56 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ И ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ РОЛЬ СИСТЕМЫ ИММУНИТЕТА В ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ МОДИФИКАТОРОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ Н.В. Чердынцева, Н.В. Литвяков, О.В. Кокорев, А.А. Кузнецова, Е.А. Малиновская, Е.С. Смольянинов, В.А. Евтушенко Одним из современных подходов к повышению эффективности лечения злокачественных новообразований является использование биотерапевтических воздействий в сочетании с классическими методами (химио-, лучевая терапия, операционное вмешательство). Преимущество такого комплексного подхода заключается в одновременном повреждающем воздействии на опухолевые клетки и активизации защитных механизмов организма, оказывающих, в свою очередь, противоопухолевый эффект [2, 8]. В качестве наиболее перспективных биотерапевтических воздействий рассматриваются модификаторы биологических реакций (МБР) – агенты различной природы, проявляющие свой противоопухолевый эффект путем модуляции ответа организма на опухоль. В число МБР входят природные и синтетические иммуномодуляторы и адаптогены, цитокины и их индукторы, цитостатические препараты, а также физические факторы. Современные представления о механизмах канцерогенеза, взаимоотношениях опухоли и организма, о роли системы иммунитета в противоопухолевой защите, которая осуществляется в тесном взаимодействии с факторами неиммунной природы, а также данные последних лет о механизмах действия МБР различной природы позволяют утверждать, что иммунологические факторы принимают активное участие в реализации их модулирующего действия. В этой связи одним из основных направлений биотерапии является применение агентов, модулирующих активность противоопухолевого иммунитета. Целью настоящей работы было изучение противоопухолевого действия модифика- торов биологических реакций различной природы и его механизмов. Материалы и методы Экспериментальные модели. В работе использованы половозрелые мыши массой 18–20 г, разводки питомника Сибирского отделения Научноисследовательской лаборатории экспериментально-биологических моделей Томского научного центра РАМН (Томск) следующих линий: C57Bl/6 (H–2b), F1 (CBA/C57Bl/6) (H–2b/k), DBA/2j (H–2d). Карцинома легких Льюис (LLC), полученная в лаборатории опухолевых штаммов Онкологического научного центра РАМН (Москва), пассировалась методом подкожных трансплантаций на мышах C57Bl/6, опытным мышам перевивалась в область бедра п/к в концентрации 1×106 кл/мышь. Терапевтические агенты. Циклофосфан (ЦФ) вводили внутрибрюшинно в дозе 60 мг/кг на 3-и и 7-е сут после трансплантации опухоли. 5фторурацил (5-ФУ) вводили внутримышечно в дозе 25 мг/ кг через день 3 раза, начиная с 7-х сут после перевивки опухоли. Субалин – препарат на основе живых рекомбинантных бактерий, продуцирующих человеческий альфа-интерферон (любезно предоставлен его авторами из НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор», г. Бердск) – вводили перорально по 5х108 микробных клеток (2 дозы) в 0,5 мл воды ежедневно в течение 10–14 сут. Препарат саназол (АК-2123)-N-(2-метоксиэтил)-2-(3нитро-1триазолил) ацетоамид – гипоксический радиосенсибилизатор из класса нитро- 57 триазолов, синтезированный в Киотском университете (Япония), обладающий низкой токсичностью. В экспериментальных исследованиях на мышах саназол использовали в дозе 1 мг/кг внутрибрюшинно в течение 7–12 дней. Низкоэнергетическое лазерное излучение генерировалось лазерной установкой на парах меди "Малахит" с частотой импульсов 15–22 кГц. В составе лазерного луча присутствуют две спектральные линии – зеленая (510,6 нм) и желтая (578,2 нм). Лазерное облучение в дозе 30 Дж/см2 на область опухоли (длительность экспозиции 1 мин) проводили ежедневно в течение 5 дней. Методы оценки терапевтической эффективности. Оценку противоопухолевой и антиметастатической активности исследуемых агентов проводили в соответствии с принятыми в экспериментальной онкологии методами [6]. Определяли торможение роста опухоли (%), индекс ингибиции метастазирования (ИИМ,%) и процент торможения роста метастазов (ТРМ), характеризующий уменьшение суммарной площади метастатических колоний в легких. Методы оценки функциональной активности клеток иммунной системы. Активность макрофагов оценивали по их антипролиферативному действию на клетки-мишени мастоцитомы Р-815 (пассировалась в асцитной форме на мышах DBA) и LLC (пассировалась в асцитной форме на мышах C57Bl/6) в цитостатическом тесте, а также по цитолитическому действию на клетки-мишени LLC. Подсчитывали цитостатический индекс (ИЦС, %) и цитотоксический индекс (ИЦТ, %) [1]. Естественную киллерную активность лимфоцитов крови оценивали в мембранотоксическом тесте по отношению к клеткам-мишеням человеческого эритромиелолейкоза К-562 [7]. Пролиферативную активность лимфоцитов оценивали в реакции бласттрансформации по включению 3Нтимидина в ДНК клеток при добавлении в культуральную среду Т-клеточного митогена ФГА в оптимальной концентрации 10 мкг/мл (“Serva”, Германия) и без него (спонтанная пролиферация). Результаты обработаны статистически, достоверность различий между выборками определяли с помощью непараметрического критерия Вилкоксона–Манна–Уитни. Результаты и обсуждение Мы показали, что интраперитонеальное введение ультранизких доз саназола сочетанно с цитостатической терапией циклофосфаном в дозе 60 мг/кг привело к двукратному усилению ингибиции роста первичной опухоли и практически полной отмене метастазирования у мышей с LLC (табл. 1). Существенное увеличение торможения роста опухоли и ингибиции метастазирования при сочетанной терапии циклофосфаном и субалином свидетельствует о потенцирующем действии пробиотика на антибластомную активность циклофосфана. Как и в случае применения саназола, более выраженный ингибирующий эффект субалина и его сочетания с цитостатиком отмечен в отношении метастазов, но не первичного опухолевого узла. Умеренная противоопухолевая и антиметастатическая активность саназола и субалина выявлена также на модели меланомы В-16 у мышей C57Bl/6 (данные не представлены). Несмотря на низкий индекс ингибиции метастазирования при использовании субалина в моноварианте, обращает на себя внимание значительное торможение роста метастатических колоний (уменьшение их суммарной площади) в легких при применении субалина не только в сочетании с цитостатической терапией, но и в самостоятельном варианте (табл.1). Терапия карциномы легких Льюис 5-ФУ в комбинации с излучением лазера на парах меди привела к достоверному усилению противоопухолевого и антиметастатического эффекта. Лазерное излучение также ингибировало рост и метастазирование опухоли, при этом антиметастатическое действие было более выражено, чем влияние на первичный опухолевый узел (табл.1). Т а б л и ц а 1 Влияние цитостатиков в комбинации с модификаторами биологических реакций на рост и метастазирование карциномы легких Льюис у мышей C57Bl/6 Группа Контроль ЦФ ЦФ+саназол ЦФ+субалин 5-ФУ 5-ФУ+НЛИ Саназол Субалин НЛИ Доза – 60 мг/кг 60+1,0 мг/кг 60+2,0 дозы 25 мг/кг 25мг/кг+30Дж/см2 1,0 мг/кг 2 дозы 30Дж/см2 ТРО, ИИМ, ТРМ, % % % – – –` 40 70 80,5 66 * 100 * н/о 79* 98,8* 98,5* 63 40 н/о 80* 77* н/о 0 72 н/о 37** 5 41** 37** 51** н/о П р и м е ч а н и е. ЦФ – циклофосфан; 5-ФУ – 5фторурацил; ТРО – торможение роста опухоли; ИИМ – индекс ингибиции метастазирования; ТРМ – торможение роста метастазов; в каждой группе от 8 до 10 животных; н/о – не определяли; * – различия достоверны по сравнению с группой ЦФ или 5-ФУ; ** – различия достоверны по сравнению с контрольной группой. 58 В связи с отмеченным существенным антиметастатическим эффектом саназола, субалина и излучения лазера на парах меди представляется очевидным предположение о важной роли в его реализации эффекторных клеток иммунной системы – прежде всего ЕКК, макрофагов, цитотоксических Т-лимфоцитов, поскольку известно, что эти клетки наиболее эффективно реализуют свое противоопухолевое действие в отношении небольшого числа опухолевых клеток, что имеет место при формировании метастатических колоний [12]. При оценке естественной киллерной активности спленоцитов выявлено достоверное ее усиление у мышей, получавших циклофосфан в сочетании с саназолом, общая литическая активность селезенки также возрастала, наряду со способностью спленоцитов оказывать цитостатическое действие на опухолевые клетки-мишени (табл.2). Т а б л и ц а 2 Естественная киллерная активность и цитостатическая активность спленоцитов у мышей линии С57Вl/6 с карциномой легких Льюис, леченных циклофосфаном и саназолом (X ± m) Группа животных Количество спленоцитов, млн ИМТ,% ЕКА спленоцитов в пересчете на селезенку, ЛЕ Индекс цитостазиса спленоцитов, % LLC (1) LLC+ЦФ (2) LLC+ЦФ+ саназол (3) 147,0±21,0 121,0±14,0* 141,0±11,0 62 1500±83 60* 1215±146* 70 1786±194 62,8±6,4* 81,4±2,1 * 91,2±1,9 П р и м е ч а н и е. ЕКА – естественная киллерная активность; ИМТ – индекс мембранотоксичности; ЛЕ – литические единицы; * – различия достоверны по сравнению с группой 3 (в каждой группе по 6–8 животных). Эти результаты согласуются с опубликованными нами ранее данными о способности саназола модулировать противоопухолевую активность макрофагов и лимфоцитов у мышей C57Bl/6 с меланомой В-16, причем отмечалась положительная корреляция между активностью эффекторных клеток и ингибирующим действием препарата на рост и метастазирование опухоли при разных схемах его введения [15]. Саназол проявляет иммуномодулирующее действие и при введении безопухолевым мышам [14]. При сочетанной терапии мышей с LLC циклофосфаном и субалином мы отметили существенное уменьшение ростстимулирующей активности макрофагов по отношению к опухолевым клеткам по сравнению с их высокой фидерной активностью у мышей, леченных циклофосфаном. Введение субалина мышам с карциномой легких Льюис, не подвергавшимся дополнительным терапевтическим воздействиям, приводило к значительному увеличению мембранотоксической активности ЕКК и тотальной литической активности селезенки, а также существенно усиливало цитотоксическое и антипролиферативное действие макрофагов на клетки LLC (рис. 1). Обратимый ингибитор функциональной активности макрофагов каррагенан при введении in vivo уменьшал или отменял их активацию под влиянием субалина. Введение каррагенана мышам с LLC, леченным субалином, существенно снижало антиметастатическую активность последнего: отмечено повышение интенсивности метастазирования и более чем двукратное увеличение суммарной площади легочных метастазов по сравнению с мышами, получавшими только субалин [5]. Эти данные свидетельствуют о том, что макрофаги являются одной из первоочередных мишеней действия субалина. При использовании "бестимусных" мышей nude также показана необходимость полноценного Т-клеточного звена для реализации его антибластомного эффекта [11]. Возрастание литического потенциала селезенки под влиянием субалина и саназола связано с повышением функциональной активности ЕК клеток, увеличением скорости созревания предшественников и ускорением рециклинга (скорости их восстановления). Основным фактором, регулирующим эти процессы, является интерферон, стимулирующее влияние на продукцию которого в организме оказывают оба препарата [12]. Определенное значение в повышении литического потенциала селезенки имеют миграционнопролиферативные процессы, так как отмечено увеличение ее клеточности субалином и саназолом. Согласно представленным выше данным и результатам исследований, проведенных ранее, триггерным фактором иммуномодулирующей активности субалина является продуцируемый им в кишечнике альфа-интерферон, ключевая роль которого в активации неспецифических факторов иммунитета и специфической реакции на антиген на местном уровне (в слизистой кишечника, в частности) и системно (кровь, селезенка) экспериментально доказана [17]. 59 450 450 400 400 350 % от контроля 300 250 203 202 200 165 150 124 100 50 0 ИМТ ЛЕ Кл е тки ИЦ С LLC ИЦ Т LLC ИЦ С Р 815 Рис. 1. Влияние субалина на активность ЕК клеток селезенки и перитонеальных макрофагов у мышей F1(CBAxC57Bl/6) с карциномой легких Льюис: ИМТ – индекс мембранотоксичности спленоцитов по отношению к клеткам К-562; ЛЕ – литическая активность селезенки, литические единицы; ИЦТ LLC – индекс цитотоксичности перитонеальных макрофагов по отношению к клеткам карциномы легких Льюис; ИЦС LLC – индекс цитостазиса перитонеальных макрофагов по отношению к клеткам карциномы легких Льюис; ИЦС Р-815 – индекс цитостазиса перитонеальных макрофагов по отношению к клеткам мастоцитомы Р-815; клетки – количество спленоцитов. По оси ординат – прирост (%) по сравнению с контролем (мыши – опухоленосители, не получавшие субалин) Повышение противоопухолевого эффекта цитостатика при включении в схему лечения излучения лазера на парах меди сочетается с восстановлением либо усилением функциональной активности эффекторных клеток иммунной системы, это справедливо в отношении как неспецифических эффекторных механизмов (ЕКК, цитостатические лимфоциты), так и процессов, лежащих в основе формирования специфического иммунного ответа (активация пролиферативного ответа лимфоцитов на Т- и В-клеточные митогены) (рис. 2). При исследовании противоопухолевой активности НЛИ было выявлено, что излучение лазера на парах меди при достаточно высокой мощности дозы (30 Дж/см2) индуцирует некробиотические и дистрофические процессы в ткани опухоли на фоне своеобразной воспалительной реакции, по-видимому опосредующей его противоопухолевое действие. Кроме этого, модулирующее действие НЛИ на иммунологические факторы может быть реализовано путем регуляции активности компонентов антиоксидантной системы. В частности, отмеченное нами повышение активности су- пероксиддисмутазы в крови, с одной стороны, способствует восстановлению иммунокомпетентности; ее снижение в опухоли, с другой стороны, приводит к повышению чувствительности опухолевых клеток к эндогенным и экзогенным свободнорадикальным повреждающим воздействиям [10]. В реализацию противоопухолевого действия НЛИ могут вносить вклад различные механизмы, связанные как с прямым повреждением опухолевых клеток (термический, фотодинамический эффекты), так и с активацией эндогенных факторов, приводящих к стимуляции важнейших гомеостатических систем организма, обеспечивающих интегральный терапевтический эффект [4]. Общепринятая в настоящее время точка зрения о триггерном механизме действия НЛИ, независимо от длины волны и, соответственно, первичной точки приложения (первичного фотоакцептора), вызывающем системный ответ на уровне целостного организма, дает основания считать очевидным вовлечение иммунологических механизмов в реализацию его противоопухолевой активности. Известно, что клетки иммунной систе- 60 * о ФГА 6 Индекс стимуляции ЛПС 5 4 3 2 1 0 Контроль НЛИ 5-ФУ 5ФУ+НЛИ Рис. 2. Изменение пролиферативного ответа спленоцитов на ФГА и ЛПС у мышей с карциномой легких Льюис, леченных 5-фторурацилом и излучением лазера на парах меди: • – различия достоверны по сравнению с группой 5-ФУ; о – различия достоверны по сравнению с контрольной группой мы являются одной из непосредственных точек приложения действия НЛИ, которое способно изменять экспрессию их мембранных рецепторов, функциональную активность, пролиферативный потенциал, стимулировать продукцию цитокинов, а также действовать через модуляцию компонентов антиоксидантной системы организма [3]. Установлено, что модификация активности естественных киллеров различными агентами может быть одним из механизмов их антиметастатического действия [14]. Цитостатическая активность иммунокомпетентных клеток также может выступать важным фактором, воздействующим на процесс метастазирования, что подтверждается экспериментальными результатами ряда авторов как в отношении макрофагов, так и спленоцитов [18]. Полученные нами данные указывают на то, что модуляция активности спленоцитов и макрофагов под действием использованных МБР может играть важную роль в усилении терапевтической эффективности цитостатиков. Важное значение в реализации модулирующего действия МБР имеет многокомпонентность ответной реакции и тесное взаимодействие иммунной системы с факторами неиммунной природы. В совокупности это обеспечивает, с одной стороны, изменения опухолевых клеток, приводящие к реверсии трансформированного фенотипа, индукции их дифференцировки и созрева- ния, снижению метастатического потенциала, устранению резистентности к цитостатическим воздействиям; с другой – усиление или восстановление эффекторных противоопухолевых реакций хозяина и селективную супрессию или устранение компонентов, способствующих опухолевому росту. ЛИТЕРАТУРА 1. Богдашин И.В. Цитостатическое действие клеток иммунной системы на опухолевые клетки // БЭБиМ. 1986. №6. С. 744–746. 2. Зуева Е.П., Амосова Е.Н., Гольдберг Е.О. и др. Препараты из растений Сибири и Дальнего Востока, повышающие эффективность существующих методов лечения опухоли // Материалы 6-го Национального конгресса "Человек и лекарство". М., 1998. С. 359. 3. Головизнин М.В. Лазерная иммунокоррекция. Подходы, проблемы, перспективы // Лазеры в медицине и биологии. 1995. № 2–3. С. 22–27. 4. Каплан М.А. Лазерная терапия – механизмы действия и возможности // Laser and health: Abstracts of the International Congress. Cyprus, 1997. L06. 5. Литвяков Н.В., Чердынцева Н.В., Белявская В.А., Малиновская Е.А., Ильиных И.С., Смольянинов Е.С. Роль макрофагов в реализации антибластомного действия рекомбинантного пробиотика субалина // Вопросы онкологии. (В печати). 6. Методические рекомендации по доклиническому изучению средств, обладающих способностью ингибировать процесс метастазирования и повышать эффективность цитостатической терапии злокачественных опухолей / Под ред. Е.Д.Гольдберга, А.Б.Сыркина. М., 1992. 7. Рыкова М.П., Спиранде И.В., Зедгенидзе М.С. Новая чувствительная техника тестирования активности нормальных киллеров // Иммунология. 1981. № 3. С. 88–90. 61 8. Хансон К.П., Афанасьев Б.В., Берштейн Л.М. и др. Современные тенденции в развитии биологической терапии злокачественных опухолей // Вопросы онкологии. 1996. Т.42, №5. С. 7–13. 9. Чекнев С.Б. Дифференцировка естественных киллеров с позиции органоспецифической регуляции // Иммунология. 1998. №5. С. 22–31. 10. Чердынцева Н.В., Кузнецова А.А., Кондакова И.В., Евтушенко В.А. Модуляция цитостатического действия 5фторурацила и активности антиоксидантных ферментов излучением лазера на парах меди со злокачественными опухолями. // Оптика атмосферы и океана. 1998. Т.11, № 2–3. С. 246–250. 11. Чердынцева Н.В., Литвяков Н.В., Смольянинов Е.С., Белявская В.А. Влияние рекомбинантного пробиотика субалина на функциональную активность иммунокомпетентных клеток // БЭБиМ. 1999. Т. 127. Прил. 1. С. 67–70. 12. Чердынцева Н.В. Иммунологические механизмы противоопухолевого действия модификаторов биологических реакций различной природы: Автореф. ... докт. биол. наук. Иркутск, 1999. 45 с. 13. Fogler M.E., Volker K., McCormic K.L. NK-cell infiltration into lung and subcutaneous B-16 melanoma is mediated dy VCAM-1/VLA-4 interaction // J.Immunol. 1996. Vol.156, №12. P. 4707–4014. 14. Marcovic S.N., Murashko D.M. Role of natural killer and T-cells in interferon induced inhibition of spontaneous metastases of the B16F10l murine melanoma // Cancer Res. 1991. Vol. 51, №4. P. 1124–1128. 15. Tcherdyntseva N., Kokorev O., Kagiya T.Activation of immunocompetent cells by ultra low dose administration of radiosensitiser AK-2123 in healhty mice // Sensitization Newsletter. 1997. Vol. 4, № 2, С. 6–9. 16. Tcherdyntseva N., Kokorev O., Konovalova N., Kagiya T. Effect of radiosensitizer AK-2123 on the activity of natural killer cells and macrophages in B-16 melanoma bearing mice // Sensitization Newsletter. 1998. Vol. 5, № 1. P. 2–6. 17. Tompkins W. A. Immunomodulation and therapeutic effects of the oral use of interferon-alpha: mechanism of action // J.Interfer.Cytokin Research. 1999. Vol.19. P. 817–828. 18. Wallace P.K., Morahan P.S. Role of macrophages in the immunotherapy of Lewis lung peritoneal carcinomatosis // J. Leukoc. Biol. 1994. Vol. 56, №1. P. 41–51.