colonic Caco-2 epithelial cells through the basolateral pole // Infect Immun. ‒ 1992. ‒ T. 60, № 1. ‒ C. 237-48. 134. Mukhopadhaya A., Mahalanabis D., Khanam J., Chakrabarti M. K. Protective efficacy of oral immunization with heat-killed Shigella flexneri 2a in animal model: study of cross protection, immune response and antigenic recognition // Vaccine. ‒ 2003. ‒ T. 21, № 21-22. ‒ C. 3043-3050. 127 135. Munoz C., Baqar S., van de Verg L., Thupari J., Goldblum S., Olson J. G., Taylor D. N., Heresi G. P., Murphy J. R. Characteristics of Shigella sonnei infection of volunteers: signs, symptoms, immune responses, changes in selected cytokines and acute-phase substances // Am. J. Trop Med Hyg. ‒ 1995. ‒ T. 53, № 1. ‒ C. 47-54. 136. Noriega F. R., Liao F. M., Maneval D. R., Ren S., Formal S. B., Levine M. M. Strategy for cross-protection among Shigella flexneri serotypes // Infect Immun. ‒ 1999. ‒ T. 67, № 2. ‒ C. 782-8. 137. Oberhelman R. A., Kopecko D. J., Salazar-Lindo E., Gotuzzo E., Buysse J. M., Venkatesan M. M., Yi A., Fernandez-Prada C., Guzman M., Leon-Barua R., et al. Prospective study of systemic and mucosal immune responses in dysenteric patients to specific Shigella invasion plasmid antigens and lipopolysaccharides // Infect Immun. ‒ 1991. ‒ T. 59, № 7. ‒ C. 2341-50. 138. Orr N., Robin G., Lowell G., Cohen D. Presence of specific immunoglobulin A-secreting cells in peripheral blood after natural infection with Shigella sonnei // J. Clin Microbiol. ‒ 1992. ‒ T. 30, № 8. ‒ C. 2165-8. 139. Pannaraj P. S., Edwards M. S., Ewing K. T., Lewis A. L., Rench M. A., Baker C. J. Group B streptococcal conjugate vaccines elicit functional antibodies independent of strain O-acetylation // Vaccine. ‒ 2009. ‒ T. 27, № 33. ‒ C. 4452-6. 140. Passwell J. H., Harlev E., Ashkenazi S., Chu C., Miron D., Ramon R., Farzan N., Shiloach J., Bryla D. A., Majadly F., Roberson R., Robbins J. B., Schneerson R. Safety and immunogenicity of improved Shigella O-specific polysaccharide-protein conjugate vaccines in adults in Israel // Infect Immun. ‒ 2001. ‒ T. 69, № 3. ‒ C. 1351-7. 141. Perdomo O. J., Cavaillon J. M., Huerre M., Ohayon H., Gounon P., Sansonetti P. J. Acute inflammation causes epithelial invasion and mucosal destruction in experimental shigellosis // J. Exp Med. ‒ 1994. ‒ T. 180, № 4. ‒ C. 1307-19. 142. Qureshi N., Jarvis, B.W., Takayama, K. . Nontoxic RsDPLA as a potent antagonist of toxic lipopolysaccharide // Endotoxin in health and disease. ‒ 1999. ‒ T. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y. ‒ C. 689-698 143. Rangarajan M., Aduse-Opoku J., Paramonov N., Hashim A., Bostanci N., Fraser O. P., Tarelli E., Curtis M. A. Identification of a second lipopolysaccharide in Porphyromonas gingivalis W50 // J. Bacteriol. ‒ 2008. ‒ T. 190, № 8. ‒ C. 2920-32. 144. Raqib R., Reinholt F. P., Bardhan P. K., Karnell A., Lindberg A. A. Immunopathological patterns in the rectal mucosa of patients with shigellosis: 128 expression of HLA-DR antigens and T-lymphocyte subsets // APMIS. ‒ 1994. ‒ T. 102, № 5. ‒ C. 371-80. 145. Rasolofo-Razanamparany V., Cassel-Beraud A. M., Roux J., Sansonetti P. J., Phalipon A. Predominance of Serotype-Specific Mucosal Antibody Response in Shigella flexneri-Infected Humans Living in an Area of Endemicity // Infect Immun. ‒ 2001. ‒ T. 69, № 9. ‒ C. 5230-5234. 146. Ravaut a. D. // Bull. SOL. Put. exot. ‒ 1909. ‒ T. 2. ‒ C. 17. 147. Roark C. L., Simonian P. L., Fontenot A. P., Born W. K., O'Brien R. L. gammadelta T cells: an important source of IL-17 // Curr Opin Immunol. ‒ 2008. ‒ T. 20, № 3. ‒ C. 353-7. 148. Robbins J. B., Chu C., Schneerson R. Hypothesis for vaccine development: protective immunity to enteric diseases caused by nontyphoidal salmonellae and shigellae may be conferred by serum IgG antibodies to the O-specific polysaccharide of their lipopolysaccharides // Clin Infect Dis. ‒ 1992. ‒ T. 15, № 2. ‒ C. 346-61. 149. Roberts F., Jennison A. V., Verma N. K. The Shigella flexneri serotype Y vaccine candidate SFL124 originated from a serotype 2a background // FEMS Immunol Med Microbiol. ‒ 2005. ‒ T. 45, № 2. ‒ C. 285-9. 150. Rossi O., Pesce I., Giannelli C., Aprea S., Caboni M., Citiulo F., Valentini S., Ferlenghi I., MacLennan C. A., D'Oro U., Saul A., Gerke C. Modulation of Endotoxicity of Shigella Generalized Modules for Membrane Antigens (GMMA) by Genetic Lipid A Modifications: Relative Activation of TLR4 and TLR2 Pathways in Different Mutants // J. Biol Chem. ‒ 2014.10.1074/jbc.M114.566570. 151. Rui X., Xu Y., Wan H., Su G., Huang C. Construction of a stable and non-resistant bivalent vaccine candidate strain against Shigella flexneri 2a and Shigella sonnei // Chin J. Biotechnol. ‒ 1996. ‒ T. 12, № 2. ‒ C. 89-97. 152. Sansonetti P. J., Arondel J., Huerre M., Harada A., Matsushima K. Interleukin-8 controls bacterial transepithelial translocation at the cost of epithelial destruction in experimental shigellosis // Infect Immun. ‒ 1999. ‒ T. 67, № 3. ‒ C. 1471-80. 153. Sansonetti P. J., Arondel J., Fontaine A., d'Hauteville H., Bernardini M. L. OmpB (osmo-regulation) and icsA (cell-to-cell spread) mutants of Shigella flexneri: vaccine candidates and probes to study the pathogenesis of shigellosis // Vaccine. ‒ 1991. ‒ T. 9, № 6. ‒ C. 416-22. 129 154. Sansonetti P. J., Arondel J., Cavaillon J. M., Huerre M. Role of interleukin-1 in the pathogenesis of experimental shigellosis // J. Clin Invest. ‒ 1995. ‒ T. 96, № 2. ‒ C. 884-92. 155. Satoh-Takayama N., Vosshenrich C. A., Lesjean-Pottier S., Sawa S., Lochner M., Rattis F., Mention J. J., Thiam K., Cerf-Bensussan N., Mandelboim O., Eberl G., Di Santo J. P. Microbial flora drives interleukin 22 production in intestinal NKp46+ cells that provide innate mucosal immune defense // Immunity. ‒ 2008. ‒ T. 29, № 6. ‒ C. 958-70. 156. Seltmann G., Holst O. The Bacterial Cell Wall // "Springer". NY. ‒ 2002. ‒ C. 4048. 157. Sereny B. Experimental keratoconjunctivitis shigellosa. // Acta Microbiol Acad Sci Hung. ‒ 1957. ‒ T. 4(4). ‒ C. 367-376. 158. Shiga R. Ueber Versuche zur Schutzimpfung gegen die Ruhr. // Deutsch. med. Wschr. ‒ 1903. ‒ T. N18. ‒ C. S. 327. 159. Stead C. M., Beasley A., Cotter R. J., Trent M. S. Deciphering the unusual acylation pattern of Helicobacter pylori lipid A // J. Bacteriol. ‒ 2008. ‒ T. 190, № 21. ‒ C. 7012-21. 160. Suzue K., Asai T., Takeuchi T., Koyasu S. In vivo role of IFN-gamma produced by antigen-presenting cells in early host defense against intracellular pathogens // Eur J. Immunol. ‒ 2003. ‒ T. 33, № 10. ‒ C. 2666-75. 161. van de Verg L. L., Mallett C. P., Collins H. H., Larsen T., Hammack C., Hale T. L. Antibody and cytokine responses in a mouse pulmonary model of Shigella flexneri serotype 2a infection // Infect Immun. ‒ 1995. ‒ T. 63, № 5. ‒ C. 1947-54. 162. Vinogradov E., Perry M. B., Conlan J. W. Structural analysis of Francisella tularensis lipopolysaccharide // Eur J Biochem. ‒ 2002. ‒ T. 269, № 24. ‒ C. 6112-8. 163. Wahid R., Simon J. K., Picking W. L., Kotloff K. L., Levine M. M., Sztein M. B. Shigella antigen-specific B memory cells are associated with decreased disease severity in subjects challenged with wild-type Shigella flexneri 2a // Clin Immunol. ‒ 2013. ‒ T. 148, № 1. ‒ C. 35-43. 164. Watson D. W., Kim Y. B. Modification of Host Responses to Bacterial Endotoxins. I. Specificity of Pyrogenic Tolerance and the Role of Hypersensitivity in Pyrogenicity, Lethality, and Skin Reactivity // J. Exp Med. ‒ 1963. ‒ T. 118. ‒ C. 42546. 130 165. Way S. S., Borczuk A. C., Dominitz R., Goldberg M. B. An essential role for gamma interferon in innate resistance to Shigella flexneri infection // Infect Immun. ‒ 1998. ‒ T. 66, № 4. ‒ C. 1342-8. 166. Zhang J., Liu Y. J., MacLennan I. C., Gray D., Lane P. J. B cell memory to thymus-independent antigens type 1 and type 2: the role of lipopolysaccharide in B memory induction // Eur J. Immunol. ‒ 1988. ‒ T. 18, № 9. ‒ C. 1417-24. 167. Zheng Y., Valdez P. A., Danilenko D. M., Hu Y., Sa S. M., Gong Q., Abbas A. R., Modrusan Z., Ghilardi N., de Sauvage F. J., Ouyang W. Interleukin-22 mediates early host defense against attaching and effacing bacterial pathogens // Nat Med. ‒ 2008. ‒ T. 14, № 3. ‒ C. 282-9. 168. Zhou L., Chong M. M., Littman D. R. Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation // Immunity. ‒ 2009. ‒ T. 30, № 5. ‒ C. 646-55. 169. Zwillich S. H., Duby A. D., Lipsky P. E. T-lymphocyte clones responsive to Shigella flexneri // J. Clin Microbiol. ‒ 1989. ‒ T. 27, № 3. ‒ C. 417-21. 170. Zychlinsky A., Kenny B., Menard R., Prevost M. C., Holland I. B., Sansonetti P. J. IpaB mediates macrophage apoptosis induced by Shigella flexneri // Mol Microbiol. ‒ 1994. ‒ T. 11, № 4. ‒ C. 619-27. 171. Zychlinsky A., Prevost M. C., Sansonetti P. J. Shigella flexneri induces apoptosis in infected macrophages // Nature. ‒ 1992. ‒ T. 358, № 6382. ‒ C. 167-169. 131
