морфофункциональные особенности легочных макрофагов у
advertisement
34 БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ УДК 591.4:575.113.1:612.017.1:578.232 МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЛЕГОЧНЫХ МАКРОФАГОВ У МЫШЕЙ ОППОЗИТНЫХ ЛИНИЙ CBA И C57Bl/6g Потапова О.В., Черданцева Л.А., Шаркова Т.В., Шкурупий В.А., Лузгина Н.Г., Ковнер А.В. Научный центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, Новосибирск potapova@soramn.ru Изучены генетически детерминированные морфофункциональные особенности легочных макрофагов у интактных мышей-самцов оппозитных линий С57Bl/6g и СBА. У мышей-самцов линии C57Bl/6g, в отличие от мышей линии CBA, больше величина численной плотности легочных макрофагов и относительно большее содержание макрофагов, обладающих секреторной активностью, определяемой по экспрессии маркеров внутриклеточных энзимов (миелопероксидазы, катепсина Д, индуцибельной NO – синтазы). Ключевые слова: оппозитные линии мышей CBA и C57Bl/6g, легочные макрофаги, PCNA, миелопероксидаза, катепсин Д, индуцибельная NO–синтаза. Инфекции, передающиеся воздушно- секреторной активности легочные макро- капельным путем, такие как грипп и ОРВИ, фаги играют ключевую роль в инициации остаются в сфере особого внимания. Боль- и развитии воспалительного процесса в шинство возбудителей ОРВИ, особенно ви- легких [10]. русы гриппа А, обладают тропностью к аль- Выраженность воспалительного ответа веолярному эпителию и вызывают у млеко- и особенности клеточных реакций в легких питающих млекопитающих при инфекционных забо- и человека заболевание c глубоким поражением легких [2]. Формирование местного иммунитета в леваниях в определенной мере зависят от исходной фенотипически детерминиро- легких как первой линии защиты организма ванной реактивности мононуклеарных фа- при вирусных инфекциях осуществляется за гоцитов и их регуляции [5]. Рядом авторов счет легочных макрофагов, которые под- выявлены межлинейные отличия реагиро- разделяют на интерстициальные (перивас- вания различных систем организма мышей кулярные, перибронхиальные) и альвеоляр- оппозитных линий СВА и С57Bl/6g на бак- ные. Все они входят в легочный компарт- териальные и грибковые агенты – M. tuber- мент системы мононуклеарных фагоцитов culosis [3], С. albicans [1]. К сожалению, (СМФ). Благодаря своей фагоцитозной и очень мало современных исследований ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ № 10, 2010 БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ 35 посвящено изучению генетической детер- к инфекционным агентам [1, 3, 4], струк- минации иммунного ответа у млекопита- турно-функциональным ющих при гриппе и ОРВИ [4, 7]. На осно- коры надпочечников [3], по количествен- вании ранее описанных межлинейных раз- ному представительству клеток СМФ в личий различных органах [9]. можно предположить, что у характеристикам млекопитающих с разной генетической Мышей-самцов выбранных оппозитных программой имеют место как морфофунк- линий содержали на стандартной лабора- циональные различия клеток системы мо- торной диете со свободным доступом к нонуклеарных фагоцитов, так и различные воде и пище. Перед проведением экспери- варианты реагирования этой системы на мента в течение 2-х недель их адаптирова- одинаковые патогены. Однако механизмы ли к условиям содержания. Исследование реализации обусловленной проводили в соответствии с «Правилами предрасположенности или устойчивости к проведения работ с использованием экспе- инфекциям, в том числе вирусным, обу- риментальных животных» (Приложение к словленные морфофункциональными ха- приказу Министерства здравоохранения рактеристиками системы мононуклеарных СССР от 12.08.1977 г. N 755), с соблюде- фагоцитов, остаются малоизученными. нием международных принципов Хельсин- генетически В связи с вышесказанным, целью данно- ской декларации. го исследования явилось изучение у мышей Для морфологического исследования оппозитных линий СВА и С57Bl/6g межли- использовали по 20 мышей каждой оппо- нейных морфофункциональных особенно- зитной линии, которых выводили из экспе- стей легочных макрофагов как вероятного римента путем дислокации позвонков в фактора детерминации характера иммунно- шейном отделе. Объектом исследования го ответа при вирусных инфекциях. служили легкие. Образцы ткани получали Методика исследования из левого легкого (тотально) и из средних В исследовании были использованы 40 и нижних отделов правого легкого. мышей-самцов оппозитных линий СВА и Для светооптического исследования по- С57Bl/6g двухмесячного возраста с массой лученный материал после фиксации в 10 % тела 20-25 г, полученных из питомника растворе нейтрального формалина обезвожи- Научно-исследовательского института вали в серии спиртов возрастающей концен- клинической иммунологии СО РАМН. трации и ксилолов и заключали в парафин. Мыши, выбранные для исследования, яв- Срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали по ляются оппозитными по ряду признаков: стандартной методике гематоксилином и по активности обменных процессов в пе- эозином. Иммунофенотипирование легочных чени макрофагов, оценку их пролиферативной и [3], разной чувствительностью ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ № 10, 2010 36 БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ функциональной активности проводили с ток СМФ с потенциально пролифератив- помощью иммуногистохимического (ИГХ) ной активностью. Полученный результат анализа с использованием непрямого стреп- выражали в процентах от общего числа тавидинбиотинового метода с применением клеток СМФ легких. специфических моноклональных антител: к маркеру макрофагального ряда Средние величины исследованных пара- CD68 метров определяли с использованием стан- («DBS»), маркеру пролиферации PCNA дартного пакета программ «Statistica», при- («Novocastra»), к маркерам индуцибельной меняли t-критерий Стьюдента. Достовер- NO–синтазы (iNOS) («Novocastra»), лизосо- ными считали различия при р менее 0,05. мальных протеаз – катепсина Д («DBS») и Результаты исследования миелопероксидазы («DBS»). Методом обзорной световой микроско- Для проведения ИГХ–исследования пии образцов ткани легких мышей оппо- срезы легких подвергали депарафиниза- зитных линий C57Bl/6g и CBА изучали то- ции, регидратации, демаскировке антиге- пологию легочных макрофагов. При этом нов в микроволновой печи мощностью отмечали, что большая часть из них – 68 % – 700W. Время экспозиции с первичными были представлены альвеолярными макро- антителами составляло 30 мин при темпе- фагами, расположенными на поверхности ратуре 37°С. Затем срезы инкубировали со альвеол, другие – макрофаги интерстиция – стрептавидин–пероксидазным комплексом, были распределены в межальвеолярных DAB–субстратом и дополнительно докра- перегородках перибронхиально и перивас- шивали гематоксилином Майера. кулярно. Величины численной плотности Визуализацию проводили на микроскопе клеток макрофагов легких и их размеров у AxioImager A1 с фотокамерой AxioCam мышей линии C57Bl/6g были выше, чем у MRc (Carl Zeiss). Морфометрию структур- мышей линии СВА, на 22,6 % и 16 % соот- ных элементов тканей осуществляли с по- ветственно. Диаметры ядер не имели досто- мощью окулярной сетки на 100 точек пло- верных межлинейных различий. 4 2 щадью 3,64х10 мкм (при определении численной плотности ких мышей-самцов линии C57Bl/6/g, воз- программы можно, обусловлена большим содержанием AxioVision (rel. 4,7). Определяли числен- у них моноцитов в периферической крови по ную плотность (Nai) клеток СМФ легких в сравнению с мышами линии СВА [9], так тестовой площади; средние величины диа- как поддержание и увеличение пула клеток метров макрофагов и их ядер. Исследовали СМФ происходит, в основном, за счет ре- долю клеток СМФ легких, экспрессирую- крутирования моноцитов крови, имеющих щих внутриклеточные энзимы, долю кле- костномозговое происхождение [10]. структур) и/или и объемной Большая численность макрофагов в лег- инструментов ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ № 10, 2010 БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ Однако в последнее десятилетие рядом ются протеолитические 37 ферменты из автором выявлена способность легочных группы эндопептидаз – катепсин Д и мие- макрофагов к синтезу ДНК, что не позволя- лопероксидаза, осуществляющие внутри- ет исключить определенный вклад проли- клеточное расщепление белковых струк- ферации in situ в поддержание численности тур вирусов [4]. При ИГХ-исследовании альвеолярных макрофагов [8]. Другие авто- функциональной активности макрофагов ры связывают активацию синтеза ДНК в легких мышей-самцов оппозитных линий легочных макрофагах с усилением их син- по экспрессии внутриклеточных энзимов тезирующей и фагоцитарной активности, было выявлено, что показатели числен- свидетельствующих о фенотипической диф- ной плотности клеток, экспрессирующих ференциации юных клеток СМФ [10]. лизосомальные протеазы (миелоперокси- В представленной работе исследована дазу, катепсин Д), у мышей линии экспрессия ядерного маркера пролифера- C57Bl/6g были большими в 1,3 раза, чем ции PCNA в клетках СМФ легких мышей у мышей линии СBА (Табл.). При этом оппозитных линий. Показатель численной распределение иммунопозитивных гра- плотность PCNA-позитивных клеток был нул, содержащих секреторные протеазы, на 28,3 % выше у мышей линии C57Bl/6g в цитоплазме клеток было равномерным по сравнению с аналогичным показателем у обеих линий животных. у мышей линии СВА, что может свиде- Немаловажную роль в противовирусной тельствовать о высоком функциональном защите отводят и системе оксида азота. Ак- потенциале клеток системы мононуклеар- тивация ных фагоцитов животных линии C57Bl/6g. (iNOS) в альвеолярных макрофагах в пер- индуцибельной NO–синтазы Известно, что взаимодействие макро- вые сутки после инфицирования вирусами фагов легких с вирусными частицами че- гриппа А способствует накоплению оксида рез Fc–peцепторы сопровождается акти- азота вацией респираторного взрыва с избыточ- транспортные группы ферментов вирусов, ной провоспалительных участвующих в цикле Кребса и синтезе цитокинов и хемокинов. Фагоцитоз и ДНК [5]. Показатель численной плотности дальнейшая деградация микроорганизмов iNOS-позитивных клеток СМФ в легких происходит в фаголизосомах макрофагов мышей-самцов линии C57Bl/6g был выше с помощью специализированных фер- на 20,5 % в сравнении с величиной анало- ментных систем, наиболее значимыми из гичного показателя у мышей-самцов линии которых при вирусных инфекциях явля- СВА (табл.). секрецией (NO), ингибирующего электрон- ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ № 10, 2010 38 БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ Морфофункциональные характеристики легочных макрофагов интактных мышей оппозитных линий С57Bl/6g и СВА (M±m) Линии животных Интактные мыши Интактные мыши линии C57Bl/6/g линии CBA Параметры исследования Численная плотность CD68+ легочных макрофагов (Nai) (тестовая площадь 3,64х105 мкм2) - из них PCNA+- клетки, % - из них экспрессирующие: iNOS, % Cathepsin D, % Myeloperoxidase, % Средний диаметр альвеолярных макрофагов, мкм Средний диаметр ядра альвеолярных макрофагов, мкм 10,12 ± 0,96 8,25 ± 0,26a 12,2 ± 0,56 9,51 ± 0,91а 35,96 ± 1,97 47,43 ± 2,86 35,17 ± 2,47 28,61 ± 2,67а 36,02 ± 2,79а 26,67 ± 2,42а 9,44 ± 0,15 7,92 ± 0,14а 5,63 ± 0,11 5,53 ± 0,08 Примечание: «a» – достоверность отличия величин рассматриваемых параметров у мышей оппозитных линий C57Bl/6/g и CBA. Учитывая полученные результаты, представительству и функциональным можно сделать предположение о более возможностям клеток СМФ легких у мы- высоких функциональных возможностях шей линий С57Bl/6g и СBА указывают на СМФ мышей линии C57Bl/6g, что соотно- генетическую детерминацию морфофунк- сится об ционального состояния легочного ком- устойчивости животных данной линии к парт-мента СМФ. Это дополняет уже име- воздействию многих патогенных факторов, ющиеся провоцирующих формирование различных физиологических патологических [6]. линий и позволяет рекомендовать их в ка- Возможно, легочные макрофаги мышей честве моделей для изучения генетически линии С57Bl/6g как регуляторы противо- детерминированных особенностей проти- вирусного ответа будут демонстрировать вовирусного ответа млекопитающих. с литературными состояний данными легких большую фагоцитозную и секреторную сведения об анатомо- особенностях данных Работа выполнена в рамках Федеральной активность при моделировании вирусных целевой инфекций с последующей элиминацией «Научные и научно-педагогические кадры возбудителя, что, в свою очередь, может инновационной России на 2009-2013 гг.», обусловить более ранний и полноценный госконтракт № 02.740.11.0709. Таким образом, выявленные межлинейразличия по программы Список литературы противовирусный ответ. ные научно-технической количественному ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ № 10, 2010 1. Система мононуклеарных фагоцитов в постнатальном периоде у мышей, перенесших БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ 39 внутриутробное кандидозное инфицирование, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 1995. при экспериментальном туберкулезе / А.П. 268. P. 501–504. Надеев [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. Т. 141. № 1. С. 103-106. 2. 6. Hayden F.G., Hay H.J. // Curr. Top. Mi- crobiol. Immunol. 1992. 176. P. 119–130. 7. Low–dose arsenic compromises the im- Структурные изменения легких у mune response to influenza A infection in vivo / мышей, инфицированных вирусом гриппа Kozul C.D. [et al.] // Environ. Health Perspect. птиц H5N1 субтипа / Л.В. Шестопалова 2009. 117(9). P. 1441–1447. [и др.] // Вестник НГУ. 2008. Т. 6, вып. 3, ч. 2. С. 3-10. 3. Шкурупий В.А. Туберкулезный грану- М.: Изд-во РАМН, 2007. С. 109-150. Influenza A virus elevates active cathep- sin B in primary murine DC / Burster T. [et al.] // Int. Immunol. 2007. 19. P. 645–655. 5. Landsman L, Jung S. Lung macrophages serve as obligatory intermediate between blood лематоз. Цитофизиология и адресная терапия. 4. 8. monocytes and alveolar macrophages // J Immunol. 2007. 179(6). Р. 3488-94. 9. Murciano C. [et al.] // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2008. 53(2). P. 214–221. 10. Transcriptome profiling of primary murine monocytes, lung macrophages and lung den- Pulmonary alveolar epithelial inducible dritic cells reveals a distinct expression of genes NO synthase gene expression: regulation by in- involved in cell trafficking / Zasłona Z. [et al.] // flammatory mediators / Gutierrez H.H. [et al.] // Respir Res. 2009. Р. 10-122. MORPHO-FUNCTIONAL FEATURES OF PULMONARY MACROPHAGES OF OPPOSED LINEAR MICE CBA AND C57Bl/6g Potapova O.V., Cherdanceva L.A.,Sharkova T.V., Shkurupi V.A., Luzgina N.G., Kovner A.V. Scientific center of clinical and experimental medicine of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Novosibirsk potapova@soramn.ru We studied genetically determinated structural functional features of pulmonary macrophages of linear mice C57Bl/6g and CBA. Morphological study revealed, that mice C57Bl/6g in contrast to mice CBA were characterized by high numerical density of pulmonary macrophages. Simultaneously lungs of linear mice C57Bl/6g had high percentage of secretory cells, which expressed enzymes Myeloperoxidase, Cathepsin D and inducible NO- synthase. Keywords: opposed linear mice CBA and C57Bl/6g, pulmonary macrophages, Myeloperoxidase, Cathepsin D, inducible NO-synthase, PCNA. ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ № 10, 2010
