морфофункциональные особенности легочных макрофагов у
реклама
34 БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ УДК 591.4:575.113.1:612.017.1:578.232 МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЛЕГОЧНЫХ МАКРОФАГОВ У МЫШЕЙ ОППОЗИТНЫХ ЛИНИЙ CBA И C57Bl/6g Потапова О.В., Черданцева Л.А., Шаркова Т.В., Шкурупий В.А., Лузгина Н.Г., Ковнер А.В. Научный центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, Новосибирск [email protected] Изучены генетически детерминированные морфофункциональные особенности легочных макрофагов у интактных мышей-самцов оппозитных линий С57Bl/6g и СBА. У мышей-самцов линии C57Bl/6g, в отличие от мышей линии CBA, больше величина численной плотности легочных макрофагов и относительно большее содержание макрофагов, обладающих секреторной активностью, определяемой по экспрессии маркеров внутриклеточных энзимов (миелопероксидазы, катепсина Д, индуцибельной NO – синтазы). Ключевые слова: оппозитные линии мышей CBA и C57Bl/6g, легочные макрофаги, PCNA, миелопероксидаза, катепсин Д, индуцибельная NO–синтаза. Инфекции, передающиеся воздушно- секреторной активности легочные макро- капельным путем, такие как грипп и ОРВИ, фаги играют ключевую роль в инициации остаются в сфере особого внимания. Боль- и развитии воспалительного процесса в шинство возбудителей ОРВИ, особенно ви- легких [10]. русы гриппа А, обладают тропностью к аль- Выраженность воспалительного ответа веолярному эпителию и вызывают у млеко- и особенности клеточных реакций в легких питающих млекопитающих при инфекционных забо- и человека заболевание c глубоким поражением легких [2]. Формирование местного иммунитета в леваниях в определенной мере зависят от исходной фенотипически детерминиро- легких как первой линии защиты организма ванной реактивности мононуклеарных фа- при вирусных инфекциях осуществляется за гоцитов и их регуляции [5]. Рядом авторов счет легочных макрофагов, которые под- выявлены межлинейные отличия реагиро- разделяют на интерстициальные (перивас- вания различных систем организма мышей кулярные, перибронхиальные) и альвеоляр- оппозитных линий СВА и С57Bl/6g на бак- ные. Все они входят в легочный компарт- териальные и грибковые агенты – M. tuber- мент системы мононуклеарных фагоцитов culosis [3], С. albicans [1]. К сожалению, (СМФ). Благодаря своей фагоцитозной и очень мало современных исследований ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ № 10, 2010 БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ 35 посвящено изучению генетической детер- к инфекционным агентам [1, 3, 4], струк- минации иммунного ответа у млекопита- турно-функциональным ющих при гриппе и ОРВИ [4, 7]. На осно- коры надпочечников [3], по количествен- вании ранее описанных межлинейных раз- ному представительству клеток СМФ в личий различных органах [9]. можно предположить, что у характеристикам млекопитающих с разной генетической Мышей-самцов выбранных оппозитных программой имеют место как морфофунк- линий содержали на стандартной лабора- циональные различия клеток системы мо- торной диете со свободным доступом к нонуклеарных фагоцитов, так и различные воде и пище. Перед проведением экспери- варианты реагирования этой системы на мента в течение 2-х недель их адаптирова- одинаковые патогены. Однако механизмы ли к условиям содержания. Исследование реализации обусловленной проводили в соответствии с «Правилами предрасположенности или устойчивости к проведения работ с использованием экспе- инфекциям, в том числе вирусным, обу- риментальных животных» (Приложение к словленные морфофункциональными ха- приказу Министерства здравоохранения рактеристиками системы мононуклеарных СССР от 12.08.1977 г. N 755), с соблюде- фагоцитов, остаются малоизученными. нием международных принципов Хельсин- генетически В связи с вышесказанным, целью данно- ской декларации. го исследования явилось изучение у мышей Для морфологического исследования оппозитных линий СВА и С57Bl/6g межли- использовали по 20 мышей каждой оппо- нейных морфофункциональных особенно- зитной линии, которых выводили из экспе- стей легочных макрофагов как вероятного римента путем дислокации позвонков в фактора детерминации характера иммунно- шейном отделе. Объектом исследования го ответа при вирусных инфекциях. служили легкие. Образцы ткани получали Методика исследования из левого легкого (тотально) и из средних В исследовании были использованы 40 и нижних отделов правого легкого. мышей-самцов оппозитных линий СВА и Для светооптического исследования по- С57Bl/6g двухмесячного возраста с массой лученный материал после фиксации в 10 % тела 20-25 г, полученных из питомника растворе нейтрального формалина обезвожи- Научно-исследовательского института вали в серии спиртов возрастающей концен- клинической иммунологии СО РАМН. трации и ксилолов и заключали в парафин. Мыши, выбранные для исследования, яв- Срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали по ляются оппозитными по ряду признаков: стандартной методике гематоксилином и по активности обменных процессов в пе- эозином. Иммунофенотипирование легочных чени макрофагов, оценку их пролиферативной и [3], разной чувствительностью ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ № 10, 2010 36 БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ функциональной активности проводили с ток СМФ с потенциально пролифератив- помощью иммуногистохимического (ИГХ) ной активностью. Полученный результат анализа с использованием непрямого стреп- выражали в процентах от общего числа тавидинбиотинового метода с применением клеток СМФ легких. специфических моноклональных антител: к маркеру макрофагального ряда Средние величины исследованных пара- CD68 метров определяли с использованием стан- («DBS»), маркеру пролиферации PCNA дартного пакета программ «Statistica», при- («Novocastra»), к маркерам индуцибельной меняли t-критерий Стьюдента. Достовер- NO–синтазы (iNOS) («Novocastra»), лизосо- ными считали различия при р менее 0,05. мальных протеаз – катепсина Д («DBS») и Результаты исследования миелопероксидазы («DBS»). Методом обзорной световой микроско- Для проведения ИГХ–исследования пии образцов ткани легких мышей оппо- срезы легких подвергали депарафиниза- зитных линий C57Bl/6g и CBА изучали то- ции, регидратации, демаскировке антиге- пологию легочных макрофагов. При этом нов в микроволновой печи мощностью отмечали, что большая часть из них – 68 % – 700W. Время экспозиции с первичными были представлены альвеолярными макро- антителами составляло 30 мин при темпе- фагами, расположенными на поверхности ратуре 37°С. Затем срезы инкубировали со альвеол, другие – макрофаги интерстиция – стрептавидин–пероксидазным комплексом, были распределены в межальвеолярных DAB–субстратом и дополнительно докра- перегородках перибронхиально и перивас- шивали гематоксилином Майера. кулярно. Величины численной плотности Визуализацию проводили на микроскопе клеток макрофагов легких и их размеров у AxioImager A1 с фотокамерой AxioCam мышей линии C57Bl/6g были выше, чем у MRc (Carl Zeiss). Морфометрию структур- мышей линии СВА, на 22,6 % и 16 % соот- ных элементов тканей осуществляли с по- ветственно. Диаметры ядер не имели досто- мощью окулярной сетки на 100 точек пло- верных межлинейных различий. 4 2 щадью 3,64х10 мкм (при определении численной плотности ких мышей-самцов линии C57Bl/6/g, воз- программы можно, обусловлена большим содержанием AxioVision (rel. 4,7). Определяли числен- у них моноцитов в периферической крови по ную плотность (Nai) клеток СМФ легких в сравнению с мышами линии СВА [9], так тестовой площади; средние величины диа- как поддержание и увеличение пула клеток метров макрофагов и их ядер. Исследовали СМФ происходит, в основном, за счет ре- долю клеток СМФ легких, экспрессирую- крутирования моноцитов крови, имеющих щих внутриклеточные энзимы, долю кле- костномозговое происхождение [10]. структур) и/или и объемной Большая численность макрофагов в лег- инструментов ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ № 10, 2010 БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ Однако в последнее десятилетие рядом ются протеолитические 37 ферменты из автором выявлена способность легочных группы эндопептидаз – катепсин Д и мие- макрофагов к синтезу ДНК, что не позволя- лопероксидаза, осуществляющие внутри- ет исключить определенный вклад проли- клеточное расщепление белковых струк- ферации in situ в поддержание численности тур вирусов [4]. При ИГХ-исследовании альвеолярных макрофагов [8]. Другие авто- функциональной активности макрофагов ры связывают активацию синтеза ДНК в легких мышей-самцов оппозитных линий легочных макрофагах с усилением их син- по экспрессии внутриклеточных энзимов тезирующей и фагоцитарной активности, было выявлено, что показатели числен- свидетельствующих о фенотипической диф- ной плотности клеток, экспрессирующих ференциации юных клеток СМФ [10]. лизосомальные протеазы (миелоперокси- В представленной работе исследована дазу, катепсин Д), у мышей линии экспрессия ядерного маркера пролифера- C57Bl/6g были большими в 1,3 раза, чем ции PCNA в клетках СМФ легких мышей у мышей линии СBА (Табл.). При этом оппозитных линий. Показатель численной распределение иммунопозитивных гра- плотность PCNA-позитивных клеток был нул, содержащих секреторные протеазы, на 28,3 % выше у мышей линии C57Bl/6g в цитоплазме клеток было равномерным по сравнению с аналогичным показателем у обеих линий животных. у мышей линии СВА, что может свиде- Немаловажную роль в противовирусной тельствовать о высоком функциональном защите отводят и системе оксида азота. Ак- потенциале клеток системы мононуклеар- тивация ных фагоцитов животных линии C57Bl/6g. (iNOS) в альвеолярных макрофагах в пер- индуцибельной NO–синтазы Известно, что взаимодействие макро- вые сутки после инфицирования вирусами фагов легких с вирусными частицами че- гриппа А способствует накоплению оксида рез Fc–peцепторы сопровождается акти- азота вацией респираторного взрыва с избыточ- транспортные группы ферментов вирусов, ной провоспалительных участвующих в цикле Кребса и синтезе цитокинов и хемокинов. Фагоцитоз и ДНК [5]. Показатель численной плотности дальнейшая деградация микроорганизмов iNOS-позитивных клеток СМФ в легких происходит в фаголизосомах макрофагов мышей-самцов линии C57Bl/6g был выше с помощью специализированных фер- на 20,5 % в сравнении с величиной анало- ментных систем, наиболее значимыми из гичного показателя у мышей-самцов линии которых при вирусных инфекциях явля- СВА (табл.). секрецией (NO), ингибирующего электрон- ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ № 10, 2010 38 БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ Морфофункциональные характеристики легочных макрофагов интактных мышей оппозитных линий С57Bl/6g и СВА (M±m) Линии животных Интактные мыши Интактные мыши линии C57Bl/6/g линии CBA Параметры исследования Численная плотность CD68+ легочных макрофагов (Nai) (тестовая площадь 3,64х105 мкм2) - из них PCNA+- клетки, % - из них экспрессирующие: iNOS, % Cathepsin D, % Myeloperoxidase, % Средний диаметр альвеолярных макрофагов, мкм Средний диаметр ядра альвеолярных макрофагов, мкм 10,12 ± 0,96 8,25 ± 0,26a 12,2 ± 0,56 9,51 ± 0,91а 35,96 ± 1,97 47,43 ± 2,86 35,17 ± 2,47 28,61 ± 2,67а 36,02 ± 2,79а 26,67 ± 2,42а 9,44 ± 0,15 7,92 ± 0,14а 5,63 ± 0,11 5,53 ± 0,08 Примечание: «a» – достоверность отличия величин рассматриваемых параметров у мышей оппозитных линий C57Bl/6/g и CBA. Учитывая полученные результаты, представительству и функциональным можно сделать предположение о более возможностям клеток СМФ легких у мы- высоких функциональных возможностях шей линий С57Bl/6g и СBА указывают на СМФ мышей линии C57Bl/6g, что соотно- генетическую детерминацию морфофунк- сится об ционального состояния легочного ком- устойчивости животных данной линии к парт-мента СМФ. Это дополняет уже име- воздействию многих патогенных факторов, ющиеся провоцирующих формирование различных физиологических патологических [6]. линий и позволяет рекомендовать их в ка- Возможно, легочные макрофаги мышей честве моделей для изучения генетически линии С57Bl/6g как регуляторы противо- детерминированных особенностей проти- вирусного ответа будут демонстрировать вовирусного ответа млекопитающих. с литературными состояний данными легких большую фагоцитозную и секреторную сведения об анатомо- особенностях данных Работа выполнена в рамках Федеральной активность при моделировании вирусных целевой инфекций с последующей элиминацией «Научные и научно-педагогические кадры возбудителя, что, в свою очередь, может инновационной России на 2009-2013 гг.», обусловить более ранний и полноценный госконтракт № 02.740.11.0709. Таким образом, выявленные межлинейразличия по программы Список литературы противовирусный ответ. ные научно-технической количественному ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ № 10, 2010 1. Система мононуклеарных фагоцитов в постнатальном периоде у мышей, перенесших БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ 39 внутриутробное кандидозное инфицирование, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 1995. при экспериментальном туберкулезе / А.П. 268. P. 501–504. Надеев [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. Т. 141. № 1. С. 103-106. 2. 6. Hayden F.G., Hay H.J. // Curr. Top. Mi- crobiol. Immunol. 1992. 176. P. 119–130. 7. Low–dose arsenic compromises the im- Структурные изменения легких у mune response to influenza A infection in vivo / мышей, инфицированных вирусом гриппа Kozul C.D. [et al.] // Environ. Health Perspect. птиц H5N1 субтипа / Л.В. Шестопалова 2009. 117(9). P. 1441–1447. [и др.] // Вестник НГУ. 2008. Т. 6, вып. 3, ч. 2. С. 3-10. 3. Шкурупий В.А. Туберкулезный грану- М.: Изд-во РАМН, 2007. С. 109-150. Influenza A virus elevates active cathep- sin B in primary murine DC / Burster T. [et al.] // Int. Immunol. 2007. 19. P. 645–655. 5. Landsman L, Jung S. Lung macrophages serve as obligatory intermediate between blood лематоз. Цитофизиология и адресная терапия. 4. 8. monocytes and alveolar macrophages // J Immunol. 2007. 179(6). Р. 3488-94. 9. Murciano C. [et al.] // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2008. 53(2). P. 214–221. 10. Transcriptome profiling of primary murine monocytes, lung macrophages and lung den- Pulmonary alveolar epithelial inducible dritic cells reveals a distinct expression of genes NO synthase gene expression: regulation by in- involved in cell trafficking / Zasłona Z. [et al.] // flammatory mediators / Gutierrez H.H. [et al.] // Respir Res. 2009. Р. 10-122. MORPHO-FUNCTIONAL FEATURES OF PULMONARY MACROPHAGES OF OPPOSED LINEAR MICE CBA AND C57Bl/6g Potapova O.V., Cherdanceva L.A.,Sharkova T.V., Shkurupi V.A., Luzgina N.G., Kovner A.V. Scientific center of clinical and experimental medicine of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Novosibirsk [email protected] We studied genetically determinated structural functional features of pulmonary macrophages of linear mice C57Bl/6g and CBA. Morphological study revealed, that mice C57Bl/6g in contrast to mice CBA were characterized by high numerical density of pulmonary macrophages. Simultaneously lungs of linear mice C57Bl/6g had high percentage of secretory cells, which expressed enzymes Myeloperoxidase, Cathepsin D and inducible NO- synthase. Keywords: opposed linear mice CBA and C57Bl/6g, pulmonary macrophages, Myeloperoxidase, Cathepsin D, inducible NO-synthase, PCNA. ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ № 10, 2010
