Новые высокочувствительные и специфические экспресс

Новые высокочувствительные и специфические экспресс-тесты для
определения антител к протеиназе-3, миелопероксидазе и базальной
мембране клубочков почек
Обоснование: васкулит возникает в результате воспаления стенок кровеносных сосудов и имеет
разные клинические проявления, одной из наиболее распространенных причин которых является васкулит малых сосудов, связанный с антинейтрофильными цитоплазматическими антителами
(АНЦА). АНЦА-ассоциированный васкулит включает в себя микроскопичекий полиангиит, гранулематоз Вегенера, синдром Черджа-Стросс и лекарственный васкулит. Даже при малейшем подозрении на почечный васкулит, который имеет место примерно в 80% всех случаев гранулематоза Вегенера, настоятельно рекомендуется провести чувствительное и специфическое определение антител
к протеиназе-3 (Pr3) и/или миелопероксидазе (MPO). Антитела к базальной мембране клубочков
(GBM), также известные как антитела Гудпасчера, высоко специфичны для нефрита с антителами к
базальной мембране клубочков. Примерно в 75% всех случаев эти аутоантитела связаны с синдромом Гудпасчера, который характеризуется гломерулонефритом и легочным кровотечением.
Только быстрое и адекватное лечение может позволить избежать развития почечной недостаточности. Для этой цели мы разработали два высокочувствительных и специфических 15-минутных иммунохроматографических экспресс-теста (латеральный проточный иммуноанализ) (рис.1) для определения антител к протеиназе-3 (Pr3), миелопероксидазе (MPO) и специфических антител класса IgG к
базальной мембране клубочков (GBM) с целью сокращения периода времени от начала диагностики
до лечения пациента. Более того, данные тесты делают индивидуальную диагностику одного пациента экономичной.
а
Жидкофазный антигенлиганд (Pr3 или MPO)
Образец (sIgG)
Золотой конъюгат
Анти-IgG
Комплекс
Антиген-Лиганд,
sIgG и Конъюгат
Иммобилизованное
антитело к лиганду (тестполоска)
Избыточный Конъюгат
связывается антителами
к конъюгату
Иммобилизованное
антитело к конъюгату
(контрольная полоска)
б
Рис. 1 Основа экспресс-теста для диагностики аутоиммунных заболеваний (AI-LFA) путем определения
Pr3/MPO/GBM (a) и кассета для экспресс-теста для диагностики аутоиммунных заболеваний (AI-LFA) (б)
Новые иммунохроматографические экспресс-тесты для диагностики аутоиммунных заболеваний
(AI-LFA) основаны на использовании жидкофазных аллергенов в максимально нативной форме,
благодаря чему обеспечивается наивысшая чувствительность и специфичность.
Методы: Все образцы пациентов (n=20 Pr3; n=24 MPO, n=7 GBM) были протестированы и найдены положительными при анализе методом иммунофлюоресцентного анализа, а также с применением двух коммерческих наборов для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) (фирмы
«Orgentec» и фирмы «Binding Site»). Контрольные образцы (n=44 Pr3; n=45 MPO, n=32 GBM), то есть
образцы, полученные у здоровых доноров, и образцы с аутоиммунными заболеваниями, были протестированы на предмет Pr3, MPO и GBM методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA)
(«Orgentec»). Все образцы были подвергнуты анализу с использованием иммунохроматографических
экспресс-тестов для диагностики аутоиммунных заболеваний (AI-LFA) и считывающей системы для
латерального поточного иммуноанализа. Статистический анализ проводили с помощью программы
«Analyse-it» для Microsoft-Excel.
Полученные данные и результаты: Все образцы пациентов, положительные в отношении Pr3, MPO
и GBM, также были диагностированы как положительные по результатам иммунохроматографических экспресс-тестов AI-LFA. 20 из 20 были диагностированы как положительные в отношении Pr3,
22 из 22 – как положительные в отношении MPO и 7 из 7 – как положительные в отношении GBM.
Из панели контролей 43 из 43 образцов (пороговое значение 280000 условных единиц (у.е.)), 44
из 45 (пороговое значение 500000 у.е.) и 32 из 32 (пороговое значение 200000 у.е.) были диагностированы как отрицательные в отношении Pr3, MPO и GBM по результатам иммунохроматографических экспресс-тестов AI-LFA. Это соответствует технической чувствительности и специфичности, составляющей 100%/98% для протеиназы-3 (Pr3), 100%/98% для миелопероксидазы (MPO)
и 100%/100% для базальной мембраны клубочков (GBM). Анализ ROC-кривой (график зависимости чувствительности от частоты ложноположительных заключений) при сравнении с результатами
твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) показал следующие значения AUC (площадь
под кривой): 1,0 для Pr3 в экспресс-тестах AI-LFA и для MPO в экспресс-тестах AI-LFA, соответственно, а также AUC = 1,0, для GBM (Рис. 2). Установлено, что линейность при разведении составляла
R2=0,94 для Pr3 и R2=0,93 для MPO. Данные не представлены. Коэффициент корреляции Пирсона
при сравнении данных иммунохроматографических экспресс-тестов AI-LFA и данных твердофазного
иммуноферментного анализа (ELISA) составил 0,89 для Pr3, 0,88 для MPO и 0,89 для GBM (Рис.3).
0,9
n
64
<Фактор>
Положит.
Отриц.
Преобладание
n
20
44
0,688
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
Тест Площадь
<Переменная>
1,00
0,2
0,1
0
0
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
1
Частота определения ложно-положительных
результатов (1-Специфичность)
б
с
ROC-кривая AI-LFA, миелопероксидаза
1
0,9
n
67
0,8
<Фактор>
Положит.
Отриц.
Преобладание
0,7
0,6
0,5
0,4
n
22
45
0,672
0,3
Тест Площадь
<Переменная>
1,00
0,2
0,1
0
0
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
1
Частота определения ложно-положительных
результатов (1-Специфичность)
Частота определения истинно-положительных
результатов (Чувствительность)
ROC-кривая AI-LFA, протеиназа-3
1
Частота определения истинно-положительных
результатов (Чувствительность)
Частота определения истинно-положительных
результатов (Чувствительность)
a
ROC-кривая AI-LFA, базальная мембрана клубочков
1
n
39
<Фактор>
Отриц.
Положит.
Преобладание
n
32
7
0,179
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
Тест Площадь
AI-LFA GBM
(у.е.)
1,00
0,2
0,1
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Частота определения ложно-положительных
результатов (1-Специфичность)
Рис. 2 Анализ кривой-ROC: протеиназа-3 (a), миелопероксидаза, экспресс-тест AI-LFA (б) и базальная
мембрана клубочков, экспресс-тест AI-LFA (c)
a
б
Протеиназа-3 AI-LFA (у.е.)
5,0E+06
2,5E+06
4,0E+06
2,0E+06
n
r статистика
95% ДИ
t статистика
степень свободы (DF)
2-стороннее значение p
3,0E+06
2,0E+06
1,0E+06
0,0E+00
0
50
100
150
64
0,89
от 0,83 до 0,93
15,43
62
<0.0001
200
Протеиназа-3, твердофазный ИФА (ELISA) (Е/мл)
с
Базальная мембрана клубочков AI-LFA (у.е.)
1,8E+06
1,5E+06
n
r статистика
95% ДИ
t статистика
степень свободы (DF)
2-стороннее значение p
1,5E+06
1,0E+06
5,0E+05
0,0E+00
Миелопероксидаза AI-LFA (у.е.)
67
0,88
от 0,81 до 0,92
14,91
65
<0.0001
1,2E+06
n
r статистика
95% ДИ
t статистика
Степень свободы (DF)
2-стороннее значение p
9,0E+05
6,0E+05
39
0,89
от 0,80 до 0,94
12,08
37
<0.0001
3,0E+05
0
20
40
60
80
100
Миелопероксидаза, твердофазный ИФА (ELISA) (Е/мл)
0,0E+00
0
50
100
150
200
Базальная мембрана клубочков, твердофазный ИФА (ELISA) (Е/мл)
Рис. 3 Корреляция Пирсона: протеиназа-3 (a), миелопероксидаза (б) и базальная мембрана клубочков (c)
– экспресс-тест AI-LFA и твердофазный ИФА (ELISA)
Заключение: Новые иммунохроматографические экспресс-тесты AI-LFA для определения протеиназы-3/миелопероксидазы/базальной мембраны клубочков (Pr3/MPO/GBM) за 15 мин. дают результаты, аналогичные результатам, полученным с помощью определения АНЦА методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) третьего поколения и иммунофлюоресцентным методом
(IFA), не требуя дорогого лабораторного оборудования. Иммунохроматографические экспресс-тесты
AI-LFA сокращают период времени от первоначальной диагностики до адекватного лечения, и делают индивидуальную диагностику одного пациента экономичной.