На правах рукописи ЕЛИСЕЕВА ДАРЬЯ ДМИТРИЕВНА

Реклама
На правах рукописи
ЕЛИСЕЕВА ДАРЬЯ ДМИТРИЕВНА
КРИТЕРИИ АКТИВНОСТИ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ПРИ
РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ИССЛЕДОВАНИЯ
РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-КЛЕТОК
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Специальность: 14.01.11 – Нервные болезни
14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология
Москва 2011
Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук
Научном центре неврологии РАМН
НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:
доктор медицинских наук, профессор
Завалишин Игорь Алексеевич;
доктор медицинских наук, профессор
Быковская Светлана Нюневна
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
доктор медицинских наук, профессор
Бойко Алексей Николаевич;
доктор медицинских наук, профессор
Пинегин Борис Владимирович
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ГОУ ВПО «Московский государственный медикостоматологический университет» Министерства здравоохранения и социального
развития РФ
Защита диссертации состоится « »
2011 года в
часов на
заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 001.006.01
при Учреждении Российской академии медицинских наук Научном центре
неврологии РАМН по адресу: 125367, Москва, Волоколамское шоссе, 80.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НЦН РАМН
по адресу: 125367, Москва, Волоколамское шоссе, 80.
Автореферат разослан «
»
2011 года
Ученый секретарь
Совета по защите докторских
и кандидатских диссертаций Д 001.006.01,
кандидат медицинских наук
Е.В. Гнедовская
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Рассеянный
склероз
(РС)
–
распространенное
аутоиммунное
демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС), которое
поражает в основном лиц молодого возраста и почти неизбежно приводит на
определенной стадии своего развития к инвалидизации [Compston A., Coles A.,
2002].
В основе патогенеза РС лежит аутоиммунный процесс, который выражается
в
активации,
дифференцировке
специфические
рецепторы
аутореактивных
Т-клеток,
к
и
пролиферации
компонентам
индуцирующих
Т-клеток,
в
имеющих
миелина,
т.е.
образовании
развитие
демиелинизирующего
процесса. Причем, ведущая роль в развитии иммунопатологического процесса при
РС принадлежит популяции CD4+ Т-клеток. Считается, что CD4+ Т-лимфоциты
первыми встречаются с антигеном и приобретают свойства эффекторных миелинспецифических клеток [Delgado S., Sheremata W.A., 2006; Hemmеr В. et al., 2002].
Активация Т-клеток происходит при взаимодействии соответствующего
рецептора Т-лимфоцита и аутоантигена, связанного с молекулами главного
комплекса гистосовместимости II класса, который экспрессируется на антигенпрезентирующих (АПК) клетках, после чего происходит пролиферация и
дифференцировка
аутореактивных
В
Т-клеток.
результате
Т-лимфоциты
приобретают аутоагрессивные свойства. На следующем этапе происходит
проникновение активированных Т-лимфоцитов через гематоэнцефалический
барьер (ГЭБ) в ЦНС и их взаимодействие с антигенами собственного миелина, в
результате
развивается
воспалительный
процесс,
который
приводит
к
повреждению миелина головного и спинного мозга.
По современным представлениям, развитие аутоиммунных заболеваний
связано
не
только
с
дифференцировкой,
пролиферацией
и
активацией
эффекторных Т-клеток, но и с нарушением супрессорных механизмов, которые
контролируют толерантность Т- и В-лимфоцитов к аутоантигенам [Mills K.H. et al.,
2004].
Ключевую роль в механизмах иммуносупрессии играют регуляторные Тклетки с фенотипом CD4+CD25+Foxp3+ (Т рег). Т рег в норме составляют 3-5 % от
3
общего числа CD4+ T-клеток в периферической крови и лимфоидных тканях. Т рег
созревают в тимусе и на 3-4 день неонатального развития расселяются в кровь и
периферические лимфоидные органы [Sakaguchi S. et al., 1995].
У
больных
аутоиммунными
заболеваниями
выявлено
значительное
снижение количества и нарушение функции Т рег. Так, дефект Т рег показан у
больных системной красной волчанкой [Lyssik E.Y. et al., 2007], сахарным
диабетом 1 типа [Dejaco C. et al., 2006], псориазом [Sugiyama H. et al., 2005],
ревматоидным артритом [Pohlers D. et al., 2007].
Проведенные в настоящее время исследования показали, что имеется
возможность увеличить количество Т рег, выделенных из крови пациента,
культивированием их в условиях ex vivo [Selvaraj R.K., Geiger T.L., 2008; Allan S.E.
et al., 2008]. При этом, полученные культивированием Т рег высоко стабильны,
долго
живущие,
обладают
супреcсорными
свойствами,
неспецифичны
и
неиммуногенны и введение этих клеток пациенту с целью восстановления Т рег в
крови больного до уровня нормы может стать инструментом коррекции иммунных
нарушений при аутоиммунных заболеваниях [Peters J.H. et al., 2008; Thornton A.M.
el., 2010].
Проведены
пилотные
испытания
по
введению
аутологичных
культивированных Т рег больным системной красной волчанкой [Lyssik E. Y. et al.,
2007], диабетом 1-го типа [Godebu E., Summers-Torres D. et al., 2008], пациентам с
реакции трансплантант-против хозяина после трансплантации гемопоэтических
стволовых клеток [Корсунский И.А. и соавт., 2008; Riley J.L. et al., 2009]. При этом,
получено достоверное увеличение количества Т рег в периферической крови этих
больных, которое коррелировало с улучшением клинических показателей и не
вызывало побочных реакций у больных.
В последнее время появились работы, посвящённые изучению роли Т рег в
патогенезе рассеянного склероза [Haas J. et al., 2005, 2007; Venken K. et al., 2007,
2008, 2010; Feger U. С. et al., 2007].
Установлено, что Т рег играют определенную роль в нарушении
регуляторных механизмов в аутоиммунитете, приводящих к развитию и
прогрессированию РС. В то же время, результаты исследований количества и
функциональной активности при РС отличаются значительной разноречивостью,
4
что обусловлено недостаточностью сопоставлений количества и функциональной
активности Т рег с клинической картиной заболевания. Помимо этого, в настоящее
время имеются лишь единичные описания результатов культивирования Т рег
больных РС, а попыток использования Т рег в терапевтических целях при этом
заболевании не проводилось.
В связи с вышеизложенным были сформулированы цели и задачи
исследования.
Цели и задачи исследования
Целью настоящего исследования является изучение роли регуляторных Т-клеток
CD4+CD25+Foxp3+ в патогенезе рассеянного склероза.
Задачи исследования:
1. Исследовать состояние клеточного иммунитета больных ремитирующим РС
путем изучения содержания основных субпопуляций лимфоцитов (фенотипы
CD3+, CD4+, CD8+, CD16+56+, CD19+) на различных этапах заболевания.
2. Изучить количество регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ в крови больных
РС в зависимости от стадии заболевания (обострение, ремиссия), длительности
и тяжести его течения.
3. Изучить функциональную активность Т рег у больных РС в стадии обострения
и ремиссии.
4. Провести культивирование аутологичных Т рег, выделенных из крови больных
РС, с целью получения линий этих клеток (индукция Т рег ex vivo) и сравнить
их фенотипические и функциональные характеристики с нативными Т рег.
5. Выполнить
введение
выращенных
ex
vivo
регуляторных
Т-клеток
CD4+CD25+Foxp3+ для коррекции иммунных нарушений у больных РС, от
которых эти клетки были получены.
Научная новизна. Впервые исследовано количество и функциональная активность
регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ в крови больных РС в зависимости от
стадии заболевания. При этом, установлены значимые корреляции стадии
демиелинизирующего процесса с количеством Т рег. Проведено культивирование
аутологичных Т рег путем их индукции ex vivo и доказана идентичность
культивированных и нативных клеток. Впервые выполнено введение выращенных
ex vivo аутологичных регуляторных Т-клеток с целью коррекции иммунных
5
нарушений у больных РС. Выявлено, что введение таких аутологичных клеток
больным приводит к увеличению содержания Т рег в крови и хорошо переносится
пациентами, и может в дальнейшем рассматриваться как новый подход к терапии
этого заболевания.
Практическая и теоретическая значимость работы. На основании проведенного
исследования расширены представления о взаимосвязи количественного и
функционального дефекта регуляторных Т-клеток в механизмах формирования
иммунопатологического процесса при РС, что имеет значение для понимания роли
регуляторных
механизмов
в
патогенезе
этого
заболевания.
Результаты
проведенного исследования имеют важное практическое значение в плане
диагностического показателя наступающего обострения РС при снижении
количества Т рег и формирования ремиссии заболевания при повышении числа
этих
клеток
в
крови
больных.
Выявлено,
что
регуляторные
Т-клетки
CD4+CD25+Foxp3+ можно выделить из периферической крови больного и
вырастить в лабораторных условиях достаточное количество клеток, которое
может компенсировать их дефицит в организме и соответственно применяться для
коррекции иммунных нарушений при РС.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Иммунофенотипическое исследование крови больных РС выявило дисбаланс
CD4+ и CD8+ Т-клеток за счет повышения количества СD8+ Т-клеток.
2. Выявлено снижение количества Т рег в крови больных РС в целом по группе.
Установлено, что в стадии обострения РС количество Т рег значительно
снижено, а переход в стадию ремиссии заболевания характеризуется ростом их
числа.
3. Отмечено снижение функциональной активности Т рег, выделенных из
периферической крови больных РС, как в стадии обострения, так и в стадии
ремиссии заболевания.
4. Установлена обратная зависимость между количеством Т рег и степенью
инвалидизации и длительностью РС, что является отражением степени
активности иммунопатологического процесса.
5. В результате культивирования аутологичных Т рег больных количество этих
клеток увеличивается в десятки раз. При этом, культивированные Т рег по
6
фенотипическим и функциональным характеристикам идентичны нативным.
Введение выращенных ex vivo аутологичных Т рег больным РС позволяет
повысить уровень Т рег в крови больных и не вызывает побочных эффектов.
Апробация работы. Работа апробирована и рекомендована к защите на
совместном
заседании
сотрудников
I,
II,
III,
V,
VI
неврологических,
нейрореанимационного и научно-консультативного отделений, отделения лучевой
диагностики, лабораторий нейрохимии, гемореологии и гемостаза, эпидемиологии
и профилактики заболеваний нервной системы, клинической нейрофизиологии и
патоморфологии Научного центра неврологии РАМН 06 апреля 2011 г.
Материалы диссертации были представлены и обсуждены на: заседании
XVII Всероссийской конференции «Нейроиммунология. Рассеянный склероз»
(Санкт-Петербург, 2009 г.), IX Международном конгрессе «Новые направления
иммуносупрессии и иммунотерапии” (Женева, 2010 г.), Совете молодых ученых
НЦН РАМН (Москва, 2011 г.), V Сибирской межрегиональной научнопрактической конференции «Рассеянный склероз: 30 лет спустя» (Новосибирск
2011 г.), V Международной конференции по иммунологической регуляции (Давос,
2011 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 5
в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем
и
структура
Работа
диссертации.
изложена
на
120
страницах
машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики
пациентов и методов исследования, главы, посвященной результатам, обсуждения
полученных
результатов,
выводов
и
практических
рекомендаций.
Работа
иллюстрирована 20 рисунками и 10 таблицами. Библиографический указатель
включает в себя 199 источников, из них 11 отечественных и 188 зарубежных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Общая характеристика больных
В настоящей работе представлены результаты клинико-иммунологического
исследования, в том числе, определение количества регуляторных Т-клеток
CD4+CD25+Foxp3+ (Т рег), у 50 больных с достоверным диагнозом РС. 19
пациентов из этой группы изучены в динамике, как в стадии обострения, так и в
стадии ремиссии. 10 больным РС проведено исследование функциональной
7
активности Т рег в смешанной культуре лимфоцитов. Выращено 5 клеточных
линий CD4+ Т-клеток 5 больных РС и 3 здоровых доноров для индукции ex vivo
(культивирования)
регуляторных
Т-клеток
CD4+CD25+Foxp3+.
Проведено
подкожное введение выращенных ex vivo (культивированных) Т рег 5 больным РС.
Клиническое обследование больных проводилось в 6-ом неврологическом
отделении НЦН РАМН, руководитель отделения – профессор И.А. Завалишин.
У больных была детально изучена клиническая картина заболевания с
использованием данных анамнеза, неврологического и соматического статуса,
проведена магнитно-резонансная томография (МРТ) головного и/или спинного
мозга. Все 50 пациентов, включенных в исследование, имели достоверный диагноз
ремитирующего РС, согласно диагностическим критериям Poser С.М. (1998г) и
McDonald W.I. (2005г.). Группа пациентов состояла из больных РС: в стадии
ремиссии – 31 человек, в стадии обострения – 19 человек. Среди обследованных
лиц преобладали женщины в соотношении 1:2,3. Возраст больных варьировал от 19
до 56 лет. Тяжесть неврологического дефицита оценивалась с использованием
расширенной шкалы инвалидизации EDSS (The Expanded Disability Status Scale),
которая у больных в стадии обострения РС находилась в пределах от 1,0 до 5,0, в
стадии ремиссии РС от 1,0 до 2,5 баллов. У 19 больных в стадии обострения
болезни, были взяты образцы крови в динамике, т.е. как в стадии обострения, так и
в стадии ремиссии заболевания. Этим больным, до забора крови для определения
иммунофенотипического состава крови, проведены неврологический осмотр, при
котором
выявлено
нарастание
или
появление
новой
неврологической
симптоматики и МРТ головного и/или спинного мозга, позволяющая выявить
активные очаги демиелинизации. После выявления обострения процесса больным
проводилась пульс-терапия метилпреднизолоном (суммарная доза 3000 - 5000 мг).
Повторное взятие крови осуществлялось спустя не менее 4-х недель после
окончания гормональной терапии. У пациентов, изученных в динамике в стадии
обострения и в стадии ремиссии, средний возраст составил 34,9±9,76 лет (25-56),
балл по шкале EDSS находился в пределах от 1,5 - 5,0, в стадии ремиссии степень
выраженности неврологического дефицита у этих больных составила 1,55±0,57
[1,0;3,0] баллов.
8
У всех 50 больных была проведена оценка периода от момента постановки
диагноза РС до начала исследования. В целом по группе длительность РС
варьировала от 3 до 207 месяцев. Выделено 2 группы больных по длительности
течения РС. Первую группу составили 28 больных, страдающих РС менее 36
месяцев, вторую – 22 больных, страдающих РС более 36 месяцев. При этом,
средняя длительность заболевания в первой и второй группах была равна 15,29
±11,12 (3-35) и 110,5±51,17 (44-208) месяцев, соответственно.
В качестве контрольной группы исследован иммунофенотип крови 21
здорового донора, соответствующих больным по возрастному и половому составу.
Среди здоровых лиц, преобладали женщины 1:1,63. Возраст доноров находился в
пределах от 19 до 57 лет.
Определение функциональной активности Т рег проведено 10 больным РС,
из них 7 пациентам в стадии обострения и 3 – в стадии ремиссии. Среди них 7
женщин и 3 мужчин. Возраст этих больных РС варьировал от 24 до 39 лет.
Группа больных РС, у которых были взяты образцы крови для
культивирования аутологичных Т рег и последующего их подкожного введения
состояла из 5 человек. Данная группа больных состояла из 4 женщин и 1 мужчины,
возраст пациентов составил от 26 до 37 лет, средний балл по шкале EDSS был
равен 2,9 [2,5±3,0].
Протоколы
диссертационного
исследования
«Критерии
активности
патологического процесса при рассеянном склерозе по результатам исследования
регуляторных Т-клеток» и клинического исследования «Иммунокоррегирующая
терапия ремитирующего рассеянного склероза путем введения выращенных ex vivo
аутологичных
регуляторных
Т-клеток
CD4+CD25+Foxр3+»
были
одобрены
Локальным Этическим Комитетом НЦН РАМН. Протокол №9/08 от 25 июня 2008
года. Все пациенты дали согласие на участие в исследовании, подписав
информированное согласие.
Методы исследований
Исследование
иммунофенотипического
состава
крови,
в
том
числе
определение количества регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ больных РС и
здоровых доноров, проводилось с использованием метода проточной цитометрии
9
на базе лаборатории клинической и экспериментальной нейрохимии НЦН РАМН,
руководитель – профессор А.А. Болдырев.
Все измерения проводились на проточном цитометре FACS Calibur(tm) (BD
Biosciences). Для оценки количества клеток CD3+, CD8+, CD4+, CD4+CD25+, CD19+,
CD16+CD56+ в мононуклеарной фракции, клеточную суспензию окрашивали
соотвествующими антителами. Оценка экспрессии поверхностных маркеров
проводилась в соответствии с протоколом, разработанным производителем набора
антител BD Multitest IMK Kit(tm) (BD Biosciences, США). Процентное содержание
позитивных по специфическим маркерам клеток подсчитывалось при помощи
программного обеспечения MACSQuantify(tm) (Miltenyi Biotec GmbH, Германия).
Выделение регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxр3+ из периферической крови
больных рассеянным склерозом осуществлялось инкубацией CD4+CD25+ Т-клеток
с
PE-мечеными анти-человеческими антителами к FoxP3, клон PCH101
(eBioscience, США).
Определение функциональной активности и культивирование регуляторных Тклеток CD4+CD25+Foxp3+ проводилось на базе Отдела клеточных технологий и
регенеративной медицины ГОУ ВПО РГМУ, руководитель отдела – профессор
С.Н. Быковская.
Данный метод включал забор 40 мл периферической крови у испытуемого,
выделение субпопуляций регуляторных и эффекторных Т-лимфоцитов и АПК
донора,
окраску
эффекторных
Т-лимфоцитов
витальным
красителем
карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловым эфиром (Carboxyfluorescein succinimidyl
ester – CFSE) и пролиферацию в смешанной культуре лимфоцитов (mixed
lymphocyte reaction – MLR), которая оценивается по редукции внутриклеточного
красителя CFSE методом проточной цитометрии.
Для культивирования Т рег применяли среду RPMI-1640, содержащую
феноловый красный, L-глутамин и 25мМ HEPES (Gibco, Великобритания) c
добавлением 5-10% аутологичной сыворотки и 1% раствора пенициллинстрептомицина (Gibco, Великобритания). В культуральную среду добавляли
интерлейкин (ИЛ) - 2 (ИЛ-2, R&D Systems, Великобритания), мышиные
моноклональные антитела к человеческому рецептору CD3 (МедБиоСпектр, РФ) и
мышиные моноклональные антитела к человеческому рецептору CD28 (BD
10
Pharmingen, США). Клетки культивировали во флаконах 25 см2 или 75 см2 в CO2инкубаторе при 370С в атмосфере 5% СО2. Свежую среду и ростовые факторы
добавляли каждые 3-4 дня. Время культивирования составляло от 5-8 дней. Далее
оценивались фенотипические характеристики (экспрессии маркеров) и экспансия
(увеличение количества) Т рег после культивирования с помощью проточной
цитометрии, и изучалась супрессорная активность нативных и индуцированных ex
vivo Т рег.
На 7-12й день культивирования клетки концентрировали, подсчитывали
количество живых клеток в гемоцитометре и отмывали центрифугированием в 50
мл конических стерильных пробирках в фосфатном солевом буферном растворе
без Са2+ и Mg2+ в течение 10 мин при 300 g. Осадок разводили в 2-3 мл стерильного
физиологического раствора или 6% раствора полиглюкина и сразу набирали в
стерильный одноразовый шприц, который помещали в стерильную упаковку и в
специальный
контейнер
для
переноса
клеток,
который
незамедлительно
транспортировался в НЦН РАМН.
После доставки в 6-ое неврологическое отделение НЦН РАМН, клетки
немедленно вводили пациенту подкожно, в область передней брюшной стенки.
После введения клеток пациент находился на стационарном лечении в 6-ом
неврологическом отделении НЦН РАМН в течение 2-х недель. В течение
последующего года наблюдение за пациентами осуществлялось в амбулаторном
порядке, с явкой на осмотр 1 раз в 3 месяца.
Статистическая
обработка
полученных
результатов
осуществлялась
с
использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc., США)
для персонального компьютера. Для нормально распределенных признаков
вычислялось среднее значение и стандартное отклонение, результаты представлены
в виде m±δ. При выполнении описательной статистики для количественных
признаков,
распределение
которых
не
подчинялось
законам
нормального
распределения, вычислялись медиана и интерквартильный размах – нижний 25% и
верхний 75%-ный интервалы. Результаты представлены в виде медианы (нижний
квартиль (LQ)=; верхний квартиль (UQ)=). Сравнение двух независимых групп по
одному признаку для количественных, качественных, порядковых и номинальных
признаков проводилось с помощью критерия Манна-Уитни. Взаимосвязь двух
11
признаков анализировалась при помощи корреляционного анализа по Спирмену, с
вычислением коэффициента корреляции R. Порог статистической значимости (р)
был установлен на уровне 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что в целом по группе больных РС имело место статистически
значимое снижение уровня иммунологического регуляторного индекса (ИРИ) –
CD4+/CD8+ (р=0,04) (табл. 1).
Таблица 1
Иммунофенотип периферической крови больных РС в целом по группе больных
Больные РС I
n=50
70,95 ± 8,19
[52,20;88,70]
+
CD8
25,75 ± 7,83
[11,09;51,25]
+
CD4
42,18 ± 9,42
[19,70;64,06]
+
+
CD4 /CD8
1,83 ± 0,88
[0,40;5,78]
+
CD19
9,83 ± 3,94
[2,60;19,78]
+
+
CD16 CD56
17,01 ± 7,53
[3,20;34,90]
«*»- статистически значимые отклонения
Количество (n)
CD3+
Доноры II
n=21
72,52 ± 7,79
[(61,30;84,30]
22,70 ± 4,77
[14,50;28,88]
46,67 ± 7,15
[34,94;55,01]
2,18 ± 0,72
[1,29;3,66]
11,89 ± 6,72
[5,41;29,13]
13,72 ± 5,84
[6,24;25,00]
р I-II
0,58
0,19
0,07
0,04*
0,48
0,15
При динамическом исследовании иммунофенотипа крови 19 больных РС в
стадии обострения и ремиссии выявлено достоверное повышение количества CD8+
Т-клеток (р=0,007) по сравнению с количеством этих клеток в стадии ремиссии,
что обусловило снижение ИРИ (р=0,04) у этой группы пациентов. Ремиссия же PC
ассоциировалась со снижением числа эффекторных Т-лимфоцитов (CD4+, CD8+),
причем, в большей степени CD8+ Т-клеток. Кроме того, иммунограмма больных PC
в стадии ремиссии характеризовалась достоверным снижением содержания Влимфоцитов (р=0,009) (табл. 2).
Таблица 2
Иммунофенотип периферической крови больных РС, обследованных в динамике
Количество (n)
Обострение РС I
n=19
Ремиссия РСII
n=19
Доноры
n=21
р I-II
12
CD3+
70,84 ± 8,33
69,36 ± 8,92
[55,80;82,90]
[48,10;81,80]
+
CD8
26,59 ± 4,62
21,83 ± 5,31
[20,60;36,20]
[13,67;33,70]
+
CD4
42,58 ± 8,61
39,98 ± 8,90
[30,23;59,12]
[21,30;54,70]
+
+
CD4 /CD8
1,61 ± 0,43
1,86 ± 0,36
[1,20;2,80]
[1,30;2,80]
+
CD19
11,76 ± 3,79
8,37 ± 4,29
[4,80;19,30]
[3,45;16,50]
+
+
CD16 CD56
19,07 ± 7,32
16,92 ± 11,87
[8,50;34,90]
[3,20;37,67]
«*»- статистически значимые отклонения
72,52 ± 7,79
[(61,30;84,30]
22,70 ± 4,77
[14,50;28,88]
46,67 ± 7,15
[34,94;55,01]
2,18 ± 0,72
[1,29;3,66]
11,89 ± 6,72
[5,41;29,13]
13,72 ± 5,84
[6,24;25,00]
0,67
0,007*
0,43
0,02*
0,009*
0,22
Таким образом, в исследовании выявлено, что процентное содержание Тлимфоцитов,
экспрессирующих
CD4+
и
СD8+
маркеры
и
обладающих
эффекторными свойствами, и, соответственно, способностью атаковать миелин в
целом по группе больных РС не отклонялось от нормальных показателей. Однако,
имело место снижение показателя ИРИ, который отражает соотношение популяций
этих Т-клеток. Снижение ИРИ у больных РС может быть обусловлено дисбалансом
этих клеток вследствие несущественного уменьшения процентного содержания
CD4+ Т-клеток и увеличения числа CD8+ Т-клеток. При обострении РС отмечалось
преобладание CD8+ Т-клеток и еще в большей степени снижался показатель ИРИ.
В стадии ремиссии РС наблюдалось уменьшение количества Т-лимфоцитов,
экспрессирующих CD4+ и CD8+, причем, в большей степени последних, что
приводило к нормализации ИРИ.
Следующим этапом нашей работы явилась идентификация субпопуляции
регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+, характерными маркёрами которых,
являются постоянная экспрессия на мембране клетки альфа-цепи рецептора ИЛ-2
(IL2R) CD25+ высокой афинности и экспрессия продукта гена Foxp3, который
кодирует дифференцировку и функциональную активность этих клеток [Nakamura
K., Kitani A., Strober W., 2001].
В результате исследования установлено, что содержание Т рег в
периферической крови больных РС в целом по группе составило 1,38±0,86%
[0,19;4,40], у доноров – 3,56±1,53% [1,86;6,07], что указывает на достоверно
значимое снижение количества Т рег у больных (р=0,0001).
При сравнении содержания Т рег в периферической крови больных РС в
стадии ремиссии (1,37±0,90% [0,2;4,4]) и в стадии обострения (0,88±0,45%
13
[0,19;1,90]) заболевания наблюдалось достоверное отличие числа этих клеток
(р=0,03) (рис. 1).
Рис. 1. Увеличение содержания регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ в крови
больных РС в стадии ремиссии
Таким образом, по нашим данным, в крови больных РС выявлено
достоверное снижение количества Т рег независимо от стадии заболевания.
Однако, обращает на себя внимание, что в большей степени содержание Т рег
снижено при обострении аутоиммунного процесса. Аналогичные данные получены
в работах других авторов [Haas J. et al., 2007; Venken K. et al., 2007, 2008, 2010;
Jean M. Fletcher et al., 2009]. Причиной данного обстоятельства может быть
увеличенная продукция провоспалительных цитокинов активированными CD4+ Тклетками, которые угнетают как образование Т рег на периферии, так и
повреждают уже существующие клетки. Помимо этого, может наблюдаться
цитотоксическое действие CD8+ Т-клеток. Venken K. с соавт. (2008) связывают
наличие малого числа Т рег в крови больных РС со снижением уровня экспрессии
гена Foxp3 на периферических Т рег, в результате чего нарушается образование
этих клеток, а Т рег, циркулирующие в крови, подвергаются повреждающему
действию эффекторных клеток.
При динамическом анализе периферической крови 19 больных в стадии
обострения и в стадии ремиссии РС получено достоверное повышение количества
14
Т рег с 0,88±0,45% [0,19;1,90] до 2,57±1,52% [0,63;5,50] (р=0,00003), которое не
достигало уровня здоровых лиц (3,56 ± 1,53% [1,86;6,07]) (р=0,04).
Таким образом, установлено, что при переходе заболевания в фазу ремиссии
отмечается увеличение числа Т рег в крови больных РС. Такие результаты
получены впервые, т.к. ранее не проводилось подобных исследований у одних и
тех
же
больных
РС
в
динамике.
Следует
отметить,
что
некоторыми
исследователями продемонстрирован дефицит Т рег в крови больных в стадии
обострения [Viglietta V. et al., 2004; Venken K. et al., 2007, 2008], причем, основной
причиной низкого количества Т рег в обострении РС, по их мнению, является
миграция этих клеток с периферии в участки демиелинизации, что объясняется
выявлением количественного преобладания Т рег в ЦСЖ больных, особенно в
период обострения процесса [Venken K. et al., 2008; Feger U. et al., 2007; Haas J et
al., 2005]. Увеличение количества Т рег в крови больных РС в стадии ремиссии
заболевания может быть связано с тем, что в дополнение к натуральным Т рег,
образующимся в тимусе, прибавляются индуцированные на периферии Т рег. Эти
клетки образуются из CD4+ Т-клеток, примированных антигеном. Необходимым
условием
для
появления
индуцированных
Т
рег
является
присутствие
трансформирующего фактора ростаβ (Transforming growth factor beta – TGFβ). При
этом индуцированные Т рег обладают таким же фенотипом и функциями как и
натуральные.
В процессе сопоставления выраженности неврологического дефицита,
который в группе больных РС в целом составил 2,84±1,26 [1,0-5,5] баллов со
средним содержанием Т рег (1,38±0,86% [0,19;4,40]) в периферической крови этих
пациентов, выявляется обратная корреляция (r=-0,7175), т.е., чем больше выражена
интенсивность
неврологических
симптомов,
которая
является
отражением
активности иммунопатологического процесса, тем меньшее количество Т рег
определяется в крови больных (рис. 2).
15
Correlation: r = -,7175
5,0
4,5
3,5
3,0
+
+
CD4 CD25 Foxp3
+
4,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
1
2
3
4
5
EDSS
6
95% confidence
Рис. 2. Обратная корреляция между степенью инвалидизации (баллы) по
шкале EDSS и количеством Т рег в периферической крови больных РС
В группе больных РС, обследованных в динамике, получено подтверждение
этих результатов. Так, при обострении РС балл инвалидизации по шкале EDSS
составил 3,08±1,12 [1,5;5,0], при этом количество Т рег было равно 0,88±0,45
[0,19;1,90], в стадии же ремиссии содержание Т рег возросло до 2,57±1,52
[0,63;5,50]%
и,
соответственно,
уменьшилась
степень
выраженности
неврологического дефицита (1,55±0,57 [1,0;3,0] балла).
Выявленная в работе корреляционная зависимость между степенью
неврологического дефицита и количеством Т рег в крови больных РС, вероятно,
вторичная,
нарушений.
т.к.
является
Иными
проявлением
словами,
активности
иммунопатологических
распространенность
демиелинизирующего
повреждения в ЦНС зависит от пролиферативной и функциональной активности
миелин-специфических Т-клеток. Соответственно, более агрессивное течение
аутоиммунного процесса опосредует вовлечение большего объема белого вещества
головного и/или спинного мозга, что в большинстве случаев отражается в
клинической картине заболевания. У больных РС, обследованных в динамике и
получавших гормональную терапию, мы получили ту же взаимосвязь. Стадия
обострения характеризуется появлением новой или усугублением имеющейся
неврологической
симптоматики,
что,
как
мы
показали,
ассоциируется
с
дисбалансом аутоагрессивных CD4+ и CD8+ Т-клеток, вследствие дефицита
16
CD4+
активированных
Т-клеток,
экспрессирующих
CD25+,
и
активной
пролиферацией цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ), в результате чего, вероятно,
происходит угнетение циркулирующих в крови Т рег. В стадии ремиссии
происходит
снижение
степени
тяжести
клинических
проявлений,
что
ассоциируется с увеличением Т-клеток, секретирующих провоспалительные
цитокины, и стимуляцией образования Т рег.
Средняя длительность заболевания в группе больных РС составила
57,58±58,68 [3;207] месяцев. При анализе количества Т рег в крови пациентов РС в
зависимости от длительности заболевания получена обратная корреляционная
зависимость (r=-0,6891), т.е. у длительно болеющих пациентов в периферической
крови содержится меньшее число Т рег (рис. 3).
Correlation: r = -,6891
5,0
4,5
3,5
3,0
+
+
CD4 CD25 Foxp3
+
4,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
-20
0
20
40
60
80
100
120
длительность РС
140
160
180
200
220
95% confidence
Рис. 3. Обратная корреляция между количеством регуляторных Т-клеток
CD4+CD25+Foxp3+ в периферической крови больных и длительностью РС
Для уточнения этого результата, мы разделили больных РС на 2 группы: у
лиц, болеющих меньше 36 (15,11±11,20 [3;35]) месяцев количество Т рег составило
1,94±0,75% [0,6;4,4], в то время как в группе пациентов, болеющих более 36
(106,83±51,73 [44;207]) месяцев – 0,72±0,37% [0,19;1,8]. Получена статистически
достоверная разница в содержании Т рег между этими группами больных
(р=0,0001).
17
Таким образом, установлено, что содержание Т рег в крови больных РС
обратно пропорционально длительности заболевания, что, вероятно, связано с
истощением
регуляторных
механизмов
при
длительно
существующем
аутоиммунном процессе. Эти данные подчеркивают влияние повторяющихся
эпизодов активации аутореактивных клеток на иммунорегуляторное звено
иммунитета.
Помимо уменьшения количества Т рег в крови, также важную роль в
развитии
иммунопатологического
процесса
при
РС
играют
нарушения
функциональной (супрессорной) активность этих клеток, т.е. способность Т рег
подавлять пролиферацию эффекторных CD4+ Т-клеток.
Нами исследована супрессорная активность Т рег, выделенныех из
периферической крови 7 больных РС в стадии обострения, 3 больных – в стадии
ремиссии и 5 здоровых доноров.
Установлено, достоверное снижение функциональной активности Т рег у
больных РС как в стадии обострения (55,94±7,76% [48,90;69,60]) (р=0,004), так и в
стадии ремиссии (65,20±4,92% [59,70;69,20]) (р=0,02) по сравнению с группой
здоровых доноров (86,92±4,41% [79,7;91,2]). Статистически значимого отличия
супрессорной активности Т рег на разных стадиях аутоиммунного процесса при РС
не получено (р=0,14).
Для определения супрессорного влияния Т рег на эффекторные клетки
рассчитывают
индекс
пролиферации
(ИП),
который
представляет
собой
способность CD4+ Т-клеток пролиферировать в отсутствии и в присутствии Т рег.
Так, при определении ИП CD4+ Т-клеток в отсутствии Т рег, статистически
достоверные отличия наблюдались между группой доноров и больными РС как в
стадии обострения (р=0,004), так и больными в стадии ремиссии (р=0,025). При
сравнении значения ИП CD4+ Т-клеток на разных стадиях заболевания отмечалось
статистически значимое его повышение у больных РС в стадии обострения
(р=0,03).
При инкубации СD4+ Т-клеток с Т рег получены достоверные различия
между группой доноров и группой больных как в стадии обострения (р=0,004),
так и в стадии ремиссии (р=0,025) (табл. 3).
18
Таблица 3
Индекс пролиферации CD4+ Т-лимфоцитов и CD4+ Т-лимфоцитов,
инкубированных с Т рег.
Пролиферативный
Обострение РС Ремиссия
индекс
(1)
(2)
1,74±0,10
1,56±0,05
0,82±0,14
*р1-2=0,03
[1,59;1,91]
[1,52;1,61]
[0,61;0,96]
*р1-3=0,004
CD4
+
РС Доноры (3)
р
*р2-3=0,025
CD4+/Т рег
0,75±0,10
0,77±0,08
0,16±0,04
р1-2=0,23
[0,61;0,89]
[0,69;0,85]
[0,1;0,21]
*р1-3=0,004
*р2-3=0,025
«*» - статистически значимые отклонения
Таким образом, установлено, что способность к пролиферации CD4+ Тлимфоцитов значительно выше у больных РС, причем, в большей степени в стадии
обострения заболевания. При инкубации CD4+ Т-клеток с Т рег наблюдалось
подавление активности эффекторных Т-лимфоцитов, за счет проявления Т рег
супрессорных свойств. Однако, у больных РС эта способность значительно
снижена по сравнению с донорами и не зависит от стадии заболевания.
В настоящее время установлена возможность выделения и индукции ex vivo
больших количеств Т рег [Hoffmann P. et al., 2004; Battaglia M. et al., 2006; Lyssik
E. Y. et al., 2007; Godebu E., Summers-Torres D. et al., 2008; Thornton A.M. et al.,
2010].
Считается, что полученные ex vivo (культивированные) Т рег высоко
стабильны, долго живущие, обладают супрессорными свойствами, неспецифичны и
неиммуногенны. Эти клетки можно размножить без потери функции и ввести в
периферические участки тела с уверенностью, что они будут мигрировать в
анатомический очаг воспаления [Allan S.E. et al., 2008]. В нашем исследовании
индукция ex vivo Т рег осуществлялась культивированием выделенных из
суспензии мононуклеарных клеток (МНК) CD4+ Т-лимфоцитов в течение 6 - 7 дней
с помощью их стимуляции анти-CD3 и анти-CD28 в присутствии АПК и ИЛ-2. Мы
располагали клеточными линиями CD4+ T-клеток 5 больных РС и 3 здоровых
доноров.
19
В результате культивирования CD4+ Т-клеток больных и доноров получено
увеличение количества регуляторных Т-клеток с фенотипом CD4+CD25+Foxp3+ в
десятки раз (табл. 4).
Таблица 4
Количество CD4+CD25+Foxp3+ Т-клеток до и после культивирования у больных РС
(А) и здоровых доноров (Б)
А.)
Количество клеток
%
CD4+CD25+Foxp3+
До
культивирования
1,10±0,48
[0,60;1,80]
Больные РС
После
культивирования
89,12±0,93
[87,9; 90,3]
1
Увеличение в n раз
95,08±41,80
[49,22;149,5]
Б.)
Количество клеток
%
CD4+CD25+Foxp3+
1
Доноры
До
культивирования
3,05±0,65
[2,50;3,77]
1
После
культивирования
89,23±0,85
[88,40;90,10]
Увеличение в n раз
30,03±5,92
[23,66;35,36]
кратность увеличения количества клеток после культивирования в течение 7 дней
С целью изучения супрессорной активности Т рег после экспансии, мы
сравнили способность культивированных и нативных Т рег ингибировать
пролиферацию клеток-мишений (CD4+) в смешанной культуре лимфоцитов.
Установлено, что у больных РС супрессорная активность нативных
(53,04±4,03% [48,2;56,8]) и культивированных Т рег (55,04±4,66% [50,20;60,10])
достоверно не отличалась (р=0,94).
Таким образом, установлено, что выращенные ex vivo регуляторные Тклетки
CD4+CD25+Foxр3+
по
фенотипическим
и
функциональным
характеристикам полностью идентичны нативным Т рег, выделенным из
периферической крови больного, и их количество после экспансии возрастает
в десятки раз
На основании, полученных нами результатов, мы предположили, что
введение аутологичных (собственных) регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+
больным РС с целью восстановления количества этих клеток до уровня нормы
может использоваться в качестве коррекции иммунных нарушений при этом
заболевании.
20
Нами однократно проведено введение культивированных аутологичных
регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ пяти больным РС.
После введения выращенных ex vivo аутологичных регуляторных Т-клеток
CD4+CD25+Foxр3+ у всех больных РС через 2 недели выявлено увеличение
содержание этих клеток в периферической крови в среднем с 0,6±0,14% [0,4;0,8] до
1,4±0,44% [1,1;1,9], (p=0,009) (табл. 5).
Таблица 5
Увеличение количества Т рег в периферической крови больных РС через 2 недели
после введения выращенных ex vivo Т рег
Больные РС
Кол-во Т рег
до введения , %
Кол-во Т рег введенных
больным, х106
Кол-во Т рег после
трансплантации, %
М.
Т.
З.
Ч.
П.
0,7
0,7
0,4
0,4
0,8
355
400
273
250
312
1,1
1,5
1,1
1,4
1,9
Таким образом, в результате пилотного исследования получено достоверное
увеличение содержания Т рег в крови больных РС после подкожного введения
культивированных аутологичных Т рег, что свидетельствует о возможности
миграции этих клеток в кровь. Причем, у пациентов не наблюдалось никаких
побочных реакций в ответ на инъекцию выращенных ex vivo Т рег, как в первые
дни, так и в течение последующих 12 месяцев наблюдения, что указывает на
безопасность и потенциальную возможность применения культивированных
аутологичных Т рег в клинике для коррекции иммунных нарушений у больных РС.
Выводы:
1. Исследование иммунофенотипического состава крови больных РС выявило
разнонаправленные изменения содержания CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, что
является
отражением
активности
аутоиммунного
процесса
при
этом
заболевании.
2. Установлено снижение количества регуляторных Т-клеток с фенотипическими
характеристиками CD4+CD25+Foxp3+ в крови больных РС в целом по группе.
21
3. Выявлено, что больший количественный дефект Т рег имеет место у больных в
стадии обострения РС, а при переходе в стадию
ремиссии
число Т рег
возрастает.
4. Получено снижение супрессорной активности Т рег больных РС как в стадии
обострения, так и в стадии ремиссии заболевания.
5.
Установлена обратная зависимость между количеством Т рег в периферической
крови больных и длительностью РС, а также между количеством Т рег и
тяжестью течения РС, что отражает степень активности аутоиммунного
процесса.
6.
Показано увеличение количества Т рег в 30-90 раз с помощью их индукции ex
vivo.
Причем,
культивированные
Т
рег
имеют
фенотипические
и
функциональные характеристики нативных Т рег.
7. В результате введения выращенных ex vivo аутологичных Т рег больным РС
наблюдается повышение уровня Т рег в крови пациентов, при этом в течение 12месячного периода наблюдения за больными после инъекции Т рег не
зарегистрировано побочных эффектов.
Практические рекомендации:
1. Снижение количества Т рег можно использовать как диагностический критерий
активности
наступающего
обострения,
а
повышение
их
количества
рассматривать как прогностический тест формирования ремиссии
2.
Т рег клетки CD4+CD25+Foxp3+ можно выделить из периферической крови
больного и вырастить в лабораторных условиях такое количество клеток,
которое потенциально может компенсировать их дефицит в организме и,
соответственно, использоваться с терапевтической целью
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Елисеева Д.Д., Быковская С.Н., Завалишин И.А. Регуляторные Т-клетки
CD4+CD25+FoxP3+ при рассеянном склерозе // Нейроиммунология. – 2009. –
Т. 7. – № 1. – С. 35 – 36.
2. Завалишин И.А., Елисеева Д.Д. Патогенетическая терапия рассеянного
склероза // Лечащий врач. – 2009. – №9. – С. 43 – 46.
22
3. Елисеева Д.Д., Быковская С.Н., Завалишин И.А. Роль регуляторных Тклеток в патогенезе рассеянного склероза // Журн Медицина критических
состояний. – 2010. – № 5. – С. 18 – 23.
4. Елисеева Д.Д., Завалишин И.А., Быковская
Карандашов
Е.Н.,
Трунова
О.А.
С.Н., Федорова Т.Н.,
Регуляторные
Т-клетки
CD4+CD25+Foxр3+ у больных ремитирующим рассеянным склерозом //
Анналы клин. и эксперим. неврологии. – 2011. – Т. 5. – № 2. С. 9 – 13.
5. Завалишин И.А., Переседова А.В., Стойда Н.И., Алексеева Н.С., Гулевская
Т.С., Гурьянова О.Е., Арзуманян Н.Ш., Елисеева Д.Д., Трифонова О.В.,
Брюхов В.В. Вопросы диагностики и лечения рассеянного склероза // Журн
неврол. и психиатрии им. С.С.Корсакова. – 2011. – Т. 111. – № 6. – С. 88 – 95.
6. Завалишин И.А., Елисеева Д.Д. Лечение рассеянного склероза // Доктор.Ру. –
2009. – № 4. – С. 25 – 29.
7. D. Eliseeva, I. Zavalishin, E. Lyssuk, E. Karandashev, S. Bykovskaia. Pathological
impairments of regulatory T cells CD4+CD25+Foxp3 in multiple sclerosis and
injections of expanded ex vivo autologous T regs // Materials of 9th International
Conference on New Trends in Immunosuppression and Immunotherapy, Geneva,
Switzerland. – 2010. – P. 37.
8. Елисеева Д.Д., Быковская С.Н., Завалишин И.А. Регуляторные Т-клетки
CD4+CD25+Foxp3+ при ремитирующем рассеянном склерозе // Материалы V
Сибирской межрегиональной научно-практической конференции «Рассеянный
склероз: 30 лет спустя». Новосибирск. – 2011. – С. 53-58.
9. Eliseeva D., Lyssuk Е., Karandashov E., Zavalishin I., Bykovskaia S., Karaulov A.
Expanded ex vivo regulatory T cells CD4+CD25+FOXP3+ (Tregs) can restore immune
regulation in patients with remitting-relapsing multiple sclerosis (RR-MS) // Final
Programme and Abstracts. V World Immune Regulation Meeting. Davos, Switzerland.
– 2011. P.67.
23
Условные сокращения:
АПК - антиген-презентирующие клетки
ИЛ - интерлейкин
ИП - индекс пролиферации
ИРИ - иммунологический регуляторный индекс
МНК - мононуклеарные клетки
МРТ - магнитно-резонансная томография
РС - рассеянный склероз
Т рег - регуляторные Т- клетки CD4+CD25+Foxp3+
ЦНС - центральная нервная система
ЦТЛ - цитотоксические лимфоциты
CFSE - сarboxyfluorescein succinimidyl ester (карбоксифлуоресцеин
сукцинимидиловый эфир)
EDSS - the Expanded Disability Status Scale (расширенная шкала инвалидизации)
MLR - mixed lymphocyte reaction (смешанная культура лимфоцитов)
TGFβ - transforming growth factor beta (трансформирующий фактора ростаβ)
24
Скачать