Результаты и достижения за 2014

Результаты и достижения за 2014-2015 гг.
Согласно плану научных исследований в процессе работы по тематике проекта получены следующие
результаты:
1. Охарактеризованы два новых локуса, которые вносят вклад в TLR4-опосредованный ответ
на LPS, а также на некоторые другие агонисты Toll-подобных рецепторов. В частности,
локус на хромосоме 10 усиливал ответ на ЛПС, а также на другие TLR-лиганды. Локус на
хромосоме 13 оказывал ингибирующее действие на фенотип, заключающееся в снижении
уровня цитокинов в ответ на ЛПС и другие TLR-лиганды Перечень генов-кандидатов,
расположенных в этих локусах, не содержит ни один из известных компонентов TLRопосредованной активации, тем самым указывая на новые, ранее неизвестные функции
данных генов в реализации изучаемого признака;
2. Локус, принадлежащий хромосоме 10, стимулирует TLR-опосредованный сигналинг.
Последующий анализ генов-кандидатов позволил выявить два представителя
иммуноглобулинового семейства, а именно GP49a и LILRB4, которые дифференциально
экспрессируются в C57BL/6 и MOLF макрофагах и содержат многочисленные
полиморфные замены, в том числе преждевременный стоп-кодон в GP49A и пропущенный
экзон 5 в LILRB4 (GP49B) у MOLF мышей. Согласно предлагаемой рабочей модели ITIM
домен в цитоплазматическом «хвосте» данных белков имеет нарушенную структуру в
линии MOLF и поэтому не способен рекрутировать ингибиторную фосфатазу, что придает
иммунному ответу в MOLF мышах более выраженный про-воспалительный характер. С
использованием техники нокаута в первичных макрофагах было показано, что ген LILRB4
является геном, ответственным за повышение продукции Il-6 у мышей линии MOLF. При
этом наиболее специфичным лигандом для LILRB4 является маннан. В настоящее время
изучается механизм действия LILRB4 в передаче клеточного сигнала для активации
иммунного ответа;
3. Локус на хромосоме 13, обладающий ингибиторным эффектом на TLR-опосредованную
активацию, с высоким разрешением картируется в хромосомной области, размер которой
составляет 0.4 Mbp, и содержит один аннотированный ген и несколько неаннотированных
транскриптов в геноме MOLF, но не C57BL/6 мышей, что делает данные транскрипты
главными кандидатами на искомый ген. Согласно предлагаемой на текущий момент
модели один из этих транскриптов кодирует lncRNA (длинную некодирующую РНК) или
miRNA (микроРНК), которая подавляет один из компонентов транскрипционной активации
TLR-зависимого сигналинга, оказывая таким образом ингибиторный эффект на
воспалительный ответ в целом. Идентификация ранее неизвестной регуляторной
(ингибиторной) РНК, вовлеченной в TLR-опосредованную активацию иммунного ответа,
представляет значительную новизну. Локус на хромосоме 13 получил название Lcx (Low
CXCL1). Установлено, что Lcx оказывает влияние на транскрипцию генов Cxcl1 и Tnf, не
нарушая при этом стабильность их транскриптов. Анализ экспрессии методом глубокого
секвенирования следующего поколения и нокаут по мРНК позволили установить гены в
пределах локусе Lcx (Cntnap3 и CtsL). При помощи метода серийного ауткросса была
получена линия конгенных мышей, содержащих Lcx локус в B6 геноме. Используя
полученных конгенных мышей, показано, что локус Lcx влияет на иммунный ответ in vitro и
in vivo на бактериальные инфекции, вызванные Клебзелла и Легионелла. Данные
результаты подчеркивают физиологическую значимость Lcx в иммунном ответе на граммотрицательные инфекции;
4. В результате отдельного генетического скрининга, направленного на изучение дефекта
CpG-индуцированного ответа в MOLF макрофагах, был идентифицирован ген, отвечающий
за CpG-дефект и кодирующий MRC1 (маннозный рецептор, CD206), который, в свою
очередь, участвует в связывании (захвате) и транспортировке CpG-ODN в перитонеальных
макрофагах линии «диких» мышей MOLF/Ei. Более того, показано, что в других линиях
«диких» мышей для CpG-индуцируемой продукции цитокинов также необходим MRC1.
Таким образом, по результатам проведенных исследований были обнаружены новые
функции MRC1, а также было показано, что линии «диких» мышей представляют собой
важную и незаменимую модель для понимания естественных регуляторов воспалительного
ответа, принадлежащих системе врожденного иммунитета;
5. RIP1-киназа представляет собой центральную молекулу, участвующую в некроптозе и
высвобождении цитокинов при воспалении. Для изучения баланса между клеточной
гибелью и воспалительными реакциями проведены эксперименты по регуляции RIP1. В
качестве фенотипических моделей использованы дикие мыши, которые разошлись от
общего предка с классическими лабораторными мышами более миллиона лет назад и
поэтому обладают высоким уровнем генетического разнообразия. В первом эксперименте
MOLF макрофаги обладали высокой устойчивостью к RIP1-опосредованному некроптозу по
сравнению с C57BL/6. Другой эксперимент показывал RIP1-зависимую продукцию
цитокинов в C57BL/6 и MOLF макрофагах и значительную разницу в уровнях цитокинов в
ответ на ингибирование RIP1. Оба результата демонстрируют зависимость от киназной
активности RIP1, тем самым предполагая, что: 1 – генетическое картирование признака
может выявить мишени RIP1-киназы; 2 – ген(ы) передачи данных функций признака на
уровне RIP1 участвуют в реализации некроптоза. Также было показано, что ферментом,
непосредственно действующим на RIP1, является деубиквитиназа, CYLD. Далее будет
описан новый механизм регулирования CYLD в MOLF, который характеризуется переходом
от полноразмерного CYLD к укороченному. Также предполагается эпигенетический
механизм регуляции CYLD в качестве переключателя;
6. Проведен ряд экспериментов по изучению функционирования TNF-рецептора у пациентов
с онкопатологиями и аутоиммунными заболеваниями (на примере рака шейки матки
(РШМ), рака молочной железы (РМЖ), ревматоидного артрита (РА), системной красной
волчанки (СКВ) и хронического гломерулонефрита (ХГН)). У пациентов с аутоиммунными
патологиями (РА, СКВ и ХГН) концентрация в плазме обоих типов рецепторов TNF (р55 и
р75) значительно повышена по сравнению с контрольной группой. Наибольшее повышение
наблюдается при РА (острая фаза). Развитие онкологических заболеваний также приводит
к повышению рецепторов TNF, причем в зависимости от стадии и локализации процесса
может быть повышен либо TNFR1 (р55), либо TNFR2 (р75), либо оба рецептора. Также
была изучена частота встречаемости аллельных вариантов промоторов генов TNFR1 в
позициях -609 и -1207 и TNFR2 типа в -1709 и -3609 у больных ревматоидным артритом и
раком молочной железы. Показано, что аллельные варианты генов рецепторов TNF,
ассоциированные с повышенным или пониженным уровнем белка, являются одним из
генетических факторов, связанных с развитием ревматоидного артрита и наследственной
формы рака молочной железы. Установленный факт следует учитывать при применении
антицитокиновой терапии.
На основе полученных результатов опубликовано 10 научных статей, 5 статей
представлены в печать, опубликованы 3 монографии, 10 учебных пособий, поданы в
Роспатент 3 заявки на изобретение, представлены научные доклады на 28 международных
конференциях. Коллектив лаборатории на Международной выставке-конференции
«Биоиндустрия-2014» (15-17.10.2014, С.-Петербург) удостоен 2 золотых и 1 серебряной
медалей, на Международной выставке «Высокие технологии. Инновации. Инвестиции» (2426.03.2015, С.-Петербург) 4 серебряных медалей за практические разработки по проекту.
На базе лаборатории подготовлены 1 докторская и 1 кандидатская диссертации, 8
выпускных квалификационных работ бакалавров и магистров. Шесть сотрудников
лаборатории прошли стажировку в ведущих российских и международных научнообразовательных центрах. Лаборатория приняла участие в подготовке 7 конференций и
научных школ.