ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИКО-
advertisement
1 ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИКОСТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ им. А.И. ЕВДОКИМОВА» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ На правах рукописи Чаусова Светлана Витальевна Особенности оксидантной активности фагоцитов периферической крови больных с непереносимостью нестероидных противовоспалительных препаратов и обоснование патогенетической терапии непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов 14.03.03 – Патологическая физиология 14.03.06 – Фармакология, клиническая фармакология Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научные консультанты: д.м.н., профессор Малышев И.Ю. д.м.н., профессор Гуревич К.Г. Москва 2016 2 Содержание ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………… 8 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………..21 1.1. Нестероидные противовоспалительные препараты: классификация, механизм действия………………………………………………………21 1.2. Влияние нестероидных продукцию противовоспалительных активных форм кислорода препаратов и на азота фагоцитами……………………………………………………………….25 1.3. Влияние нестероидных противовоспалительных препаратов на выработку цитокинов……………………………………………………29 1.4. Непереносимость нестероидных противовоспалительных препаратов………………………………………………………………..30 1.4.1. Клинико-эпидемиологические аспекты непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов………………….30 1.4.2. Патогенез непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов…………………………………………………………………35 1.4.2.1. Роль цитокинов в патогенезе непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов…………………………………………...39 1.4.2.2. Роль медиаторов в патогенезе непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов…………………………………………..42 1.4.2.3. Роль оксида азота в патогенезе непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов…………………………………………..53 1.4.2.4. Роль фагоцитов в патогенезе непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов…………………………………………..55 3 1.4.2.5. Иммунологическая характеристика пациентов с непереносимостью нестероидных противовоспалительных препаратов…………………………..57 1.5. Влияние биологически активных веществ на клеточную хемилюминесценцию……………………………………………………………61 1.5.1. Влияние цитокинов на продукцию активных форм кислорода и азота фагоцитами………………………………………………………………………61 1.5.2. Влияние медиаторов на хемилюминесценцию фагоцитов……………..67 1.6. Современные методы диагностики непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов…………………………………………..73 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ…………………………………………..78 2.1. Использованные реактивы…………………………………………………78 2.2. Использованные материалы……………………………………………….79 2.3. Использованные методы……………………………………………………82 2.3.1. Метод подсчета полиморфно-ядерных лейкоцитов цельной крови в камере Горяева…….…………………………………………………………….82 2.3.2. Метод определения жизнеспособности полиморфно-ядерных лейкоцитов………………………………………………………………………82 2.3.3. Выделение суспензии лейкоцитов……………………………………….83 2.3.4. Выделение суспензии полиморфно-ядерных лейкоцитов………..........83 2.3.5. Метод измерения люминол-зависимой хемилюминесценции цельной крови и клеточной суспензии…………………………………………………..84 2.3.6. Метод измерения люцигенин-зависимой хемилюминесценции цельной крови и клеточной суспензии…………………………………………………..90 4 2.3.7. Инкубация образцов крови и клеточной суспензии с исследуемыми препаратами……………………………………………………………………...91 2.3.8. Метод культивирования суспензии лейкоцитов………………………..93 2.3.9. Метод определения содержания метаболитов оксида азота в культуральной среде…………………………………………………………….94 2.3.10. Подготовка образцов плазмы для определения концентрации цитокинов………………………………………………………………………...94 2.3.11. Метод иммуноферментного анализа…………………………………...95 2.3.12. Методы статистической обработки результатов……………………...96 СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ…………………………………………........97 Глава 3. Оценка оксидантной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов у больных с непереносимостью нестероидных противовоспалительных препаратов разных клинических групп………………………………………...97 3.1. Определение суммарной продукции активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью нестероидных противовоспалительных препаратов разных клинических групп……………………………………………………...98 3.2. Определение продукции супероксидного анион радикала полиморфноядерными лейкоцитами непереносимостью у здоровых нестероидных доноров и пациентов противовоспалительных с препаратов разных клинических групп………………………………………………….....100 3.3. Определение продукции активных форм кислорода полиморфноядерными лейкоцитами непереносимостью у здоровых нестероидных доноров и противовоспалительных пациентов с препаратов, проявляющейся реакциями со стороны органов дыхания (бронхоспазм, 5 ринит), после предстимуляции комплексом антигенов Staphylococcus aureus……………………………………………………………………………101 3.4. Исследование воздействия нестероидных противовоспалительных препаратов на стимулированную сульфатом бария люминол-зависимую хемилюминесценцию периферической крови у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью данных препаратов………………………..113 3.5. Исследование воздействия нестероидных противовоспалительных препаратов на стимулированную сульфатом бария люцигенин-зависимую хемилюминесценцию периферической крови у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью данных препаратов……………………….120 3.6. Исследование воздействия стимулированную пищевого сульфатом красителя бария хемилюминесценцию периферической тартразина на люминол-зависимую крови у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью нестероидных противовоспалительных препаратов в сочетании с непереносимостью тартразина………………….126 3.7. Исследование воздействия стимулированную пищевого сульфатом красителя бария хемилюминесценцию периферической тартразина на люцигенин-зависимую крови у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью нестероидных противовоспалительных препаратов в сочетании с непереносимостью тартразина…………………..129 Глава 4. Определение роли плазменных факторов в развитии феномена ингибирования стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой хемилюминесценции крови под противовоспалительных препаратов, влиянием тартразина у нестероидных больных с их непереносимостью……………………………………………………………...132 6 4.1. Определение светосумм люминол- и люцигенин-зависимой хемилюминесценции суспензии полиморфно-ядерных лейкоцитов после прединкубации с нестероидными противовоспалительными препаратами у здоровых доноров и больных с их непереносимостью……………………..132 4.2. Определение светосумм люминол- и люцигенин-зависимой хемилюминесценции суспензии полиморфно-ядерных лейкоцитов после прединкубации с пищевым красителем тартразином у здоровых доноров и больных с непереносимостью НПВП в сочетании с непереносимостью тратразина………………………………………………………………………140 4.3. Определение светосуммы люминол-зависимой хемилюминесценции суспензии полиморфно-ядерных инкубированных с плазмой лейкоцитов крови больных здоровых с доноров, непереносимостью нестероидных противовоспалительных препаратов ………………………...143 4.4. Определение роли медиаторов (гистамина, серотонина, цистеиниловых лейкотриенов) в реализации феномена ингибирования стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой хемилюминесценции крови под влиянием нестероидных противовоспалительных препаратов, тартразина у пациентов с их непереносимостью……………………………………………145 4.5. Определение концентрации цитокинов в плазме крови здоровых доноров и больных с непереносимостью нестероидных противовоспалительных препаратов, тартразина и оценка их роли в реализации феномена ингибирования стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой хемилюминесценции крови под противовоспалительных препаратов, влиянием тартразина у нестероидных пациентов с их непереносимостью……………………………………………………………..184 7 Глава 5. Определение вклада индуцибельной NO- синтазы фагоцитов периферической крови стимулированной в развитие сульфатом хемилюминесценции крови под феномена бария ингибирования люминол-зависимой влиянием нестероидных противовоспалительных препаратов, тартразина у больных с астматической триадой………………………………………………………………………….192 Глава 6. Определение стимулированной хемилюминесценции зависимости сульфатом крови между бария под степенью угнетения люминол-зависимой влиянием нестероидных противовоспалительных препаратов, тартразина и временем, прошедшим с момента возникновения непереносимости данных псевдоаллергенов…….197 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ………………………….201 ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………………...235 ВЫВОДЫ……………………………………………………………………….246 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ……………………………………….250 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ…………………………………………………….251 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………..253 ПРИЛОЖЕНИЕ………………………………………………………………...295 8 ВВЕДЕНИЕ Актуальность и степень разработанности темы исследования В последнее страдающих время стремительно растет непереносимостью нестероидных количество больных, противовоспалительных препаратов (НПВП). Частота непереносимости НПВП при различных заболеваниях, по разным данным, колеблется: при хронической крапивнице от 23 до 28%, при полипозном риносинусите - от 14 до 23%, при бронхиальной астме - от 4,3 до 21%, при рините — около 1,5%, у практически здоровых - 0,3% [214; 294]. Клинически непереносимость чаще всего проявляется симптоматикой со стороны органов дыхания (аспириновая астма/ринит) или со стороны кожных покровов (крапивница/отек Квинке). С учетом широкого использования НПВП и роста больных с непереносимостью данной группы препаратов не теряет актуальности вопрос изучения механизмов непереносимости НПВП. В настоящее время считается, что в большинстве случаев непереносимость НПВП не является истиной аллергической реакцией [166; 241; 244]. Из неиммунологических механизмов непереносимости наибольшее значение придается способности НПВП угнетать активность циклооксигеназы (ЦОГ) и, тем самым, сдвигать баланс метаболитов арахидоновой кислоты в сторону преимущественного образования лейкотриенов (ЛТ) [139; 148; 241; 244]. Последующее усиление синтеза цистеиниловых ЛТ (цис-ЛТ) и активация воспалительных клеток провоцирует развитие клинической симптоматики. Однако с позиции циклооксигеназной концепции нельзя объяснить, почему у части пациентов с непереносимостью НПВП развиваются бронхиальные и назальные симптомы в ответ на вещества, не являющиеся ингибиторами ЦОГ, в частности, на консервант бензоат натрия, сульфит-содержащие медикаменты, сукцинат натрия, входящий в состав многих препаратов. 9 Кроме того, известно, что интал (стабилизатор мембран базофилов и тучных клеток) может блокировать развитие негативных реакций на ацетилсалициловую кислоту (АСК), хотя и не влияет на метаболизм арахидоновой кислоты [67]. В исследованиях последних лет появились данные об участии тромбоцитов, лимфоцитов, тучных клеток, базофилов, полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПМЛ), эозинофилов в патогенезе непереносимости НПВП [107; 136; 168; 232; 241; 244]. Однако результаты исследований у разных авторов противоречивы, объясняют лишь отдельные звенья патогенеза непереносимости НПВП и не раскрывают путей поиска патогенетической терапии непереносимости НПВП. Таким образом, проблема изучения механизмов непереносимости НПВП и поиска методов ее коррекции остается открытой. Многочисленными исследованиями установлено, что ПМЛ участвуют в патогенезе аллергических процессов в качестве клеток-эффекторов. При этом отмечается количественное изменение этих клеток в тканях, изменение их функциональной активности (хемотаксис, способность поглощать и переваривать бактерии, способность продуцировать активные формы кислорода (АФК), ферментативная активность и др.) [1; 16; 23; 34; 39; 40; 59; 64; 67; 92]. Однако до настоящего времени не выяснены механизмы участия фагоцитов периферической крови в патогенезе псевдоаллергических процессов, к которым относится непереносимость НПВП. Большую клиническую группу больных с непереносимостью НПВП занимают больные с астматической триадой (АТ) или аспириновой бронхиальной астмой, характеризующейся тремя основными клиническими проявлениями: собственно бронхиальной астмой (БА), полипозным риносинуситом (ПРС) и непереносимостью НПВП. Известно, что у больных с АТ выявляются рецидивирующие инфекции различной этиологии и 10 локализации [9; 10]. Так, более 4 раз в году 56,3% пациентов с АТ болеют ОРВИ; герпесвирусная инфекция выявлена у 47,6% всех обследованных больных АТ [9]. У больных АТ чаще отмечаются обострения инфекционного процесса как местной, так и системной локализации, обострения очагов хронической инфекции и наличие признаков вторичного иммунодефицитного состояния. Наличие частых инфекционных осложнений у больных с АТ могут свидетельствовать о том, что у этих лиц имеется недостаточность в неспецифических или иммунных защитных механизмах, возможно, недостаточность фагоцитарного звена иммунитета. Кроме того, проведенные ранее нами исследования показали также изменение оксидантной активности ПМЛ периферической крови под влиянием НПВП у больных с непереносимостью данных препаратов разных клинических групп [18]. Так, добавление салицилата и метамизола натрия к пробам крови больных с непереносимостью АСК и/или метамизола натрия сопровождалось ингибированием стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой хемилюминесценции (СЛХЛ) крови, в то время как у здоровых доноров показатели СЛХЛ крови под воздействием НПВП были достоверно выше по сравнению с таковыми данных больных. Между тем, до настоящего времени не известно, связаны ли выявленные различия СЛХЛ крови под воздействием НПВП у доноров и больных с непереносимостью НПВП исключительно с влиянием на ПМЛ крови биологически активных веществ (медиаторов, цитокинов) плазмы, или все же существуют какие-то окислительного метаболизма ПМЛ у данной особенности группы больных, проявляющиеся при воздействии на ПМЛ НПВП. Известно, что непереносимость НПВП нередко сочетается с непереносимостью пищевых красителей [34; 67], на которые часто развиваются псевдоаллергические реакции [34]. Возникает вопрос, будут ли происходить изменения СЛХЛ крови под влиянием пищевых красителей у 11 пациентов с их непереносимостью, аналогичные изменениям СЛХЛ под влиянием НПВП, а также каковы механизмы возможных изменений СЛХЛ, и существуют ли общие механизмы изменения СЛХЛ крови под влиянием псевдоаллергенов (пищевых красителей и НПВП)? Известно также, что у пациентов с АТ определяется более высокий уровень активности индуцибельной NO-синтазы (iNOS) в эпителии носовых полипов и, следовательно, более высокий уровень NO в выдыхаемом воздухе по сравнению с таковым у пациентов с полипозом носа и БА без непереносимости НПВП [210]. Между тем, до настоящего времени не известно существует ли зависимость между степенью подавления СЛХЛ крови под влиянием НПВП у больных с АТ и уровнем активности iNOS фагоцитов периферической крови. Анализируя вышесказанное, сформировалось представление о наличии изменений функциональной (оксидантной) активности фагоцитов периферической крови у больных с непереносимостью НПВП, что обусловило актуальность проведения настоящей работы. Цель исследования. Определение общих закономерностей изменения оксидантной активности фагоцитов периферической крови у больных с непереносимостью нестероидных противовоспалительных препаратов разных клинических групп, а также выяснение механизмов изменения оксидантной активности фагоцитов для поиска патогенетической терапии непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов. Задачи исследования. Выполнение поставленной цели требует решения следующих задач: 1. Определить общие закономерности продукции активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами периферической крови у больных с 12 непереносимостью нестероидных противовоспалительных препаратов разных клинических групп и у здоровых доноров. 2. Определить закономерности продукции активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами периферической крови при воздействии комплексным бактериальным антигеном Staphylococcus aureus у больных с непереносимостью нестероидных противовоспалительных препаратов и здоровых доноров. 3. Исследовать общие закономерности изменения продукции активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами периферической крови под влиянием препаратов, псевдоаллергенов тартразина) у (нестероидных больных с противовоспалительных различными клиническими проявлениями непереносимости данных псевдоаллергенов и у здоровых доноров. 4. Изучить вклад НАДФН-оксидазы в изменение продукции активных форм кислорода полиморфно-ядерными псевдоаллергенов тартразина) у (нестероидных больных с лейкоцитами крови под противовоспалительных различными клиническими влиянием препаратов, проявлениями непереносимости данных псевдоаллергенов. 5. Выявить медиаторные механизмы регуляции продукции активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами крови, участвующие в патогенезе непереносимости псевдоаллергенов (нестероидных противовоспалительных препаратов, тартразина), у больных с различными клиническими проявлениями непереносимости данных псевдоаллергенов. 6. Определить цитокиновые механизмы регуляции продукции активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами крови у больных с непереносимостью псевдоаллергенов (нестероидных противовоспалительных препаратов, тартразина) разных клинических групп. 13 7. Изучить закономерности продукции оксида азота фагоцитами периферической крови у больных с астматической триадой. 8. Исследовать зависимость между выраженностью изменений продукции активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами под влиянием нестероидных противовоспалительных препаратов и фазой течения заболевания у больных с астматической триадой. 9. Выявить зависимость между выраженностью изменений продукции активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами под влиянием нестероидных противовоспалительных препаратов, тартразина и давностью развития непереносимости у больных с различными клиническими проявлениями непереносимости данных псевдоаллергенов. 10. Обосновать применение метода стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой хемилюминесценции крови для диагностики in vitro повышенной чувствительности к псевдоаллергенам (НПВП, пищевым красителям) и персонифицированного подбора патогенетической терапии. Научная новизна. Впервые определено, что суммарная продукция АФК, в том числе продукция супероксидного анион радикла ПМЛ периферической крови, различна у пациентов с непереносимостью НПВП разных клинических групп Впервые выявлено, что у пациентов с астматической триадой в стадии ремиссии, не сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами, наблюдается снижение праймирующего влияния антигенов Staphylococcus aureus на выработку АФК ПМЛ цельной крови и выделенными ПМЛ по сравнению с донорами, что связано со снижением активности НАДФНоксидазы ПМЛ. В то же время при наличии сенсибилизации организма стафилококковыми специфическим энтеротоксинами аллергеном прединкубация (Staphylococcus aureus) проб крови со сопровождается 14 значительным увеличением продукции АФК ПМЛ по сравнению со здоровыми донорами, при этом активность НАДФН-оксидазы ПМЛ у этих больных снижена по сравнению с таковой здоровых доноров. Определено, что прединкубация крови с псевдоаллергенами (НПВП, тартразином) у соответствующим больных с повышенной псевдоаллергенам чувствительностью сопровождается к дозозависимым ингибированием СЛХЛ крови, при этом практически при всех используемых концентрациях псевдоаллергенов показатели СЛХЛ крови больных достоверно ниже, чем у здоровых доноров. Установлено, что одним из механизмов ингибирования СЛХЛ крови под влиянием НПВП у больных с непереносимостью данных препаратов является снижение активности НАДФН-оксидазы ПМЛ относительно таковой здоровых доноров, вместе с тем НАДФН-оксидаза ПМЛ не вносит вклад в реализацию ингибирования СЛХЛ крови под влиянием тартразина у пациентов с непереносимостью этого красителя. Впервые выявлено, что феномен подавления СЛХЛ крови под влиянием псевдоаллергенов (НПВП, тартразина) у больных с их непереносимостью опосредуется участием медиаторов. Вклад Н1- и Н2гистаминовых, 5-НТ2 серотониновых и цис-лейкотриеновых рецепторов в развитие феномена ингибирования СЛХЛ крови под воздействием НПВП, тартразина зависит от химической природы псевдоаллергенов и от клинических проявлений непереносимости. Установлено, что активность индуцибельной NO-синтазы фагоцитов повышена у больных с астматической триадой по сравнению с таковой у здоровых доноров и у больных с атопической бронхиальной астмой без полипоза носа и непереносимости НПВП. В стадии обострения хронического бронхита и астмы активность индуцибельной NO-синтазы фагоцитов больных с астматической триадой выше, чем в стадии ремиссии. 15 Впервые доказано, что степень подавления стимулированной люминолзависимой хемилюминесценции крови под влиянием псевдоаллергенов (НПВП, тартразина) у пациентов с их непереносимостью зависит от времени, прошедшего с момента возникновения непереносимости псевдоаллергенов. Впервые обосновано применение хемилюминесцентного теста для персонифицированного подбора патогенетической терапии повышенной чувствительности к псевдоаллергенам (НПВП, пищевым красителям). Теоретическая значимость работы Значимость исследования заключается в расширении представлений об особенностях оксидантной активности фагоцитов периферической крови у больных с непереносимостью нестероидных противовоспалительных препаратов с различными клиническими проявлениями, что углубляет понимание патогенеза непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов и создает основу для разработки новых подходов к диагностике и патогенетически обоснованной терапии указанной непереносимости. Практическая значимость работы На основании полученных экспериментальных данных установлена возможность применения метода стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой хемилюминесценции крови для диагностики in vitro повышенной чувствительности к псевдоаллергенам (НПВП, тартразину). Обосновано применение хемилюминесцентного теста для персонифицированного подбора патогенетической терапии повышенной чувствительности к псевдоаллергенам (НПВП, тартразину). Вынесено положительное решение о выдаче патента на изобретение от 23.11.2015г. по заявке «Способ диагностики in vitro повышенной чувствительности к псевдоаллергенам и подбора противоаллергической 16 терапии». Дата поступления заявки: 22.04.2014. Входящий номер: 025205. Регистрационный номер: 2014116060. На основании полученных экспериментальных данных установлена возможность применения метода стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой хемилюминесценции крови для диагностики in vitro специфической сенсибилизации организма к бактериальным аллергенам. Подана патентная заявка на изобретение «Способ диагностики in vitro специфической сенсибилизации организма к бактериальным аллергенам». Дата поступления заявки: 19.11.2014. Входящий номер: 074551. Регистрационный номер: 2014146260. Методология и методы исследования Работа представляет собой перспективное клинико-лабораторное исследование, выполненное с учетом этических норм, в котором приняли участие пациенты с различными формами клинических проявлений непереносимости НПВП в сочетании и без такового с непереносимостью тартразина. Изучали анамнез и клиническую картину непереносимости псевдоаллергенов (НПВП, тартразина), использовали клинические и лабораторные методы исследования. Непереносимость НПВП, тартразина определяли по данным анамнеза и результатам теста торможения естественной миграции лейкоцитов in vivo. Отсутствие специфических IgE к исследуемым псевдоаллергенам определяли методом иммуно-ферментного анализа. Для решения поставленных в данной работе задач использовали следующие основные методы исследования: метод хемилюминесцентного анализа, метод культивирования суспензии лейкоцитов периферической крови, метод определения нитритов в культуральной среде, метод твердофазного иммуноферментного анализа, а также методы статистики для подтвержения достоверности полученных результатов. 17 Степень достоверности результатов Степень достоверности результатов основана на большом объеме клинического материала, клинических и экспериментальных исследований и подтверждена статистическими методами. Основные положения, выносимые на защиту. 1. Суммарная продукция АФК ПМЛ периферической крови, в том числе продукция супероксидного анион радикала, различна у пациентов с непереносимостью НПВП разных клинических групп. 2. У пациентов с АТ в стадии ремиссии, не сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами, наблюдается снижение праймирующего влияния антигенов Staphylococcus aureus на выработку АФК ПМЛ цельной крови и выделенными ПМЛ по сравнению с донорами, что связано со снижением активности НАДФН-оксидазы ПМЛ. У пациентов с стафилококковыми специфическим АТ в стадии энтеротоксинами, аллергеном ремиссии, сенсибилизированных прединкубация (Staphylococcus проб aureus) крови со сопровождается значительным увеличением продукции АФК ПМЛ по сравнению со здоровыми донорами, при этом активность НАДФН-оксидазы ПМЛ у этих больных снижена по сравнению с таковой здоровых доноров. 3. Псевдоаллергены (НПВП, тартразин) оказывают дозозависимое ингибирующее влияние на СЛХЛ крови больных с их непереносимостью, при этом практически при всех используемых концентрациях псевдоаллергенов показатели СЛХЛ крови больных достоверно ниже, чем у здоровых доноров. 4. Ингибирование СЛХЛ крови под влиянием НПВП у больных с непереносимостью данных препаратов связано со снижением активности НАДФН-оксидазы ПМЛ относительно таковой здоровых доноров. НАДФН- 18 оксидаза ПМЛ не вносит вклад в реализацию ингибирования СЛХЛ крови под влиянием тартразина у пациентов с непереносимостью данного пищевого красителя. 5. Феномен подавления СЛХЛ крови под влиянием псевдоаллергенов (НПВП, тартразина) у больных с их непереносимостью опосредуется участием медиаторов. Вклад Н1- и Н2- гистаминовых, 5-НТ2 серотониновых и цис-лейкотриеновых рецепторов в развитие феномена ингибирования СЛХЛ крови под воздействием НПВП, тартразина зависит от химической природы последних и от клинических проявлений непереносимости. 6. Активность индуцибельной NO-синтазы фагоцитов повышена у больных с астматической триадой по сравнению с таковой у здоровых доноров и больных с атопической бронхиальной астмой без полипоза носа и непереносимости НПВП. 7. Степень подавления СЛХЛ крови под влиянием псевдоаллергенов (НПВП, тартразина) у пациентов с их непереносимостью зависит от времени, прошедшего с момента возникновения непереносимости данных псевдоаллергенов. Апробация работы Основные результаты работы доложены и обсуждены на совместной научной конференции кафедр патологической физиологии, фармакологии ГБОУ ВПО МГСМУ им. А.И. Евдокимова МЗ РФ и общей патологии медико-биологического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова МЗ РФ 04 июня 2015 года. Материалы диссертационной работы доложены на конгрессе по ЛОР болезням (Вильнюс, 2005); на XIV, XVI, XIХ, XXI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007, 2009, 2012, 2014 г.г.); на научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины» (Москва, 2008); на научно- 19 практической конференции с международным участием «Профилактика 2014» (Москва, 2014); на XIV международной конференции «Высокие технологии ХХI века» (Бенидорм, Испания, 2015). Результаты диссертационной работы внедрены в практику ГБУЗ «Городская поликлиника №63 Департамента здравоохранения г. Москвы», филиал №3; в организационно-методическую работу Республики Мордовия Министерством здравоохранения Республики Мордовия (Приказ №734-с от 23.04.2014), в организационно-методическую работу Рязанской области Министерством здравоохранения Рязанской области (Приказ №ВГ/11-7679 от 26.08.2014), а также в учебный процесс кафедры общей патологии медикобиологического факультета ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» МЗ РФ, кафедры патологической физиологии ГБОУ ВПО «МГМСУ им. А.И. Евдокимова» МЗ РФ. Публикации результатов исследования По результатам исследования опубликовано 24 печатных работы, из них 16 статей- в российских научных рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ. Поданы 2 патентные заявки. Вынесено положительное решение о выдаче патента на изобретение от 23.11.2015 по повышенной чувствительности заявке «Способ диагностики in vitro к псевдоаллергенам и подбора противоаллергической терапии». Дата поступления заявки: 22.04.2014. Входящий номер: 025205; Регистрационный номер: 2014116060. Личный вклад автора Автору принадлежит ведущая роль в планировании исследования, наборе клинического материала, проведении экспериментальных исследований, анализе и обобщении полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех 20 этапах настоящего исследования: от постановки задач до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрении в практику. В статьях, написанных в соавторстве, авторский вклад составляет не менее 80%. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 305 страницах машинописи. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, четырех глав собственных результатов исследования, обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы, состоящего из 99 отечественных и 262 иностранных источников, приложения. иллюстрирован 20 таблицами и 24 рисунками. Текст диссертации 21 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 1.1. Нестероидные противовоспалительные препараты: классификация, механизм действия. Нестероидные противовоспалительные препараты широко используются в медицинской практике уже более 100 лет. Они относятся к числу наиболее эффективных и часто применяемых симптоматических лекарственных средств для купирования боли, воспаления и лихорадки, которые наблюдаются при многих заболеваниях (ревматические заболевания, костно- мышечно- суставные патологии, неврологические заболевания и др.) Следует отметить также широкое применение аспирина, обладающего свойством уменьшать вязкость крови, для коррекции микроциркуляции (например, при тромбофлебитах, постинфарктных состояниях). Трудно назвать отрасль медицины, где бы не использовались НПВП. Они применяются в ревматологии, травматологии, хирургии, кардиологии, гематологии, неврологии, гинекологии, офтальмологии, стоматологии и других отраслях. По данным ряда авторов, более 30 млн. людей в мире ежедневно принимают НПВП [30; 85]. Старейшим из НПВП является ацетилсалициловая кислота (аспирин), впервые синтезированная Шарлем Фредериком Жераром в 1853 г. Феликс Хоффман, работавший в лабораториях фирмы Bayer AG, 10 августа 1897 г. впервые получил образцы ацетилсалициловой кислоты в форме, возможной для медицинского применения. Уже в 1899 году первая партия этого лекарства появилась в продаже [263; 326]. Классификация НПВП В настоящее время существует несколько классификаций НПВП: по активности и химической структуре, по селективности в отношении различных форм ЦОГ [21; 41; 86; 88; 94]. Классификация НПВП химической структуре и активности [21]. 22 1. НПВП с выраженной противовоспалительной активностью. Салицилаты (ацетилсалициловая кислота, лизинмоноацетилсалицилат, салицилат натрия, холинсалицилат, салициламид, дифлунизал, дисалцид, трилисат). Производные пиразолона (азапропазон, клофезон, фенилбутазон, оксифенилбутазон). Производные индолуксусной кислоты (индометацин, этодолак, сулиндак). Производные фенилуксусной кислоты (диклофенак натрия, диклофенак калия, фентиазак, лоназалак кальция). Производные пропионовой кислоты (ибупрофен, кетопрофен, напроксен, флурбипрофен, фенопрофен, фенбуфен, тиапрофеновая кислота). Оксикамы (пироксикам, мелоксикам, теноксикам, лорноксикам). Производные сульфонамида (целекоксиб, нимесулид, рофекоксиб). Алканоны (набуметон). 2. НПВП со слабой противовоспалительной активностью. Пиразолоны (метамизол, аминофеназон, пропифеназон). Производные антраниловой кислоты (мефенамовая кислота, меклофенамовая кислота, нифлумовая кислота, морнифлумат, толфенамовая кислота). Производные гетероарилуксусной кислоты (кеторолак, толметин). Производные парааминофенола (парацетамол, фенацетин). Как терапевтические, так и побочные эффекты НПВП связаны с ингибированием ключевого фермента метаболизма арахидоновой кислоты ЦОГ [340]. Описано три изоформы ЦОГ: ЦОГ-1, ЦОГ-2 и ЦОГ-3 [5; 53; 88; 94; 135; 153; 340]. 23 ЦОГ–1 является конститутивной, обладает функциональной активностью структурного фермента, постоянно присутствует в клетках, катализируя образование простагландинов (ПГ) (ПГE2, тромбоксана A2, простациклина), регулирующих физиологические функции в различных органах, например в слизистой оболочке желудка и бронхов, в почках, а также в сосудистой стенке и крови [94;135]. ЦОГ–2 является индуцируемой изоформой, поскольку она начинает функционировать, и ее содержание увеличивается на фоне воспаления. Уровень ЦОГ-2 в нормальных условиях низкий. Он возрастает под влиянием провоспалительных цитокинов, включая ИЛ-6, ИЛ-1. Считается, что именно ЦОГ–2 принимает участие в синтезе «провоспалительных» ПГ, потенциирующих активность медиаторов воспаления, таких как гистамин, серотонин, брадикинин [88; 94;135]. Следовательно, торможение активности ЦОГ-2 приводит к значительным противовоспалительным эффектам. В связи с этим предполагается, что противовоспалительное действие НПВП обусловлено ингибированием ЦОГ–2, а побочные реакции — воздействием на ЦОГ-1 [53]. ЦОГ-3 функционирует в структурах ЦНС. Проведенные исследования показали, что активность этого фермента ингибируется жаропонижающими препаратами, такими как парацетамол, фенацетин, антипирин, метамизол натрия. Таким образом, ингибирование ЦОГ-3 может представлять основной центральный механизм, с помощью которого эти препараты уменьшают боль и, возможно, лихорадку [153]. Все НПВП подразделяются на группы по их способности ингибировать различные изоформы ЦОГ. Классификация НПВП по селективности в отношении различных форм ЦОГ [86; 94] 24 Выраженная селективность в отношении ЦОГ-1 (ацетилсалициловая кислота, кетопрофен, индометацин, пироксикам, сулиндак) Умеренная селективность в отношении ЦОГ-1 (диклофенак, ибупрофен, напроксен и большинство других НПВП) Примерно равноценное ингибирование ЦОГ-1 и ЦОГ-2 (лорноксикам) Умеренная селективность в отношении ЦОГ-2 (мелоксикам, этодолак, набуметон, нимесулид) Выраженная селективность в отношении ЦОГ-2 (целекоксиб, рофекоксиб) По литературным данным противовоспалительный, анальгезирующий, жаропонижающий и антиагрегационный эффекты НПВП достигаются несколькими механизмами. Григорович Р. И. и соавторы (2010г) в своей обзорной статье сделали следующие обощения [56]: - механизмы анальгетического действия опосредованы преимущественно ингибированием ЦОГ–1 и ЦОГ-3 и включают в себя: во-первых, периферический механизм, характеризующийся снижением продукции ПГЕ2, ПГI2, ПГF2α (модуляторов боли) в поврежденных тканях и, как следствие, ослаблением гиперальгезии, а также уменьшением экссудации, приводящем к снижению механического давления на болевые рецепторы; во-вторых, центральный механизм, который осуществляется путем диффузии НПВП в ЦНС через ГЭБ, что приводит к ингибиции ЦОГ-3 в таламических центрах болевой чувствительности; - механизмы противовоспалительного действия включают в себя: во-первых, угнетение ЦОГ-2 с последующим нарушением синтеза ПГ (воздействие на комплекс «арахидоновая кислота – ЦОГ»); во-вторых, ингибирование ферментного нарушением комплекса синтеза ПГ); простагландин-синтетазы в-третьих, угнетение (с последующим 5-липооксигеназы с последующим снижением продукции ЛТ; в-четвертых, проникновение 25 НПВП в липидный бислой иммунокомпетентных клеток с последующим предотвращением активации последних на ранних стадиях воспалительного процесса. Следует отметить, что первые два из указанных механизмов (связанные с угнетением синтеза ПГ) проявляются при действии низких доз НПВП, третий механизм- при действии высоких доз данных препаратов [36]. - механизмы антипиретического действия включают: во-первых, угнетение синтеза ПГЕ1 в ЦНС и предотвращение его влияния на центр терморегуляции; во-вторых, ингибирование синтеза эндогенных пирогенов с молекулярной массой 10000-20000 Дальтон в ПМЛ, моноцитах и ретикулоцитах; - механизм антиагрегационного эффекта: в результате ингибирования ЦОГ-1 в тромбоцитах подавляется синтез эндогенного проагреганта тромбоксана А2. Несмотря на высокую эффективность и широкое применение НПВП в клинике, прием побочными препаратов данной группы может сопровождаться эффектами. Наиболее распространенными из них являются повреждение слизистой (гастропатии), гепатотоксические геморрагический синдром оболочки желудочно-кишечного реакции, интерстициальный тракта нефрит, [51; 88; 118; 338], также отмечаются такие серьезные явления как крапивница/ ангионевротический отек (отек Квинке), шок, токсический эпидермальный некролиз (синдром Лайелла), синдром Стивенса-Джонсона [118; 338]. Необходимо отметить, что препараты группы НПВП могут вызывать частичную бронхоконстрикцию и бронхоспазм, что затрудняет их использование среди лиц, страдающих БА [88; 118; 338]. 1.2. Влияние нестероидных противовоспалительных препаратов на продукцию активных форм кислорода и азота фагоцитами. Много исследований посвящено изучению антирадикальной и антиокислительной активности НПВП [3; 14; 32; 76; 87; 100; 171; 293; 359]. 26 Показана антирадикальная активность ацетилсалициловой кислоты, диклофенака, бутадиона, индометацина, парацетамола, 5-аминосалицилатов в тесте со стабильным долгоживущим свободным радикалом дифенилпикрилгидразилом [32; 87; 100; 171], причем у индометацина выявлены антирадикальные свойства также по отношению к АФК [293]. Изучению антиоксидантных свойств ацетилсалициловой кислоты посвящено много работ [112; 179; 204; 207]. Обсуждается ее влияние на активность гемоксидазы и NO-синтазы, синтез ферритина и т. д., при этом антиоксидантные свойства этого препарата во всех экспериментах резко отличают его от других НПВП [65]. Методом электронного парамагнитного резонанса было установлено, что ацетилсалициловая кислота является эффективной «ловушкой» гидроксильных радикалов [112; 204], при этом у ацетилсалициловой кислоты не было обнаружено способности эффективно взаимодействовать с супероксидным анион радикалом и перекисью водорода (предшественниками гидроксильного радикала) [112]. Известно, что салицилаты могут связывать гидроксильные радикалы за счет о-оксигрупп [126]. Однако есть и другое мнение: Ю. М. Петренко и Ю. А Владимировым [63] установлено, что под влиянием салицилатов происходит генерация радикалов. Ацетилсалициловая кислота не образует хелатов, так как имеет блокированную фенольную группу. Однако в условиях, близких к физиологическим, из нее образуется салициловая кислота, обладающая свойством связывать катионы закисного железа и катализировать их окисление молекулярным кислородом. Этот процесс сопровождается продукцией АФК. катализирующие Хотя именно способностью свободнорадикальные связывать процессы, металлы, объясняют цитопротективные свойства ацетилсалициловой кислоты, которые в условиях in vitro сравнивают с таковыми у токоферола [130]. 27 Установлено, что ряд НПВП (индометацин, ибупрофен, бутадион, протизиновая кислота, метиозиновая кислота) ингибируют ферментативное образование супероксидного анион радикала в активированных фагоцитах [54;324]. В роли “ловушки” свободных радикалов может выступать широко используемый в клинической практике НПВП — диклофенак натрия, что подтвержено исследованиями, проведенными на модели ишемии-реперфузии печени [335]. Имеются ферментативного сообщения образования об супероксидного ингибировании анион НПВП радикала в активированных фагоцитах [38; 54; 324]. Показано, что, диклофенак натрия [38], индометацин, ибупрофен, бутадион [54; 324] вызывают дозозависимое угнетение образования супероксидного анион радикала в активированных фагоцитах. Simchowitz L. et al. [324] установили также, что при некоторых формах воспаления, включая артрит, супероксидные анион радикалы вовлекаются в патогенез тканевых повреждений и, следовательно, механизмы противовоспалительного действия НПВП связаны с угнетением образования супероксидных анион радикалов. Парацетамол и салицилат натрия угнетают образование гидроксильных радикалов в системе Сu2+/H2O2 в эритроцитах человека [182]. В литературе нет однозначных данных об антиоксидантных свойствах парацетамола (ацетаминофена). С одной стороны, показано гашение парацетамолом супероксидных анион радикалов в модельных системах in vitro [26], с другой стороны, in vivo в процессе монооксигеназного окисления парацетамол преобразуется в ряд промежуточных продуктов (в том числе N-ацетилпарабензохинонимин [101], которые обладают подтверждается про-оксидантными результатами исследования свойствами. других Последнее авторов [19], свидетельствующих о том, что парацетамол, введенный внутрь крысам, является индуктором перекисных процессов в печени; при этом возрастает содержание малонового диальдегида и интенсивности хемилюминесценции 28 (ХЛ). Подобные нарушения развиваются только в условиях снижения содержания восстановленного глутатиона на 70–90 % по сравнению с нормой, когда уменьшается глутатионредуктазы и активность прекращается глутатионпероксидазы связывание и электрофильных метаболитов [13]. Показано, что практически все НПВП оказывают ингибирущее действие на стимулированную опсонизированным зимозаном люминол- и люцигенинзависимую ХЛ ПМЛ и перитонеальных макрофагов, то есть подавляют количество АФК, генерируемых клетками [115; 143; 176; 285]. Наиболее активными ингибиторами люминол-зависимой ХЛ ПМЛ являются бутадион, индометацин, сулиндака сульфид, менее активными — салицилаты, арилуксусные кислоты (напроксен) [54]. Ингибирующее действие НПВП на стимулированную люминол-зависимую ХЛ ПМЛ обусловлено не только антиокислительной активностью НПВП, в частности, способностью ингибировать процессы образования супероксиданионов в активированных фагоцитах [38; 54; 324; 335], гидроксильных радикалов [112; 182; 204], но также и ингибированием активности фосфолипазы А2 [164], что сопровождается снижением синтеза в ПМЛ эйкозатетраеновых метаболитов, которые, являясь оксидантами, могут напрямую взаимодействовать с люминолом, усиливая ХЛ фагоцитов [7; 163]. При изучении регуляции оксидантных реакций в ПМЛ было выявлено, что НПВП способны вызывать латентное раздражение ПМЛ, меняющее чувствительность переадаптация последних к вторичных стимулам [45]. Скрытая ПМЛ, возникающая под влиянием НПВП, проявляется ослаблением (деактивацией) реакций ПМЛ к вторичным стимулам [46]. Элементы деактивации, которые неоднократно воспроизводились в экспериментах с НПВП (а также в экспериментах с ГКС), используются, как противовоспалительная терапия [46]. 29 Кроме того, установлено, что НПВП подавляют синтез мРНК индуцибельной NO-синтазы [27; 330], а также ингибируют образование провоспалительных цитокинов, стимулирующих активность индуцибельной NO-синтазы [279; 339], что сопровождается снижением синтеза оксида азота под влиянием НПВП. Таким образом, НПВП обладают антиоксидантными свойствами и изменяют окислительный метаболизм фагоцитов. 1.3. Влияние нестероидных противовоспалительных препаратов на выработку цитокинов. Опубликован ряд работ, в которых сообщается о влиянии НПВП на выработку цитокинов [24; 279; 339]. Показано, что НПВП селективно ингибируют продукцию провоспалительных цитокинов (интерферона γ (ИФН γ) и фактора некроза опухоли α (ФНОα)) клетками врожденного иммунитета - естественными киллерами (NK) и гамма дельта Т-клетками [141]. В другой работе исследовали влияние ингибиторов ЦОГ-1 и ЦОГ-2 на продукцию цитокинов при системном воспалении [142]. Мышам были предварительно введены НПВП, после чего следовала внутрибрюшинная инъекция липополисахаридов (ЛПС). Известно, что ЛПС индуцируют развитие системного воспаления с повышением уровня ИЛ-6, ИЛ-1β, ФНОα, а также ПГЕ2 в сыворотке крови и головном мозге. Однако, предварительное (перед ЛПС) введение ингибиторов ЦОГ-1 (индометацина, ибупрофена, пироксикама) не изменяло уровни мРНК исследуемых цитокинов ни в сыворотке крови, ни в гиппокампе, в отличие от ингибитора ЦОГ-2 нимесулида, подавляющего продукцию цитокинов. Показано, что НПВП угнетают активацию NF-kB (фактора транскрипции), который является регулятором синтеза провоспалительных цитокинов [300]. 30 Имеются сообщения о влиянии диклофенака натрия на баланс цитокинов: снижение концентрации ИЛ-6 и повышение содержания ИЛ-10 в периферической крови после лечения данным препаратом [140]. Таким образом, НПВП селективно ингибируют продукцию провоспалительных цитокинов иммунными клетками. 1.4. Непереносимость нестероидных противовоспалительных препаратов 1.4.1. Клинико-эпидемиологические аспекты непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов. На протяжении актуальной проблемой многих лет непереносимость фармакологии и НПВП аллергологии. остается Клинические симптомы непереносимости НПВП весьма различны. Они колеблются от небольших высыпаний на коже до развития анафилактоидного шока. Но чаще всего непереносимость НПВП проявляется в виде поражения органов дыхания (аспириновая астма, ринит) либо в виде крапивницы и/или отека Квинке [67]. Анализ литературных данных по эпидемиологическим исследованиям распространенности непереносимости НПВП показал вариабельность этого показателя. Считается, что частота отрицательных реакций на аспирин среди здоровых людей небольшая и составляет менее 1% [294]. Больные аспириновой астмой составляют 3,1%-22% всех пациентов с БА [9; 43; 44; 233; 241; 294; 331]. Среди стероидзависимых больных положительная реакция на пероральную провокацию аспирином подтверждена у 40% [331]. Ретроспективный анализ 610 историй болезни у детей с БА выявил непереносимость аспирина в виде различных клинических проявлений (кожные, респираторные, гастроинтестинальные) у 3% пациентов, и только 0,7% детей этой группы имели аспирин-индуцированный бронхоспазм [4;44]. 31 Частота непереносимости аспирина, по разным данным, колеблется при ПРС от 14 до 23%, при рините – около 1,5% [294]. Хронический риносинусит с носовым полипозом или без него отмечается у 36%-96% больных с аспириновой непереносимостью [275]. Крапивница/отек Квинке возникает у 0,1% до 0,3% лиц, принимающих НПВП [214; 319; 323; 338]. Уртикарные кожные высыпания, связанные с повышенной чувствительностью к НПВП, занимают значительное место (от 23 до 35%) среди различных форм хронической крапивницы [67; 118; 214; 294]. Рассмотрим более подробно клинические проявления повышенной чувствительности к НПВП. Астматическая триада (АТ) («аспириновая» астма или заболевания органов дыхания, обостряющиеся после приема аспирина) – синдром, объединяющий в себе непереносимость ацетилсалициловой кислоты и других НПВП, ПРС и БА [10; 12; 34; 67; 148; 214; 223; 234; 241; 245]. Основные проявления АТ взаимосвязаны и развиваются в определенной последовательности [9;12]. Наиболее часто встречается следующая последовательность: БА→ ринит→ ПРС→ непереносимость НПВП. На втором месте по частоте стоит последовательность: Ринит→ БА→ ПРС→ непереносимость НПВП. Остальные схемы развития АТ (Ринит → ПРС → БА → непереносимость НПВП; Ринит → БА → непереносимость НПВП → ПРС и др.) встречаются редко [9; 12]. При этом тяжесть БА не оказывает существенного влияния на последовательность формирования полного синдрома АТ [9]. Для развития полной клинической картины синдрома АТ (непереносимость НПВП, ПРС и БА) иногда требуются годы. Чаще всего АТ развивается следующим образом. Дебют синдрома АТ, как правило, начинается после перенесенной острой респираторной вирусной инфекции, в исходе которой развивается хронический эозинофильный риносинусит [241]. Уже на этой стадии у части больных достаточно часто обнаруживают полипы 32 в носовой полости. Далее в ходе развития воспалительных изменений носовых пазух присоединяются симптомы поражения верхних дыхательных путей - развивается БА, которая является следующим компонентом АТ. Непереносимость НПВП, как правило, присоединяется в последнюю очередь. При приеме пациентами ацетилсалициловой кислоты развивается острая реакция, характеризующаяся бронхоспазмом и/или ринитом. У части больных могут также развиваться изменения со стороны кожных покрововкрапивница/отек Квинке [12; 241]. Ранее БА у пациентов с непереносимостью НПВП рассматривали, как неаллергическую, однако, в настоящее время установлено, что в большинстве случаев у пациентов с АТ в анамнезе присутствует аллергия на ингаляционные аллергены, которая подтверждается при постановке кожных проб с основными ингаляционными аллергенами [241; 318]. Проведенное клинико-иммунологическое обследование выявило неоднородность группы больных с АТ [9; 10]. В зависимости от механизма развития выделены три формы АТ: АТ с атопической формой БА, АТ со смешанной формой БА, АТ с инфекционно-зависимой формой БА [9]. Особенностью аллергологической характеристики АТ является повышение роли атопии в формировании заболевания. За последние 20 лет наблюдения доля больных атопической формой БА при АТ увеличилась с 19% до 47% [10]. Сенсибилизация к небактериальным аллергенам выявлена у 48,4% всех больных АТ. В группах больных с АТ со смешанной формой БА и АТ с инфекционно-зависимой формой БА достоверно чаще встречались местные и системные инфекции дыхательных путей. Установлена зависимость микробного пейзажа дыхательных путей от степени тяжести заболевания [10]. Кроме того, у многих больных с АТ выявляется сенсибилизация к бактериальным аллергенам, в частности, к стафиллококковым энтеротоксинам. Van Zele и соавт. [355] в своей работе показали, что наличие 33 у пациента с ПРС непереносимости аспирина и БА, повышает распространенность стафилококковой колонизации слизистой оболочки носовых путей до 87,5%, при этом IgE-антитела к стафилококковым энтеротоксинам обнаруживаются в 80% случаев. Также установлено, что уровень колонизации золотистого стафилококка в среднем носовом ходе у пациентов с полипозом носа прямо пропорционален содержанию специфических IgE-антител к его энтеротоксинам [281]. По данным исследования TENOR [131], основывающегося на результатах опроса врачей - аллергологов, пациенты с непереносимостью НПВП чаще страдают более тяжелой формой БА, чем пациенты с БА, не имеющие непереносимости НПВП (66% против 49%). Они нуждаются в более интенсивной лекарственной терапии, в том числе гормональной. Их приходится чаще интубировать при развитии асфиксии (20% и 11%, соответственно), назначать им большие дозы топических стероидов (34% против 26%), а также использовать модификаторы лейкотриенов (67% и 57%). Непереносимость НПВП у пациентов с аспириновой астмой представляет собой следующую картину: в течение часа, следующего за приемом аспирина или другого антициклоксигеназного препарата, развивается приступ, необычный по продолжительности и нечувствительности к обычным симпатомиметикам и бронхолитикам. Непереносимость аспирина у пациентов с АТ может проявляться как в виде бронхоконстрикторных реакций, так и уртикарных высыпаний на коже, иногда с отеком Квинке [34]. Крапивница (urticaria) – заболевание, характеризующееся быстрым более или менее распространенным высыпанием на коже зудящих волдырей, представляющих собой отек ограниченного участка, главным образом, сосочкового слоя кожи [67]. Она характеризуется мономорфной сыпью, первичный элемент которой — волдырь (urtica). В ответ на прием НПВП 34 обычно через 1-4 часа (реже через 15 минут или 22-24 часа) возникает гиперемия лица, сильный зуд кожи лица и различных участков тела, иногда всей поверхности тела [67; 214]. Вскоре на зудящих участках появляются гиперемированные высыпания, выступающие над поверхностью кожи. Обычно волдыри розового и красного цвета. По мере нарастания отека происходит сдавление капилляров, и волдырь бледнеет. В центре отека при значительной экссудации возможно образование пузырька с отслойкой эпидермиса. Экссудат может приобретать геморрагический характер за счет выхода из сосудистого русла форменных элементов крови. Величина элементов сыпи различна- от булавочной головки до гигантских размеров. Элементы сыпи могут располагаться отдельно или сливаться, образуя фигуры причудливых очертаний с фестончатыми краями. При распространенных высыпаниях этого типа речь идет о гигантской крапивнице. В процессе обратного развития элементы сыпи могут приобретать кольцевидную форму. Крапивница может сопровождаться недомоганием, головной болью, нередко подъемом температуры тела до 38— 39°С. Длительность периода клинических проявлений после приема виновного лекарственного препарата- от нескольких часов до нескольких суток. В ряде случаев в ответ на прием НПВП развивается отек Квинке. Однако чаще всего он развивается вместе с генерализованной уртикарной сыпью и имеет сходные с ней патофизиологические процессы [67;170]. Отек возникает в результате местного увеличения проницаемости капилляров и посткапиллярных венул кожи и слизистых оболочек в ответ на действие медиаторов [170]. Он имеет вид большого, бледного, плотного, незудящего инфильтрата, при надавливании на который не остается ямки [67; 170]. Чаще всего отек локализуется в местах с рыхлой клетчаткой – на веках, губах, мошонке, слизистых оболочках рта (мягкое небо, язык, миндалины). 35 Показано, что НПВП-индуцированный ангионевротический отек наиболее часто локализуется в области лица: в периорбитальной области (95.2%), отек губ (14,3%), отек языка (4,8%) [111]. Процент пациентов с отеком конечностей при приеме НПВП небольшой и составляет 4,8%. Таким образом, больные с НПВП-индуцированным отеком Квинке, как правило, имеют высокий процент периорбитальных отеков по сравнению с аллергическими отеками Квинке, не связанными с приемом НПВП (95,2% в сравнении с 68,8%, р < 0,05), при этом в группе с аллергическим отеком Квинке, не связанным с приемом НПВП, чаще развивается отек губ при сравнении с группой с НПВП – индуцированным отеком Квинке (43,8% против 14,3%, р<0,05) [111]. Анафилактоидный шок, развивающийся в ответ на прием НПВП, характеризуется быстрыми проявлениями, такими как: острой болью в области сердца, сопровождающейся затруднением дыхания, снижением артериального давления, снижением температуры тела, кожным зудом и уртикарной сыпью, нарушением сознания [67]. 1.4.2. Патогенез непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов. До настоящего времени этиология и патогенез непереносимости НПВП остаются неясными. Существуют различные представления о возможных механизмах непереносимости НПВП. Значительное внимание было уделено возможности включения иммунологических механизмов в реализацию патогенного действия этих препаратов. На сегодняшний день доказано, что в большинстве случаев непереносимость НПВП не является истинной лекарственной аллергией [67; 214; 223; 244; 247]. Данное положение по данным D.D. Stevensov и соавт. [166] наблюдениях: большинство пациентов базируется на следующих с непереносимостью 36 ацетилсалициловой кислоты не дают немедленных кожных реакций ни на данный препарат, ни на его конъюгаты; чувствительность к препарату не передается пассивно с сывороткой крови; пациенты с чувствительностью к ацетилсалициловой кислоте оказываются чувствительными также и к другим химически различным НПВП. Кроме того, в сыворотке крови пациентов с непереносимостью НПВП в большинстве случаев отсутствуют аллергенспецифические IgE и IgG. Из неиммунологических механизмов непереносимости НПВП основным механизмом считается способность препаратов данной группы нарушать метаболизм арахидоновой кислоты, и, тем самым, изменять соотношение различных ее метаболитов [67; 214; 223; 241; 244; 247; 358]. Метаболизм арахидоновой кислоты идет по циклогеназному и липоксигеназному пути. Угнетая ЦОГ-1, аспирин тормозит образование простагландинов (ПГЕ2), что обусловливает чрезмерную активацию 5-липоксигеназы (5-ЛОГ). В результате баланс метаболитов арахидоновой кислоты сдвигается в сторону преимущественного образования ЛТ. Последующее усиление синтеза цис-ЛТ и активация воспалительных клеток провоцирует развитие клинической симптоматики [214; 223; 241; 244; 247; 314; 358]. Однако существуют и другие механизмы непереносимости НПВП, поскольку с позиции циклооксигеназной концепции нельзя объяснить, почему у части пациентов с непереносимостью НПВС развиваются бронхиальные и назальные симптомы в ответ на вещества, не являющиеся ингибиторами ЦОГ, в частности, на консервант бензоат натрия, сульфит-содержащие медикаменты, сукцинат натрия, входящий в состав многих препаратов. Кроме того, ЦОГ-теория не объясняет, почему интал (стабилизатор мембран базофилов и тучных клеток) может блокировать реакции на ацетилсалициловую кислоту, хотя и не влияет на метаболизм арахидоновой кислоты[67]. 37 Несмотря на то, что в большинстве случаев непереносимость НПВП не является истинной лекарственной аллергией, в последние годы у ряда пациентов было установлено также участие иммунных механизмов в патогенезе повышенной чувствительности к НПВП. Так, у части больных с аспириновой астмой, отвечающих на прием НПВП анафилактоидными реакциями, крапивницей или ангионевротическими отеками, в основе патогенеза заболевания лежат IgE-зависимые реакции I типа гиперчувствительности [34; 342]. Представляет также большой интерес тромбоцитарная теория развития аспириновой астмы [35;107]. Обнаружено, что тромбоциты больных с аспириновой астмой в отличие от здоровых активируются in vitro под действием аспирина и других НПВП, что проявляется увеличением хемилюминесценции и дегрануляции клеток с выбросом цитотоксических и провоспалительных медиаторов. Показано, что после инактивации аспирином ЦОГ в тромбоцитах возникает дефицит ПГН2. На уменьшение продукции активности ПГН2 с тромбоцит последующей реагирует усилением гиперпродукцией функциональной ЛТ. Добавление синтетического ПГН2 полностью предотвращало аспириновый бронхоспазм. Напротив, блокада рецепторов ПГН2 провоцировала реакцию тромбоцитов без участия аспирина у больных аспириновой астмой. Здоровые люди, а также больные бронхиальной астмой, толерантные к аспирину, не обладали подобной реакцией тромбоцитов на НПВП [35; 107]. Таким образом, по мнению авторов, снижение ПГН2 играет важную роль в активации тромбоцитов у больных аспириновой астмой. Евсюковой Е.В. (2003 г.) [28] подробно описана роль тромбоцитов в патогенезе аспириновой астмы. При этом большая роль в развитии данного заболевания отводится нарушению синтеза мелатонина, а также повышению 38 чувствительности и извращению реакции на мелатонин рецепторного аппарата тромбоцитов. Патогенез крапивницы/отека Квинке, индуцированных приемом НПВП, окончательно не изучен. Отмечено, что у пациентов с крапивницей, индуцированной НПВП, также как и у пациентов с аспириновой астмой, перекрестные реакции на НПВП происходят при применении ЦОГ-1 ингибирующих препаратов [118; 318], в то время как НПВП, оказывающие незначительное влияние на активность ЦОГ-1 фермента (например, нимесулид, парацетамол, ингибиторы ЦОГ-2) [121; 214; 260; 265; 316; 317; 346; 347; 348] или агонисты опиоидных рецепторов с сильной анальгезирующей активностью (например, трамадол) [117; 120; 196; 260], как правило, хорошо переносятся. Эти наблюдения ясно дают понять, что ингибирование ЦОГ-1 играет патогенетическую роль в развитии псевдоаллергических кожных реакций, индуцированных НПВП. В результате блокады ЦОГ-1 метаболизм арахидоновой кислоты отклоняется в сторону 5ЛОГ пути, что в конечном итоге приводит к производству цис-ЛТ, являющихся сильнодействующими медиаторами воспалительных процессов и опосредующих развитие НПВП-индуцированной крапивницы [118]. Однако, несмотря на то, что ингибиторы ЦОГ-2 хорошо переносятся большинством пациентов с кожными реакциями на НПВП, у некоторых пациентов описана реакция на высокоселективные ингибиторы ЦОГ-2, что говорит о существовании других механизмов развития НПВП- индуцированных крапивницы/отека Квинке [214; 319]. В ряде исследований сообщалось о повышенной чувствительности к единичному НПВП, в частности, пиразолону [109; 203], парацетомолу [199; 239; 284], аспирину [110], кеторолаку [321], нимесулиду [116] и целекоксибу [201; 257]. Был сделан вывод, что в случае повышенной чувствительности к единичному НПВП патогенез крапивницы является IgE-опосредованным 39 (образуются специфические IgE к гаптенам метаболитов НПВП), тем более, что иногда кожные тесты с виновным препаратом оказываются положительными [118; 319]. Кроме того, полагают, что существует генетическая предрасположенность анафилактическим реакциям к [123]. У НПВП-индуцированным пациентов с повышенной чувствительностью к одному НПВП могут произойти перекрестные реакции на другие НПВП того же химического семейства, но не на препараты, относящиеся к разным химическим группам. Указанный тип реакций никогда не возникает при первом применении, в отличие от псевдоаллергических реакций, часто возникающих при первом применении определенного препарата [118]. Тем не менее, нельзя исключать, что реакции на единичные НПВП иногда могут являться и ЦОГ-1-опосредованными [118]. Следует еще раз подчеркнуть, что истинные аллергические реакции на НПВП встречаются редко [111]. 1.4.2.1. Роль цитокинов в патогенезе непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов Воспалительные клетки и профиль цитокинов в слизистой оболочке дыхательных путей у пациентов с заболеваниями органов дыхания, обостряющимися после приема аспирина. Установлено, дыхательных что путей обостряющимися в слизистой больных после с приема оболочке заболеваниями аспирина, верхних органов усилена и нижних дыхания, выработка цитокинов/хемокинов, отвечающих за активацию, миграцию и выживание эозинофилов, таких как интерлейкин 5 (ИЛ-5), гранулоцитарно- макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), молекулы адгезии RANTES, эотаксин-2 [148; 191; 223; 226; 314]. Указанные цитокины, особенно ИЛ-5, обеспечивают развитие и пролонгирование эозинофильного 40 воспаления в слизистой оболочке дыхательных путей. Количество эозинофилов в биоптатах слизистого и подслизистого слоев бронхов в 2-3 раза превышает соответствующие показатели в биоптатах пациентов с БА, не имеющих непереносимости НПВП [195; 245; 282; 314]. Активированные эозинофилы высвобождают лейкотриены, главный основной протеин, эозинофильный катионный протеин, АФК, вызывающие местное повреждение тканей [314]. Развитию эозинофильного воспаления также способствует образование специфических IgE к стафилококковым энтеротоксинам в ткани назальных полипов [148; 223; 314]. При аспириновой астме в слизистой оболочке дыхательных путей обнаруживается большое количество тучных клеток [124; 127; 180]. Дегрануляция тучных клеток обеспечивает повышение в сыворотке крови базальных уровней их медиаторов, в частности триптазы, стабильных метаболитов простагландина D2, гистамина [288]. Значительное увеличение количества тучных клеток связано с активной выработкой эпителиальными клетками назальных полипов фактора стволовых клеток (SCF), отвечающего за дифференцировку, хемотаксис, выживание и активацию тучных клеток. Следует отметить, что уровень экспрессии указанного ростового фактора положительно коррелирует с количеством тучных клеток [124;145]. Недавние исследования показали заметное увеличение количества лейкоцитов, ассоциированных с тромбоцитами (тромбоцитарно-лейкоцитарных агрегатов) в образцах ткани назальных полипов у пациентов с аспириновой астмой по сравнению с контрольной группой лиц, толерантных к аспирину [161]. Более того, процент эозинофилов, нейтрофилов и моноцитов с адгезированными тромбоцитами был в несколько раз выше в крови пациентов с аспириновой астмой по сравнению с контрольной группой лиц, толерантных к аспирину [161; 302]. Тромбоцит-ассоциированные фракции каждого типа лейкоцитов экспрессировали более высокие уровни β1 и β2 интегринов, по сравнению с 41 фракциями лейкоцитов, неассоциированных с тромбоцитами. Эти результаты показывают, что тромбоцит-зависимый механизм может усиливать воспаление слизистой оболочки дыхательных путей у пациентов с аспириновой астмой с помощью прайминга (предстимуляции) лейкоцитов к поступлению их в воспаленную ткань [245]. Поскольку признаки хронического эозинофильного воспаления слизистой оболочки дыхательных путей развиваются за несколько лет до возникновения непереносимости НПВП (то есть непереносимость НПВП развивается при наличии воспалительного процесса в дыхательных путяхриносинусита и/или астмы), можно заключить, что хроническое эозинофильное воспаление служит фоном для индукции непереносимости НПВП [241; 273]. Предполагают, что первичными триггерами непереносимости НПВП и одновременно причиной хронического эозинофильного воспаления в слизистой оболочке дыхательных путей у больных с аспириновой астмой являются вирусы и бактерии [332; 333]. В последнее время широко обсуждается роль золотистого стафилококка в патогенезе ПРС и непереносимости НПВП [11; 148; 217; 223; 281; 314; 315; 327; 355]. Уровень цитокинов в сыворотке крови пациентов с астматической триадой. Зенкиной Л.В. и соавт. [29] были проведены клинические исследования по определению уровня цитокинов в сыворотке периферической крови больных с АТ в период обострения. Было выявлено повышение концентрации провоспалительных цитокинов IFN-γ, TNF-α (секретируются Тh-1типа и NK-клетками), усиливающих активность эозинофилов и NK клеток и в синергизме увеличивающих эозинофильный характер воспаления. «IFN-γ, TNF-α, действуя согласованно, вызывают усиление секреции молекул адгезии RANTES эндотелиальными клетками, которые в свою очередь 42 являются мощным хемоаттрактантами для эозинофилов. Поэтому увеличение концентрации указанных цитокинов у пациентов с АТ приводит к усилению эозинофильного воспаления слизистой оболочки дыхательных путей» [29]. Концентрация ИЛ-4 в сыворотке крови пациентов с АТ не имела достоверных отличий от таковой здоровых доноров [29]. 1.4.2.2. Роль медиаторов в патогенезе непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов. Метаболиты арахидоновой кислоты. Для воспалительного процесса в слизистой оболочке дыхательных путей у пациентов с заболеваниями органов дыхания, обостряющимися после приема аспирина, характерны различные нарушения метаболизма арахидоновой кислоты. Характерной чертой таких заболеваний является повышенная продукция цисЛТ, которые могут выступать в качестве медиаторов хронического воспалительного процесса в стенке дыхательных путей [127; 148; 214; 223; 244; 245; 314]. Тучные клетки, эозинофилы, лейкоциты с адгезированными тромбоцитами, представленные в изобилии в слизистой оболочке дыхательных путей таких пациентов, способны синтезировать цис-ЛТ [244]. Под действием цитозольной фосфолипазы А2 из фосфолипидов клеточных мембран высвобождается арахидоновая кислота. Арахидоновая кислота может подвергаться дальнейшим метаболическим превращениям как с помощью циклооксигеназной системы (с образованием ПГ и тромбоксанов), так и с помощью системы ферментов 5-липоксигеназы (5-ЛОГ) (с образованием ЛТ). Вначале с помощью 5-ЛОГ образуется 5-гидропероксиэйкозатетраеновая кислота (5-НЕТЕ), которая может превращаться в нестабильный эпоксид- ЛТА4. Последний может претерпевать дальнейший метаболизм в двух направлениях: соединяясь с водой, может превращаться 43 неэнтиматическим путем в дигидроксикислый ЛТВ4 или, соединяясь с глутатионом при участии фермента ЛТС4-синтазы, - в цистеиниловый ЛТС4. Далее ЛТС4 с помощью гамма-глютамилтранферазы превращается в ЛТД4 и затем с помощью дипептидаз - в ЛТЕ4. ЛТЕ4 подвергается дальнешим метаболическим изменениям [244]. В норме у человека небольшая, но постоянная часть ЛТЕ4 экскретируется в неизменном виде с мочой [35; 67]. У пациентов с аспириновой астмой определяется повышенное содержание ЛТЕ4 (в 3-6 раз) в моче и ЛТС4 в назальном секрете по сравнению с другими вариантами бронхиальной астмы [129; 149; 214; 219; 223; 261; 314; 357]. Провокация аспирином резко повышает количество ЛТЕ4 и ЛТС4 в моче, назальном секрете и бронхиальном лаваже у таких пациентов [129; 214; 223; 261; 311; 353]. Зная базальный уровень ЛТЕ4, можно прогнозировать силу бронхоспазма при проведении провокационных проб с аспирином [125]. Показан также высокий исходный уровень ряда продуктов ЛОГ-зависимого пути метаболизма арахидоновой кислоты: 5-НЕТЕ, 15-НЕТЕ, ЛТ-С4 в конденсате выдыхаемого воздуха у пациентов с аспириновой астмой [184; 192; 336]. Все цис-ЛТ (ЛТ-D4, ЛТ-С4 и ЛТ-Е4) вызывают бронхоспазм, приводят к развитию отека, повышают секрецию слизи [106; 250; 255]. Кроме того, ЛТЕ4, являясь самым слабым бронхоконстриктором из всех цис-ЛТ, способствует привлечению эозинофилов в дыхательные пути у больных БА [227]. ЛТ-С4 активирует тромбоциты и индуцирует развитие эозинофильного воспаления слизистой оболочки дыхательных путей [290], причем ЛТ-С4 активирует тромбоциты в крови исключительно через СysLT2R [154]. В экспериментах на животных было выявлено, что цис-ЛТ стимулируют развитие соединительной ткани и, следовательно, способствуют ремоделированию бронхов [114; 337]. Таким образом, цис-ЛТ могут способствовать развитию хронического воспаления в слизистой оболочке 44 дыхательных путей и процесса ремоделирования бронхов у пациентов с аспириновой астмой. Гиперпродукция цис-ЛТ у пациентов с аспириновой астмой может происходить в силу следующих причин. Тромбоциты, экспрессирующие ЛТС4-синтазу, могут превращать лейкоцитарный ЛТА4 в ЛТС4 в том случае, когда они адгезированы на лейкоцитах, экспрессирующих 5-ЛОГ [262; 291]. У лиц с аспириновой астмой наибольшая активность ЛТС4-синтазы выявляется в тромбоцитах, адгезированных выделенными из с лейкоцитами, при сравнении с гранулоцитами, периферической крови. Следует отметить, что уровень ЛТЕ4 в моче сильно положительно коррелирует с количеством эозинофилов, нейтрофилов и моноцитов, ассоциированных с тромбоцитами [161]. Иммуногистохимические исследования показали, что в эозинофилах бронхиальных и назальных биоптатов пациентов с аспириновой астмой имеется гиперэкспрессия ЛТС4-синтазы, при этом не было выявлено повышенного синтеза или повышенной активности 5-ЛОГ [214; 282]. Соответственно, эозинофилы периферической крови больных с аспириновой астмой экспрессировали большее количество мРНК ЛТС4-синтазы по сравнению с эозинофилами лиц, не имеющих непереносимости аспирина [187]. Процент тучных клеток и базофилов с активированной 5-ЛОГ был в несколько раз выше в биоптатах пациентов с аспириновой астмой по сравнению с лицами, не имеющими непереносимости аспирина [225]. Кроме того, ослабление экспрессии мРНК ЦОГ-2 [155; 193] и, следовательно, снижение выработки ПГЕ2 [165; 169], способного подавлять активность 5ЛОГ, также может способствовать гиперпродукции цис-ЛТ. Таким образом, гиперпродукция цис-ЛТ скорее всего связана со следующими факторами: увеличение активности 5-ЛОГ в тучных клетках, базофилах; повышение доступности субстрата ЛТА4 для ЛТС4-синтазы в 45 тромбоцитарно-лейкоцитарных агрегатах, увеличение количества гранулоцит-адгезированных тромбоцитов; увеличение экспрессии ЛТС4синтазы в эозинофилах; снижение выработки ПГЕ2, способного подавлять активность 5-ЛОГ [139; 241; 244]. Следует отметить, что в воспалительных клетках слизистой оболочки носовой полости пациентов с аспириновой астмой повышена активность лейкотриеновых рецепторов - цисЛТ1R, которые являются высокоаффинными рецепторами для ЛТ-Е4 [193; 194; 214; 242; 256; 314]. Это позволяет предположить наличие локальной гиперреактивности в отношении ЛТ. Аналогичный паттерн гиперэкспрессии цисЛТ1R в слизистой оболочке нижних дыхательных путей мог бы объяснить селективную гиперреактивность бронхов к ЛТ-Е4, выявляемую у пациентов с аспириновой астмой [105]. увеличение Другими количества исследователями клеток, установлено экспрессирующих значительное цис-ЛТ рецепторы (CysLT1R и CysLT2R) в ткани назальных полипов у пациентов с аспириновой астмой по сравнению с пациентами с БА и риносинуситами, не имеющими непереносимости аспирина [193]. Описано улучшение состояния больных с аспириновой астмой при применении антагонистов лейкотриенов, таких как Зафирлукаст (Аколат), Монтелукаст (Сингуляр). Данные препараты имеют сродство к рецепторам ЛТD4, ЛТЕ4 (цисЛТ1R) и блокируют эти рецепторы от активации лейкотриенами, быстро устраняя создаваемую лейкотриенами бронхиальную обструкцию [22; 61; 217; 243]. Рассмотренные данные говорят о ключевой роли цис-ЛТ в патогенезе заболеваний органов дыхания, обостряющихся после приема аспирина. Существует ряд доказательств, что цис-ЛТ опосредуют развитие НПВПиндуцированной крапивницы [119; 213; 264; 286; 325]. Во-первых, внутрикожные инъекции цис-ЛТ вызывают образование папулы или 46 вспышку реакции как у больных с хронической крапивницей, так и у здоровых лиц [325], причем при сравнении молярных концентраций цис-ЛТ являются в 100 раз более сильными, чем гистамин, по их способности вызывать кожные реакции [118]. Во-вторых, у пациентов с хронической крапивницей и непереносимостью НПВП также, как и у пацинетов с аспириновой астмой базальный уровень ЛТЕ4 повышен, при этом уровень последнего значительно увеличивается в ответ на прием аспирина [213; 264]. В-третьих, центральная роль цис-ЛТ в качестве медиаторов индуцированной аспирином и другими НПВП крапивницы косвенно подтверждается результатами исследований, демонстрирующих защитную роль антагонистов лейкотриеновых рецепторов [119]. В результате активации 5-ЛОГ также образуется ЛТ-В4. Главные действия ЛТВ4, по- видимому, состоят в привлечении и активации клеток, участвующих в воспалении, в первую очередь нейтрофилов и эозинофилов. ЛТВ4, как считается, играет важную роль в развитии гнойного воспаления, ревматоидного артрита и других воспалительных заболеваний. Однако, его роль в патогенезе БА, в том числе аспириновой, вызывает сомнения и остается неясной. Показано, что при БА антагонисты рецепторов к ЛТВ4 не оказывают влияния на раннюю и отсроченную фазы реакции на провокацию антигеном [35]. Продукты ЦОГ-зависимого пути метаболизма арахидоновой кислоты. Провоспалительные простагландины. Известно, что под действием ЦОГ из арахидоновой кислоты происходит образование циклических эндопероксидов (ПГG2, ПГН2). Затем при участии ферментов простагландин-синтетазы, простациклин-синтетазы и тромбоксан-синтетазы образуются ПГ (ПГЕ2, ПГF2α, ПГD2), простациклин (ПГI2) и тромбоксан А2 (ТХА2), соответственно [244; 313]. 47 Образование ТХА2 доминирует в тромбоцитах, но он может синтезироваться в моноцитах, тучных клетках, гранулоцитах. Он является мощным бронхоконстриктором [344], а также индуктором экспрессии молекул адгезии на эндотелиальных клетках [329]. В бронхоальвеолярном лаваже пациентов с аспириновой астмой обнаруживают более высокие уровни метаболитов ТХА2 по сравнению с таковыми у больных БА, не имеющих непереносимости аспирина [183], что потенциально отражает наличие тромбоцитов в слизистой оболочке дыхательных путей. Кроме того, ТХА2 может быть вовлечен в бронхоконстрикторные эффекты цис-ЛТ, поскольку увеличение сопротивления дыхательных путей, обусловленное ЛТС4 или ЛТЕ4 у морских свинок удавалось предотвратить с помощью селективного ингибитора ТХА2-синтазы [352]. Кроме того, индуцированная гистамином гиперреактивность бронхов человека, а также индуцированная ЛТЕ4 гиперреактивность бронхов морских свинок может быть заблокирована с помощью антагониста высокоаффинного рецептора для ТХА2 или с помощью предварительной обработкой тканей индометацином, блокирующим ЦОГ [341]. Образование ПГD2 доминирует в тучных клетках [292]. Базовые уровни метаболитов ПГD2 выше в сыворотке крови и в ткани назальных полипов у пациентов с аспириновой астмой по сравнению с больными БА, не имеющими непереносимости аспирина [102], что вероятно отражает активацию тучных клеток у таких больных. ПГD2 является бронхоконстриктором [297] и мощным хемоаттрактантом для эозинофилов [298; 313]. Постоянное образование ПГD2 в слизистой оболочке дыхательных путей у пациентов с аспириновой астмой вносит свой вклад в дисфункцию дыхательных путей и развитие эозинофильного воспаления [139]. В то время, как при приеме аспирина, как правило, происходит снижение уровня метаболитов ТХА2 в бронхоальвеолярном лаваже и в моче пациентов с 48 аспириновой астмой, уровень метаболитов ПГD2 не снижается и даже (в некоторых исследованиях) несколько возрастает [102; 129; 142; 296]. Данное явление, вероятно, связано либо с образованием разными типами клеток (тромбоцитами этих ЦОГ-производных и тучными клетками, соответственно), либо они образуются при участии различных изоформ ЦОГ у данных пациентов [244]. В этой связи примечательно, что экспрессия ЦОГ2 фермента выражена сильнее в тучных клетках биоптатов слизистой оболочки бронхов у пациентов с аспириновой астмой по сравнению с пациентами с БА, не имеющими непереносимости аспирина [186], что, возможно, объясняет постоянную продукцию ПГD2 у пациентов с аспириновой астмой. Противовоспалительные простагландины. ПГЕ2 уникален по своим бронхопротективным и противовоспалительным эффектам в дыхательных путях из всех продуктов ЦОГ [313]. Он оказывает ингибирующее влияние на образование 5-ЛОГ и, таким образом, контролирует продукцию цис-ЛТ, что является весьма актуальным для пациентов с аспириновой астмой [287]. Показано, что вдыхание ПГЕ2 предотвращает обструкцию дыхательных путей и увеличение ЛТЕ4 в моче в ответ на прием аспирина у пациентов с аспириновой астмой [228]. ПГЕ2 в значительной степени тормозит миграцию эозинофилов [301], что подавляет накопление последних в легких человека [303] и грызунов [300]. Кроме того, ПГЕ2 способен ослаблять пролиферацию фибробластов и синтез ими коллагена [216; 356]. Данные наблюдения показывают, что дефицит ПГЕ2 или нарушение функции клеточных рецепторов для ПГЕ2 также может иметь отношение к патогенезу аспирин-зависимых заболеваний органов дыхания [193; 223; 244; 308; 314]. ПГЕ2 синтезируется при участии ЦОГ-2 и микросомальной ПГЕ2-синтазы1. Эти два фермента коэкспрессируются в эпителиальных клетках, 49 фибробластах, макрофагах [259]. Имеются веские доказательства, что у больных аспириновой астмой нарушены синтез ПГЕ2 и функция ферментов ЦОГ-2 и микросомальной ПГЕ2-синтазы1в тканях дыхательных путей [139; 148; 241; 244; 299; 308]. Несмотря на то, что уровни ПГЕ2 метаболитов в моче у пациентов с аспириновой астмой аналогичны таковым у пациентов с БА, не имеющих непереносимости аспирина, в ткани назальных полипов у больных аспириновой астмой содержатся значительно более низкие уровни ПГЕ2 по сравнению с его содержанием в ткани полипов у больных БА без непереносимости аспирина [151]. Следует отметить, что уровни ПГЕ2 в ткани назальных полипов находятся в обратно пропорциональной зависимости от уровней цис-ЛТ. Показано, что лейкоциты периферической крови пациентов с аспириновой астмой производят меньше ПГЕ2 по сравнению с лейкоцитами пациентов с БА, не имеющих непереносимости аспирина [178]. Сообщают также о том, что эпителиальные клетки назальных полипов и фибробласты слизистой оболочки бронхов и ткани назальных полипов вырабатывают меньше ПГЕ2 [165; 169; 308; 320]. Кроме того, у таких пациентов ослаблена экспрессия мРНК ЦОГ-2 в слизистой оболочке носовых полипов по сравнению с нормальной слизистой облочкой носа и cлизистой полипов пациентов с БА, не имеющих непереносимости аспирина [155; 193; 308]. Следует отметить, что количество нейтрофилов, тучных клеток, эозинофилов, Т-лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы для ПГЕ2, ниже в биоптатах слизистой оболочки носа у пациентов с аспириновой астмой по сравнению с пациентами с БА, не имеющими непереносимости аспирина [132]. Аналогичные результаты были получены при изучении биоптатов слизистой оболочки бронхов [309]. Таким образом, уменьшение уровня ПГЕ2 в ткани дыхательных путей в сочетании со снижением экспрессии рецепторов для него снимает ингибирующее влияние ПГЕ2 на 5-ЛОГ, что сопровождается 50 гиперпродукцией цис-ЛТ эозинофилами, тучными клетками, нейтрофилами, тромбоцитами у пациентов с заболеваниями органов дыхания, обостряющимися после приема аспирина [139; 223; 244; 261; 309]. Кроме того, дефицит ПГЕ2 и нарушение функции его рецепторов будет содействовать постоянной активации тучных клеток и стимулировать хемотаксис эозинофилов, что может обуславливать развитие более мощного эозинофильного воспаления [241; 244; 374]. В процессе метаболизма арахидоновой кислоты по 15-ЛОГ пути образуются липоксины, обладающие противовоспалительными свойствами. Показано, что липоксины тормозят образование цис-ЛТ и эозинофильную инфильтрацию ткани грызунов в модели воспаления легких [274] и являются антагонистами цис-ЛТ1-рецепторов [322]. Сообщают также, что стимуляция ионофором кальция лейкоцитов периферической крови пациентов с аспириновой астмой приводит к высвобождению меньшего количества липоксина А4 по сравнению с пациентами с БА, не имеющими непереносимость аспирина [133; 134; 314]. Суммируя вышеизложенное, можно с уверенностью говорить об участии эйкозаноидов в патогенезе хронического эозинофильного воспаления слизистой оболочки верхних и нижних дыхательных путей и, возможно, непереносимости НПВП у больных с аспириновой асмой. Биогенные амины. Обсуждается патогенетическая роль биогенных аминов при непереносимости НПВП. Как уже указывалось ранее, при аспириновой астме в слизистой оболочке дыхательных путей обнаруживается огромное количество тучных клеток [124; 180]. В ходе астматических приступов, спровоцированных приемом аспирина, происходит активация и дегрануляция тучных клеток, что обеспечивает повышение уровней их медиаторов, включая биогенные амины, 51 в биологических жидкостях и ткани назальных полипов [142; 173; 211; 225; 230; 246; 288; 292; 307]. Показано повышение уровня медиаторов тучных клеток- гистамина [211; 246], триптазы [246; 288], стабильных метаболитов ПГD2 [288], нейтрофильного хемотаксического фактора [246] в сыворотке крови пациентов с аспириновой астмой после приема аспирина. При этом повышение базальных уровней медиаторов в сыворотке сочетается с нарушением вентиляционной функции легких, а также увеличением уровня гистамина и ЛТ4 в назальном секрете [246]. Предварительное применение кромогликата натрия, блокирующего освобождение медиаторов из тучных клеток, предотвращало развитие аспирин-индуцированного бронхоспазма. Поэтому полагают, что тучные клетки являются клетками-мишенями для НПВП, и, следовательно, участвуют в патогенезе непереносимости НПВП [67; 246]. Другие исследователи измеряли уровень метаболита гистамина (N- метилгистамина) в моче в течение 24 часов после внутривенного введения лизин-аспирина. Было выявлено более значительное увеличение экскреции N-метилгистамина (а также ЛТЕ4 и стабильного метаболита ПГD2- 9α,11βПГF2) у пациентов с аспириновой астмой по сравнению с пациентами с БА, не имеющими непереносимость аспирина [292]. Ferreri NR et al. [307] определили увеличение уровня гистамина после приема малых доз аспирина в носовых выделениях пациентов с аспириновой астмой, у которых повышенная чувствительность к аспирину проявлялась, как в виде риноконьюктивита, так и виде бронхоспазма. У больных аспириновой астмой, имеющих только бронхоспастические реакции на прием аспирина, повышения уровня гистамина в назальных выделениях обнаружено не было. Аналогичный результат был получен другими авторами [173; 230], которые отмечали увеличение уровня гистамина, триптазы и цис-ЛТ в назальном 52 секрете имеющих после приема аспирина у пациентов с аспириновой астмой, назоокулярные реакции после приема аспирина или других НПВП, что также свидетельствует об активации тучных клеток слизистой оболочки носа при развитии риноконьюктивита в ответ на прием аспирина. Szczeklik et al. [142] обнаружили значительное увеличение уровней гистамина, цис-ЛТ, ИЛ-5, эозинофильного катионного белка, количества эозинофилов в бронхоальвеолярном лаваже больных аспириновой астмой по сравнению с аспирин-толерантными астматиками через 15 минут после провокации лизин-аспирином. Bumsted RM et al. [212] анализировали уровни гистамина, норадреналина и серотонина методом флуоресцентной гистохимии в нормальной слизистой оболочке носа и ткани назальных полипов, исходя из возможной роли биогенных аминов в развитии воспаления и отека в ткани верхних дыхательных путей. Биогенные амины присутствовали в более высокой концентрации в ткани носовых полипов, чем в нормальной слизистой оболочке. У пациентов с аспириновой астмой определялись намного более низкие уровни гистамина в ткани носовых полипов, чем у всех других пациентов с полипами носа. Высокие уровни серотонина в плазме крови больных БА, включая аспириновую БА [122; 310], показывают, что серотонин, высвобождающийся преимущественно из тромбоцитов при БА [295], также вовлечен патофизиологию заболевания, причем увеличение плазменного уровня серотонина положительно коррелирует с клиническими проявлениями и нарушением показателей вентиляционной функции легких [224]. Таким образом, биогенные амины, высвобождающиеся из тучных клеток и тромбоцитов в большом количестве после приема аспирина у больных с аспириновой астмой, вовлечены в механизм развития данного заболевания и оказывают свои патофизиологические эффекты. 53 1.4.2.3. Роль оксида азота в патогенезе непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов. В последние годы в литературе большое внимание уделено оксиду азота (NO), физиологических являющемуся универсaльным процессов клеткaх функционирующему, как в и сигнальнaя регулятором оргaнизме молекулa в многих целом и межклеточных взaимодействий прaктически во всех оргaнах и ткaнях человека и животных [42; 60; 78; 271]. На сегодняшний день проведено немaло исследований по изучению роли оксида азота в патогенезе бронхиaльной aстмы. Многочисленными исследованиями устaновлено, что у больных бронхиaльной aстмой в выдыхаемом воздухе выявляется значительное повышение содержaния NO по сравнению с таковым у здоровых людей [37; 93; 95; 218; 221; 223; 236]. Известно, что повышение уровня NO в выдыхaемом воздухе зависит от нaличия воспaлительных изменений в бронхaх, которые влияют на aктивность индуцибельной NO-синтaзы [220; 235; 361]. Индуцибельнaя NO-синтaзa aктивируется в клетках под действием бaктериaльных липополисaхaридов, эндотоксинов, а также провоспaлительных цитокинов, таких как ИЛ-1β, ИФНγ, ФНО [60]. В клеткaх, находящихся в покое, она не определяется. Она образует и обеспечивает длительное выделение NO aктивированными мaкрофaгaми, нейтрофилaми, лимфоцитами, сосудистым эндотелием, микроглиальными клеткaми, aстроцитaми и др. Продуцируемый индуцибельной NO-синтaзой, NO, прежде всего, предназначен для зaщиты организма хозяина, способствует снижению aктивности погрaничных воспaлительных клеток, гибели микроорганизмов и внутриклеточных пaрaзитов, опухолевых клеток и др. эффекты [60]. Однако при определенных условиях (слишком высоких концентрaциях в ткaнях) NO способен усиливaть рaзвитие рядa 54 пaтологических процессов [276; 328]. Согласно современным предстaвлениям, они обусловлены обрaзованием продуктов метaболизма NO - сильнейших оксидaнтов - пероксинитритного aниона, пероксинитритной кислоты, приводящих к обрaзованию гидроксильного рaдикала, который, как известно, индуцирует процесс перекисного окисления липидов клеточных мембрaн [113; 345]. У больных БА накопление токсичных свободных радикалов приводит к усугублению процесса воспaления дыхательных путей за счет их токсического повреждения, увеличения сосудистой проницaемости, появления воспaлительного отекa[197]. Кроме того, высокие концентрaции NO в эпителиaльных или воспaлительных клеткaх, обрaзующиеся под воздействием цитокинов или эндотоксинов, могут подaвлять aктивность конститутивной NO-синтазы и угнетaть aктивность рaстворимой гуaнилaтциклaзы, что приводит к уменьшению продукции циклического гуaнозинмонофосфaтa, увеличению содержaния внутриклеточного Ca2+ и, в конечном счете, к бронхоспaзму [277]. Тaким обрaзом, NO, произведенный в физиологических количествах конститутивной NO-синтaзой, нaпрaвлен на поддержaние определенного ткaневого рaвновесия, в то время как NO, являющийся продуктом индуцибельной NO-синтaзы, усиливает воспалительные изменения в дыхaтельных путях при aстме [137]. При обострении aстмы имеется пaрaллельное увеличение количествa выдыхаемого NO, aктивности индуцибельной NO-синтaзы, а также высокотоксичного пероксинитритa [168]. Parikh A. et. al. [210]. В своих исследовaниях определили более высокий уровень aктивности индуцибельной NO-синтaзы в эпителии носовых полипов у пaциентов с АТ по срaвнению с тaковым у пaциентов с полипозом носа и aстмой без непереносимости aспиринa. 55 Таким образом, анализируя вышесказанное, можно заключить, что NO принимает участие в патогенезе БА, в том числе АТ. 1.4.2.4. Роль фагоцитов в патогенезе непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов. Появившиеся в исследованиях последних лет данные об участии тромбоцитов, лимфоцитов, тучных клеток, базофилов, полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПМЛ), эозинофилов в развитии непереносимости НПВП противоречивы и объясняют лишь отдельные звенья патогенеза непереносимости НПВП и не раскрывают путей поиска патогенетической терапии непереносимости НПВП [107; 136; 168; 232; 241; 244; 245]. Таким образом, проблема изучения механизмов непереносимости НПВП остается открытой. Установлено, что ПМЛ участвуют в патогенезе аллергических процессов в качестве клеток - эффекторов. При этом отмечается количественное функциональной изменение этих активности клеток (хемотаксис, в тканях, изменение способность поглощать их и переваривать бактерии, способность продуцировать АФК, ферментативная активность и др.) [16; 23; 39; 40; 59; 64; 67]. Данных об участии фагоцитов в патогенезе непереносимости НПВП немного. Исследование хемотаксической активности ПМЛ больных с аспириновой астмой и с аспирин-чувствительной крапивницей до и после провокации аспирином выявило постпровокационное увеличение хемотаксической активности ПМЛ у всех больных с аспирин-чувствительной крапивницей и у 50% больных с аспириновой астмой. Это увеличение связывают с дегрануляцией тучных клеток [128]. Интересно, что после проведения десенситизации к ацетилсалициловой кислоте прием 60 мг аспирина не сопровождался увеличением хемотаксической активности ПМЛ, 56 что, по мнению авторов, происходило вследствие отсутствия процесса дегрануляции тучных клеток. Был также обнаружен дефект в миграции гранулоцитов крови in vivo и in vitro у детей, имеющих родителей, страдающих аспириновой астмой [200]. Имеются сообщения, что лейкоциты периферической крови пациентов с аспириновой астмой производят меньше ПГЕ2, чем лейкоциты пациентов с БА, не имеющих непереносимости аспирина [178]. Вместе с тем, гранулоциты больных с аспириновой астмой продуцируют больше ЛТВ 4 и цис-ЛТ по сравнению с гранулоцитами здоровых доноров и больных с БА, не имеющих повышенной чувствительности к аспирину [302]. Выявлено заметное увеличение количества лейкоцитов, ассоциированных с тромбоцитами (тромбоцитарно-лейкоцитарные агрегаты) в образцах ткани назальных полипов у пациентов с аспириновой астмой по сравнению с контрольной группой лиц, не имеющих непереносимости аспирина [161]. Более того, процент эозинофилов, нейтрофилов и моноцитов с адгезированными тромбоцитами был в несколько раз выше в крови пациентов с аспириновой астмой по сравнению с контрольной группой лиц, не имеющих непереносимости аспирина [302]. Тромбоцит-ассоциированные фракции каждого типа лейкоцитов экспрессировали более высокие уровни β1 и β2 интегринов, по сравнению с фракциями лейкоцитов, неассоциированных с тромбоцитами. Эти результаты показывают, что тромбоцит-зависимый механизм может усиливать воспаление слизистой оболочки дыхательных путей у пациентов с аспириновой астмой с помощью прайминга (предстимуляции) лейкоцитов к поступлению их в воспаленную ткань [161; 245]. Таким образом, по имеющимся на сегодняшний день данным можно заключить, что фагоциты периферической крови участвуют в патогенезе псевдоаллергических процессов, к которым относится непереносимость НПВП. 57 1.4.2.5. Иммунологическая характеристика пациентов с непереносимостью нестероидных противовоспалительных препаратов. Наличие множественных очагов инфекции различной этиологии и локализации, их частые обострения, низкая эффективность стандартной терапии у больных с АТ могут свидетельствовать о том, что у этих лиц имеется недостаточность в защитных иммунных механизмах. Бондаревой Г.П. (2009 г.) были исследованы показатели иммунограммы 273 пациентов с АТ (табл.1) [9]. Все больные с АТ были разделены на три группы: группа 1АТ с атопической формой БА, группа 2- АТ со смешанной (инфекционно+неинфекционно-зависимой) формой АТ, группа 3- АТ с инфекционно-зависимой формой БА. «При сопоставлении показателей клеточного и гуморального иммунитета у больных разными формами БА существенных изменений в иммунограмме больных АТ не выявлено. Однако установлено достоверное снижение фагоцитарной функции нейтрофилов в группе больных АТ с инфекционно-зависимой формой БА и моноцитов во всех группах, что может быть связано с частыми инфекционными осложнениями, характерными в большей степени для больных инфекционно зависимой АТ» [9]. Также Бондаревой Г.П. [10] было проведено сравнительное изучение показателей местного иммунитета в назальном секрете больных АТ (n=154) при разных формах заболевания по уровню Ig класса A, As, G, M, E, D. В качестве контроля были обследованы пациенты с атопической (n=10) и инфекционно - зависимой БА без полипов и непереносимости НПВП (n=10) и 14 здоровых доноров. У больных АТ со смешанной формой БА и АТ с инфекционной формой БА отмечался дефицит IgAs в назальном секрете относительно контроля. Содержание IgM в назальном секрете в каждой из групп больных АТ было 58 Таблица 1 Показатели иммунного статуса у больных АТ (n=105), Бондарева Г.П. Показатель Нормальные значения n=25 1 группа 2 группа 3 группа n=23 n=22 n=35 (M±m) (M±m) (M±m) Лейкоциты, абс. (109/л) 6,451,48 6,5±0,19 6,6±0,15 6,2±0,26 Лимфоциты (%) 31,33,5 28±1,04 29±1,97 29±0,64 Лимфоциты, абс. (109/л) 1,900,45 1,9±0,09 1,91±0,05 1,81±0,1 CD3+ (%) 68,94,91 68±1,46" 64±1,18 64±1,49 CD3+ абс. (109/л) 1,40,35 1,3±0,08 1,27±0,07 1,17±0,08 CD3+CD4+ (%) 42,34,98 41±1,04 37±0,74˚ 43±1,07 CD3+CD4+ абс. 0,790,23 0,76±0,04 0,7±0,02˚ 0,77±0,02 CD3+CD8+ (%) 30,65,03 29±1,25 29±0,84 28± 0,85 CD3+CD8+ абс. 0,500,18 0,56±0,04 0,570,03 0,51±0,04 CD3+CD4+ / CD3+CD8+ 1.80,47 1,5±0,06 1,4±0,07˚ 1,6±0,06 CD19+ (%) 11,64,1 9,3±0,48 11,4±0,78 10±0,85 CD19+ абс. 0,240,13 0,17±0,09 0,22±0,01 0,18±0,01 94,49,8 75±1,67 71 ±1,69 77± 1,49 Моноциты 85,15,3 65±1,46 71± 1,35 71±1,07 IgA , мг% 206,026,0 206±12,97 193± 10,13 205± 13,86 IgG, мг% 1427,5182,0 1436±41,88 1320± 50,67 1485 ±92,54 IgM, мг% 188,340,5 205±6,46 170± 8,78 184 ±12,31 Фагоцитоз S.aureus в цельной крови (%:) Нейтрофилы Примечания: * – достоверные различия по критерию Стьюдента (р<0,05) между контрольными значениями и показателями в группах. 59 достоверно выше, чем в контроле (p<0,05), причем минимальная концентрация IgM наблюдалась у пациентов с инфекционно-зависимой формой БА. Средние значения концентрации IgG в назальном секрете у всех пациентов с АТ и БА без ПРС были достоверно выше, чем у здоровых лиц (p<0,05). Наибольшие значения концентрации IgE были выявлены у больных АТ с атопической формой БА и АТ со смешанной формой БА, что было достоверно выше, чем у пациентов с АТ с инфекционно-зависимой формой БА, а также в группах контроля (p<0,05). У больных с АТ отмечалось увеличение содержания IgD в назальном секрете, однако статистически значимым это повышение было лишь в группе АТ с инфекционно-зависимой формой БА (p<0,05). Таким образом, Бондаревой Г.П. было выявлено, что показатели иммунного статуса пациентов при всех формах АТ характеризовались снижением количества и функциональной активности фагоцитов, снижением мукозального иммунитета (sIgA в смывах из полости носа), высокими титрами антител к хроническим внутриклеточным инфекциям [10]. Другой группой исследователей также изучался иммунный статус 26 пациентов с АТ [29]. При исследовании клеточного звена иммунитета было выявлено увеличение числа NK клеток и угнетение супрессорных и хелперных клонов лимфоцитов. Изменения гуморального звена иммунитета проявлялись повышением уровня IgG и IgE относительно контроля. Однако значения IgE не превышали диапазона общепринятой нормы. Вместе с тем, выявлялось снижение продукции IgM и IgA. По мнению авторов, «приоритетный синтез IgG характеризует изменения, наиболее специфичные для механизмов вторичного иммунного ответа в ответ на присутствие токсинов и патогенов, а также активацию механизмов развития реакции антителозависимой клеточной цитотоксичности». Снижение уровня IgA в 60 сыворотке периферической крови у всех больных БА свидетельствует о снижении барьерной функции слизистой оболочки дыхательных путей [29] . Ряд исследователей выявили высокий уровень специфических IgE-антител к стафиллококковым энтеротоксинам в сыворотке крови и ткани носовых полипов у больных с аспирин-зависимыми заболеваниями органов дыхания [281; 315; 327; 355]. Van Zele и соавт. [355] в своей работе показали, что наличие у пациента с полипозным риносинуситом непереносимости аспирина и бронхиальной астмы, повышает распространенность стафилококковой колонизации слизистой оболочки носовых путей до 87,5%, при этом IgE-антитела к стафилококковым энтеротоксинам обнаруживают в 80% случаев. Также установлено, что уровень колонизации золотистого стафилококка в среднем носовом ходе у пациентов с полипозом носа прямо пропорционален содержанию специфических IgE-антител к его энтеротоксинам [281]. В среднем, уровень общего IgE в сыворотке периферической крови несколько увеличен у пациентов с АТ по сравнению с лицами, не имеющими БА, но ниже уровня общего IgE у пациентов с атопической БА без непереносимости НПВП [315; 334]. Показатели иммунограммы пациентов с непереносимостью НПВП, проявляющейся в виде поражения кожных покровов - крапивницей/отеком Квинке, не имеют каких-либо характерных особенностей. Возникающие изменения в иммунограмме у таких пациентов определяются изменением показателей иммунитета при наличии других заболеваний [118]. 61 1.5. Влияние биологически активных веществ на продукцию активных форм кислорода и азота фагоцитами. 1.5.1. Влияние цитокинов на продукцию активных форм кислорода и азота фагоцитами. Цитокин-индуцированная стимуляция фагоцитов широко обсуждается в литературе [47; 48; 71; 83; 205; 240]. Среди наиболее активных специфических стимуляторов фагоцитов можно выделить группу провоспалительных цитокинов: ГМ-КСФ, фактор некроза опухоли (ФНО), ИЛ-1, ИЛ-6 (Naga I., 1993). Никанкиной Л.В. и соавт. [48] изучалось комплексное действие цитокинов на мононуклеарные фагоциты периферической крови человека и перитонеальные макрофаги крыс на модели, максимально приближенной к условиям регуляции функций фагоцитов в условиях жизнедеятельности организма. В своей работе они использовали комбинацию природных цитокинов: ИЛ-1β (3200 ± 530 ЕД/мг белка), ИЛ-6 (700 ± 100 ЕД/мг белка), ФНО-α (212 ± 53 ЕД/мг белка), фактор ингибирования миграции макрофагов (МИФ) (3200 ± 80 ЕД/мг белка), трансформирующий фактор роста β (ТФРβ) (5860 ±230 пг/мг) [240]. Было выявлено, что комплекс природных цитокинов (в дозах 0,1-1 мкг/мл) способен праймировать мононуклеарные фагоциты крови человека и перитонеальные макрофаги крыс к усилению продукции АФК, что сопровождается увеличением интенсивности стимулированной зимозаном люминол-зависимой ХЛ. Оказалось, что исследованный комплекс природных цитокинов обладает более выраженной праймирующей активностью по сравнению с рекомбинантными цитокинами ФНО-α и ИЛ1β, что, по-видимому, происходит в результате синергичного действия цитокинов, входящих в его состав. Праймирующая способность изучаемых цитокинов увеличивалась в ряду: ФНО-α <ИЛ-1β <комплекс цитокинов. Полученные результаты свидетельствуют, что продукция АФК моноцитами 62 периферической крови человека может регулироваться путем цитокинзависимого прайминга клеток. Известно, что трансдукции прайминг может являться сигнала взаимодействия результатом модификации стимулятор-рецептор на внутриклеточные ферментативные системы и последующей активацией этих систем (Клебанов Г.И., 1999). При изучении механизмов праймирующего действия комплекса природных цитокинов на окислительный метаболизм фагоцитов Никанкиной Л.В. и соавт. было обнаружено: во-первых, увеличение активности НАДФН-оксидазы в процессе прайминга комплексом цитокинов, что свидетельствует о сборке фермента НАДФН-оксидазы; вовторых, увеличение внутриклеточного кальция более, чем в 4 раза в макрофагах, праймированных комплексом цитокинов [48]. В этой же работе было показано, что комплекс природных цитокинов индуцировал выработку NO перитонеальными макрофагами крыс, увеличивая ее в 2 раза, причем моноциты периферической крови человека не продуцировали значимых количеств NO в ответ на стимуляцию комплексом природных цитокинов и рекомбинантным ИЛ-1β. Другими исследователями также была установлена способность низких доз ФНО-α предактивировать и активировать крысиные перитонеальные макрофаги, повышая способность последних к продукции АФК, что сопровождалось увеличением зимозан-зависимой хемилюминесценции [8]. Ярилин А.А [99] в своей работе отметил интересный факт, что стимулирующая активность ФНО-α в отношении высвобождения АФК адгезированными ПМЛ феноменальна: оптимальная концентрация этого цитокина на 3-5 порядков ниже, а высвобождение АФК в 10-100 раз выше, чем при действии других естественных стимуляторов (С5а, ЛТВ4, арахидоновая кислота) [99]. 63 Был опубликован рекомбинантного ряд работ, ИЛ-1 в человека которых на исследовалось кислородный влияние метаболизм фагоцитирующих клеток при различных заболеваниях [31; 71]. На сегодняшний день известно, что ИЛ-1 обладает способностью опосредованно стимулировать функции ПМЛ. Преинкубация ПМЛ человека с ИЛ-1 усиливает способность последних отвечать на другие стимулы, повышая продукцию супероксидных радикалов и вызывая усиление фагоцитоза (Ogle J.D., et al., 1990; Yagisawa M., 1995). Варюшиной Е.А. и соавт. [71] изучалось ранозаживляющее действие мазевой формы рекомбинантного ИЛ-1 человека у пациентов с длительно незаживающими ранами и трофическими язвами нижних конечностей на фоне хронической венозной недостаточности, варикозного расширения вен или сахарного диабета I и II типов. Показано, что при применении мазевой формы ИЛ-1 происходило увеличение показателей спонтанной продукции супероксидных радикалов нейтрофилами по сравнению с исходными значениями и контрольной группой (p<0,05). Уровень продукции активных форм кислорода нейтрофилами, полученными из очага воспаления, оценивали в НСТ-тесте на стеклах (Och H.D. et al., 1973). Также, происходило выраженное усиление процессов фагоцитоза после применения ИЛ-1, что обеспечивало очищение раны от некротических тканей и микроорганизмов, и в дальнейшем, предохраняло рану от развития вторичной инфекции. Фагоцитарную активность нейтрофилов в очаге воспаления оценивали с использованием опсонизированных дрожжей и подсчитывали результаты под микроскопом (Root R.K. et al., 1975). Конусовой В.Г. и соавт. [31] было проведено исследование влияния рекомбинантного ИЛ-1β на индуцированную ФМА люминол-зависимую ХЛ цельной крови больных с хроническими вирусными гепатитами В и С. Показано, что курс из 10 внутривенных, капельных инъекций 64 рекомбинантного ИЛ-1β через день в дозе 7–8 нг/кг веса увеличивал индуцированную ФМА люминол-зависимую ХЛ цельной крови до уровня показателей здоровых индивидуумов. Benbarek H et al. [174] изучали возможность прямой стимуляции цитокинами ИЛ-1β и ФНО-α окислительной активности выделенных из крови лошадей ПМЛ. Было выявлено выраженное дозозависимое увеличение интенсивности люминол- и люцигенин-зависимой ХЛ под действием указанных цитокинов. При этом увеличение использовании интенсивности низких доз данных ХЛ уже цитокинов, наблюдалось при эквивалентных их концентрации в плазме крови. Следует отметить, что ХЛ ответ, полученный с ФНО-α был более выраженным в реакции с люминолом, нежели чем с люцигенином, в то время у ИЛ-1β наблюдалась обратная ситуация. В других опытах Staphylococcus ИЛ-1, aureus ФНО-α и нейтрофилами ИФН-γ человека усиливали и их фагоцитоз бактерицидную активность [66]. Показано, что инкубация ПМЛ с ИФН-γ в течение 24 часов увеличивала ХЛ ПМЛ, стимулированных Staphylococcus aureus, опсонизированным зимозаном и форболмеристатацетатом (ФМА). Воздействие ФНО также увеличивало ХЛ ПМЛ [141]. Wittler RR et al. [146] исследовали влияние рекомбинантного ИФН-γ на окислительную активность ПМЛ новорожденных и взрослых особей крыс хемилюминесцентным методом. ИФН-γ повышал интенсивность хемилюминесценции ПМЛ как у новорожденных, так и у взрослых особей, причем у новорожденных особей этот эффект был выражен в меньшей степени. Аналогичный результат был получен и другими авторами при изучении воздействия человеческого рекомбинантного ИФН-γ на ПМЛ. Показано, что инкубация ПМЛ с рекомбинантным ИФН-γ в течение 1 ч сопровождается 65 увеличением интенсивности зимозан- и ФМА – зависимой ХЛ ПМЛ. При этом ИФН-α2 не оказывал подобного эффекта на окислительный метаболизм ПМЛ [269]. Считают также, что ИЛ-6 и ИЛ-8, ассоциированные с мембраной моноцитов, изменяют в условиях межклеточного контакта функциональную активность ПМЛ. Так, моноциты периферической крови человека, активированные липидом А, значительно повышают фагоцитарную активность в отношении Candida albicans ПМЛ лишь в условиях межклеточного контакта. Отмена этого эффекта наблюдалась при обработке моноцитов моноклональными антителами против проинкубированные рекомбинантного с супернатантом ИЛ-6 и ИЛ-8. культуры ПМЛ, мононуклеаров периферической крови, активированных липидом А, усиливают фагоцитоз. Эффект блокировался после обработки супернатанта антителами к ИЛ-6 и ИЛ-8 [188]. Возможно. ИЛ-8 оказывает влияние через активацию фосфолипазы Д в клетках, на которую он действует время- и дозозависимо [104; 175]. Ряд авторов исследовали противовоспалительную активность рекомбинантного цитокина ТРФ-β по его способности ингибировать образование АФК и нитроксидных радикалов [58; 83; 205]. Heck D. et. al. (1992 г.) определяли влияние рекомбинантного ТРФ-β на продукцию супероксидных и нитроксидных радикалов кератиноцитами [34]. Было выявлено, что ТРФ-β ингибировал образование нитроксидных радикалов, что несомненно также указывает на его противовоспалительную активность. Еричев В.П. и соавт. (1999 г.) [83] для определения противовоспалительной активности ТРФ-β измеряли хемилюминесценцию модельной системы гемоглобин - пероксид водорода - люминол [58] без ТФР-β и с добавлением различных концентраций ТФР-β. Добавление в модельную систему ТРФ-β в количествах от 1 до 100 нг вызывало 66 дозозависимое уменьшение максимальной интенсивности ХЛ модельной системы. Количество ТРФ-β, вызывающее уменьшение максимальной интенсивности хемилюминесценции модельной системы на 50%, составляло 0,01 мкг (0,4 нМ). Никанкина Л.В. (1999 г.) исследовала влияние ТФР-β1 на люминол-зависимую ХЛ фагоцитов периферической крови человека и перитонеальных макрофагов крыс [48]. Установлено, что прединкубация фагоцитов с противовоспалительным цитокином ТФР-β1 приводила к ингибированию люминол-зависимой ХЛ. Изучалось влияние противовоспалительного цитокина ИЛ-4 на адгезионные свойства и окислительный метаболизм ПМЛ. Показано ингибирующее действие указанного цитокина как на процесс адгезии ПМЛ, так и на связанный с последним процесс образования АФК ПМЛ [49]. Исследовали воздействие противовоспалительного цитокина ИЛ-10 на фагоциты периферической крови человека хемилюминесцентным методом в присутствии и отсутствии ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНО-α. Инкубация фагоцитов в течение 3-х часов с ИЛ-10 в отсутствии провоспалительных цитокинов не сопровождалось изменением продукции АФК ПМЛ и моноцитами. ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНО-α, напротив, оказывали праймирующее действие на продукцию АФК фагоцитами. При этом ИЛ-10 не влиял на прайминг-эффект провоспалительных цитокинов. Полученные результаты показывают, что ИЛ-10 не контролирует активацию фагоцитов в крови [215]. Анализируя результаты вышеупомянутых экспериментальных исследований, можно сделать вывод, что провоспалительные цитокины оказывают праймирующее влияние на фагоциты к усилению продукции АФК в ответ на разные стимулы, что сопровождается увеличением интенсивности люминол- и люцигенин-зависимой ХЛ. Противовоспалительные цитокины, в частности, ТФР-β, ИЛ-4, напротив, снижая продукцию АФК, способны оказывать ингибирующее влияние на ХЛ. 67 Кроме того, выработку провоспалительные NO фагоцитами. цитокины ТФР-β, способны напротив, стимулировать угнетал продукцию нитроксидных радикалов. 1.5.2. Влияние медиаторов на хемилюминесценцию фагоцитов. Респираторный взрыв фагоцитов может регулироваться активацией 5ЛОГ пути и образованием ЛТВ4, стимулирующего продукцию АФК фагоцитами [177; 202]. Известно также, что фагоциты экспрессируют рецепторы cysLTR1, уровень которых ниже по сравнению с таковым на тучных клетках, базофилах, макрофагах, моноцитах, эозинофилах [280]. Воздействие ЛТС4 и ЛТD4 на ПМЛ приводило к незначительной активации мобилизации Са2+, а также умеренной продукции оксида азота и АФК по сравнению с воздействием ЛТВ4 и других мощных хемоаттрактантов для ПМЛ [103; 206; 251; 280]. Однако установлено праймирующее действие цисЛТ на ПМЛ, то есть цис-ЛТ сенсибилизируют ПМЛ к повышению продукции АФК под воздействием вторичных стимулов, в частности формилметиониллейцилфенилаланина (ФМЛФ) [251]. Этот эффект ослаблялся при использовании экспериментальных антагонистов cysLTR (SKαF 104353) [103; 280] или монтелукаста [251]. Anderson R. et al. (2009 г.) [272] показано, что после предварительной обработки ПМЛ антагонистами cysLTR монтелукастом, пранлукастом или зафирлукастом (0,25-2мкМ), стимуляция клеток хемоаттрактантом ФМЛФ (1мкМ) сопровождалась дозозависимым ингибированием люцигенин-зависимой ХЛ, что свидетельствовало об угнетении продукции супероксидных анион радикалов. Следует отметить, что указанные антагонисты cysLTR дозозависимо ингибировали дегрануляцию активированных ФМЛФ ПМЛ, в частности, высвобождение эластазы [229], а также продукцию ЛТВ4 активированными ТАФ ПМЛ, причем наиболее выраженное подавляющее воздействие на 68 продукцию ЛТВ4 ПМЛ наблюдалось у зафирлукаста [162]. Сообщают также о неспецифической ингибирующей активности антагонистов cysLTR в отношении ПГЕ, что, вероятно, лежит в основе их противовоспалительных эффектов [229; 272]. Предполагают, что антагонисты cysLTR подавляют провоспалительную активность нейтрофилов с помощью цАМФ-зависимого механизма [229; 272]. Воздействие цис-ЛТ на моноциты/макрофаги активирует миграцию последних, продукцию ими АФК, ИЛ-8, эндотелиального фактора роста и другие провоспалительные эффекты [156; 157; 158; 159; 160; 252; 253; 254]. Изучали действие ПГ на люминол-зависимую ХЛ ПМЛ человека, стимулированных стафилоккоковым дельта-токсином [350]. Было показано, что ПГЕ1 и ПГJ2 в концентрации 10 мкм угнетали ХЛ-ответ на 90% и 33%, соответственно. Чем больше была концентрация ПГ, тем выше был эффект тушения. Инкубация ПМЛ с аналогом ПГЕ1 - мизопростолом также подавляла генерацию О2 при ответе на ФМЛФ. В то же время мизопростол увеличивал ингибирующее воздействие салицилата натрия и других НПВП на целый ряд функций ПМЛ (дегрануляция, агрегация, увеличение цитоплазматического Са2+). Однако, мизопростол и НПВП не ингибировали продукцию О2 в ответ на ионофор А 23187 или форболмиристатацетат (ФМА) [238]. Таким образом, стимулы, не увеличивающие концентрацию цАМФ в клетке и не запускающие G-протеин-зависимые пути, не изменяют своего действия под влиянием ПГЕ1 или НПВП. Исследовали влияние простагландина E1, простагландина Е2, индометацина, гистамина на ХЛ бычьих ПМЛ. Добавление ПГE1, ПГE2, индометацина и гистамина к выделенным ПМЛ сопровождалось значительным подавлением ХЛ ПМЛ. Подавление зависило от дальнейшего присутствия ПГE1, ПГE2 и гистамина в культуральной среде. Тем не менее, подавляющее действие индометацина оставалась даже после того, как он был удален из 69 культуральной среды. Интенсивность ХЛ ПМЛ была ингибирована высокими концентрациями индометацина и гистамина [231]. Влиянию биогенных аминов (гистамина, серотонина) на ХЛ ПМЛ посвящено много исследований [17; 55; 72; 181; 189; 231; 248; 268; 283]. Гистамин поразному воздействует на продукцию АФК и, следовательно, на ХЛ ПМЛ. Показано, что вызванная Н2О2 ХЛ ПМЛ ингибировалась высокими концентрациями этого медиатора. [189]. Высокие концентрации гистамина (10-5М) подавляли ХЛ ПМЛ при стимуляции последних ФГА, в то время как низкие концентрации вызывали незначительное усиление ХЛ ПМЛ у больных аутоиммунными заболеваниями [268]. Аналогичный результат был получен другими авторами [55], когда зависимую ХЛ использование ПМЛ при кетотифена гистамин подавлял люминол3х10-5М. концентрации (Н1-блокатора) и интала Вместе с тем, сопровождалось подавлением продукции АФК ПМЛ [72]. Показано также, что большинство Н1-антигистаминных препаратов первого и второго поколения (бромадрил, бромфенирамин, циклизин, дитиаден, хлорциклин, хлорменирамин, клемастин) оказывают ингибирующий эффект на интенсивность ХЛ фагоцитов [270]. Кроме того, они способны влиять на синтез NO макрофагами, стимулированными ЛПС. Максимально высокая активность наблюдалась у бромадрила, клемастина и дитиадена, поскольку они подавляли экспрессию индуцибельной NO-синтазы, что сопровождалось значительным снижением уровней нитрита [270]. Воздействие селективного Н2-агониста димаприта сопровождалось угнетением ХЛ ПМЛ [283]. Использование ранитидина и циметидина- селективных Н2-антагонистов блокировало угнетающее действие гистамина на ХЛ ПМЛ, при этом Н1антагонист мепирамин не вызывал такого эффекта. Следовательно, ингибирующий эффект гистамина на ХЛ ПМЛ может быть опосредован через Н2-рецепторы [55; 268; 283]. Циметидин усиливал стимуляцию ХЛ 70 ПМЛ под влиянием малых доз гистамина (10-8-10-10М) [181]. Следует отметить, что гистамин по- разному действует на ХЛ цельной крови и выделенных ПМЛ [17; 248]. Показано, что гистамин подавлял ХЛ цельной крови при концентрации 1,5х10-3М, а выделенных ПМЛ при концентрации 8х10-5М [248]. Н1-антогонист дифенгидрамин усиливал ингибирующее действие гистамина на ХЛ выделенных ПМЛ. Н2-антагонист циметидин блокировал подавление гистамином ХЛ ПМЛ и не изменял эффект указанного медиатора на ХЛ цельной крови [248]. Можно предположить, что гистаминовые рецепторы экспрессируются по-разному в присутствии и в отсутствии плазменных факторов. Искусных и соавт. (2008 г.) [17] исследовали влияние гистамина (10–5÷10–2 моль/л) на продукцию АФК выделенными ПМЛ и ПМЛ в составе цельной крови доноров. Добавление гистамина (10–4 моль/л) в кровь сопровождалось у одних доноров повышением, а у других- снижением интенсивности люцигенин-зависимой ХЛ крови, что косвенно свидетельствовало об увеличении или угнетении активности НАДФН-оксидазы ПМЛ, соответственно. Чтобы понять механизм такого неоднонаправленного действия гистамина на ПМЛ, авторы провели исследования по изучению по влиянию данного медиатора (10–4 моль/л) на суспензию ПМЛ. Выявлена активация НАДФН-оксидазы и снижение активности миелопероксидазы (МПО) суспензии ПМЛ у всех доноров. По мнению авторов, обратная связь люцигенин-зависимого ХЛ-ответа с активностью МПО при используемой концентрации биогенного амина является результатом последовательного ряда событий, развивающихся при взаимодействии гистамина с мембранами ПМЛ. Существует мнение [343], что НАДФН-оксидазная и миелопероксидазная активности ПМЛ в определенных условиях могут компенсировать друг друга. Так, недостаток активности МПО компенсируется возрастанием продукции супероксидного анион радикала, и, 71 вероятно, альтернативным метаболизмом перекиси водорода, при котором последняя превращается не в гипохлорит, а, например, в гидроксильные радикалы. Полученные авторами данные подтверждают предположение о возможности взаимной функциональной компенсации НАДФН-оксидазы и миелопероксидазы фагоцитов доноров. Наличие на мембране ПМЛ двух типов гистаминовых рецепторов противоположного характера действия само по себе обуславливает возможность корригирующего влияния гистамина на функциональную активность клетки, что и подтверждено в экспериментах с добавлением гистамина к цельной крови и к суспензии ПМЛ: инкубация суспензии ПМЛ доноров с гистамином (с учетом разведения —10–6 моль/л) приводила к увеличению интенсивности люцигенинзависимой хемилюминесценции клеток, тогда как добавление гистамина к цельной крови оказывало корригирующее действие на активность НАДФН- оксидазной ферментной системы, что, вероятно, связано с различным исходным содержанием биогенного амина в крови доноров. Показано модулирующее влияние биогенных аминов дофамина, серотонина, гистамина, мелатонина и аминокислоты триптофана на генерацию АФК изолированными перитонеальными макрофагами крыс по данным хемилюминесцентного анализа [6]. Установлено, что гистамин ингибирует спонтанную и индуцированную опсонизированным зимозаном ХЛ суспензии резидентных макрофагов примерно на 20% при концентрации 10-4 М, не оказывая влияния на генерацию АФК при более низком его содержании в клеточной системе. Ранее проведенные авторами исследования позволили установить, что гистамин ингибирует генерацию АФК в ПМЛ и цельной крови, однако данный эффект лишь частично обусловлен активацией специфических рецепторов, в то же время установлена способность АФК стимулировать выделение гистамина из тучных клеток [147]. 72 Серотонин дозозависимо ингибировал макрофагальную продукцию АФК [6]. При концентрации серотонина 10-4 М наблюдалось подавление спонтанной и индуцированной ХЛ на 50% и 60%, соответственно. Концентрации серотонина ниже 10-6 М не влияли на индуцированную ХЛ, в то же время отмечалась тенденция к усилению спонтанной ХЛ при таких низких концентрациях серотонина, как 10-9-10-7 М. Предшественник серотонина – аминокислота триптофан – качественно аналогично модулировал макрофагальную генерацию АФК: при концентрациях 10-6-10-5 М отмечалось усиление спонтанной ХЛ на 50%, сменявшееся ингибированием при концентрациях, превышающих 10-4 М. При концентрации 10-3 М подавление спонтанной ХЛ составляло 42% [6]. Таким образом, в результате проведенного исследования установлено, что биогенные амины являются эффективными модуляторами клеточной генерации АФК. Физиологические и субфизиологические концентрации дофамина, серотонина и триптофана стимулируют фагоцитарную генерацию АФК in vitro, тогда как высокие концентрации (выше 10-5 М) дофамина, гистамина, серотонина и мелатонина подавляют этот процесс [6]. Ингибирующее фагоцитов влияние объясняется серотонина его на способностью окислительный метаболизм индуцировать образование эндогенной цистионин-β-синтетазы, обеспечивающей торможение процессов генерации АФК [75]. S.C. Stenton et al. [289] исследовали влияние тромбоцит-активирующего фактора (ТАФ) на ХЛ фагоцитов бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ) пациентов с БА. Выявлено, что ТАФ не оказывал влияние на люминолзависимую ХЛ ПМЛ БАЛ. При этом окислительная активность альвеолярных макрофагов БАЛ в значительной степени связана с ТАФ, что подтверждалось увеличением интенсивности люцигенин – зависимой ХЛ макрофагов под влиянием ТАФ in vitro. Легочные макрофаги были метаболически активнее 73 (по параметрам хемилюминесценции) у пациентов с БА, БАЛ которых содержал ТАФ, по сравнению с больными эмфиземой легких и здоровыми донорами, в БАЛ которых не было ТАФ. Поэтому усиление интенсивности люцигенин-зависимой ХЛ легочных альвеолярных макрофагов пациентов с БА, возможно, связано с предварительным воздействием ТАФ на макрофаги in vivo. Таким образом, медиаторы, используя разные механизмы, способны изменять активность ПМЛ, модифицируя в них продукцию АФК и, следовательно, изменяя ХЛ. 1.6. Современные методы диагностики непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов В связи с тем, что в последние годы стремительно растет количество больных, страдающих повышенной чувствительностью к НПВП, имеется острая необходимость в диагностических лабораторных методиках. Как правило, реакции непереносимости НПВП по своим механизмам развития являются псевдоаллергическими [67], что не позволяет использовать обычные аллерго-тесты для их своевременного выявления и диагностики до развития осложнений. Между тем, реакции непереносимости НПВП могут включать в себя такие жизнеугрожающие состояния, как бронхиальная астма, отек Квинке, анафилактоидный шок. Поэтому до начала применения НПВП необходима дешевая методика быстрого скринингового выявления пациентов с непереносимостью НПВП, что позволит снизить побочные эффекты лекарственной терапии. Перспективными в настоящее время считаются тесты in vitro нового поколения, позволяющие изучать аспиринспецифическую активацию лимфоцитов периферической крови, такие как сульфидолейкотриеновый тест (FLOW-CAST) [237], тест генерации 15- гидроксиэйкозатетраеновой кислоты лимфоцитами периферической крови (ASPITest) [134]. Однако, к сожалению, 74 методики, разработанные в условиях in vitro, не всегда чувствительны и специфичны, являются весьма дорогостоящими и требуют специально обученных сотрудников. В практической деятельности врача – аллерголога широко используется микропровокационный тест торможения естественной миграции лейкоцитов in vivo в полости рта по А.Д.Адо (ТТЕМЛ), разработанный еще в 80 годах прошлого столетия [1]. Однако данное исследование представляет трудности у пациентов с острыми воспалительными и дегенеративными заболеваниями полости рта, верхних и нижних дыхательных путей в связи с наличием значительного количества ПМЛ в смывах с полости рта. Оценка результатов сложна у маленьких детей, а также у пациентов с малым количеством зубов или их отсутствием, у больных, перенесших синдром Лайела и Стивенс Джонсона, в связи с низким содержанием ПМЛ в ротовой полости. Микропровокационный тест не применяется у больных, перенесших анафилактический шок, и ограничен в применении при невозможности пациента выполнить указания врача [1]. В клинической практике диагноз повышенной чувствительности к НПВП основывается, главным образом, на рискованных провокационных тестах. Так, подъязычный провокационный тест с аспирином и другими НПВП до сих пор остается стандартом в диагностике непереносимости данных препаратов, однако у ряда больных при проведении теста могут развиться жизнеугрожающие состояния [241]. Помимо лекарственных препаратов, негативные реакции у людей нередко вызывают пищевые добавки [34; 67]. Так, например пищевой краситель желтого цвета тартразин (Е102), широко используемый в России в пищевой и фармакологической промышленности, часто вызывает побочные эффекты, такие как бронхоспазм, крапивница, отек Квинке, ринит, дерматит, мигрень, нарушение зрения и др. [34]. В одних случаях, являясь гаптеном, 75 тартразин образует комплексы с белком, например, с сывороточным альбумином, и становится полноценным антигеном, на который в организме вырабатываются антитела. В этом случае развиваются истинные аллергические реакции на тартразин. В других случаях, тартразин может выступать в качестве псевдоаллергена и индуцировать развитие псевдоаллергических реакций, как в результате прямого действия красителя на чувствительные клетки-мишени аллергии с последующей неспецифической либерацией медиаторов, так и в результате нарушения метаболизма арахидоновой кислоты за счет угнетения циклооксигеназы и сдвига баланса в сторону преимущественного образования лейкотриенов, которые оказывают выраженное биологическое влияние на различные ткани и системы [34]. Не исключено, что у одного пациента могут развиваться реакции на пищевой краситель, обусловленные участием как специфических иммунных реакций, так и псевдоаллергических [34]. В литературе показано, что наиболее часто побочные реакции на тартразин возникают у людей с непереносимостью НПВП [67]. Для красителям, диагностики в том повышенной числе к чувствительности тартразину, к используют пищевым кожные скарификационные тесты, prick-тесты, определение IgE-антител методом иммуноферментного анализа, аллергенспецифический тест по реакции выброса миелопероксидазы гранулоцитами и другие методы [57; 89]. Однако, кожные prick-тесты и аппликационные тесты к пищевым добавкам, в том числе тартразину, редко оказываются положительными и не совпадают с данными анамнеза и перорального тестирования [90; 172; 360]. В клинической практике диагноз повышенной чувствительности к тартразину основывается, главным образом, на рискованных провокационных тестах. Так, пероральный провокационный тест с тартразином до сих пор остается стандартом в диагностике повышенной чувствительности к данному 76 красителю [267; 360]. Основными методами иммунодиагностики гиперчувствительности к тартразину служат тесты выявления в крови свободных IgE- и реже IgG-антител и аллергенспецифический тест по реакции выброса миелопероксидазы гранулоцитами [57; 89]. Однако вышеупомянутые лабораторные методики не позволяют диагностировать непереносимость пищевых добавок, в том числе тартразина, при псевдоаллергии. С нашей точки зрения, новые возможности для выявления повышенной чувствительности к псевдоаллергенам, открывает применение метода хемилюминесценции лейкоцитов периферической крови. В 1985 году Пыцким В.И и соавторами [82] был открыт феномен специфического угнетения аллергеном СЛХЛ периферической крови сенсибилизированных людей. На основе этого феномена был разработан тест для выявления специфической сенсибилизации к пыльцевым, бытовым, лекарственным (пенициллин) и другим аллергенам. На модели немедленной аллергии в пробах крови пациентов с атопическими заболеваниями и соответствующей сенсибилизацией установлено угнетение СЛХЛ крови со специфическим аллергеном при отсутствии изменений на неспецифические агенты. Использованные аллергены были либо полноценными антигенами, либо гаптенами (пенициллин), образующими в организме комплексный антиген. Затем нами было установлено изменение СЛХЛ крови и при псевдоаллергии. Так, например, добавление салицилата или метамизола натрия к пробам крови пациентов с непереносимостью АСК и/или метамизола натрия также вызывало угнетение СЛХЛ, которое оказалось дозозависимым [18]. Выявленные различия показателей СЛХЛ крови у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью НПВП после прединкубации проб крови с данными препаратами открывают возможность применения хемилюминесцентного теста непереносимости препаратов этой группы. для экспресс-диагностики 77 Между тем, до настоящего времени не известно, связаны ли выявленные различия СЛХЛ крови под воздействием НПВП у доноров и больных с непереносимостью НПВП исключительно с влиянием на ПМЛ крови биологически активных веществ (медиаторов, цитокинов) плазмы, или все же существуют какие-то особенности окислительного метаболизма ПМЛ у данной группы больных, проявляющиеся при воздействии на ПМЛ НПВП. Ранее было упомянуто, что непереносимость НПВП нередко сочетается с псевдоаллергическими реакциями на пищевые красители, в частности тартразин [34; 67]. Возникает вопрос, будут ли происходить изменения СЛХЛ крови под влиянием пищевых красителей у пациентов с их непереносимостью, аналогичные изменениям СЛХЛ под влиянием НПВП, а также каковы механизмы возможных изменений СЛХЛ, и существуют ли общие механизмы изменения СЛХЛ крови под влиянием пищевых красителей и НПВП, выступающих в роли псевдоаллергенов? Известно также, что у пациентов с АТ определяется более высокий уровень активности индуцибельной NO-синтазы в эпителии носовых полипов и, следовательно, более высокий уровень NO в выдыхаемом воздухе по сравнению с таковым у пациентов с полипозом носа и БА без непереносимости НПВП [210]. Между тем, до настоящего времени не известно существует ли зависимость между степенью подавления СЛХЛ крови под влиянием НПВП у больных с АТ и уровнем активности индуцибельной NO-синтазы фагоцитов периферической крови. В связи закономерности с этим возникла изменения необходимость продукции АФК, изучить NO общие фагоцитами периферической крови под влиянием НПВП, тартразина у больных с их непереносимостью разных клинических групп, а также механизмы этих изменений. Планируемые исследования предназначены для более глубокого понимания патогенеза непереносимости НПВП, улучшения диагностики и лечения повышенной пищевым красителям). чувствительности к псевдоаллергенам (НПВП, 78 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 2.1 Использованные реактивы 1. Вода для инъекций 0,45% стерильная использовалась для приготовления водного раствора диклофенака натрия (ООО «Гротекс», г. Москва). 2. Гепарин (АО «Белмедпрепараты»), 20-50 ЕД на 1 мл крови. 3. Диклофенак натрия (Фармстандарт, Россия) в форме порошка. 4. Диметилсульфоксид (ДМСО) («MP Biomadicals», Франция). 5. Зафирлукаст (порошок, «Sigma», США). 6. Кетансерин (порошок, «Sigma», США). 7. Клемастин (порошок, «Sigma», США). 8. Краситель трипановый синий, концентрация раствора 0,1%, матричный раствор готовили на фосфатном буфере (Аппасами Медикал Эквипмент ЛТД, Индия). 9. Кромоглициевая кислота (порошок, «Sigma», США). 10. Культуральная среда RPMI-1640 (ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» РАМН). 11. Ледяная уксусная кислота, 90% (РЕАХИМ, Ереванский завод химреактивов). Сильно концентрированную уксусную кислоту разводили дистиллированной водой до концентрации 3%. 12. Люминол (Sigma, США). Рабочая концентрация раствора равна 2 мМ; конечная концентрация в кювете 0,3мМ. 13. Люцигенин (Sigma, США). Рабочая концентрация раствора равна 2 мМ; конечная концентрация в кювете 0,3мМ. 14. Метамизол натрия (порошок, Медокеми Лтд, Кипр). 15. Наборы реагентов для иммуноферментного определения концентраций гамма-интерферона, фактора некроза опухолей-альфа, интерлейкина 1β , 79 интерлейкина 4, интерлейкина 8 в сыворотке крови (ЗАО «ВЕКТОРБЕСТ», г. Новосибирск) 16. Ранитидин (порошок, «Sigma», США). 17. Реактив Гриса (ООО «Компонент-Реактив», г. Москва). 18. Салицилат натрия (порошок, Екатеринбургская фарм. фабрика, Россия). 19. Среда Хенкса (Филиал ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России, г. Екатеринбург; ООО «Агат-Мед», г. Москва), рН=7,45-7,35. 20. Сульфат бария. Рабочая концентрация раствора Приготавливается непосредственно перед опытом растворов: сульфата натрия и хлорида бария 2 мг/мл. из двух маточных в соотношении 1:1. Маточные растворы хранятся в холодильнике в течение месяца. BaCL2: готовится на дистиллированной воде, рабочая концентрация равна 3,64 мг/мл. Na2SO4: готовится на физиологическом растворе, рабочая концентрация равна 2,43 мг/мл. Конечная концентрация сульфата бария в кювете составляла 0,3 мг/мл. 21. Тартразин (порошок, Baker Flavors, Индия). 22. Физиологический раствор изотонический 0,9% стерильный использовался для приготовления основных реактивов, в том числе для приготовления растворов салицилата натрия, метамизола натрия (НПП «ПанЭко», г. Москва). 23. N -нитро-L-аргинин (порошок, «Sigma», США). 2.2. Использованные материалы Характеристика пациентов, включенных в исследование. Исследования выполнялись на базе ГБОУ ВПО «МГМСУ им. А.И. Евдокимова» МЗ РФ, ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России. 80 Объектом исследования были 146 пациентов с непереносимостью НПВП, тартразина, находившихся на обследовании и лечении в ГНЦ иммунологии ФМБА России; ГБУЗ «Городская Институт поликлиника №62 Департамента здравоохранения г. Москвы», филиал №3: 54 мужчины и 92 женщины в возрасте от 17 до 75 лет, средний возраст составлял 42,3±1,8 лет. У всех пациентов по данным анамнеза и результатам теста торможения естественной миграции лейкоцитов (ТТЕМЛ) имелась непереносимость более одного НПВП. У 29 обследуемых лиц непереносимость НПВП сочеталась с непереносимостью пищевого красителя тартразина. В сыворотке всех обследованных пациентов специфические IgE к АСК, метамизолу, диклофенаку натрия, тартразину не были выявлены (отсутствие специфических IgE к АСК, метамизолу, диклофенаку натрия, тартразину было определено методом иммуно-ферментного анализа (аппарат Adaltis, Германия) с использованием панелей для определения аллерген- специфических антител к НПВП, пищевым красителям Dr Fooke). Критерии включения пациентов в исследование: приступы экспираторного диспноэ, ринит, крапивница, отек Квинке при приеме НПВП (АСК и/или метамизола натрия и/или диклофенака натрия) в любой лекарственной форме (инъекции, таблетки, драже), а также при употреблении пищевых продуктов, напитков, лекарственных препаратов, окрашенных тартразином. Критерии исключения пациентов из исследования: прием антигистаминных, антисеротониновых, антилейкотриеновых препаратов, кромоглициевой кислоты (КГК), системных глюкокортикостероидов, НПВП за 2 недели и менее до исследования. Критерии алкогольного невключения или пациентов наркотического в исследование: опъянения, состояние невозможность забора 81 венозной крови, неподписание информированного согласия на проведение исследования. Контрольная группа практически здоровых людей состояла из 132 человек (79 женщины и 53 мужчины) в том же возрастном диапазоне, не принимавших НПВП, противоаллергические препараты в ближайшие 2 недели до эксперимента. Для исследования использовали гепаринизированную венозную кровь объемом 10,0 мл (концентрация гепарина- 50 ЕД/мл). Забор крови осуществлялся утром натощак. Кровь хранили в изотермических условиях при температуре 4°С не более 3 часов перед началом эксперимента. Все пациенты и здоровые доноры перед началом исследования подписали добровольное информированное согласие на проведение исследования. Клиническое исследование одобрено Межвузовским Комитетом по этике, протокол № 05-12 от 17.05.2012 г. В соответствии с задачами исследований все пациенты с непереносимостью НПВП, тартразина были разделены на 2 группы: 1 группа включала пациентов, у которых непереносимость НПВП, тартразина проявлялась реакциями со стороны органов дыхания (бронхоспазм, ринит), n=98; 2 группа включала пациентов, у которых непереносимость НПВП проявлялась реакциями со стороны кожных покровов (крапивница и/или отек Квинке), n=48. Детальная характеристика пациентов, включенных в различные исследования, приведена в разделе «Приложение». 82 2.3. Использованные методы 2.3.1. Метод подсчета полиморфно-ядерных лейкоцитов цельной крови в камере Горяева В пробирке эппендорфа смешивали 20 мкл цельной гепаринизированной крови с 380 мкл 3% раствора ледяной уксусной кислоты (ЛУК), после чего ресуспензировали и заполняли сетку камеры Горяева. Далее производили подсчет ПМЛ в 20 больших квадратах и полученное число умножали на 5 (большие квадраты сгруппированы по 4). Количество ПМЛ в 1 мл крови рассчитывали по формуле: N = 5 Х n 2500, где N – количество клеток в 1 мл крови Х – количество клеток в 20 квадратах n - разведение (в данном случае равно 20). 2500 – коэффициент для подсчета клеток в камере Горяева 2.3.2. Метод определения жизнеспособности полиморфно-ядерных лейкоцитов Каплю крови, разведенную в 20 раз 3% раствором ЛУК, помещали на предметное стекло, добавляли каплю 0,1% раствора трипановой сини, перемешивали стеклянной палочкой и оставляли на 10 минут при комнатной температуре. Затем накрывали покровным стеклом и под световым микроскопом подсчитывали количество окрашенных ПМЛ в расчете на 100 полиморфно-ядерных клеток крови. Жизнеспособность вычисляли, как процентное соотношение живых (неокрашенных) клеток к 100 клеткам препарата. Этот показатель составлял не менее 80-90%. 83 2.3.3. Выделение суспензии лейкоцитов. Гепаринизированную венозную кровь (20 ЕД/мл крови) в количестве 5 мл центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об/мин. Сыворотку отбирали автоматической пипеткой и сливали, а образовавшееся на поверхности клеточного осадка кольцо лейкоцитов снимали с помощью загнутого наконечника и осторожно сливали в другую пробирку. Для лизиса примеси эритроцитов к полученному клеточному осадку добавляли 1 мл 0,83% раствора хлорида аммония, затем ресуспензировали клетки, после чего повторно добавляли 3 мл раствора хлорида аммония, снова ресуспензировали и выдерживали клеточную суспензию в течение 5 мин. Далее полученную суспензию центрифугировали в течение 3 мин при 1000 об/мин. Клетки дважды отмывали в среде Хенкса (рН 7,4). Конечный клеточный осадок ресуспензировали в 1 мл раствора Хенкса. Выход ПМЛ составлял 85-95%. Жизнеспособность клеток, определяемая в тесте с трипановым синим, составляла не менее 97%. 2.3.4. Выделение суспензии полиморфно-ядерных лейкоцитов ПМЛ периферической крови человека выделяли по методу Boyum A. с некоторыми модификациями [140]. Для этого кровь собирали в силиконизированные центрифужные пробирки в количестве 4-6 мл. В качестве антикоагулянта использовали гепарин (20 ЕД/мл крови) Кровь отстаивали в течение 30-60 мин при комнатной температуре. (Для более быстрого и эффективного осаждения эритроцитов кровь смешивали с 1 мл 6% декстрана (М.в. 250000) на фосфатно-солевом буфере (136,7 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, , 1,5 мМ КН2РО4, 8,1 мМ Na2HPO4, pH 7,4) и отстаивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Плазму крови со взвешенными в ней лейкоцитами отбирали шприцем с длинной иглой, наслаивали на 1,5-2 мл раствора фиколл-верографина с плотностью 1,077 г/см3 и центрифугировали при 400g в течение 30-40 мин при 200С. После центрифугирования в 84 градиенте плотности между плазмой и фиколл-верографином образуется слой мононуклеаров (лимфоциты и моноциты) и тромбоцитов, а ПМЛ и примесь эритроцитов оседают на дне пробирки. Для лизиса примеси эритроцитов к полученному клеточному осадку добавляли 10 мл 0,83% раствора хлорида аммония, ресуспензировали клетки и выдерживали их в течение 5 мин. Далее полученную суспензию центрифугировали при 400g в течение 10 мин. Все последующие операции проводили при 4оС (пользовались холодными растворами). Клетки дважды отмывали в фосфатно-солевом буфере (136,7 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1,5 мМ КН2РО4, 8,1 мМ Na2HPO4, pH 7,4). Конечный клеточный осадок ресуспензировали в 1 мл стандартного раствора Хенкса (рН 7,4). Выход ПМЛ составлял 85-95%. Жизнеспособность клеток, определяемая в тесте с трипановым синим, составляла не менее 97%. Полученные суспензии ПМЛ хранили при 4 оС в течение 5-6 ч. 2.3.5. Метод стимулированной сульфатом бария люминолзависимой хемилюминесценции цельной крови и клеточной суспензии Для измерения люминол-зависимой хемилюминесценции исследуемых образцов цельной крови или клеточной суспензии использовали биохемилюминесцентный анализатор БЛМ 3606 - 01 (СКТБ «Наука» КНЦ СО РАН, Россия), сигнал от которого поступал на персональный компьютер и анализировался с помощью программы BLM- Obrab. В качестве активатора свечения использовали люминол (отражает суммарную продукцию практически всех генерируемых в процессе дыхательного взрыва АФК: НО, О2-, Н2О2 и CLO-) [16]. С помощью метода стимулированной сульфатом бария люминолзависимой ХЛ определяли: во-первых, суммарную продукцию АФК ПМЛ у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью НПВП разных клинических групп; во-вторых, праймирующее влияние комплекса антигенов Staphylococcus aureus на ПМЛ здоровых доноров и пациентов с АТ; в- 85 третьих, суммарную продукцию АФК ПМЛ под воздействием псевдоаллергенов (НПВП (салицилата, метамизола, диклофенака натрия), пищевого красителя тартразина) у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью НПВП в сочетании и без такового с непереносимостью тартразина; воздействием в-четвертых, суммарную блокаторов продукцию гистаминовых АФК (клемастина, ПМЛ под ранитидина), серотониновых (кетансерина), лейкотриеновых (зафирлукаста) рецепторов, стабилизатора мембран базофилов и тучных клеток (кромоглициевой кислоты) в смеси с псевдоаллергенами (НПВП, тартразином) у пациентов с непереносимостью НПВП в сочетании и без такового с непереносимостью тартразина; в-пятых, суммарную продукцию АФК ПМЛ под воздействием блокатора индуцибельной NO-синтазы N -нитро-L-аргинина в смеси с НПВП у пациентов с АТ. Определение суммарной продукции АФК ПМЛ Для определения суммарной продукции АФК ПМЛ из образцов цельной крови или суспензии ПМЛ отбирали объемы, содержащие 1х106 лейкоцитов и доводили их до 0,70 мл средой Хенкса. В кювету хемилюминометра вносили 0,7 мл пробы и 0,15 мл активатора свечения люминола (2мМ). Далее измеряли уровень спонтанной ХЛ. После регистрации спонтанной ХЛ добавляли 0,15 мл сульфата бария (2мг/мл) стимулятора свечения – и регистрировали уровень стимулированной ХЛ. Измерение ХЛ крови проводили в режиме постоянного перемешивания при температуре 37˚С. Конечный объем проб составлял 1 мл. С помощью компьютерной программы BLM-Obrab определяли площадь под кривой ХЛSхл, отражающую светосумму ХЛ, поскольку общее количество выработанных клеткой АФК наиболее тесно коррелирует с площадью под кривой ХЛ (Sхл), а не с интенсивностью вспышки (амплитудой). 86 Определение влияния псевдоаллергенов (НПВП, тартразина) на стимулированную сульфатом бария люминол-зависимую ХЛ цельной крови и клеточной суспензии Для исследования влияния НПВП, тартразина на люминол-зависимую ХЛ из образцов крови или клеточной суспензии отбирали объемы, содержащие 1х106 лейкоцитов, и доводили их до 0,69 мл средой Хенкса. Затем к полученным образцам добавляли 0,01 мл растворенного исследуемого псевдоаллергена. В контрольные пробы вместо исследуемого псевдоаллергена добавляли разводящую жидкость в том же объеме. Каждую пробу инкубировали в течение 45 минут при 37ºС при постоянном перемешивании. Жизнеспособность ПМЛ за время инкубации существенно не изменялась. В кювету хемилюминометра вносили 0,7 мл пробы после инкубации и 0,15 мл люминола (2мМ). Далее регистрировали уровень спонтанной ХЛ, затем стимулированной ХЛ, как описано выше. С помощью компьютерной программы BLM- Obrab определяли следующие параметры ХЛ: интенсивность спонтанной ХЛ- Iспонт., интенсивность максимальной ХЛ- Iмакс., время достижения максимальной вспышки ХЛ – Тмакс., интенсивность стимулированной ХЛ- Iстим., равной разнице между максимальной и спонтанной ХЛ (Iстим.= Iмакс.- Iспонт.); площадь под кривой ХЛ- Sхл, отражающую светосумму ХЛ. Характер получаемой кривой изображен на рис. 1. При оценке влияния исследуемых псевдоаллергенов на ХЛ крови определяли 2 показателя: относительную интенсивность ХЛ (ИС) и относительную светосумму свечения или индекс соотношения площадей под кривыми ХЛ (ИП). ИС рассчитывали, как отношение интенсивности стимулированной ХЛ в опыте к интенсивности стимулированной ХЛ в контроле (ИС=Iстим. опыт/Iстим. контр.); ИП рассчитывали, как отношение светосумм свечения (площадей под кривыми ХЛ) опыт/Sхл контр.). опытной и контрольной проб (ИП=Sхл 87 Рис.1. Регистрируемые параметры кривой люминол-зависимой хемилюминесценции. Определение влияния блокаторов рецепторов (клемастина, ранитидина, кетансерина, зафирлукаста) и стабилизатора мембран базофилов и тучных клеток (кромоглициевой кислоты) в смеси с псевдоаллергенами (НПВП, тартразином) на стимулированную сульфатом бария люминолзависимую ХЛ крови Для исследования влияния клемастина, ранитидина, кетансерина, зафирлукаста и КГК на люминол-зависимую ХЛ из образцов цельной крови отбирали объемы, содержащие 1х106 лейкоцитов, и доводили их до 0,68 мл средой Хенкса (в опытах с клемастином, ранитидином и КГК); до 0,687 мл (в опытах с кетансерином и зафирлукастом). Затем в пробы вносили 0,01 мл растворов клемастина, ранитидина, КГК; 0,003 мл растворов кетансерина, зафирлукаста в различных концентрациях, после чего инкубировали в течение 15 минут при 37ºС при постоянном перемешивании. В качестве разводящей жидкости для клемастина, ранитидина и КГК использовали физиологический раствор, для кетансерина и зафирлукаста – 88 диметилсульфоксид (ДМСО). Затем одну часть полученных проб использовали в качестве опытных, для чего в пробы вводили 0,01 мл раствора салицилата, метамизола, диклофенака натрия или тартразина в конечных концентрациях 3мМ, 6 мкМ, 6 мкМ, 4 мкМ, соответственно, а другую часть - в качестве контрольных, вводя разводящую жидкость для псевдоаллергена, и осуществляли повторное инкубирование в течение 45 минут при 37ºС в тех же условиях. Жизнеспособность ПМЛ за время инкубации существенно не изменялась. В кювету хемилюминометра вносили 0,7 мл пробы после инкубации и 0,15 мл люминола (2мМ). Далее регистрировали уровень спонтанной ХЛ, затем стимулированной ХЛ, как описано выше. С помощью компьютерной программы BLM- Obrab определяли площадь под кривой ХЛ- Sхл. При оценке влияния исследуемых препаратов на ХЛ крови определяли относительную светосумму свечения или индекс соотношения площадей под кривыми ХЛ (ИП), как отношение Sхл опытной пробы (с псевдоаллергеном в смеси с блокаторами рецепторов или КГК) к Sхл контрольной пробы. Определение влияния блокатора индуцибельной NO-синтазы N -нитро-L-аргинина в смеси с НПВП на стимулированную сульфатом бария люминолзависимую ХЛ цельной крови Для исследования влияния блокатора iNOS N -нитро-L-аргинина (LNNA) на люминол-зависимую ХЛ из образцов цельной крови отбирали объемы, содержащие 1х106 лейкоцитов, и доводили их до 0,68 мл средой Хенкса. Затем в пробы вносили 0,01 мл раствора LNNA в различных концентрациях, после чего инкубировали в течение 15 минут при 37ºС при постоянном перемешивании. Далее в пробы добавляли салицилат или метамизол натрия в конечных концентрациях 3,0 мМ и 6 мкМ, соответственно, после чего инкубировали еще 45 минут в тех же условиях. В 89 качестве разводящей жидкости для LNNA использовали воду для инъекций. К контрольным пробам добавляли раствор LNNA в том же объеме. Жизнеспособность ПМЛ за время инкубации существенно не изменялась. В кювету хемилюминометра вносили 0,7 мл пробы после инкубации и 0,15 мл люминола (2мМ). Далее регистрировали уровень спонтанной ХЛ, затем стимулированной ХЛ, как описано выше. С помощью компьютерной программы BLM- Obrab определяли площадь под кривой ХЛ- Sхл. При оценке влияния LNNA на ХЛ крови определяли индекс соотношения площадей под кривыми ХЛ (ИП), как отношение Sхл опытной пробы (с псевдоаллергеном в смеси с LNNA) к Sхл контрольной пробы (c LNNA). Определение праймирующего влияния комплекса антигенов Staphylococcus aureus на ПМЛ Комплексный препарат антигенов (АГ) Staphylococcus aureus получали из штаммов клинических изолятов методом приготовления бактериальных комплексов на целлофановом диске по методу Федосеевой В.Н. и соавт. [84]. Полученные маточные суспензии представляли собой комплекс АГ, содержащий 1х109 микробных клеток на 1 мл суспензии. Для изучения праймирующего влияния комплекса АГ Staphylococcus aureus на ПМЛ из образцов крови или суспензии выделенных ПМЛ отбирали объемы, содержащие 1х106 ПМЛ и доводили их до 0,69 мл средой Хенкса. Затем к полученным образцам добавляли 0,01 мл комплекса АГ Staphylococcus aureus в различных концентрациях (5х104-1000х104 микробных клеток /мл). В контрольные пробы вместо комплекса АГ Staphylococcus aureus добавляли физиологический раствор в том же объеме. Каждую пробу инкубировали в течение 60 минут при 37ºС при постоянном перемешивании. Жизнеспособность ПМЛ за время инкубации существенно не изменялась. После инкубации регистрировали люминол-зависимую ХЛ. С помощью 90 компьютерной программы BLM- Obrab определяли параметры ХЛ, после чего вычисляли показатели ХЛ: ИС и ИП, как описано выше. 2.3.6. Метод стимулированной сульфатом бария люцигенин-зависимой хемилюминесценции Описание этого метода аналогично методу, описанному в п. 2.3.5. Различие состоит в том, что в качестве активатора свечения использовался люцигенин (рабочая концентрация раствора 2 х10 -3 М, Sigma, США), который является высокочувствительным хемилюминесцентным зондом на супероксидный анион радикал (О2-) [16]. Многочисленными исследованиями установлено, что в большинстве клеток основным источником О2- служит дыхательная цепь митохондрий, а роль НАДФН-оксидазы клеточных мембран невелика [312; 351; 354]. Однако ПМЛ бедны митохондриями, поэтому образование О2- в основном связано с работой НАДФН-оксидазы клеточных мембран [15]. Следовательно, регистрируемая интенсивность люцигенин-зависимой ХЛ отражает количество О2-, образовавшегося в результате активации НАДФН-оксидазы ПМЛ при воздействии стимула. Площадь под кривой люцигенин-зависимой ХЛ ПМЛ, отражающая светосумму люцигенин-зависимой ХЛ, прямо пропорциональна активности НАДФН-оксидазы ПМЛ при действии стимула. С помощью метода стимулированной сульфатом бария люцигенинзависимой ХЛ (СЛЦХЛ) определяли: во-первых, продукцию О2- ПМЛ у здоровых доноров и больных с непереносимостью НПВП разных клинических групп; во-вторых, продукцию О2- ПМЛ под влиянием псевдоаллергенов (НПВП (салицилата, метамизола, диклофенака натрия), пищевого красителя тартразина) у здоровых доноров и больных с непереносимостью НПВП в сочетаний и без такового с непереносимостью тартразина; в-третьих, продукцию О2- ПМЛ под влиянием комплексных АГ Staphylococcus aureus у здоровых доноров и пациентов с АТ. 91 2.3.7. Инкубация образцов крови или клеточной суспензии с исследуемыми соединениями. Исследовали параметры ХЛ цельной крови или клеточной суспензии больных с непереносимостью НПВП, тартразина и здоровых доноров после прединкубации образцов крови и/или клеточной суспензии с исследуемыми соединениями. В зависимости от поставленных нами задач производили: 1. Прединкубацию гепаринизированной венозной крови или клеточной суспензии больных с непереносимостью АСК и/или метамизола натрия и/или диклофенака натрия, а также здоровых доноров с растворенным в физиологическом растворе салицилатом натрия в конечных концентрациях от 0,06 мМ до 12 мМ, или с растворенным в физиологическом растворе метамизолом натрия в конечных концентрациях от 0,6 мкМ до 600 мкМ, или с растворенным в воде для инъекций диклофенаком натрия в конечных концентрациях от 0,6 мкМ до 300 мкМ. В контрольные пробы вместо используемых препаратов добавляли физиологический раствор или воду для инъекций в том же объеме. Каждую пробу инкубировали в течение 45 минут при 37ºС при постоянном перемешивании. 2. Прединкубацию гепаринизированной венозной крови или клеточной суспензии больных с непереносимостью НПВП в сочетании с непереносимостью тартразина, а также здоровых доноров с растворенным в физиологическом растворе тартразином в конечных концентрациях от 0,4 мкМ до 4000 мкМ. В контрольные пробы вместо красителя добавляли физиологический раствор в том же объеме. Каждую пробу инкубировали в течение 45 минут при 37ºС при постоянном перемешивании. 3. Прединкубацию крови больных с непереносимостью АСК и/или метамизола натрия и/или диклофенака натрия в сочетании или без 92 такового с непереносимостью тартразина с клемастином, ранитидином, КГК в конечных концентрациях от 1 ЭСТД до 100 ЭСТД, кетансерином в конечных концентрациях от 1 ЭСТД до 30 ЭСТД, зафирлукастом в конечных концентрациях от 1 ЭСТД до 60 ЭСТД в течение 15 минут при 37ºС при постоянном перемешивании. Затем в пробу вносили салицилат, метамизол, диклофенак натрия или тартразин в концентрациях 3,0 мМ, 6 мкМ, 6 мкМ, 4 мкМ, соответственно, после чего инкубировали еще 45 минут в тех же условиях. Указанные концентрации НПВП и тартразина были выбраны, потому что на этих концентрациях выявляются наибольшие различия показателей СЛХЛ крови между здоровыми донорами и больными с непереносимостью данных псевдоаллергенов. В качестве разводящей жидкости для клемастина, ранитидина и КГК использовали физиологический раствор; для кетансерина и зафирлукаста - ДМСО. К контрольным пробам добавляли только растворы клемастина, ранитидина, КГК, кетансерина и зафирлукаста, соответственно, в смеси с разводящей жидкостью для псевдоаллергена. 4. Прединкубацию гепаринизированной венозной крови больных АТ с блокатором iNOS LNNA в конечных концентрациях от 0,046 мкМ до 45,7 мкМ в течение 15 минут при 37ºС при постоянном перемешивании. Затем в пробу вносили салицилат или метамизол натрия в конечных концентрациях 3,0 мМ и 6 мкМ, соответственно, после чего инкубировали еще 45 минут в тех же условиях. LNNA растворяли в воде для инъекций. К контрольным пробам добавляли раствор LNNA в смеси с разводящей жидкостью для псевдоаллергена. 5. Прединкубацию проб крови (1х106 ПМЛ) больных с непереносимостью АСК и здоровых доноров с салицилатом натрия в концентрации 3,0 мМ в течение 45 минут при 37ºС при постоянном перемешивании. Следует 93 отметить, что указанная концентрация оказывает угнетающее воздействие на СЛХЛ крови больных с непереносимостью аспирина, в отличие от здоровых доноров, у которых на данной концентрации подавления СЛХЛ крови не происходит (как показано в разделе 3.4.). Контрольные пробы инкубировали в тех же условиях с равным объемом физиологического раствора. Затем пробы крови центрифугировали в течение 3 минут на 1000 оборотах/мин., а полученный супернатант, содержащий плазму, добавляли в образцы суспензии ПМЛ (1х106 ПМЛ) доноров, после чего доводили объем содержимого проб суспензии ПМЛ раствором Хенкса до 700 мл. Полученные пробы снова инкубировали в течение 45 минут при 37ºС при постоянном перемешивании, после чего регистрировали СЛХЛ, как описано в п. 2.3.5. 2.3.8. Метод культивирования суспензии лейкоцитов Для исследования использовали суспензию лейкоцитов, выделенных из гепаринизированной венозной крови объемом 4,5 мл (концентрация гепарина- 50 ЕД/мл). Для выделения лейкоцитов из периферической крови использовали методику, описанную в 2.3.3. Лейкоциты в стандартной питательной среде RPMI 1640 в стерильных условиях помещали в лунки стерильных культуральных планшетов из расчета 0,5х106лейкоцитов на 1 лунку 48-луночного планшета. Планшет с лейкоцитами помещали в СО2 инкубатор (содержание СО2 составляло 5%) и инкубировали в течение часа при 37ºС. После инкубации питательная среда из всех лунок с клетками отбиралась и заменялась на следующую инкубационную смесь: 0,5 мл питательной среды + сыворотка (FBS, 10%) + антибиотик (пенициллин / стрептомицин, 100ед/мл / 100 мкг/мл). Затем в опытные пробы вносили 0,01 мл раствора салицилата натрия, метамизола натрия или диклофенака натрия 94 в конечных концентрациях 1,5 мМ, 3 мкМ, 3 мкМ, соответственно. В контрольные пробы вместо указанных препаратов добавляли физиологический раствор или воду для инъекций в том же объеме. После этого планшет с лейкоцитами вновь помещали в СО2 инкубатор и инкубировали в течение часа при 37ºС. После инкубации в каждую лунку вносили 10 мкл стимулятора- сульфата бария (рабочая концентрация 2мг/мл), после чего планшет снова помещали в СО2 инкубатор и инкубировали в течение 18 часов в тех же условиях. 2.3.9. Метод определения содержания метаболитов оксида азота в культуральной среде Учитывая, что в водной среде нитрит-ион крайне нестабилен и быстро переходит в нитрат-ион, для количественного определения уровней метаболитов NO предварительно проводилась обработка проб с помощью кадмиевых редукторов, в результате чего происходило восстановление нитратов в нитриты. Затем с помощью реакции Грисса спектрофотометрически определялось содержание нитритов в культуральной среде по стандартной методике [306]. 2.3.10. Подготовка образцов плазмы для определения концентрации цитокинов В образцы крови, содержащие 3х106 лейкоцитов, вносили 5 мкл растворов салицилата, метамизола, диклофенака натрия, тартразина в конечных концентрациях 9мМ, 18мкМ, 18мкМ, 12мкМ, соответственно. Контрольные пробы содержали равный объем разводящей жидкости. Полученные пробы тщательно ресуспензировали и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Жизнеспособность клеток, определяемая окрашиванием трипановым синим, за время инкубации существенно не изменялась. Далее пробы крови центрифугировали в течение 5 минут при 3000 об/мин. 95 Полученную сыворотку использовали в качестве источника исследуемых цитокинов. Из эксперимента исключалась гемолизированная и хилезная сыворотка. 2.3.11. Иммуноферментный анализ Определение уровня цитокинов проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) («сэндвич»-вариант ИФА) (аппарат microplate reader Bio-Rad, model 680, США) с использованием наборов для определения цитокинов ФНО-α, ИНФ- γ, ИЛ-1β, ИЛ-8, ИЛ-4. Для проверки работы наборов с сывороткой (плазмой) измеряли концентрации цитокинов в сыворотке (плазме) крови, взятой с 9 до 11 ч, у 68 здоровых лиц юговосточного региона Западной Сибири в возрасте 20-50 лет. Средняя концентрация ИЛ-1β составила 1,6 пг/мл, диапазон 0-11 пг/мл; средняя концентрация ФНО-α - 0,5 пг/мл, диапазон 0-6 пг/мл; средняя концентрация ИНФ-γ - 0,5 пг/мл, диапазон 0-10 пг/мл; средняя концентрация ИЛ-8 - 2 пг/мл, диапазон 0-10 пг/мл; средняя концентрация ИЛ-4 - 0,2 пг/мл, диапазон 0-4 пг/мл. На первой стадии анализа исследуемые образцы объемом 100 мкл инкубировали в лунках с иммобилизованными антителами в течение 2 часов в шейкере при 37°С и 700 об/мин. Затем с помощью промывочного устройства промывали лунки планшета 5 раз буферным раствором. На второй стадии анализа вносили в каждую лунку по 100 мкл рабочего раствора коньюгата №1 (антитела к цитокину с биотином) и инкубировали в течение 1 часа в шейкере при 37°С и 700 об/мин. Далее снова промывали лунки планшета 5 раз буферным раствором. На третьей стадии вносили в каждую лунку по 100 мкл рабочего раствора коньюгата №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена), после чего инкубировали в течение 30 минут в шейкере при 37°С и 700 об/мин. Затем промывали 5 раз буферным раствором. 96 Количество связавшегося коньюгата №2 определяли цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена - перекиси водорода и хромогена- тетраметилбензидина. Интенсивность желтого окрашивания была пропорциональна концентрации содержащегося в образце исследуемого цитокина. 2.3.12. Методы статистической обработки результатов. Статистическую обработку полученных результатов проводили на компьютере с применением программ «STATISTICA» версия 7.0 и приложения Microsoft Word Exel 2010. При обработке результатов пользовались параметрическими и непараметрическими статистическими методами. Для нормально распределенных переменных вычисляли М среднее арифметическое для анализируемой группы показателей, m – стандартную ошибку среднего. Соответствие закона распределения нормальному устанавливали с помощью λ-критерия Колмогорова-Смирнова. Статистическую достоверность отличия измеряемых величин определяли, используя t-критерий Стьюдента. Различия считали достоверно значимыми при уровне p< 0,05. В случаях, когда распределение измеряемых параметров не соответствовало нормальному, вычисляли критерий Манна-Уитни для непарных сравнений и критерий Уилкоксона - для парных. Для определения связи признаков использовали коэффициент корреляции Спирмена (rs). Различия считали статистически достоверными при значениях p<0,05. 97 СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ Глава 3. Оценка оксидантной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов у больных с непереносимостью НПВП разных клинических групп. Большую клиническую группу больных с непереносимостью НПВП занимают больные с АТ. Бондаревой Г.П. [10] выявлено разнообразие штаммов возбудителей острой и хронической инфекции дыхательных путей у всех больных АТ и доказано, что бактериальная, хламидийная, микоплазменная, вирусная и грибковая флора могут быть причиной обострения не только воспаления дыхательных путей, но и основных проявлений АТ - БА и ПРС. У большинства больных с АТ чаще отмечаются обострения инфекционного процесса как местной, так и системной локализации, обострения очагов хронической инфекции и наличие признаков вторичного иммунодефицитного состояния [10]. При изучении показателей иммунограммы больных с АТ существенных изменений не выявлено. Однако описан дефицит секреторного IgA в назальном секрете, а также наличие высоких уровней специфических иммуноглобулинов к возбудителям хронической внутриклеточной инфекции [9]. Вместе с тем, по нашему мнению, частые инфекционные осложнения у пациентов с АТ могут свидетельствовать о нарушении функциональной активности ПМЛ, в частности способности последних к адекватному осуществлению реакций «дыхательного взрыва» при их взаимодействии с внешними факторами (например, микроорганизмами и др.). Известно, что «дыхательный взрыв» сопровождается вспышкой ХЛ. В связи с этим ХЛ в настоящее время широко используют для оценки функционального состояния ПМЛ [15]. Для оценки оксидантной активности ПМЛ пациентов с непереносимостью НПВП разных клинических групп были проведены следующие исследования. 98 3.1. Определение суммарной продукции АФК ПМЛ у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью НПВП разных клинических групп. В данной серии опытов мы определяли суммарную продукцию АФК ПМЛ цельной крови и суспензии выделенных ПМЛ методом СЛХЛ, как описано в п. 2.3.5., у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью НПВП. Все пациенты, принявшие участие в данном исследовании, были разделены на 2 группы: 1 группа включала пациентов с АТ, 2 группа пациентов с хронической псевдоаллергической крапивницей, обостряющейся после приема НПВП. Для оценки суммарной продукции АФК ПМЛ мы регистрировали светосумму свечения (площадь под кривой ХЛ) - Sхл, прямо пропорциональную общей фагоцитарной активности ПМЛ. Результаты представлены в таблице 2. Таблица 2. Светосумма СЛХЛ ПМЛ периферической крови доноров и больных с непереносимостью НПВП, (М±m) Исследуемые группы лиц Светосумма СЛХЛ ПМЛ ПМЛ цельной крови Выделенные ПМЛ Доноры 232750,9 ± 23283,1 20005759,1±1200345,5 Группа1 155020,6 ± 22307,5* 16507651±990459,1* Группа 2 251055,1± 18025,4 19917131,3 ± 2600718,2 Примечание: * - р<0,05 относительно аналогичного показателя у здоровых доноров Как видно из результатов, представленных в таблице 2, у больных 1 группы показатели светосуммы СЛХЛ достоверно ниже таковых здоровых доноров, как в цельной крови (ниже на 33,4 %), так и в суспензии ПМЛ (ниже на 17,5 %) (р<0,05). У пациентов 2 группы не было выявлено существенных изменений исследуемых показателей относительно таковых здоровых доноров. 99 Полученные результаты показывают, что в группе пациентов с АТ (группа 1) снижена суммарная свидетельствовать продукция о АФК нарушении ПМЛ крови, окислительного что может метаболизма и, следовательно, функциональной активности ПМЛ. Пациенты с хронической крапивницей/отеком Квинке, обостряющейся после приема НПВП (группа 2), не имеют существенных изменений суммарной продукции АФК ПМЛ по сравнению со здоровыми донорами. Таким образом, суммарная продукция АФК ПМЛ различна у пациентов с непереносимостью НПВП разных клинических групп. У пациентов с АТ выявляется снижение суммарной продукции АФК выделенными ПМЛ на 17,5%, ПМЛ в составе цельной крови – на 33% по сравнению со здоровыми донорами (p<0,05). У пациентов с хронической псевдоаллергической крапивницей, обостряющейся после приема НПВП, не обнаруживается существенных изменений суммарной продукции АФК ПМЛ по сравнению с группой здоровых доноров. Более выраженное снижение суммарной продукции АФК ПМЛ цельной крови по сравнению с таковой выделенными ПМЛ у пациентов 1 группы, вероятно, связано с супрессирующим влиянием на люминол-зависимую ХЛ ПМЛ биологически активных веществ (медиаторов, цитокинов), находящихся в цельной крови больных. Следует отметить, что все пациенты 1 группы, принявшие участие в данном исследовании, находились в стадии ремиссии хронического бронхита и астмы. Проведенные ранее нами исследования показали, что у пациентов 1 группы, находившихся в стадии обострения хронического бронхита и астмы, суммарная продукция АФК ПМЛ была достоверно ниже, чем у пациентов в стадии ремиссии (p<0,05), что свидетельствует об еще более выраженном снижении фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови в стадии обострения, возможно, в связи с тем, что фагоциты уже израсходовали свой функциональный потенциал (не исключено также 100 угнетение фагоцитарной активности ПМЛ крови под влиянием системных ГКС, используемых при лечении данных больных в стадии обострения). 3.2. Определение продукции супероксидного анион радикала выделенными ПМЛ и ПМЛ в составе цельной крови у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью НПВП разных клинических групп. Для выяснения вопроса, изменяется ли продукция О2- ПМЛ у больных с непереносимостью НПВП разных клинических групп, измеряли СЛЦХЛ, как описано в п. 2.3.6. В данном исследовании приняли участие те же пациенты, что и в п. 3.1. Определяли площадь под кривой СЛЦХЛ, отражающую светосумму свечения и прямо пропорциональную активности НАДФНоксидазы ПМЛ при действии стимула (табл.3). Таблица 3. Светосумма СЛЦХЛ ПМЛ периферической крови доноров и больных с непереносимостью НПВП, (М±m) Исследуемые группы лиц Светосумма СЛЦХЛ ПМЛ ПМЛ цельной крови Выделенные ПМЛ Доноры 96803,1± 8586,6 874586 ± 92247 Группа1 74151,2 ± 5343,4* 637095 ± 58963* Группа 2 105469 ± 8601,5 850228 ±82528 Примечание: * - р<0,05 относительно аналогичного показателя у здоровых доноров Как видно из данных, представленных в таблице 3, у пациентов 1 группы наблюдается снижение светосуммы СЛЦХЛ выделенных ПМЛ (на 27%) и ПМЛ цельной крови (на 23%) по сравнению со здоровыми донорами (p<0,05). У пациентов 2 группы существенных изменений СЛЦХЛ ПМЛ не было выявлено. 101 Полученные результаты свидетельствуют о снижении продукции О2- ПМЛ у пациентов 1 группы, что косвенно свидетельствует об угнетении активности НАДФН-оксидазы ПМЛ в данной группе пациентов. У пациентов 2 группы существенных изменений продукции О2- не обнаружено. Таким образом, продукция О2- ПМЛ различна у пациентов с непереносимостью НПВП разных клинических групп. У пациентов с АТ выявляется снижение продукции О2- выделенными ПМЛ на 27%, ПМЛ в составе цельной крови – на 23% по сравнению со здоровыми донорами, что косвенно свидетельствует об угнетении активности НАДФН-оксидазы ПМЛ у этих больных. У пациентов с хронической псевдоаллергической крапивницей, обостряющейся после приема НПВП, не обнаруживается существенных изменений продукции О2- ПМЛ и, следовательно, активности НАДФН-оксидазы ПМЛ по сравнению со здоровыми донорами. 3.3. Определение продукции АФК ПМЛ у здоровых доноров и больных с непереносимостью НПВП, проявляющейся реакциями со стороны органов дыхания (бронхоспазм/ринит), после предстимуляции комплексным антигеном Staphylococcus aureus. Известно, что в организме фагоциты могут находиться в двух хорошо различимых состояниях: исходном и активированном, характерном для многих воспалительных заболеваний. Переход фагоцитов из одного состояния в другое протекает через промежуточную стадию, получившую название «прайминга». Суть данного эффекта заключается в том, что воздействие праймирующего непосредственной активации, агента а на клетку вызывает не приводит развитие к ее повышенной функциональной готовности клетки, что влечет за собой усиление интенсивности ответа (повышенную продукцию АФК) на последующее добавление этого же или другого стимула [33]. На сегодняшний день описано 102 много праймирующих стимулов для лейкоцитов, среди которых есть микроорганизмы и их отдельные компоненты [91]. Возможно, что от способности фагоцитов к праймингу зависит адекватный ответ последних на инфекционную нагрузку. Из полученных нами результатов в предыдущем исследовании (разделы 3.1., 3.2.) видно, что у пациентов с АТ наблюдаются нарушения окислительного метаболизма в ПМЛ крови, проявляющиеся в снижении фагоцитарной активности и активности НАДФН-оксидазы ПМЛ, что может свидетельствовать о наличии дефектов в работе кислородо-зависимых ферментных систем ПМЛ крови у таких больных. Для подтверждения данного предположения мы исследовали способность ПМЛ крови к праймингу при воздействии комплексного антигенного препарата Staphylococcus aureus у больных с АТ и здоровых доноров. Выбор Staphylococcus aureus в качестве бактериального АГ был не случайным. В настоящее время широко обсуждается роль Staphylococcus aureus в этиологии и патогенезе полипозного риносинусита больных БА. Van Zele и соавт. [355] в своей работе показали, что наличие у пациента с ПРС непереносимости аспирина и БА повышает распространенность стафилококковой колонизации слизистой оболочки носовых путей до 87,5%, при этом IgE к стафилококковым энтеротоксинам обнаруживают в 80% случаев. Также установлено, что уровень колонизации золотистого стафилококка в среднем носовом ходе у пациентов с полипозом носа прямо пропорционален содержанию специфических IgE к его энтеротоксинам [281]. Опытные пробы крови или суспензии ПМЛ, содержащие 1х106 клеток в пробе, инкубировали в течение 60 минут с комплексным препаратом АГ Staphylococcus aureus в различных концентрациях, как описано в 2.3.5. В контрольные пробы вместо бактериального АГ добавляли физиологический раствор в том же объеме. После инкубации одновременно регистрировали 103 параметры люминол- функциональной и люцигенин-зависимой активности ПМЛ вычисляли 2 ХЛ. Для показателя: оценки индекс стимуляции (ИС), равный отношению интенсивности стимулированной ХЛ опытной пробы к интенсивности стимулированной ХЛ контрольной пробы и индекс соотношения площадей (ИП), равный отношению площадей под кривыми ХЛ опытной и контрольной проб (табл. 4-6). В первой серии опытов определяли влияние комплексного препарата антигенов Staphylococcus aureus на продукцию АФК ПМЛ здоровых доноров (табл.4). Таблица 4. Влияние комплексного препарата антигенов Staphylococcus aureus на продукцию АФК ПМЛ здоровых доноров, (М±m) Вид ХЛ СЛХЛ CАГ, микр.кл/мл, х104 5 1,55 ± 0,20* 2,13 ± 0,27* 0,99 ± 0,01 0,93 ± 0,04 50 1,02 ± 0,07 1,21 ± 0,09* 1,10 ± 0,12 1,10 ± 0,09 250 0,61 ± 0,04* 0,72 ± 0,05* 1,74 ± 0,15* 1,48 ± 0,11* 1000 0,22 ± 0,03* 0,31 ± 0,04* 1,62 ± 0,18* 1,60 ± 0,19* 5 2,85 ± 0,13* 3,12 ± 0,24* 1,12 ± 0,04* 1,11 ± 0,03* 50 1,47 ± 0,22* 1,27 ± 0,12* 1,30 ± 0,08* 1,26 ± 0,05* 1,18 ± 0,18 1,30 ± 0,14* 1,38 ± 0,06* 1,63 ± 0,08* 0,50 ± 0,08* 0,75 ± 0,16* 1,32 ± 0,07* 1,45 ± 0,08* СЛЦХЛ 250 1000 ПМЛ крови ИС Выделенные ПМЛ ИП ИС ИП Примечание: * - р<0,05 относительно контроля Как следует из таблицы 4, у здоровых доноров комплексный АГ Staphylococcus aureus стимулирует продукцию АФК ПМЛ цельной крови и суспензии ПМЛ. Однако имеются существенные различия в выработке АФК выделенными ПМЛ и ПМЛ цельной крови. При исследовании СЛХЛ и СЛЦХЛ ПМЛ цельной крови доноров было выявлено, что эффект прайминга имел характер, обратнопропорциональный дозе АГ. Так, самая большая концентрация 1000х104 микр. кл./мл вызывала максимальное подавление 104 продукции АФК, как в случае СЛХЛ, так и в случае СЛЦХЛ цельной крови. Стимуляция суммарной продукции АФК ПМЛ цельной крови доноров выявлялась в диапазоне концентраций 5х104-50х104 микр. кл./мл. Максимальная стимуляция суммарной выработки АФК ПМЛ наблюдалась на самой минимальной концентрации АГ 5х104 микр. кл./мл. ИС и ИП на указанной концентрации составляли 1,55 и 2,13, соответственно. Влияние комплексного АГ Staphylococcus aureus на выработку О2- ПМЛ цельной крови было выражено в большей степени по сравнению влиянием данного АГ на суммарную выработку АФК. Стимуляция продукции О2- обнаруживалась в более широком диапазоне концентраций 5х104-250х104 микр. кл./мл. ИС и ИП на самой минимальной концентрации АГ 5х104 микр. кл./мл имели наибольшее значение и составляли 2,85 и 3,12, соответственно. При исследовании суммарной продукции АФК выделенными ПМЛ было выявлено, что эффект прайминга наблюдался в диапазоне концентраций 250х104-1000х104 микр. кл./мл. Следует отметить, что на указанных концентрациях наблюдалось ингибирование суммарной выработки АФК ПМЛ цельной крови. При исследовании СЛЦХЛ суспензии ПМЛ под влиянием комплексного АГ Staphylococcus aureus обнаружили стимуляцию СЛЦХЛ ПМЛ во всем диапазоне концентраций 5х104-1000х104 микр. кл./мл. Максимальная продукция О2- наблюдалась при концентрации АГ 250х104 микр. кл./мл. ИС и ИП на указанной концентрации АГ составили 1,38 и 1,63, соответственно. Мы вычисляли коэффициенты корреляции между ИС и ИП для обоих типов свечения, как для выделенных ПМЛ, так и для ПМЛ цельной крови. Была найдена сильная положительная корреляция между указанными индексами (для СЛХЛ ПМЛ цельной крови r= 0,99; для СЛХЛ выделенных ПМЛ r= 0,95; для СЛЦХЛ ПМЛ цельной крови r= 0,98; для СЛЦХЛ выделенных ПМЛ r= 0,91; p<0,01), что может позволить в дальнейшей работе оценивать праймирующее влияние по одному из 105 индексов. Мы отдали предпочтение ИП. Следует отметить, что при сравнении ИП для ПМЛ цельной крови и выделенных ПМЛ с помощью корреляционного анализа была выявлена отрицательная корреляция для обоих типов свечения (в случае использования люминола r= -0,96, при использовании люцигенина r= -0,72; p<0,05). Таким образом, у здоровых доноров комплексный антиген Staphylococcus aureus оказывает праймирующее воздействие на продукцию АФК ПМЛ цельной крови и суспензии ПМЛ. Имеются существенные различия в выработке АФК выделенными ПМЛ и ПМЛ цельной крови под влиянием АГ Staphylococcus aureus. Эффект прайминга наблюдается в различных диапазонах концентраций для ПМЛ цельной крови и выделенных ПМЛ, как в случае СЛХЛ, так и в случае СЛЦХЛ. Увеличение суммарной продукции АФК ПМЛ цельной крови наблюдается в диапазоне концентраций 5х104-50х104 микр. кл./мл, суспензией ПМЛ- 250х104-1000х104 микр. кл./мл. Увеличение продукции О2- ПМЛ цельной крови выявляется в диапазоне концентраций 5х104-50х104 микр. кл./мл, суспезией ПМЛ- 5х1041000х104 микр. кл./мл. Указанные различия в выработке АФК ПМЛ цельной крови и выделенными ПМЛ могут быть связаны с влиянием плазменного фактора, в частности, с присутствием в плазме опсонинов. Праймирующее влияние АГ Staphylococcus aureus на выработку АФК ПМЛ цельной крови и выделенными ПМЛ здоровых доноров в значительной степени связано с активацией НАДФН-оксидазы ПМЛ. Исходя из полученных закономерностей влияния комплексного АГ Staphylococcus aureus на продукцию АФК ПМЛ здоровых доноров, нас заинтересовало, в какой мере они сохранятся у больных с АТ. С этой целью в следующей серии опытов исследовали влияние АГ Staphylococcus aureus на продукцию АФК ПМЛ пациентов с АТ. Поскольку предварительные исследования показали существенные различия в продукции АФК ПМЛ под 106 воздействием антигенов Staphylococcus aureus при наличии или отсутствии у пациентов сенсибилизации стафилококковыми энтеротоксинами, все пациенты с АТ были разделены на 2-е группы: сенсибилизированные и несенсибилизированные вышеупомянутыми АГ (табл. 5). Как видно из данных таблицы 5, у пациентов, не сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами, наблюдается снижение продукции АФК ПМЛ по сравнению со здоровыми донорами. При исследовании ХЛ цельной крови выявлялась обратно пропорциональная дозовая зависимость, как в случае использования люминола, так и при использовании люцигенина. Незначительное праймирующее воздействие комплексного препарата антигенов Staphylococcus aureus на суммарную продукцию АФК ПМЛ цельной крови больных отмечалось только на самой малой исследованной концентрации АГ 5х104 микр. кл./мл. ИП на указанной концентрации АГ составлял 1,25. Затем при увеличении концентрации АГ развивалось угнетение суммарной продукции АФК ПМЛ крови. При изучении СЛЦХЛ цельной крови этих больных мы не обнаружили стимуляции продукции О2- ни на одной из используемых нами концентраций. При концентрациях АГ в диапазоне 5х10 4-50х104 микр. кл./мл ИП не имел достоверных отличий от контроля, однако при использовании более высоких концентраций АГ наблюдалось дозозависимое угнетение выработки О2-, что косвенно свидетельствует об угнетении активности НАДФН-оксидазы ПМЛ. При исследовании сенсибилизированных СЛХЛ выделенных ПМЛ стафилококковыми больных с энтеротоксинами, АТ, не эффект прайминга наблюдался при концентрациях АГ в диапазоне 250х10 4-1000х104 микр. кл./мл, как и у доноров, но был значительно менее выраженным. 107 Таблица 5. Влияние комплексного препарата антигенов Staphylococcus aureus на продукцию АФК ПМЛ пациентов с астматической триадой, (М±m) Вид ХЛ CАГ, микр.кл/мл, х104 Больные, не сенсибилизированные стафилокококковыми энтеротоксинам 5 1,25 ± 0,06*# 0,96 ± 0,06 3,34 ± 0,07*# ИП суспензии ПМЛ 0,97 ± 0,08 50 1,02 ± 0,05 1,08 ± 0,08 2,33 ± 0,06*# 1,15 ± 0,06 250 0,86 ± 0,09 1,17 ± 0,07*# 1,35 ± 0,06*# 1,23 ±0,05*# 1000 0,48 ± 0,14* 1,18 ± 0,07*# 0,74 ± 0,09*# 1,19 ±0,07*# 5 0,95 ± 0,10# 0,86 ± 0,05*# 1,23 ± 0,06*# 0,88 ±0,04*# 50 0,92 ± 0,06 0,89 ± 0,04*# 0,88 ± 0,08*# 0,90 ±0,04*# 0,84 ± 0,06*# 0,96 ± 0,06# 0,88 ± 0,07*# 1,01 ±0,07# 0,57 ± 0,05* 0,96 ± 0,04# 0,76 ± 0,04*# 1,05 ±0,07# ИП ПМЛ крови СЛХЛ СЛЦХЛ 250 1000 ИП суспензии ПМЛ Больные, сенсибилизированные стафилокококковыми энтеротоксинам Примечание. * - р<0,05 относительно контроля # - р<0,05 относительно аналогичной точки у здоровых доноров ИП ПМЛ крови 108 Так, у доноров при максимальной концентрации АГ 1000х104 микр. кл./мл ИП составлял 1,6, а у пациентов с АТ, не сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами, ИП составлял 1,17. При концентрациях в диапазоне 5х104-50х104 микр. кл./мл эффект прайминга у этих больных отсутствовал, и ИП достоверно не отличался от контрольных значений, как и в группе здоровых доноров. Продукция О2- выделенными ПМЛ больных с АТ, не сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами, была снижена в диапазоне 5х10 450х104 микр. кл./мл и не имела достоверных отличий от контрольных значений в диапазоне 250х104-1000х104 микр. кл./мл, в то время как у доноров при всех концентрациях АГ наблюдалась стимуляция продукции О2- выделенными ПМЛ. Таким образом, у пациентов с АТ, не сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами, наблюдается снижение способности ПМЛ крови и выделенных ПМЛ к суммарной продукции АФК при воздействии комплексным АГ Staphylococcus aureus, что свидетельствует о снижении функциональной активности (в частности, оксидантных функций) ПМЛ у пациентов с АТ. При воздействии комплексным АГ Staphylococcus aureus не выявляется праймирующего влияния последнего на продукцию О2- ПМЛ цельной крови и выделенными ПМЛ, что косвенно свидетельствует снижении активности НАДФН-оксидазы ПМЛ больных с АТ, возможно, связанное с нарушением сборки данного фермента в процессе предстимуляции АГ Staphylococcus aureus. Полученные результаты подтверждают, что наблюдаемое снижение продукции АФК ПМЛ крови и выделенными ПМЛ у больных с АТ (раздел 3.1.), в том числе и снижение продукции О2- (раздел 3.2.) связано с дефектами в работе НАДФН-оксидазы ПМЛ, однако мы не можем исключать 109 нарушение активности других кислородозависимых ферментных систем, например, МПО, СОД. При исследовании СЛХЛ цельной крови больных, сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами, была выявлена выраженная стимуляция суммарной продукции АФК ПМЛ в широком диапазоне используемых концентраций комплексного АГ Staphylococcus aureus, значительно превышающая таковую у здоровых доноров (p<0,05). Увеличение суммарной продукции АФК ПМЛ при предынкубации проб крови больных с комплексным АГ Staphylococcus aureus отмечалось в диапазоне 5х104-250х104 микр. кл./мл и имело характер обратной дозовой зависимости. В частности, при концентрации 5х104 микр. кл./мл ИП имел максимальное значение и составлял 3,34, в то время как у доноров ИП при данной концентрации был ниже (на 37%) и составлял 2,13. При исследовании СЛЦХЛ цельной крови больных, сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами, мы отмечали подавление продукции О2- ПМЛ по сравнению со здоровыми донорами. Незначительная стимуляция выработки О2- ПМЛ цельной крови наблюдалась на минимальной концентрации АГ 5х104 микр. кл./мл, ИП на данной концентрации составлял 1,23, что примерно на 61% ниже аналогичной точки здоровых доноров. Изучение СЛХЛ и СЛЦХЛ выделенных ПМЛ больных с АТ, сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами, не выявило достоверных отличий от показателей светосуммы СЛХЛ и СЛЦХЛ выделенных ПМЛ больных с АТ без указанной сенсибилизации. Таким образом, у пациентов с АТ, сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами, при предынкубации проб крови с комплексным АГ Staphylococcus aureus наблюдается значительное увеличение суммарной продукции АФК ПМЛ по сравнению со здоровыми 110 донорами. Выраженная стимуляция СЛХЛ цельной крови, по-видимому, происходит вследствие действия на нейтрофилы высвобождающихся из базофилов при образовании медиаторов, на их поверхности иммунного комплекса аллерген - IgE, где в качестве аллергена выступают энтеротоксины стафилококка. Полученные результаты подтверждают ранее выявленную нами закономерность, когда у больных с поллинозом и атопической бронхиальной астмой в стадии ремиссии наблюдалось увеличение суммарной продукции АФК ПМЛ крови после предварительной инкубации проб крови со специфическим аллергеном [20]. Увеличение светосуммы СЛХЛ крови под действием специфического аллергена (энтеротоксины Staphylococcus aureus) у больных с АТ в стадию ремиссии, сенсибилизированных АГ Staphylococcus aureus, в определяющей степени связано с активацией МПО ПМЛ. НАДФН-оксидаза ПМЛ вносит свой вклад в увеличение интенсивности СЛХЛ цельной крови только при концентрации АГ 5х104 микр. кл./мл. Выраженные различия СЛХЛ крови больных с АТ, сенсибилизированных энтеротоксинами стафилококка, и здоровых доноров открывают возможность применения метода стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой ХЛ в качестве диагностического теста для определения специфической сенсибилизации организма к бактериальным аллергенам, в частности, к Staphylococcus aureus. Данный тест был оформлен, как патентная заявка на изобретение «Способ диагностики in vitro специфической сенсибилизации организма к бактериальным аллергенам». Дата поступления заявки: 19.11.2014. Входящий номер: 074551. Регистрационный номер: 2014146260. Из литературы известно, что у пациентов с АТ колонизация Staphylococcus aureus в слизистой оболочке среднего носового хода встречается с частотой 87,5% [355]. Для того, чтобы определить, оказывает 111 ли влияние колонизация Staphylococcus aureus в слизистой оболочке среднего носового хода на продукцию АФК ПМЛ у больных с АТ, мы определяли параметры СЛХЛ и СЛЦХЛ ПМЛ отдельно для сенсибилизированных энтеротоксинами стафилококка, пациентов, не с колонизацией Staphylococcus aureus в среднем носовом ходе и с отсутствием таковой (табл. 6). Таблица 6. Влияние комплексного препарата антигенов Staphylococcus aureus на продукцию АФК ПМЛ у пациентов с астматической триадой с колонизацией и без колонизации Staphylococcus aureus в среднем носовом ходе, (М±m) Вид ХЛ CАГ, микр.кл/мл, х104 Больные, не сенсибилизированные стафилокококковыми энтеротоксинами, носители золотистого стафилококка 5 1,52 ± 0,05*# ИП суспензии ПМЛ 0,99 ± 0,05 50 1,10 ± 0,04*# 1,16 ± 0,08# 0,92 ± 0,06 0,89 ± 0,06 250 0,95 ± 0,06# 1,25 ± 0,06*# 0,77 ± 0,06* 1,05 ±0,07 1000 0,69 ± 0,12*# 1,26 ± 0,06*# 0,28 ± 0,09* 1,09 ±0,05 5 1,05 ± 0,17 0,93 ± 0,06 0,85 ± 0,05* 0,78 ±0,05* 50 1,01 ± 0,07 0,97 ± 0,07 0,83 ± 0,07* 0,80 ±0,05* 0,91 ± 0,05 1,05 ± 0,07 0,77 ± 0,06* 0,86 ±0,06* 0,62 ± 0,05* 1,03 ± 0,04 0,50 ± 0,04* 0,89 ±0,06 ИП ПМЛ крови СЛХЛ Больные, не сенсибилизированные стафилокококковыми энтеротоксинами, без носительства золотистого стафилококка ИП ИП суспензии ПМЛ крови ПМЛ 0,98 ± 0,07 0,92 ± 0,09 СЛЦХЛ 250 1000 Примечание: * - р<0,05 относительно контроля. # - р<0,05 относительно аналогичной точки пациентов без носительства золотистого стафилококка Как видно из данных таблицы 6, у пациентов с АТ, не сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами, но являющихся носителями Staphylococcus aureus, показатели СЛХЛ ПМЛ крови и выделенных ПМЛ достоверно выше таковых, чем у пациентов без носительства золотистого 112 стафилококка, что свидетельствует о предстимулирующем влиянии золотистого стафилоккока на суммарную продукцию АФК ПМЛ. Показатели СЛЦХЛ ПМЛ цельной крови и выделенных ПМЛ у больных АТ с колонизацией Staphylococcus aureus в среднем носовом ходе не имели достоверных отличий от таковых у больных без колонизации Staphylococcus aureus. Таким образом, полученные результаты показали, что при воздействии комплексным АГ Staphylococcus aureus на ПМЛ цельной крови больных с АТ наблюдалось достоверное снижение суммарной продукции АФК ПМЛ в группе больных с АТ, не сенсибилизированных АГ стафилококка, и повышение таковой в группе пациентов с АТ, сенсибилизированных данными АГ, по сравнению со здоровыми донорами. При этом суммарная продукция АФК выделенными ПМЛ при воздействии АГ Staphylococcus aureus была снижена в обеих группах пациентов с АТ по сравнению со здоровыми донорами. АГ Staphylococcus aureus не оказывали праймирующего действия на выработку О2 ПМЛ цельной крови и выделенными ПМЛ у всех пациентов с АТ, что косвенно свидетельствует об угнетении активности НАДФНоксидазы ПМЛ у данных больных. Мы склонны полагать, что нарушения оксидантных функций ПМЛ крови больных с АТ может быть связано с дефектами в работе НАДФН-оксидазы ПМЛ и, возможно, других кислородозависимых ферментных систем. Нарушения механизмов «дыхательного» взрыва» в ПМЛ крови могут являться причиной частых инфекционных осложнений у больных с АТ. Следует отметить, что у пациентов с АТ, не сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами, но имеющих колонизацию Staphylococcus aureus в среднем носовом ходе, суммарная продукция АФК ПМЛ была достоверно выше таковой, чем у пациентов без носительства золотистого стафилококка, что свидетельствует о предстимулирующем 113 влиянии золотистого стафилоккока на суммарную продукцию АФК ПМЛ. При этом активность НАДФН-оксидазы ПМЛ была сходной у всех пациентов, не сенсибилизированных Staphylococcus aureus, как с носительством Staphylococcus aureus, так и без такового. 3.4. Исследование воздействия НПВП на стимулированную сульфатом бария люминол-зависимую хемилюминесценцию периферической крови у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью данных препаратов В 1985 году Пыцким В.И и соавторами [82] был открыт феномен специфического угнетения аллергеном СЛХЛ лейкоцитов периферической крови сенсибилизированных людей. На основе этого феномена был разработан тест для выявления специфической сенсибилизации к пыльцевым, бытовым, лекарственным (пенициллин) и другим аллергенам. Использованные аллергены были либо полноценными антигенами, либо гаптенами (пенициллин), образующими в организме комплексный антиген. Вместе с тем, оставалась неизвестной возможность использования хемилюминесцентного теста для выявления повышенной чувствительности к псевдоаллергенам, в частности к НПВП. Предварительные исследования влияния салицита и метамизола натрия показали, что они также угнетают СЛХЛ крови людей с непереносимостью данных препаратов [18]. Для определения зависимости изменения СЛХЛ крови от концентрации НПВП у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью данных препаратов было проведено настоящее исследование. В первой серии опытов нами проводилось исследование влияния диклофенака натрия на СЛХЛ цельной крови в группе пациентов с непереносимостью диклофенака натрия; в группе пациентов с непереносимостью НПВП, не имеющих повышенной чувствительности к диклофенаку натрия, а также в группе здоровых доноров после 114 предварительной инкубации проб крови с диклофенаком натрия в различных концентрациях. Следует отметить, что ранее проведенные нами исследования показали, что степень подавления СЛХЛ крови под влиянием салицилата и метамизола натрия у больных с непереносимостью АСК и/или метамизола натрия не зависела от формы клинического проявления непереносимости [18]. Недавние наши исследования показали аналогичный результат и у больных с различными клиническими проявлениями непереносимости диклофенака натрия. Поэтому при исследовании влияния диклофенака натрия на СЛХЛ цельной крови мы не стали делить группу пациентов с непереносимостью диклофенака на отдельные клинические группы, объединив всех пациентов с различными формами клинических проявлений непереносимости диклофенака в одну группу. Опытные пробы инкубировали с диклофенаком в различных концентрациях по методике, описанной в 2.3.7. В качестве контрольных проб использовали образцы крови, инкубированные при тех же условиях с равным объемом воды для инъекций. Далее регистрировали СЛХЛ крови и рассчитывали относительную интенсивность СЛХЛ (ИС) и относительную светосумму СЛХЛ (ИП), как описано в 2.3.5. Результаты представлены на рисунках 2,3. На рис. 2 показано влияние различных концентраций диклофенака натрия на ИС СЛХЛ здоровых доноров, больных с непереносимостью диклофенака натрия и больных с непереносимостью НПВП, не имеющих непереносимости диклофенака натрия. Как видно из рисунка 2, у здоровых доноров имеется зависимость изменений интенсивности СЛХЛ крови от концентрации диклофенака натрия. Малые концентрации препарата (концентрации, которые могут создаваться в крови in vivo при применении диклофенака) стимулируют СЛХЛ крови, наблюдается подавление СЛХЛ. однако при увеличении концентрации 115 Отн. интенсивность СЛХЛ 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0,6 6 30 75 150 300 концентрация диклофенака натрия, мкМ Доноры Больные с непереносимостью диклофенака Больные без непереносимости диклофенака Рис.2. Зависимость относительной интенсивности СЛХЛ крови от концентрации диклофенака натрия у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью НПВП. Примечание. * - р<0,05 относительно контроля; # - р<0,05 относительно аналогичной точки у здоровых доноров. Отн. светосумма СЛХЛ 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0,6 6 30 75 150 300 Концентрация диклофенака натрия, мкМ Доноры Больные с непереносимостью диклофенака Больные без непереносимости диклофенака Рис.3. Зависимость относительной светосуммы СЛХЛ крови от концентрации диклофенака натрия у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью НПВП. Примечание. * - р<0,05 относительно контроля; # - р<0,05 относительно аналогичной точки у здоровых доноров. 116 Так, например, на самой высокой концентрации препарата 300 мкМ относительная интенсивность СЛХЛ составила 0,19. Дозозависимое изменение СЛХЛ крови выявляется и у больных с непереносимостью диклофенака. Малые концентрации препарата не вызывают достоверного изменения СЛХЛ крови. При концентрациях, больших 6 мкМ, развивается угнетение СЛХЛ, достигающее при 300 мкМ 0,13. При всех исследованных концентрациях препарата СЛХЛ крови больных была меньше, чем у здоровых, и отсутствовала фаза стимуляции СЛХЛ. Угнетение СЛХЛ у больных наступало при применении меньших концентраций препарата, чем у здоровых доноров. В частности, при концентрации препарата 75 мкМ относительная интенсивность СЛХЛ крови больных составляла 0,46, в то время как у здоровых доноров указанная концентрация препарата еще не вызывала достоверных изменений СЛХЛ крови, и относительная интенсивность СЛХЛ оставалась равной 1,0. В общем кривая изменений относительной интенсивности СЛХЛ больных была аналогична таковой здоровых доноров, но располагалась достоверно на более низком уровне (р<0,05) (за исключением максимальной концентрации препарата 300 мкМ). Показатели относительной интенсивности СЛХЛ крови больных с непереносимостью НПВП, не имеющих повышенной чувствительности диклофенаку, не имели достоверных отличий от таковых здоровых доноров. На рисунке 3 показано влияние различных концентраций диклофенака натрия на относительную светосумму свечения крови (ИП) здоровых доноров, больных с непереносимостью диклофенака и больных с непереносимостью НПВП, не имеющих повышенной чувствительности к диклофенаку. Из рисунка 3 видно, что изменения относительной светосуммы свечения крови под влиянием диклофенака аналогичны изменениям относительной интенсивности СЛХЛ крови у всех исследуемых групп лиц. Сравнение показателей относительной интенсивности СЛХЛ (ИС) с показателями относительной светосуммы свечения (ИП) выявило 117 положительную корреляцию между данными параметрами для здоровых доноров, больных с непереносимостью диклофенака и больных с непереносимостью НПВП, не имеющих повышенной чувствительности к диклофенаку (коэффициент корреляции для здоровых доноров r = 0,995 (p<0,05), для больных с непереносимостью диклофенака- r = 0,997 (p<0,05), для больных с непереносимостью НПВП, не имеющих повышенной чувствительности к диклофенаку - r = 0,993 (p<0,05). Поскольку показатели относительной интенсивности СЛХЛ сильно положительно коррелируют с показателями относительной светосуммы свечения, в дальнейшей работе мы оценивали продукцию АФК ПМЛ крови под влиянием различных препаратов по изменению светосуммы СЛХЛ крови. Во второй серии опытов определяли изменения СЛХЛ крови под влиянием салицилата натрия у здоровых доноров, больных с повышенной чувствительностью к АСК и больных с непереносимостью НПВП, не имеющих повышенной чувствительности к АСК (рис.4). Из рисунка 4 видно, что изменения СЛХЛ крови под влиянием салицилата натрия у доноров, больных с непереносимостью АСК и больных с непереносимостью НПВП, не имеющих непереносимости АСК, в общем были аналогичны изменениям СЛХЛ крови под влиянием диклофенака натрия у доноров, больных с непереносимостью диклофенака и больных с непереносимостью НПВП, не имеющих повышенной чувствительности к диклофенаку, соответственно. Тем не менее, выявилось некое различие в продукции АФК ПМЛ цельной крови у больных под влиянием малых концентраций салицилата и диклофенака натрия. Так, уже на малых концентрациях салицилата натрия наблюдалось ингибирование СЛХЛ крови у больных с непереносимостью АСК, в то время как у больных с непереносимостью диклофенака малые концентрации диклофенака еще не оказывали ингибирующего воздействия на СЛХЛ крови. 118 1,8 Отн. светосумма СЛХЛ 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,06 0,3 1,5 3 6 12 Концетрация салицилата натрия, мМ Доноры Больные с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты Больные без непереносимости ацетилсалициловой кислоты Рис.4. Зависимость относительной светосуммы СЛХЛ крови от концентрации салицилата натрия у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью НПВП. Примечание. * - р<0,05 относительно контроля; # - р<0,05 относительно аналогичной точки у здоровых доноров. Отн. светосумма СЛХЛ 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,6 6 30 150 300 600 Концентрация метамизола натрия, мкМ Доноры Больные с непереносимостью метамизола натрия Больные без непереносимости метамизола натрия Рис.5. Зависимость относительной светосуммы СЛХЛ крови от концентрации метамизола натрия у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью НПВП. Примечание: * - р<0,05 относительно контроля; # - р<0,05 относительно аналогичной точки у здоровых доноров. 119 В следующей серии исследований определяли изменения СЛХЛ крови под влиянием метамизола натрия у здоровых доноров, больных с непереносимостью метамизола натрия, а также у больных с непереносимостью НПВП, но не имеющих повышенной чувствительности к метамизолу натрия (рис.5). Как видно из рисунка 5, изменения СЛХЛ крови под влиянием метамизола натрия у доноров, больных с непереносимостью метамизола натрия и больных с непереносимостью НПВП, не имеющих непереносимости метамизола натрия, имели сходный характер с изменениями СЛХЛ крови под влиянием салицилата и диклофенака натрия у доноров и соответствующих групп больных. У больных, с непереносимостью метамизола натрия, наблюдалось дозозависимое угнетение СЛХЛ крови под влиянием метамизола натрия при всех концентрациях препарата, как и в случае воздействия салицилата натрия на кровь больных с непереносимостью АСК. Таким образом, установлены общие закономерности изменения СЛХЛ крови под влиянием НПВП у больных с непереносимостью данных препаратов и здоровых доноров. НПВП оказывают дозозависимое модифицирующее влияние на СЛХЛ цельной крови здоровых доноров и больных с непереносимостью данных препаратов. У здоровых доноров малые концентрации препаратов стимулируют СЛХЛ крови, при увеличении концентрации развивается угнетение СЛХЛ. Наиболее выраженная стимуляция СЛХЛ крови наблюдалась при воздействии на кровь доноров диклофенака натрия, наименее выраженная - метамизола натрия. Дозозависимые изменения СЛХЛ крови выявляются и у пациентов с непереносимостью НПВП. Общая закономерность выражается в снижении СЛХЛ крови при увеличении концентрации исследуемых НПВП. Практически при всех используемых концентрациях НПВП СЛХЛ крови больных с непереносимостью данных препаратов была достоверно (p<0,05) меньше, чем у здоровых доноров, и отсутствовала фаза стимуляции. Это 120 свидетельствует об изменении оксидантной активности ПМЛ крови больных с непереносимостью НПВП при прединкубации крови с данными препаратами. У пациентов с непереносимостью НПВП при отсутствии повышенной чувствительности к какому-либо из исследуемых НПВП показатели СЛХЛ крови при воздействии этого НПВП не имели достоверных отличий от таковых здоровых доноров. Таким образом, нами выявлены статистически значимые различия показателей СЛХЛ крови у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью НПВП после прединкубации проб крови с данными препаратами, что открывает возможность применения хемилюминесцентного теста для экспересс-диагностики непереносимости препаратов этой группы. Данный тест был оформлен, как патентная заявка «Способ диагностики in vitro повышенной чувствительности к псевдоаллергенам и подбора противоаллергической терапии» (дата поступления заявки: 22.04.2014; входящий номер: 025205; регистрационный номер: 2014116060), по которой 23.11.2015г. было вынесено положительное решение о выдаче патента на изобретение. 3.5. Исследование воздействия НПВП на стимулированную сульфатом бария люцигенин-зависимую хемилюминесценцию периферической крови у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью данных препаратов. Для того, чтобы определить, какие ферментные системы фагоцитов, участвующие в развитии «дыхательного взрыва», являются объектом угнетающего действия исследуемых НПВП, мы косвенно оценивали активность НАДФН-оксидазы методом СЛЦХЛ, как описано в разделе 2.3.6. Объектом исследования были те же доноры и пациенты, что и в п. 3.4., поскольку измерение люминол- и люцигенин-зависимой ХЛ цельной крови проводили одновременно для каждого человека, включенного в 121 исследование. диклофенаком, Опытные пробы салицилатом, предварительно метамизолом инкубировали натрия в с различных концентрациях согласно методике 2.3.7. В качестве контрольных проб использовали образцы крови, инкубированные с равным объемом воды для инъекций (для диклофенака натрия) или физиологического раствора (для салицилата и метамизола натрия). После регистрации люцигенин-зависимой ХЛ рассчитывали относительную светосумму СЛЦХЛ (ИП), как отношение Sхл опытной пробы (с НПВП) к Sхл контрольной (рис. 6-8). Отн. светосумма СЛЦХЛ 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,6 6 30 75 150 300 Концентрация диклофенака натрия, мкМ Доноры Больные с непереносимостью диклофенака Больные без непереносимости диклофенака Рис.6. Зависимость относительной светосуммы СЛЦХЛ крови от концентрации диклофенака натрия у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью НПВП. Примечание: * - р<0,05 относительно контроля # - р<0,05 относительно аналогичной точки у здоровых доноров. Как видно из рисунка 6, прединкубация проб крови здоровых доноров с диклофенаком натрия не сопровождается достоверным изменением СЛЦХЛ 122 крови при самой низкой концентрации препарата (0,6 мкМ). Однако при увеличении концентрации диклофенака наблюдалось дозозависимое подавление СЛЦХЛ крови. В частности, при самой высокой концентрации препарата относительная светосумма СЛЦХЛ составила 0,62. При исследовании изменения СЛЦХЛ крови под влиянием диклофенака у больных с непереносимостью данного препарата выявлялось более выраженное подавление СЛЦХЛ крови по сравнению со здоровыми донорами практически при всех концентрациях препарата, за исключением самой низкой 0,06 мкМ и самой высокой 300 мкМ, при которых относительная светосумма СЛХЛ не имела достоверных отличий от таковой здоровых доноров. Кривая изменений СЛЦХЛ крови больных с непереносимостью НПВП, не имеющих повышенной чувствительности к диклофенаку, практически полностью совпадала с кривой здоровых доноров. Полученные результаты показывают, что при прединкубации проб крови с диклофенаком, активность НАДФН-оксидазы ПМЛ дозозависимо снижается как у здоровых, так и у больных с непереносимостью НПВП. При этом у больных с непереносимостю диклофенака наблюдается более выраженное угнетение активности НАДФН-оксидазы ПМЛ по-сравнению с таковой здоровых доноров. Изменения активности НАДФН-оксидазы ПМЛ у больных с непереносимостью НПВП, не имеющих повышенной чувствительности к диклофенаку, имели сходный характер с изменениями активности данного фермента у здоровых доноров. В следующей серии опытов исследовали изменение светосуммы СЛЦХЛ крови у здоровых доноров, больных с непереносимостью АСК и больных с непереносимостью НПВП, не имеющих повышенной чувствительности к АСК, после предварительной инкубации проб крови с салицилатом натрия в различных концентрациях, как описано в 2.3.7. (рис. 7). 123 Отн. светосумма СЛЦХЛ 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0,06 0,3 1,5 3 6 12 Концентрация салицилата натрия, мМ Больные с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты Больные без непереносимости ацетилсалициловой кислоты Доноры Рис.7. Зависимость относительной светосуммы СЛЦХЛ крови от концентрации салицилата натрия у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью НПВП. Примечание:* - р<0,05 относительно контроля; # - р<0,05 относительно аналогичной точки у здоровых доноров. Как видно из рисунка 7, у здоровых доноров наблюдалась стимуляция СЛЦХЛ крови в широком диапазоне концентраций данного препарата (от 0,3 мМ до 6 мМ). В частности, при концентрации салицилата натрия 3 мМ относительная светосумма СЛЦХЛ достигает максимального значения и составляет 1,74 отн. ед. Стимуляция СЛЦХЛ крови отсутствовала при самой минимальной (0,06 мМ) и самой максимальной (12,0 мМ) концентрациях препарата. У больных с непереносимостью АСК отмечается незначительное подавление СЛЦХЛ крови на самой малой концентрации препарата (0,06 мМ). Далее при концентрациях 0,3мМ; 1,5мМ достоверные изменения СЛЦХЛ отсутствуют. В диапазоне концентраций от 3 мМ до 6 мМ наблюдалась стимуляция СЛЦХЛ крови. Однако стимуляция СЛЦХЛ крови у больных была менее выражена, чем у здоровых доноров. При самой высокой концентрации салицилата 12 мМ ИП не имел достоверных отличий от контроля как у больных с непереносимостю АСК, так и у здоровых доноров. У больных с непереносимостью НПВП, не имеющих 124 непереносимости АСК, показатели относительной светосуммы СЛЦХЛ крови достоверно не отличались от таковых у здоровых доноров. Полученные результаты показали, что предварительная инкубация проб крови здоровых доноров с салицилатом натрия сопровождается активацией НАДФН-оксидазы ПМЛ в широком диапазоне концентраций препарата (за исключением минимальной 0,06 мМ и максимальной 12,0 мМ концентраций). У больных с непереносимостью АСК при большинстве используемых концентраций препарата (за исключением минимальной 0,06 мМ и максимальной 12,0 мМ концентраций) активность НАДФН-оксидазы ПМЛ была достоверно ниже, чем у здоровых доноров. Далее исследовали изменение светосуммы СЛЦХЛ крови под влиянием метамизола натрия у пациентов с непереносимостью метамизола натрия, у пациентов с непереносимостью НПВП, не имеющих Отн. светосумма СЛХЛ непереносимости метамизола натрия, и у здоровых доноров (рис. 8). 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,6 6 30 150 300 600 1500 3000 Концентрация метамизола натрия, мкМ Доноры Больные с непереносимостью метамизола натрия Больные без непереносимости метамизола натрия Рис.8. Зависимость относительной светосуммы СЛЦХЛ крови от концентрации метамизола натрия у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью НПВП. Примечание: * - р<0,05 относительно контроля; # - р<0,05 относительно аналогичной точки у здоровых доноров. 125 Как видно из рисунка 8, у здоровых доноров во всем диапазоне используемых концентраций метамизола натрия, за исключением самой максимальной (3000 мкМ), наблюдается стимуляция СЛЦХЛ крови, причем наиболее выраженная стимуляция отмечалась при высоких концентрациях препарата. В частности, при концентрациях 600 мкМ и 1500 мкМ относительная интенсивность СЛЦХЛ составляла 1,57 и 1,50, соответственно. У больных с непереносимостью метамизола натрия выявляется дозозависимое ингибирование СЛЦХЛ крови. Так, при самой высокой концентрации препарата относительная интенсивность СЛЦХЛ составила 0,57. У больных с непереносимостью НПВП, не имеющих повышенной чувствительности к метамизолу натрия, показатели СЛЦХЛ крови не имели достоверных отличий от таковых здоровых доноров. Приведенные выше результаты свидетельствуют, что прединкубация проб крови с метамизолом натрия сопровождается увеличением активности НАДФН-оксидазы ПМЛ у здоровых доноров и больных с непереносимостью НПВП, не имеющих повышенной чувствительности к метамизолу натрия. У пациентов с непереносимостью метамизола натрия развивается дозозависимое угнетение активности указанного фермента. Таким образом, НПВП оказывают модифицирующее влияние на СЛЦХЛ цельной крови здоровых доноров и пациентов с непереносимостью данных препаратов. У пациентов с непереносимостью НПВП показатели СЛЦХЛ крови под влиянием НПВП достоверно ниже таковых здоровых доноров, что косвенно свидетельствует о подавлении активности НАДФНоксидазы ПМЛ. У пациентов с непереносимостью НПВП при отсутствии повышенной чувствительности к какому-либо НПВП показатели СЛЦХЛ крови при воздействии этого НПВП не имеют достоверных отличий от таковых здоровых доноров. Имеются различия в активности НАДФН-оксидазы ПМЛ крови при использовании НПВП с различной химической структурой 126 (диклофенака натрия, салицилата натрия, метамизола натрия) у всех групп исследуемых лиц. 3.6. Исследование воздействия пищевого красителя тартразина на стимулированную сульфатом бария люминол-зависимую хемилюминесценцию периферической крови у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью НПВП в сочетании с непереносимостью тартразина. Пищевой краситель желтого цвета тартразин (Е102) широко используется в России в пищевой и фармакологической промышленности. Однако при употреблении пищевых продуктов, напитков, лекарственных препаратов, окрашенных тартразином, нередко возникают побочные эффекты, такие как бронхоспазм, крапивница, отек Квинке, ринит, дерматит, мигрень, нарушение зрения и другие негативные реакции [360]. В одних случаях, являясь гаптеном, тартразин образует комплексы с белком, например, с сывороточным альбумином, и становится полноценным антигеном, на который в организме вырабатываются антитела. В этом случае развиваются истинные аллергические реакции на тартразин. В других случаях, тартразин может выступать в качестве псевдоаллергена и индуцировать развитие псевдоаллергических реакций, как в результате прямого действия красителя на чувствительные клетки-мишени аллергии с последующей неспецифической либерацией медиаторов, так и в результате нарушения метаболизма арахидоновой кислоты за счет угнетения циклооксигеназы преимущественного и сдвига баланса в сторону образования лейкотриенов, которые оказывают выраженное биологическое влияние на различные ткани и системы [34]. Не исключено, что у одного пациента могут развиваться реакции на пищевой краситель, обусловленные участием как специфических иммунных реакций, так и псевдоаллергических. 127 В литературе показано, что наиболее часто побочные реакции на тартразин возникают у людей с повышенной чувствительностью к НПВП [67]. Для определения общих закономерностей изменения суммарной продукции АФК ПМЛ крови под влиянием тартразина, выступающего в роли псевдоаллергена, у больных с его непереносимостью разных клинических групп и доноров, а также для выяснения общих механизмов непереносимости тартразина и НПВП в данной части работы определяли влияние тартразина на СЛХЛ крови здоровых доноров и больных с непереносимостью НПВП в сочетании и без такого с непереносимостью тартразина. Следует отметить, что предварительно проведенные нами исследования показали, что степень подавления СЛХЛ крови под влиянием тартразина у больных с его непереносимостью не зависела от формы клинического проявления непереносимости. Поэтому при исследовании СЛХЛ цельной крови под влиянием тартразина мы не стали делить группу пациентов с непереносимостью тартразина на отдельные клинические группы, объединив всех пациентов с различными формами клинических проявлений непереносимости тартразина в одну группу. Опытные и контрольные пробы инкубировали с тартразином в различных концентрациях согласно методике 2.3.7. После регистрации СЛХЛ крови рассчитывали относительную светосумму свечения (ИП), как описано в 2.3.5. (рис. 9). Как видно из рисунка 9, тартразин оказывает модифицирующее влияние на СЛХЛ крови здоровых доноров и больных с непереносимостью НПВП в сочетании или без такового с непереносимостью данного красителя. У здоровых доноров СЛХЛ крови существенно не изменяется при малых и средних концентрациях препарата (в диапазоне от 0,4мкМ до 100 мкМ). При концентрациях, превышающих 100 мкМ, СЛХЛ крови дозозависимо снижается. В частности, при самой высокой концентрации тартразина (2000 мкМ) относительная светосумма СЛХЛ крови доноров составила 0,64 отн. ед. Отн. светосумма СЛХЛ 128 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,4 4 20 100 500 1000 2000 Концентрация тартразина, мкМ Больные с непереносимостью тартразина Больные без непереносимости тартразина Здоровые доноры Рис.9. Зависимость относительной светосуммы СЛХЛ крови от концентрации тартразина у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью НПВП в сочетании и без такового с непереносимостью тартразина. Примечание: * - р<0,05 относительно контроля; # - р<0,05 относительно аналогичной точки у здоровых доноров Таким образом, у здоровых доноров при воздействии на кровь тартразина выявлялось две фазы в изменении светосуммы СЛХЛ: в первой фазе отсутствовали выраженные изменения СЛХЛ крови (в диапазоне от 0,4 мкМ до 100 мкМ); вторая фаза характеризовалась дозозависимым угнетением СЛХЛ. При воздействии тартразина на кровь больных с непереносимостью НПВП, не имеющих непереносимости тартразина, характер изменения светосуммы СЛХЛ крови аналогичен таковому здоровых доноров. У пациентов с непереносимостью тартразина в сочетании с непереносимостью НПВП при всех концентрациях препарата наблюдалось выраженное ингибирование СЛХЛ крови, в котором можно было выделить две фазы: в первую фазу ингибирования (в диапазоне концентраций от 0,4мкМ до 100 мкМ) угнетение СЛХЛ составляло примерно 50% относительно контрольной пробы, во вторую фазу (от 500 мкМ до 2000 мкМ) – около 80%. При всех используемых концентрациях тартразина СЛХЛ больных с 129 непереносимостью тартразина была достоверно ниже, чем у здоровых доноров. Таким образом, выявляются достоверные различия в суммарной продукции АФК ПМЛ крови под влиянием тартразина у здоровых доноров и больных с непереносимостью НПВП в сочетании с непереносимостю тартразина при всех концентрациях красителя. Данные результаты согласуются с результатами, полученными при исследовании влияния НПВП in vitro на кровь больных с непереносимостью этих препаратов и здоровых доноров, когда мы наблюдали более выраженное ингибирование СЛХЛ крови у больных, наступающее при применении меньших концентраций НПВП, по сравнению со здоровыми донорами. Характер влияния тартразина на СЛХЛ крови больных с непереносимостью данного красителя и здоровых доноров является сходным с характером влияния НПВП на СЛХЛ крови больных с непереносимостью соответствующих препаратов и здоровых доноров. Это может указывать на общность механизмов изменения СЛХЛ крови под влиянием данных веществ, в частности участии одних и тех же биологически активных веществ (медиаторов, цитокинов), изменяющих активность ферментов окислительного метаболизма ПМЛ крови. Указанные различия в показателях СЛХЛ крови здоровых доноров и больных с непереносимостью тартразина открывают возможность применения хемилюминесцентного теста для диагностики повышенной чувствительности к данному красителю. 3.7. Исследование воздействия пищевого красителя тартразина на стимулированную сульфатом бария люцигенин-зависимую хемилюминесценцию периферической крови у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью НПВП в сочетании с непереносимостью тартразина. 130 Для того, чтобы определить, какие ферментные системы фагоцитов, участвующие в развитии «дыхательного взрыва», являются объектом угнетающего действия тартразина, мы косвенно оценивали активность НАДФН-оксидазы ПМЛ методом СЛЦХЛ. Опытные и контрольные пробы инкубировали с тартразином в различных концентрациях, согласно методике 2.3.7. После регистрации люцигенин-зависимой ХЛ рассчитывали Отн. светосумма СЛЦХЛ относительную светосумму СЛЦХЛ (ИП), как описано в 2.3.5. (рис. 10). 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,4 4 20 100 500 1000 2000 Концентрация тартразина, мкМ Здоровые доноры Больные без непереносимости тартразина Больные с непереносимостью тартразина Рис.10. Зависимость концентрации относительной тартразина у светосуммы здоровых доноров СЛЦХЛ и крови пациентов от с непереносимостью НПВП в сочетании и без такового с непереносимостью тартразина. Как видно из рисунка 10, предынкубация проб крови с тартразином в различных концентрациях не сопровождается существенным изменением интенсивности СЛЦХЛ при всех концентрациях красителя как у доноров, так и у больных с непереносимостью НПВП в сочетании или без такового с непереносимостью тартразина. 131 Полученные результаты свидетельствует о том, что тартразин не оказывает существенного влияния на активность НАДФН-оксидазы ПМЛ крови как у здоровых доноров, так и у больных с повышенной чувствительностью к тартразину в сочетании с непереносимостью НПВП. Выраженное подавление СЛХЛ крови, развивающееся под воздействием тартразина, у больных с непереносимостью данного красителя в значительной степени связано с угнетением активности МПО ПМЛ. НАДФН-оксидаза ПМЛ не участвует в реализации эффекта подавления СЛХЛ крови под влиянием тартразина у всех групп исследуемых лиц. Таким образом, исследуемые нами псевдоаллергены - НПВП, тартразин оказывают сходное влияние на СЛХЛ крови больных с повышенной чувствительностью к данным псевдоаллергенам и здоровых доноров. Прединкубация образцов крови с НПВП, тартразином у больных с их непереносимостью сопровождается дозозависимым ингибированием СЛХЛ крови. Практически при всех используемых концентрациях указанных псевдоаллергенов СЛХЛ крови больных с их непереносимостью достоверно ниже, чем у ингибирования здоровых СЛХЛ доноров крови под (p<0,05). влиянием Одним НПВП из у механизмов больных с непереносимостью данных препаратов является снижение активности НАДФН-оксидазы ПМЛ относительно таковой здоровых доноров. Вместе с тем, НАДФН-оксидаза ПМЛ не вносит вклад в реализацию ингибирования СЛХЛ крови под влиянием тартразина. При отсутствии исследуемых повышенной псевдоаллергенов (к чувствительности какому-либо к НПВП, одному из тартразину) показатели СЛХЛ крови при воздействии этого псевдоаллергена не имеют достоверных отличий от аналогичных показателей здоровых доноров, и активность НАДФН-оксидазы ПМЛ данных больных сходна с таковой здоровых доноров. 132 Глава 4. Определение роли плазменных факторов в развитии феномена ингибирования стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой хемилюминесценции крови под влиянием НПВП, тартразина у больных с их непереносимостью. 4.1. Определение хемилюминесценции исследуемыми светосумм суспензии НПВП у люминолПМЛ здоровых и после доноров люцигенин-зависимой прединкубации и больных с с их непереносимостью. Описанные выше эксперименты показали, что НПВП оказывают дозозависимое модифицирующее влияние на СЛХЛ цельной крови здоровых доноров и пациентов с непереносимостью данных препаратов. У здоровых доноров малые концентрации препаратов стимулируют СЛХЛ крови, при увеличении концентрации препаратов развивается угнетение СЛХЛ. У пациентов с непереносимостью НПВП фаза стимуляции СЛХЛ крови отсутствовала, а угнетение СЛХЛ наступало при применении меньших концентраций препаратов, чем у здоровых доноров. При этом подавление СЛХЛ крови больных с непереносимостью НПВП связано с угнетением активности НАДФН-оксидазы ПМЛ. Между тем, до настоящего времени не известно, связаны ли выявленные различия СЛХЛ крови под воздействием НПВП у доноров и больных с непереносимостью НПВП исключительно с влиянием на ПМЛ крови биологически активных веществ (медиаторов, цитокинов) плазмы, или все же существуют какие-то особенности окислительного метаболизма ПМЛ у данной группы больных, проявляющиеся при воздействии на ПМЛ НПВП. Для решения этого вопроса мы исследовали изменения СЛХЛ и СЛЦХЛ выделенных из периферической крови ПМЛ после предварительной инкубации суспензии ПМЛ с НПВП у здоровых доноров и больных с непереносимостью данных препаратов, как описано в п. 2.3.5., 2.3.6. 133 В первой серии опытов исследовали влияние салицилата натрия, метамизола натрия и диклофенака натрия на СЛХЛ выделенных ПМЛ у доноров и пациентов с непереносимостью АСК и/или метамизола натрия и/или диклофенака натрия (рис. 11а,12а,13а). Поскольку предварительные исследования не выявили достоверных отличий в изменении СЛХЛ выделенных ПМЛ под влиянием салицилата натрия в группах пациентов с разными клиническими проявлениями непереносимости АСК, мы объединили всех пациентов с различными клиническими проявлениями непереносимости АСК в одну группу. Аналогичный результат мы получили также в предварительных исследованиях по изучению влияния метамизола и диклофенака натрия на СЛХЛ выделенных ПМЛ пациентов с непереносимостью метамизола натрия и/или диклофенака натрия с разными клиническими проявлениями. Как видно из рисунков 12а,13а,14а, показатели относительной светосуммы СЛХЛ суспензии ПМЛ больных с непереносимостью АСК и/или метамизола натрия и/или диклофенака натрия не имеют достоверных отличий от аналогичных показателей доноров (p>0,1). Различия выявляются только при сравнении между собой указанных препаратов по их воздействию на окислительный метаболизм ПМЛ. Для того, чтобы сравнить между собой НПВП разных химических групп по их воздействию на окислительный метаболизм ПМЛ, используемые концентрации препаратов выразили в эквивалентах средних терапевтических доз (ЭСТД). Конечные концентрации салицилата натрия составили от 0,1 до 20 ЭСТД/мл; метамизола натрия - от 0,002 до 2 ЭСТД/мл; диклофенака натрия - от 0,02 до 10 ЭСТД/мл. Соответствие молярных концентраций исследуемых НПВП эквивалентам средних терапевтических доз представлено в таблице 6. Как видно из таблицы 6 и рисунков 11а,12а,13а, метамизол и диклофенак натрия оказывают сходное влияние на СЛХЛ ПМЛ. 134 а. Отн. светосумма СЛХЛ 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,06 0,3 1,5 3 6 12 Концентрация салицилата натрия, мМ Доноры Больные с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты б. Отн. светосумма СЛЦХЛ 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,06 0,3 1,5 3 6 12 Концентрация салицилата натрия, мМ Больные с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты Доноры Рисунок 11. Влияние салицилата натрия на относительную светосумму стимулированной люминол-зависимой (а) и люцигенин-зависимой (б) хемилюминесценции суспензии полиморфно-ядерных лейкоцитов периферической крови доноров и больных с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты. Примечание. * - p<0,05 относительно контроля. 135 а. Отн. светосумма СЛХЛ 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,6 6 30 150 300 600 Концентрация метамизола натрия, мкМ Доноры Больные с непереносимостью метамизола натрия Отн. светосумма СЛЦХЛ б. 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,6 6 30 150 300 600 Концентрация метамизола натрия, мкМ Доноры Больные с непереносимостью метамизола натрия Рисунок 12. Влияние метамизола натрия на относительную светосумму стимулированной люминол-зависимой (а) и люцигенин-зависимой (б) хемилюминесценции суспензии полиморфно-ядерных лейкоцитов периферической крови доноров и больных с непереносимостью метамизола натрия. Примечание. * - p<0,05 относительно контроля 136 а. Отн. светосумма СЛХЛ 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,6 6 30 75 150 300 Концентрация диклофенака натрия, мкМ Доноры Больные с непереносимостью диклофенака б. Отн. светосумма СЛЦХЛ 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,6 6 30 75 150 300 Концентрация диклофенака натрия, мкМ Доноры Больные с непереносимостью диклофенака Рисунок 13. Влияние диклофенака натрия на относительную светосумму стимулированной люминолзависимой (а) и люцигенинзависимой (б) хемилюминесценции суспензии полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови доноров и больных с непереносимостью диклофенака. Примечание: * - p<0,05 относительно контроля 137 Таблица 6. Соответствие молярных концентраций НПВП эквивалентам средних терапевтических доз. Салицилат натрия Метамизол натрия Диклофенак натрия ммоль ЭСТД мкмоль ЭСТД мкмоль ЭСТД 0,06 0,1 0,6 0,002 0,6 0,02 0,3 0,5 6 0,02 6 0,2 1,5 2,5 30 0,1 30 1 3 5 150 0,5 75 2,5 6 10 300 1 150 5 12 20 600 2 300 10 Малые концентрации метамизола натрия (0,002 ЭСТД, 0,02 ЭСТД) и диклофенака натрия (0,02 ЭСТД, 0,2 ЭСТД, 1 ЭСТД) не вызывают существенных изменений СЛХЛ ПМЛ (p>0,1). При увеличении концентрации указанных препаратов развивается дозозависимое угнетение СЛХЛ, наиболее выраженное при воздействии на ПМЛ метамизола натрия, поскольку подавление СЛХЛ ПМЛ под влиянием последнего наблюдается уже при концентрации 0,1 ЭСТД, в то время как диклофенак натрия оказывает угнетающее действие на СЛХЛ ПМЛ при концентрациях, превышающих 1 ЭСТД. Ингибирование СЛХЛ ПМЛ под влиянием салицилата натрия наблюдается только при высоких концентрациях препарата (10 ЭСТД, 20 ЭСТД), при концентрациях в диапазоне 0,5 ЭСТД – 2,5 ЭСТД, напротив, отмечается незначительная стимуляция СЛХЛ ПМЛ (примерно на 20%). Таким образом, суммарная продукция АФК выделенными ПМЛ под воздействием салицилата натрия, метамизола натрия и диклофенака натрия у доноров не имеет достоверных отличий от таковой у больных с непереносимостью АСК и/или метамизола натрия и/или диклофенака натрия. 138 Выявляются различия в суммарной выработке АФК ПМЛ при сравнении между собой влияния исследуемых НПВП на СЛХЛ ПМЛ. Для того, чтобы косвенно оценить, как изменяется активность НАДФНоксидазы ПМЛ под влиянием салицилата натрия, метамизола натрия и диклофенака натрия у здоровых доноров и больных с непереносимостью данных препаратов, в следующей серии опытов мы исследовали изменение СЛЦХЛ выделенных ПМЛ под воздействием указанных препаратов. В исследование были включены те же пациенты и доноры, что и в случае исследования СЛХЛ суспензии ПМЛ (рис. 11б,12б,13б). Как видно из рисунков 11б,12б,13б, показатели относительной светосуммы СЛЦХЛ выделенных ПМЛ не имеют достоверных отличий у доноров и у пациентов с непереносимостью АСК и/или метамизола натрия и/или диклофенака натрия при воздействии на ПМЛ салицилата, метамизола и диклофенака натрия (p>0,1). Это косвенно свидетельствует о том, что активность НАДФН-оксидазы выделенных ПМЛ под влиянием используемых нами НПВП изменяется сходным образом у доноров и у больных с непереносимостью данных препаратов. Следует отметить, что салицилат и диклофенак натрия оказывают супрессирующее влияние на НАДФН-оксидазу ПМЛ доноров и больных с непереносимостью этих препаратов, наиболее выраженное при воздействии на ПМЛ диклофенака натрия. Так, при концентрации диклофенака 2,5 ЭСТД развивается подавление СЛЦХЛ ПМЛ примерно на 40-60%, в то время как при аналогичной концентрации салицилата натрия СЛЦХЛ ингибируется примерно на 10-30%. При исследовании влияния метамизола натрия на СЛЦХЛ ПМЛ не было выявлено угнетения СЛЦХЛ ПМЛ в выбранном диапазоне концентраций. Это может свидетельствовать о том, что подавление суммарной выработки АФК ПМЛ под влиянием метамизола натрия в определяющей степени связано с угнетением активности МПО ПМЛ, в то время как подавление суммарной выработки АФК ПМЛ под 139 влиянием диклофенака и салицилата натрия связано с угнетением активности обоих ферментов. Полученные результаты показывают, что суммарная продукция АФК выделенными ПМЛ, в том числе и продукция О2-, у больных с непереносимостью НПВП не отличается от аналогичных показателей у доноров, что свидетельствует об отсутствии каких-либо особенностей в работе ферментов окислительного метаболизма под воздействием используемых нами НПВП у больных с непереносимостью данных препаратов по сравнению с донорами. Из этого можно сделать вывод, что различия в показателях СЛХЛ цельной крови больных с непереносимостью НПВП по сравнению с донорами при прединкубации проб крови с НПВП связаны с влиянием на ферменты окислительного метаболизма находящихся в плазме крови биологически активных веществ (медиаторов, цитокинов), содержание и соотношение которых различно у доноров и больных с непереносимостью НПВП. Наше предположение хорошо соотносится с результатами экспериментальных и клинических доказывающих, что на фоне стимуляции аспирином исследований, in vitro увеличивается высвобождение сульфидолейкотриенов лимфоцитами периферической крови у пациентов с непереносимостью аспирина, по сравнению с толерантными к указанному препарату лицами [241]. При непереносимости АСК аспирин провоцирует синтез и высвобождение лимфоцитами периферической крови 15- гидроксиэйкозатетраеновой кислоты in vitro, стимулирует высвобождение гистамина из тромбоцитов, базофилов, тучных клеток [237]. Последнее подтверждается тем фактом, что у больных реакция на НПВП нередко сопровождается увеличением гистамина в плазме крови и его выведения с мочой [67]. Наше предположение об участии биологически активных веществ в подавлении СЛХЛ цельной крови под влиянием НПВП у больных с непереносимостью данных препаратов подтверждают также ранее полученные Пыцким В.И. и соавт. [305] данные об участии гистаминового 140 механизма в подавлении СЛХЛ крови больных с непереносимостью аспирина и/или анальгина при инкубации проб крови с салицилатом натрия или анальгином. воздействуя на По-видимому, ПМЛ, биологически способны окислительного метаболизма ПМЛ изменять активные активность вещества, ферментов и, следовательно, модифицировать СЛХЛ крови. В частности, при изучении влияния гистамина, используемого в различных концентрациях, на окислительный метаболизм ПМЛ было выявлено, что гистамин дозозависимо изменяет активность НАДФН- оксидазной и миелопероксидазной ферментных систем ПМЛ [17]. Таким образом, показатели СЛХЛ и СЛЦХЛ выделенных ПМЛ под влиянием НПВП не имеют достоверных отличий (p>0,1) у доноров и больных с непереносимостью указанных препаратов, что свидетельствует об отсутствии каких-либо особенностей в работе ферментов окислительного метаболизма ПМЛ под воздействием указанных НПВП у больных с непереносимостью данных препаратов по сравнению с донорами. 4.2. Определение светосумм люминол- и люцигенин-зависимой хемилюминесценции суспензии ПМЛ после прединкубации с пищевым красителем тартразином у доноров и больных с его непереносимостью. Поскольку предыдущие результаты (п.4.1.) показали, что показатели СЛХЛ и СЛЦХЛ выделенных ПМЛ под влиянием НПВП не имеют достоверных отличий (p>0,1) у доноров и больных с непереносимостью указанных препаратов, что свидетельствует об отсутствии каких-либо особенностей в работе ферментов окислительного метаболизма ПМЛ под воздействием указанных НПВП у больных с непереносимостью данных препаратов по сравнению с донорами, мы посчитали важным определить, повторится ли данный результат у пациентов с непереносимостью тартразина и доноров при воздействии данного красителя на суспензию ПМЛ всех исследуемых лиц (рис.14). 141 а. Отн. светосумма СЛХЛ 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,4 4 20 100 500 1000 2000 Концентрация тартразина, мкМ Доноры Больные с непереносимостью тартразина б. Отн. светосумма СЛЦХЛ 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,4 4 20 100 500 1000 2000 Концентрация тартразина, мкМ Доноры Больные с непереносимостью тартразина Рисунок 14 (а,б). Влияние тартразина на относительную светосумму стимулированной люминолзависимой (а) и люцигенинзависимой (б) хемилюминесценции суспензии полиморфно-ядерных лейкоцитов периферической крови доноров и больных с непереносимостью тартразина. Примечание: * - p<0,05 относительно контроля 142 Как видно из рисунка 14а, показатели относительной светосуммы СЛХЛ суспензии ПМЛ больных с непереносимостью тартразина не имеют достоверных отличий от аналогичных показателей доноров (p>0,1). Таким образом, суммарная продукция АФК выделенными ПМЛ под влиянием тартразина у доноров не имеет достоверных отличий от таковой у пациентов с непереносимостью тартразина. Для того, чтобы косвенно оценить, как изменяется активность НАДФН-оксидазы ПМЛ под влиянием тартразина у здоровых доноров и больных с непереносимостью данного красителя, исследовали изменение СЛЦХЛ выделенных ПМЛ под воздействием указанного красителя (рис. 14б). В исследование были включены те же пациенты и доноры, что и в случае исследования СЛХЛ суспензии ПМЛ. Как видно из рисунка 14б, показатели относительной светосуммы СЛЦХЛ выделенных ПМЛ не имеют достоверных отличий у доноров и у пациентов с непереносимостью тартразина при воздействии на ПМЛ тартразина (p>0,1). Это косвенно свидетельствует о том, что активность НАДФН-оксидазы выделенных ПМЛ под влиянием используемого нами пищевого красителя изменяется сходным образом у доноров и у больных с непереносимостью тартразина. Следует отметить, что подавление суммарной выработки АФК выделенными ПМЛ под влиянием тартразина в значительной степени связано с угнетением активности НАДФН-оксидазы ПМЛ. Полученные результаты показывают, что суммарная продукция АФК выделенными ПМЛ, в том числе и продукция О2-, у пациентов с непереносимостью тартразина не отличается от аналогичных показателей у доноров, что свидетельствует об отсутствии каких-либо особенностей в работе ферментов окислительного метаболизма под влиянием тартразина у больных с непереносимостью данного красителя по сравнению с донорами. Это подтверждает ранее полученную нами закономерность, когда было 143 обнаружено, что суммарная продукция АФК, том числе и продукция О2-, выделенными ПМЛ под влиянием НПВП у больных с непереносимостью НПВП не отличалась от аналогичных показателей у здоровых доноров (п. 4.1). 4.3. Определение светосуммы люминолзависимой хемилюминесценции суспензии ПМЛ здоровых доноров, инкубированных с плазмой крови больных с непереносимостью НПВП. Для того, чтобы подтвердить, что именно плазменные факторы изменяют реакцию ПМЛ периферической крови на НПВП у больных с непереносимостью данных препаратов, мы исследовали влияние плазмы больных с непереносимостью НПВП на окислительный метаболизм ПМЛ здоровых доноров. С этой целью опытные пробы крови здоровых доноров и больных с непереносимостью АСК, проявляющейся реакциями со стороны органов дыхания (бронхоспазм/ринит), инкубировали с салицилатом натрия в концентрации 3,0 мМ в течение 45 минут при 37ºС при постоянном перемешивании. Следует отметить, что указанная концентрация оказывает угнетающее воздействие на СЛХЛ крови больных с непереносимостью АСК, в отличие от здоровых доноров, у которых на данной концентрации подавления СЛХЛ крови не происходит (как было показано в разделе 3.4.). Контрольные пробы инкубировали в тех же условиях с равным объемом физиологического раствора. Затем пробы крови центрифугировали в течение 3 минут на 1000 оборотах/мин., а полученную плазму, добавляли в пробы суспензии ПМЛ (1х106 ПМЛ) доноров, после чего доводили объем содержимого проб суспензии ПМЛ раствором Хенкса до 700 мл. Полученные пробы снова инкубировали в течение 45 минут при 37ºС при постоянном перемешивании, после чего регистрировали СЛХЛ, как описано в п. 2.3.5. (рис. 15) 144 35000000 30000000 25000000 20000000 15000000 10000000 5000000 0 1 2 3 4 Рис 15. Влияние плазмы здоровых доноров и больных с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты на светосумму СЛХЛ суспензии ПМЛ доноров. 1. Светосумма СЛХЛ ПМЛ доноров, инкубированных с плазмой, отобранной из проб крови доноров после предварительной инкубации крови с физиологическим раствором. 2. Светосумма СЛХЛ ПМЛ доноров, инкубированных с плазмой, отобранной из проб крови доноров после предварительной инкубации крови с салицилатом натрия (3,0 мМ). 3. Светосумма СЛХЛ ПМЛ доноров, инкубированных с плазмой, отобранной из проб крови больных с непереносимостью АСК после предварительной инкубации крови с физиологическим раствором. 4. Светосумма СЛХЛ ПМЛ доноров, инкубированных с плазмой, отобранной из проб крови больных с непереносимостью АСК после предварительной инкубации крови с салицилатом натрия (3,0 мМ). Примечание. * - р<0,05 относительно 1-го столбца # - р<0,05 относительно 2-го столбца. &- р<0,05 относительно 3-го столбца. 145 Как видно из рисунка 15, инкубация ПМЛ доноров с плазмой, отобранной после предварительной инкубации проб крови доноров с салицилатом натрия (3,0 мМ) (столбец 2), не вызывает достоверных изменений СЛХЛ выделенных ПМЛ, по сравнению с контрольной пробой (столбец 1). Добавление к ПМЛ доноров плазмы больных вызывает подавление СЛХЛ ПМЛ примерно на 26% (столбец 3), по сравнению с СЛХЛ ПМЛ доноров, инкубированных с плазмой доноров (столбец 1). Инкубация ПМЛ доноров с плазмой, отобранной после предварительной инкубации проб крови больных с салицилатом натрия (3,0 мМ) (столбец 4), вызывает ингибирование СЛХЛ выделенных ПМЛ на 40% по сравнению с контрольной пробой (столбец 3). Полученные результаты показывают, что плазма больных с непереносимостью АСК, оказывает ингибирующее воздействие на СЛХЛ суспензии ПМЛ здоровых доноров. Причем, данный эффект более выражен, если плазма была отобрана из проб крови больных с непереносимостью АСК, предварительно инкубированных с салицилатом натрия (3,0 мМ). Следовательно, плазма больных с непереносимостью НПВП, проявляющейся реакциями со стороны органов дыхания (бронхоспазм, ринит), содержит базальный уровень цитокинов), биологически оказывающих активных ингибирующее веществ действие (медиаторов на и суммарную продукцию АФК ПМЛ. Воздействие салицилата натрия на кровь больных с непереносимостью АСК сопровождается изменением соотношения биологически активных веществ в крови таким образом, что приводит к еще большему подавлению активности ферментов окислительного метаболизма ПМЛ и, следовательно, суммарной продукции АФК ПМЛ. 4.4. Определение роли медиаторов (гистамина, серотонина, цистеиниловых лейкотриенов) в реализации феномена ингибирования стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой хемилюминесценции крови под влиянием НПВП, тартразина у здоровых доноров и пациентов с их непереносимостью 146 Описанные выше исследования показали, что воздействие НПВП на кровь больных с непереносимостью данных препаратов сопровождается изменением соотношения биологически активных веществ в крови больных таким образом, что приводит к подавлению активности ферментов окислительного метаболизма ПМЛ и, следовательно, суммарной продукции АФК ПМЛ. Для выяснения участия медиаторного механизма в развитии феномена ингибирования СЛХЛ крови под влиянием НПВП, тартразина у пациентов с их непереносимостью, было проведено настоящее исследование. Исследование воздействия блокаторов гистаминовых (клемастина, ранитидина), серотониновых (кетансерина), лейкотриеновых (зафирлукаста) рецепторов и стабилизатора мембран тучных клеток и базофилов (кромоглициевой кислоты) на СЛХЛ цельной крови. Для того, чтобы исследовать воздействие блокаторов рецепторов: гистаминовых (клемастина, ранитидина), серотониновых (кетансерина), лейкотриеновых (зафирлукаста) и стабилизатора мембран базофилов и тучных клеток (кромоглициевой кислоты) на угнетение СЛХЛ крови больных с непереносимостью НПВП, тартразина, мы должны были предварительно оценить влияние указанных препаратов на СЛХЛ крови исследуемых больных в отсутствии НПВП и тартразина, так как не исключено, что данные препараты могут сами влиять на СЛХЛ крови. Для этого пробы крови инкубировали с указанными лекарственными препаратами, как описано в главе «Материалы и методы» п. 2.3.7. Результаты представлены на рисунке 16 (а,б,в,г,д). 147 а. 1 0,9 0,8 ИП, отн.ед. 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 5 10 100 Концентрация клемастина, ЭСТД б. 1,2 ИП, отн.ед. 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 5 10 Концентрация ранитидина, ЭСТД 100 148 в. 1,2 ИП, отн. ед. 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 5 10 30 Концетрация кетансерина, ЭСТД г. 1,2 ИП, отн. ед. 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 5 20 Концентрация зафирлукаста, ЭСТД 60 149 д. 1,2 ИП, отн.ед. 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 5 25 100 Концентрация кромоглициевой кислоты, ЭСТД Рис. 16 (а,б,в,г,д). Влияние клемастина (а), ранитидина (б), кетансерина (в), зафирлукаста (г), кромоглициевой кислоты (д) на СЛХЛ цельной крови больных с непереносимостью НПВП, тартразина. Примечание: *- p < 0,05 относительно контроля. ЭСТД- эквивалент средней терапевтической дозы. Из рисунка 16 (а,б,г) видно, что использование клемастина и ранитидина в концентрации 100 ЭСТД и зафирлукаста в концентрации 60 ЭСТД, приводит к значительному свидетельствовать угнетению о том, СЛХЛ что цельной указанные крови, что концентрации может являются токсическими для клеток или же имеются нерецепторные механизмы влияния указанных препаратов на СЛХЛ крови. В то же время использование клемастина, ранитидина в концентрации 10 ЭСТД и кетансерина в концентрациях 10 ЭСТД и 30 ЭСТД приводит к незначительному подавлению СЛХЛ цельной крови. Вместе с тем, использование клемастина, ранитидина, кетансерина в концентрациях от 1 ЭСТД до 5 ЭСТД и зафирлукаста в концентрациях от 1 ЭСТД до 20 ЭСТД не приводит к достоверному изменению СЛХЛ цельной крови. 150 Следует отметить, что в исследованном диапазоне доз стабилизатор мембран базофилов и тучных клеток КГК не оказывала существенного влияния на СЛХЛ крови. Поскольку все исследуемые в работе блокаторы рецепторов способны в той или иной степени угнетать СЛХЛ крови, в дальнейшем при оценке их действия на эффект подавления СЛХЛ под влиянием НПВП и/или тартразина у больных с использовали непереносимостью в качестве указанных контрольных псевдоаллергенов пробы, инкубированные мы с блокаторами рецепторов. Ниже рассмотрены закономерности влияния исследованных веществ более подробно. Влияние блокатора клемастина гистаминовых рецепторов первого типа- на феномен подавления СЛХЛ крови под воздействием салицилата, метамизола, диклофенака натрия и тартразина у больных с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты и/или метамизола натрия и/или диклофенака натрия и тартразина. При анализе полученных результатов мы объединили в группу 1 всех пациентов с БА, у которых при приеме НПВП или тартразина возникали реакции со стороны органов дыхания (бронхоспазм/ринит). Поскольку предварительные исследования не выявили достоверных различий в изменении СЛХЛ крови под влиянием исследуемых блокаторов рецепторов и КГК в смеси с НПВП или тартразином у пациентов с хронической крапивницей и у пациентов с АТ, непереносимость НПВП и тартразина у которых проявлялась только в форме крапивницы/отека Квинке, поэтому всех пациентов с кожными проявлениями при приеме НПВП и/или тартразина мы объединили в одну группу (группа 2) (табл.7). 151 Таблица 7 Влияние блокатора гистаминовых рецепторов первого типа клемастина на феномен подавления СЛХЛ крови под воздействием салицилата, метамизола, диклофенака натрия и тартразина у больных с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты и/или метамизола натрия и/или диклофенака натрия и тартразина. Концентрации препаратов ИП, отн.ед. Больные с реакцией на Больные с реакцией Здоровые НПВП или тартазин со на НПВП или доноры стороны органов тартразин со стороны дыхания кожных покровов (группа 1) (группа2) Салицилат натрия (3мМ) 0,74± 0,04# 0,67±0,04# 1,09±0,09 * Клемастин (1 ЭСТД) + салицилат 0,95± 0,04 0,85±0,05*# натрия (3мМ) Клемастин (5 ЭСТД) + салицилат 1,01± 0,06* 0,89±0,07*# натрия (3мМ) Клемастин (10 ЭСТД) + салицилат 0,98± 0,09* 0,83±0,06*# натрия (3мМ) Клемастин (100 ЭСТД) + салицилат 0,92± 0,09* 0,71±0,05# натрия (3мМ) Метамизол натрия (6 мкМ) 0,71±0,03# 0,69±0,05# 1,17±0,08 # # Клемастин (1 ЭСТД) + метамизол 0,92±0,05* 0,83±0,04* натрия (6 мкМ) Клемастин (5 ЭСТД) + метамизол 0,97±0,05*# 0,89±0,07*# натрия (6 мкМ) Клемастин (10 ЭСТД) + метамизол 1,03±0,07* 0,91±0,03*# натрия (6 мкМ) Клемастин (100 ЭСТД) + метамизол 0,94±0,08*# 0,89±0,09*# натрия (6 мкМ) Диклофенак натрия (6 мкМ) 0,87±0,04# 0,84±0,06# 1,78± 0,17 # # Клемастин (1 ЭСТД) + диклофенак 1,24±0,04* 1,02±0,04* натрия (6 мкМ) Клемастин (5 ЭСТД) + диклофенак 1,25±0,07*# 1,02±0,05*# натрия (6 мкМ) Клемастин (10 ЭСТД) + диклофенак 1,25±0,07*# 1,05±0,07*# натрия (6 мкМ) Клемастин (100 ЭСТД) + диклофенак 1,05±0,09*# 0,88±0,07# натрия (6 мкМ) Тартразин (4 мкМ) 0,53±0,05# 0,57±0,04# 1,00±0,08 Клемастин (1 ЭСТД) + тартразин 0,87±0,06* 0,91±0,04* (4мкМ) Клемастин (5 ЭСТД) + тартразин 0,89±0,05* 0,93±0,04* (4мкМ) Клемастин (10 ЭСТД) + тартразин 0,88±0,06* 0,91±0,05* (4мкМ) Клемастин (100 ЭСТД) + тартразин 0,87±0,07* 0,92±0,06* (4мкМ) Примечание: *- р <0,05 относительно ИП больных с непереносимостью НПВП, тартразина. # - р <0,05 относительно ИП здоровых доноров. ИП не имеет достоверных отличий от ИП больных с непереносимостью НПВП ИП не имеет достоверных отличий от ИП здоровых доноров 152 Из таблицы 7 следует, что прединкубация проб крови с клемастином в значительной степени снимала угнетение СЛХЛ крови, вызываемое салицилатом натрия, у пациентов с непереносимостью АСК 1 группы, а также угнетение СЛХЛ, вызываемое тартразином, у всех пациентов с непереносимостью тартразина при всех исследуемых концентрациях клемастина. ИП таких пациентов не имел достоверных отличий от ИП здоровых доноров. У пациентов с непереносимостью метамизола натрия 1 группы клемастин также существенным образом уменьшал вызываемое метамизолом натрия подавление СЛХЛ крови, однако полная отмена ингибирования СЛХЛ наблюдалась только при концентрации клемастина 10 ЭСТД. У пациентов с непереносимостью АСК и метамизола натрия 2 группы, а также у пациентов с непереносимостью диклофенака натрия обеих групп эффект уменьшения ингибирования СЛХЛ крови под действием клемастина был выражен слабее, чем у пациентов с непереносимостью АСК и метамизола натрия 1 группы и всех пациентов с непереносимостью тартразина. При концентрации клемастина 100 ЭСТД достоверного увеличения СЛХЛ крови не было выявлено у пациентов с непереносимостью АСК и диклофенака натрия 2 группы, что, по-видимому, связано со способностью высоких доз клемастина оказывать ингибирующее влияние на СЛХЛ крови. Полученный результат может свидетельствовать о разном вкладе гистаминового механизма (с реализацией его через гистаминовые Н1рецепторы) в наблюдаемый эффект подавления СЛХЛ крови под влиянием НПВП, тартразина у пациентов с непереносимостью указанных препаратов разных клинических групп. Наиболее существенный вклад гистаминовый механизм вносит в эффект подавления СЛХЛ крови у пациентов с непереносимостью АСК и/или метамизола натрия с бронхиальными проявлениями, а также у всех пациентов с непереносимостью тартазина вне зависимости от клинических проявлений. У пациентов с непереносимостью 153 диклофенака натрия 2 группы вклад гистаминового механизма с реализацией его через гистаминовые Н1- рецепторы незначителен. Таким образом, вклад гистаминового механизма с реализацией его через Н1-гистаминовые рецепторы в развитие феномена подавления СЛХЛ крови под влиянием НПВП или тартразина различен как у пациентов с непереносимостью исследуемых псевдоаллергенов разной химической природы, так и у пациентов с различными клиническими проявлениями непереносимости: со стороны органов дыхания и кожных покровов. Влияние блокатора гистаминовых рецепторов второго типа- ранитидина на феномен подавления СЛХЛ крови под воздействием салицилата, метамизола, диклофенака натрия и тартразина у больных с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты и/или метамизола натрия и/или диклофенака натрия и тартразина. После того, как мы оценили влияние Н1-блокатора на феномен подавления СЛХЛ крови под действием НПВП и тартразина у пациентов с их непереносимостью, мы исследовали влияние Н2-блокатора на данный феномен (табл.8). Из таблицы 8 следует, что ранитидин во всем диапазоне концентраций в значительной степени отменял эффект подавления СЛХЛ крови под воздействием салицилата натрия у пациентов с непереносимостью АСК 1 группы, при этом ИП на всех исследуемых концентрациях ранитидина не имеел достоверных отличий от ИП здоровых доноров. Подобный эффект наблюдался у пациентов с непереносимостью АСК 2 группы при концентрации ранитидина 5 ЭСТД, у пациентов с непереносимостью метамизола натрия 1 группы при концентрации ранитидина 10 ЭСТД, а также у всех пациентов с непереносимостью тартразина при концентрациях Н2-блокатора в диапазоне от 5 ЭСТД до 100 ЭСТД. Практически во всех остальных случаях прединкубация проб крови с ранитидином сопровождалась частичным уменьшением ингибирующего воздействия 154 Таблица 8 Влияние блокатора гистаминовых рецепторов второго типа - ранитидина на феномен подавления СЛХЛ крови под воздействием салицилата, метамизола, диклофенака натрия и тартразина у больных с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты и/или метамизола натрия и/или диклофенака натрия и тартразина. Концентрации препаратов ИП, отн.ед. Больные с реакцией на Больные с реакцией Здоровые НПВП со стороны на НПВП со стороны доноры органов дыхания кожных покровов (группа 1) (группа 2) Салицилат натрия (3мМ) 0,74± 0,04# 0,67±0,04# 1,09±0,09 * Ранитидин (1 ЭСТД) + салицилат 0,94±0,04 0,83±0,05*# натрия (3мМ) Ранитидин (5 ЭСТД) + салицилат 0,97±0,06* 0,92±0,05* натрия (3мМ) Ранитидин (10 ЭСТД) + салицилат 0,92±0,02* 0,84±0,05*# натрия (3мМ) Ранитидин (100 ЭСТД) + салицилат 0,92±0,09* 0,69±0,10# натрия (3мМ) Метамизол натрия (6 мкМ) 0,71±0,03# 0,69±0,05# 1,17±0,08 *# Ранитидин (1 ЭСТД) + метамизол 0,83±0,05 0,82±0,02*# натрия (6мкМ) Ранитидин (5 ЭСТД) + метамизол 1,02±0,07*# 0,85±0,03*# натрия (6мкМ) Ранитидин (10 ЭСТД) + метамизол 1,08±0,03* 0,94±0,04*# натрия (6мкМ) Ранитидин (100 ЭСТД) + метамизол 0,94±0,07*# 0,87±0,07*# натрия (6мкМ) Диклофенак натрия (6 мкМ) 0,87±0,04# 0,84±0,06# 1,78± 0,17 *# *# Ранитидин (1 ЭСТД) + диклофенак 1,03±0,06 1,26±0,08 натрия (6мкМ) Ранитидин (5 ЭСТД) + диклофенак 1,12±0,08*# 1,26±0,07*# натрия (6мкМ) Ранитидин (10 ЭСТД) + диклофенак 1,15±0,10*# 1,36±0,03*# натрия (6мкМ) Ранитидин (100 ЭСТД) + диклофенак 1,07±0,09*# 1,00±0,07*# натрия (6мкМ) Тартразин (4 мкМ) 0,53±0,05# 0,57±0,04# 1,00±0,08 *# *# Ранитидин (1 ЭСТД) + тартразин 0,75±0,04 0,81±0,05 (4мкМ) Ранитидин (5 ЭСТД) + тартразин 0,88±0,06* 0,95±0,05* (4мкМ) Ранитидин (10 ЭСТД) + тартразин 0,85±0,06* 0,89±0,06* (4мкМ) Ранитидин (100 ЭСТД) + тартразин 0,83±0,07* 0,81±0,08* (4мкМ) Примечание: *- р <0,05 относительно ИП больных с непереносимостью НПВП, тартразина. # - р <0,05 относительно ИП здоровых доноров. ИП не имеет достоверных отличий от ИП больных с непереносимостью НПВП ИП не имеет достоверных отличий от ИП здоровых доноров 155 НПВП и тартразина на СЛХЛ крови больных с непереносимостью данных псевдоаллергенов, и показатели ИП больных были достоверно ниже ИП здоровых доноров. У пациентов с непереносимостью аспирина 2 группы прединкубация проб крови с ранитидином в концентрации 100 ЭСТД не сопровождалась достоверным увеличением СЛХЛ крови. Полученные результаты свидетельствуют о вкладе гистаминового механизма с реализацией его через гистаминовые Н2- рецепторы в наблюдаемый эффект подавления СЛХЛ крови под влиянием НПВП, тартразина у пациентов с непереносимостью данных псевдоаллергенов разных клинических групп. При этом участие Н2-гистаминовых рецепторов, также как и Н1-гистаминовых рецепторов в реализации подавления СЛХЛ крови различно у пациентов разных клинических групп. Влияние блокатора серотониновых 5-НТ2 рецепторов- кетансерина на феномен подавления СЛХЛ крови под воздействием салицилата, метамизола, диклофенака натрия и тартразина у больных с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты и/или метамизола натрия и/или диклофенака натрия и тартразина. После того, как был изучен вклад Н1- и Н2-гистаминовых рецепторов в реализацию феномена подавления СЛХЛ крови, вызываемого НПВП или тартразином, у пациентов с их непереносимостью, мы исследовали, какой вклад в развитие данного феномена вносят расположенные на тромбоцитах серотониновые 5-НТ2 рецепторы (табл. 9). Из таблицы 9 следует, что кетансерин при всех исследуемых концентрациях не уменьшал угнетение СЛХЛ крови, вызываемое салицилатом непереносимостью АСК 1 группы. ингибирования СЛХЛ крови, натрия, у пациентов с Отсутствие эффекта уменьшения вызываемого НПВП, тартразином, наблюдалось также при использовании высокой концентрации кетансерина 156 Таблица 9 Влияние блокатора серотониновых 5-НТ2 рецепторов кетансерина на феномен подавления СЛХЛ крови под воздействием салицилата, метамизола, диклофенака натрия и тартразина у больных с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты и/или метамизола натрия и/или диклофенака натрия и тартразина. Концентрации препаратов ИП, отн.ед. Больные с реакцией на Больные с реакцией Здоровые НПВП со стороны на НПВП со стороны доноры органов дыхания кожных покровов (группа 1) (группа 2) Салицилат натрия (3мМ) 0,74± 0,04# 0,67±0,04# 1,09±0,09 # # Кетансерин (1 ЭСТД) + салицилат 0,70±0,06 0,87±0,05* натрия (3мМ) Кетансерин (5 ЭСТД) + салицилат 0,71±0,06# 0,89±0,04*# натрия (3мМ) Кетансерин (10 ЭСТД) + салицилат 0,75±0,09# 0,84±0,05*# натрия (3мМ) Кетансерин (30 ЭСТД) + салицилат 0,65±0,09# 0,81±0,07# натрия (3мМ) Метамизол натрия (6 мкМ) 0,71±0,03# 0,69±0,05# 1,17±0,08 # # Кетансерин (1 ЭСТД) + метамизол 0,93±0,07* 0,90±0,03* натрия (6 мкМ) Кетансерин (5 ЭСТД) + метамизол 0,94±0,08*# 0,93±0,05*# натрия (6 мкМ) Кетансерин (10 ЭСТД) + метамизол 0,88±0,07*# 0,94±0,05*# натрия (6 мкМ) Кетансерин (30 ЭСТД) + метамизол 0,76±0,14# 0,75±0,15# натрия (6 мкМ) Диклофенак натрия (6 мкМ) 0,87±0,04# 0,84±0,06# 1,78± 0,17 Кетансерин (1 ЭСТД) + диклофенак 1,04±0,07*# 1,25±0,09*# натрия (6 мкМ) Кетансерин (5 ЭСТД) + диклофенак 1,05±0,07*# 1,27±0,08*# натрия (6 мкМ) Кетансерин (10 ЭСТД) + диклофенак 1,12±0,11*# 1,10±0,05*# натрия (6 мкМ) Кетансерин (30 ЭСТД) + диклофенак 0,97±0,13# 0,84±0,04# натрия (6 мкМ) Тартразин (4 мкМ) 0,52±0,05# 0,57±0,04# 1,00±0,08 Кетансерин (1 ЭСТД) + тартразин (4 0,70±0,06*# 0,82±0,04*# мкМ) Кетансерин (5 ЭСТД) + тартразин (4 0,75±0,07*# 0,87±0,05* мкМ) Кетансерин (10 ЭСТД) + тартразин (4 0,74±0,06*# 0,86±0,06* мкМ) Кетансерин (30 ЭСТД) + тартразин (4 0,63±0,04# 0,71±0,05*# мкМ) Примечание:*- р <0,05 относительно ИП больных с непереносимостью НПВП, тартразина; # - р <0,05 относительно ИП здоровых доноров. ИП не имеет достоверных отличий от ИП больных с непереносимостью НПВП, тартразина ИП не имеет достоверных отличий от ИП здоровых доноров 157 (30 ЭСТД) у пациентов с непереносимостью АСК 2 группы, у всех пациентов с непереносимостью метамизола и диклофенака натрия, а также у пациентов с непереносимостю тартразина 1 группы. Прединкубация проб крови с кетансерином в диапазоне концентраций от 1 ЭСТД до 10 ЭСТД в значительной степени уменьшала угнетение СЛХЛ, вызываемое салицилатом, диклофенаком натрия, тартразином, у пациентов 2 группы с непереносимостью АСК, диклофенака натрия, тартразина, соответственно. Кроме того, кетансерин в данном диапазоне концентраций в значительной степени отменял угнетение СЛХЛ крови, вызываемое метамизолом натрия, у всех пациентов с непереносимостью метамизола натрия. Однако эффект кетансерина не достигал 100% отмены указанного явления у вышеупомянутых пациентов, и ИП у этих больных был достоверно ниже такового здоровых доноров. Частичная отмена ингибирования СЛХЛ крови под влиянием кетансерина была слабо выражена у пациентов с непереносимостью диклофенака натрия 1 группы. Наиболее существенное влияние кетансерина отмечалось непереносимостью тартразина 2 группы. Так, у пациентов с при концентрациях кетансерина 5 ЭСТД, 10 ЭСТД ИП у этих больных не имел достоверных отличий от такового здоровых доноров. Полученные результаты свидетельствуют о том, что у большинства пациентов с непереносимостью НПВП, тартразина в патогенезе феномена ингибирования СЛХЛ крови под влиянием данных препаратов участвует механизм серотонин-опосредованной активации тромбоцитов, что сопровождается высвобождением медиаторов из тромбоцитов, оказывающих модифицирующее влияние на СЛХЛ крови. Исключение составляют пациенты с непереносимостью АСК 1 группы. 158 Влияние зафирлукаста на блокатора цис-лейкотриеновых рецепторов- феномен подавления СЛХЛ крови под воздействием салицилата, метамизола, диклофенака натрия и тартразина у больных с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты и/или метамизола натрия и/или диклофенака натрия и тартразина. После того, как был изучен вклад гистаминовых (Н1 и Н2) и серотониновых (5-НТ2) рецепторов в реализацию феномена подавления СЛХЛ крови, вызываемого НПВП или тартразином, у пациентов с их непереносимостью, мы исследовали какой вклад в развитие данного феномена вносят цис-лейкотриеновые рецепторы (цисЛТ1R) (табл. 10). Как следует из таблицы 10, селективный блокатор цис-лейкотриеновых рецепторов (cysLTR1) - зафирлукаст значительной степени уменьшал ингибирование СЛХЛ крови, вызываемое салицилатом, метамизолом натрия и тартразином, у пациентов с непереносимостью АСК, метамизола натрия, тартразина, соответственно, вне зависимости от клинических проявлений непереносимости. При этом наиболее выраженный эффект отмены ингибирования СЛХЛ крови наблюдался у пациентов с непереносимостью АСК при концентрации зафирлукаста 5 ЭСТД, у пациентов с непереносимостью метамизола натрия при концентрациях зафирлукаста 5 ЭСТД, 20 ЭСТД, а также у пациентов с непереносимостью тартразина при концентрациях зафирлукаста в диапазоне от 1 ЭСТД до 20 ЭСТД. ИП у вышеперечисленных пациентов при указанных концентрациях зафирлукаста не имел достоверных отличий от ИП здоровых доноров. У пациентов с непереносимостью диклофенака эффект уменьшения ингибирования СЛХЛ под влиянием зафирлукаста был выражен в меньшей степени. Следует отметить, что высокие концентрации зафирлукаста в ряде случаев не вызывали достоверного увеличения СЛХЛ крови. В частности, отсутствие 159 Таблица 10 Влияние блокатора цис-лейкотриеновых рецепторов зафирлукаста на феномен подавления СЛХЛ крови под воздействием салицилата, метамизола, диклофенака натрия и тартразина у больных с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты и/или метамизола натрия и/или диклофенака натрия и тартразина. Концентрации препаратов ИП, отн.ед. Больные с реакцией на Больные с реакцией Здоровые НПВП со стороны на НПВП со стороны доноры органов дыхания кожных покровов (группа 1) (группа 2) Салицилат натрия (3мМ) 0,74± 0,04# 0,67±0,04# 1,09±0,09 # # Зафирлукаст (1 ЭСТД) + салицилат 0,86±0,03* 0,88±0,04* натрия (3мМ) Зафирлукаст (5 ЭСТД) + салицилат 0,96±0,07* 0,94±0,07* натрия (3мМ) Зафирлукаст (20 ЭСТД) + салицилат 0,70±0,07# 0,87±0,05*# натрия (3мМ) Зафирлукаст (60 ЭСТД) + салицилат 0,55±0,08# 0,83±0,03# натрия (3мМ) Метамизол натрия (6 мкМ) 0,71±0,03# 0,69±0,05# 1,17±0,08 # # Зафирлукаст (1 ЭСТД) + метамизол 0,94±0,06* 0,85±0,02* натрия (6мкМ) Зафирлукаст (5 ЭСТД) + метамизол 0,98±0,08* 0,99±0,04* натрия (6мкМ) Зафирлукаст (20 ЭСТД) + метамизол 0,96±0,09* 0,94±0,08* натрия (6мкМ) Зафирлукаст (60 ЭСТД) + метамизол 0,77±0,09# 0,67±0,09# натрия (6мкМ) Диклофенак натрия (6 мкМ) 0,87±0,04# 0,84±0,06# 1,78± 0,17 Зафирлукаст (1 ЭСТД) + диклофенак 1,12±0,08*# 1,18±0,09*# натрия (6мкМ) Зафирлукаст (5 ЭСТД) + диклофенак 1,22±0,11*# 1,19±0,09*# натрия (6мкМ) Зафирлукаст (20 ЭСТД) + 0,92±0,08# 1,0±0,11# диклофенак натрия (6мкМ) Зафирлукаст (60 ЭСТД) + 0,82±0,09# 0,86±0,10# диклофенак натрия (6мкМ) Тартразин (4 мкМ) 0,53±0,05# 0,57±0,04# 1,00±0,08 Зафирлукаст (1 ЭСТД) + тартразин 0,92±0,05* 0,95±0,04* (4мкМ) Зафирлукаст (5 ЭСТД) + тартразин 0,94±0,05* 0,97±0,06* (4мкМ) Зафирлукаст (20 ЭСТД) + тартразин 0,88±0,07* 0,95±0,06* (4мкМ) Зафирлукаст (60 ЭСТД) + тартразин 0,81±0,07# 0,83±0,07# (4мкМ) Примечание: *- р <0,05 относительно ИП больных с непереносимостью НПВП, тартразина; # - р <0,05 относительно ИП здоровых доноров. ИП не имеет достоверных отличий от ИП больных с непереносимостью НПВП, тартразина ИП не имеет достоверных отличий от ИП здоровых доноров. 160 эффекта уменьшения ингибирования СЛХЛ крови, вызываемого салицилатом, диклофенаком натрия, наблюдалось при использовании концентраций зафирлукаста 20 непереносимостью аспирина непереносимостью диклофенака проявлений 1 непереносимости. ЭСТД, 60 группы вне При и ЭСТД у у всех зависимости использовании пациентов с пациентов с от клинических зафирлукаста в концентрации 60 ЭСТД эффект уменьшения ингибирования СЛХЛ крови отсутствовал у пациентов с непереносимостью АСК 2 группы, а также у всех пациентов с непереносимостью метамизола натрия и тартразина. Данные результаты свидетельствуют, что ингибирование СЛХЛ крови под влиянием НПВП и тартразина опосредовано через лейкотриеновый механизм. Полученные наблюдениями, нами данные показывающими подтверждаются улучшение состояния клиническими больных с аспириновой астмой при применении антагонистов лейкотриенов, в частности, зафирлукаста, имеющего сродство к рецепторам ЛТD4, ЛТЕ4 (цисЛТ1R) и блокирующего эти рецепторы от активации лейкотриенами, быстро устраняя создаваемую лейкотриенами бронхиальную обструкцию [22; 61; 217]. Кроме того, центральная роль цис-ЛТ в качестве медиаторов индуцированной аспирином и другими НПВП крапивницы косвенно подтверждается результатами клинических исследований, демонстрирующих защитную роль антагонистов лейкотриеновых рецепторов, в том числе зафирлукаста [119; 286]. Влияние стабилизатора мембран тучных клеток и базофилов- кромоглициевой кислоты на феномен подавления СЛХЛ крови под воздействием салицилата, метамизола, диклофенака натрия и тартразина у больных с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты и/или метамизола натрия и/или диклофенака натрия и тартразина. 161 Оценив вклад гистаминовых, серотониновых и лейкотриеновых рецепторов в реализацию феномена ингибирования СЛХЛ крови, вызываемого НПВП и тартразином, у пациентов с их непереносимостью, мы посчитали важным изучить влияние стабилизатора мембран базофилов и тучных клеток КГК на эффект угнетения НПВП и тартразином СЛХЛ крови, что позволило бы оценить участие медиаторов базофилов в развитии данного феномена (табл. 11). Как следует из таблицы 11, КГК в значительной степени отменяла эффект подавления СЛХЛ крови под влиянием салицилата, метамизола натрия и тартразина у всех пациентов с непереносимостью АСК, метамизола натрия и тартразина, соответственно. Сходное воздействие КГК оказывала на СЛХЛ крови больных с непереносимостью диклофенака 2 группы. При этом при концентрации КГК в диапазоне от 5 до 100 ЭСТД ИП пациентов с непереносимостью АСК и/или метамизола натрия 1 группы не имел достоверных отличий от ИП здоровых доноров. Подобная ситуация наблюдалась у всех пациентов с непереносимостью тартразина при всех используемых концентрациях КГК. У пациентов с непереносимостью метамизола и диклофенака натрия 2 группы отмена ингибирования СЛХЛ крови наблюдалась при концентрациях КГК в диапазонах 5 СТД-25 ЭСТД и 1ЭСТД -5 ЭСТД, соответственно. У пациентов с непереносимостью диклофенака 1 группы эффект уменьшения ингибирования СЛХЛ под действием КГК был выражен намного слабее, чем во 2-ой группе пациентов. При использовании КГК в концентрациях 25 ЭСТД,100 ЭСТД эффект уменьшения ингибирования СЛХЛ крови отсутствовал у пациентов с непереносимостью АСК 2 группы, а также у всех пациентов с непереносимостью диклофенака натрия. Полученные результаты свидетельствуют о том, что дегрануляция базофилов является одним из ведущих механизмов, участвующих в феномене ингибирования СЛХЛ крови под влиянием НПВП или тартразина у пациентов с непереносимостью данных псевдоаллергенов. 162 Таблица 11 Влияние кромоглициевой кислоты на феномен подавления СЛХЛ крови под воздействием салицилата, метамизола, диклофенака натрия и тартразина у больных с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты и/или метамизола натрия и/или диклофенака натрия и тартразина. Концентрации препаратов ИП, отн.ед. Больные с реакцией на Больные с реакцией НПВП со стороны на НПВП со стороны органов дыхания кожных покровов (группа 1) (группа 2) 0,74± 0,04# 0,67±0,04# 0,89±0,03*# 0,88±0,04*# Здоровые доноры Салицилат натрия (3мМ) 1,09±0,09 Кромоглициевая кислота (1 ЭСТД) + салицилат натрия (3мМ) Кромоглициевая кислота (5 ЭСТД) + 0,93±0,08* 0,89±0,03*# салицилат натрия (3мМ) Кромоглициевая кислота (25 ЭСТД) 0,90±0,08* 0,67±0,04# + салицилат натрия (3мМ) Кромоглициевая кислота (100 ЭСТД) 0,91±0,09* 0,63±0,05# + салицилат натрия (3мМ) Метамизол натрия (6 мкМ) 0,71±0,03# 0,69±0,05# 1,17±0,08 # # Кромоглициевая кислота (1 ЭСТД) + 0,87±0,06* 0,92±0,05* метамизол натрия (6мкМ) Кромоглициевая кислота (5 ЭСТД) + 0,94±0,08* 1,05±0,09* метамизол натрия (6мкМ) Кромоглициевая кислота (25 ЭСТД) 0,92±0,09* 0,94±0,08* + метамизол натрия (6мкМ) Кромоглициевая кислота (100 ЭСТД) 0,91±0,09* 0,68±0,03# + метамизол натрия (6мкМ) Диклофенак натрия (6 мкМ) 0,87±0,04# 0,84±0,06# 1,78± 0,17 Кромоглициевая кислота (1 ЭСТД) + 1,0±0,04*# 1,39±0,13* диклофенак натрия (6мкМ) Кромоглициевая кислота (5 ЭСТД) + 1,09±0,09*# 1,56±0,15* диклофенак натрия (6мкМ) Кромоглициевая кислота (25 ЭСТД) 0,95±0,05# 1,13±0,12# + диклофенак натрия (6мкМ) Кромоглициевая кислота (100 ЭСТД) 0,79±0,04# 0,70±0,11# + диклофенак натрия (6мкМ) Тартразин (4 мкМ) 0,53±0,05# 0,57±0,04# 1,00±0,08 Кромоглициевая кислота (1 ЭСТД) + 0,88±0,07* 0,94±0,06* тартразин (4мкМ) Кромоглициевая кислота (5 ЭСТД) + 0,90±0,06* 0,94±0,05* тартразин (4мкМ) Кромоглициевая кислота (25 ЭСТД) 0,91±0,07* 0,98±0,05* + тартразин (4мкМ) Кромоглициевая кислота (100 ЭСТД) 0,91±0,07* 0,96±0,06* + тартразин (4мкМ) Примечание: *- р <0,05 относительно ИП больных с непереносимостью НПВП, тартразина. # - р <0,05 относительно ИП здоровых доноров. ИП не имеет достоверных отличий от ИП больных с непереносимостью НПВП ИП не имеет достоверных отличий от ИП здоровых доноров. 163 Оценка влияния блокаторов гистаминовых, серотониновых, лейкотриеновых рецепторов и стабилизатора мембран базофилов и тучных клеток на феномен подавления СЛХЛ крови, вызываемый салицилатом натрия, у пациентов с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты с различными клиническими проявлениями. Для того, чтобы оценить влияние блокаторов гистаминовых (клемастина, ранитидина), серотониновых (кетансерина), лейкотриеновых (зафирлукаста) рецепторов и стабилизатора мембран базофилов и тучных клеток (кромоглициевой кислоты) на феномен подавления СЛХЛ крови, вызываемый салицилатом натрия, мы исследовали воздействие указанных препаратов в концентрациях, эквивалентных 1СТД, на СЛХЛ проб крови, инкубированных с салицилатом натрия в концентрации 3мМ, у больных с непереносимостью АСК с различными клиническими проявлениями: с реакциями на АСК со стороны органов дыхания (группа 1) (рис.17) и со стороны кожных покровов (группа 2) (рис. 18). Из рисунков 17, 18 видно, что как клемастин, так и ранитидин в значительной степени отменяли ингибирующее воздействие салицилата натрия на СЛХЛ крови больных с непереносимостью АСК 1 группы. В то же время у пациентов с непереносимостью АСК 2 группы инкубация с указанными блокаторами гистаминовых рецепторов давала менее выраженный эффект. При сравнении влияния клемастина и ранитидина между собой следует отметить, что указанные блокаторы в одинаковой степени снижали ингибирующее воздействие салицилата натрия на СЛХЛ крови у больных с непереносимостью АСК обеих групп. Кетансерин не оказывал влияния на эффект угнетения СЛХЛ крови под воздействием салицилата натрия у пациентов 1 группы, в то время как у пациентов 2 группы кетансерин в значительной степени уменьшал ингибирующее действие салицилата натрия на СЛХЛ крови. 164 Больные с непереносимостью АСК 1 группы 1,4 ИП, отн.ед. 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 2 3 4 5 6 7 Рис.17. Влияние клемастина, ранитидина, кетансерина, зафирлукаста и кромоглициевой кислоты на изменение СЛХЛ крови под воздействием салицилата натрия у пациентов с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты, имеющих реакции со стороны органов дыхания (группа 1). Примечание: *- р <0,05 относительно ИП больных с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты # - р <0,05 относительно ИП здоровых доноров. 1. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с клемастином (1ЭСТД) и салицилатом натрия (3мМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с клемастином. 2. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с ранитидином (1ЭСТД) и салицилатом натрия (3мМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с ранитидином. 3. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с кетансерином (1ЭСТД) и салицилатом натрия (3мМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с кетансерином. 4. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с зафирлукастом (1ЭСТД) и салицилатом натрия (3мМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с зафирлукастом. 5. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с КГК (1ЭСТД) и салицилатом натрия (3мМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с КГК. 6. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных салицилатом натрия (3мМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с физиологическим раствором у пациентов с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты 1 группы. 7. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с салицилатом натрия (3мМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с физиологическим раствором у здоровых доноров. 165 Больные с непереносимостью АСК 2 группы 1,4 ИП, отн.ед. 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 2 3 4 5 6 7 Рис.18. Влияние клемастина, ранитидина, кетансерина, зафирлукаста и кромоглициевой кислоты на изменение СЛХЛ крови под воздействием салицилата натрия у пациентов с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты, имеющих реакции со стороны кожных покровов (группа 2). Примечание: *- р <0,05 относительно ИП больных с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты # - р <0,05 относительно ИП здоровых доноров. 1. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с клемастином (1ЭСТД) и салицилатом натрия (3мМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с клемастином. 2. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с ранитидином (1ЭСТД) и салицилатом натрия (3мМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с ранитидином. 3. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с кетансерином (1ЭСТД) и салицилатом натрия (3мМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с кетансерином. 4. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с зафирлукастом (1ЭСТД) и салицилатом натрия (3мМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с зафирлукастом. 5. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с КГК (1ЭСТД) и салицилатом натрия (3мМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с КГК. 6. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных салицилатом натрия (3мМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с физиологическим раствором у пациентов с непереносимостью АСК 2 группы. 7. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с салицилатом натрия (3мМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с физиологическим раствором у здоровых доноров. 166 Зафирлукаст и КГК существенным образом уменьшали угнетающее действие салицилата натрия на СЛХЛ крови в обеих группах пациентов, причем указанные препараты в одинаковой степени влияли на СЛХЛ крови пациентов с непереносимостью АСК разных клинических групп. Полученные результаты свидетельствуют, что гистаминовый механизм вносит существенный вклад в угнетение СЛХЛ крови под влиянием салицилата натрия у пациентов с непереносимостью АСК, при этом у пациентов 1 группы гистаминовый механизм в большей степени опосредует реализацию ингибирования СЛХЛ крови под воздействием салицилата натрия по сравнению с пациентами с непереносимостью АСК 2 группы. Следует отметить, что у всех пациентов с непереносимостью АСК Н1- и Н2гистаминовые рецепторы принимают одинаковое участие в реализации гистаминового механизма. Анализируя влияние кетансерина на эффект ингибирования СЛХЛ крови под воздействием салицилата натрия у пациентов с непереносимостью АСК, можно отметить, что блокирование кетансерином серотониновых 5-НТ2 рецепторов, расположенных на тромбоцитах, не оказывает никакого влияния на СЛХЛ крови пациентов с непереносимостью АСК 1 группы. Этот результат позволяет заключить, что у данных пациентов механизм серотонин-опосредованной активации и дегрануляции тромбоцитов, вероятно, не участвует в патогенезе феномена ингибирования СЛХЛ крови под воздействием салицилата натрия. У пациентов с непереносимостью АСК 2 группы, напротив, серотониновые 5-НТ2 рецепторы вносят вклад в реализацию подавления СЛХЛ крови под воздействием салицилата натрия. Цис-лейкотриеновые рецепторы (цисЛТ1R) в равной степени участвуют в развитии вышеупомянутого феномена у всех пациентов с непереносимостью АСК. Поскольку прединкубация крови с КГК в значительной степени снижала ингибирующий эффект, вызываемый салицилатом натрия, у всех пациентов с 167 непереносимостью АСК, мы склонны полагать, что наблюдаемый феномен ингибирования СЛХЛ крови под воздействием салицилата натрия у данных пациентов в определенной мере связан с высвобождением медиаторов из базофилов. Таким образом, мы установили, что у пациентов с непереносимостью АСК существенный вклад в развитие феномена ингибирования СЛХЛ крови, вызываемого салицилатом натрия, вносят Н1- и Н2- гистаминовые и цислейкотриеновые рецепторы. Механизм серотонин-опосредованной активации и дегрануляции тромбоцитов участвует в развитии указанного феномена только у пациентов с непереносимостью АСК, имеющих реакции со стороны кожных покровов. Можно также заключить, что в реализации подавления СЛХЛ крови под воздействием салицилата натрия в определенной мере участвуют медиаторы базофилов. Оценка влияния блокаторов гистаминовых, серотониновых, лейкотриеновых рецепторов и стабилизатора мембран базофилов и тучных клеток на феномен подавления СЛХЛ крови, вызываемый метамизолом натрия, у пациентов с непереносимостью метамизола натрия с различными клиническими проявлениями. Для того, чтобы оценить влияние блокаторов гистаминовых (клемастина, ранитидина), серотониновых (кетансерина), лейкотриеновых (зафирлукаста) рецепторов и стабилизатора мембран базофилов и тучных клеток (КГК) на феномен подавления СЛХЛ крови, вызываемый метамизолом натрия, мы исследовали воздействие указанных препаратов в концентрациях, эквивалентных 1СТД, на СЛХЛ проб крови, инкубированных с метамизолом натрия в концентрации 6мкМ, у больных с непереносимостью метамизолом натрия с различными клиническими проявлениями: с реакциями на метамизол натрия со стороны органов дыхания (группа 1) (рис. 168 19) и со стороны кожных покровов (группа 2) (рис.20). Как видно из рисунков 19, 20 у пациентов с непереносимостью метамизола натрия 1 группы клемастин, кетансерин и зафирлукаст в значительной степени отменяли ингибирующее влияние метамизола натрия на СЛХЛ крови, в то время как действие ранитидтина и КГК на СЛХЛ крови данных пациентов было немного слабее. У пациентов с непереносимостью метамизола натрия 2 группы наиболее выраженное влияние на СЛХЛ крови оказывали кетансерин и КГК. Действие клемастина, ранитидина и зафирлукаста у данных пациентов проявлялось немного слабее и было практически одинаковым. Следует отметить, что влияние ранитидина, кетансерина и КГК на СЛХЛ крови практически не отличалось у пациентов 1 и 2 группы, в то время как влияние клемастина и зафирлукаста было выражено немного больше у пациентов 1 группы по сравнению с пациентами 2 группы. Полученные результаты свидетельствуют, что гистаминовый механизм вносит существенный вклад в угнетение СЛХЛ крови под влиянием метамизола натрия у пациентов с непереносимостью метамизола натрия, при этом у пациентов 1 группы гистаминовый механизм реализуется в большей степени через Н1-рецепторы, в то время как у пациентов 2 группы оба типа рецепторов принимают одинаковое участие в реализации гистаминового механизма. Серотониновые развитие феномена воздействием 5-НТ2 рецепторы вносят существенный вклад в специфического метамизола натрия у угнетения пациентов СЛХЛ с крови под непереносимостью метамизола натрия обеих групп. Цис-лейкотриеновые рецепторы (цисЛТ1R) участвуют в развитии вышеупомянутого феномена у всех пациентов с непереносимостью метамизола натрия. 169 Больные с непереносимостью метамизола 1 группы 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 2 3 4 5 6 7 Рис.19. Влияние клемастина, ранитидина, кетансерина, зафирлукаста и кромоглициевой кислоты на изменение СЛХЛ крови под воздействием метамизола натрия у пациентов с непереносимостью метамизола натрия, имеющих реакции со стороны органов дыхания (группа 1). Примечание: *- р <0,05 относительно ИП больных с непереносимостью метамизола натрия; # - р <0,05 относительно ИП здоровых доноров. 1. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с клемастином (1ЭСТД) и метамизолом натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с клемастином. 2. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с ранитидином (1ЭСТД) и метамизолом натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с ранитидином. 3. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с кетансерином (1ЭСТД) и метамизолом натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с кетансерином. 4. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с зафирлукастом (1ЭСТД) и метамизолом натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с зафирлукастом. 5. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с КГК (1ЭСТД) и диклофенаком натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с КГК. 6. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с диклофенаком натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с физиологическим раствором у пациентов с непереносимостью метамизола натрия 1 группы. 7. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с метамизолом натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с физиологическим раствором у здоровых доноров. 170 Больные с непереносимостью метамизола 2 группы 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 2 3 4 5 6 7 Рис.20. Влияние клемастина, ранитидина, кетансерина, зафирлукаста и кромоглициевой кислоты на изменение СЛХЛ крови под воздействием метамизола натрия у пациентов с непереносимостью метамизола натрия, имеющих реакции со стороны кожных покровов (группа 2). Примечание: *- р <0,05 относительно ИП больных с непереносимостью метамизола натрия; # - р <0,05 относительно ИП здоровых доноров. 1. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с клемастином (1ЭСТД) и метамизолом натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с клемастином. 2. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с ранитидином (1ЭСТД) и метамизолом натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с ранитидином. 3. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с кетансерином (1ЭСТД) и метамизолом натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с кетансерином. 4. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с зафирлукастом (1ЭСТД) и метамизолом натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с зафирлукастом. 5. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с КГК (1ЭСТД) и диклофенаком натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с КГК. 6. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с диклофенаком натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с физиологическим раствором у пациентов с непереносимостью метамизола натрия 2 группы. 7. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с метамизолом натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с физиологическим раствором у здоровых доноров. 171 Развитие наблюдаемого феномена ингибирования СЛХЛ крови под воздействием метамизола натрия в определенной мере связано с дегрануляцией базофилов, поскольку КГК значительной степени отменял ингибирующий эффект, вызываемый метамизолом натрия, у всех пациентов с непереносимостью метамизола натрия. Таким образом, мы установили, что у пациентов с непереносимостью метамизола натрия существенный вклад в развитие феномена ингибирования СЛХЛ крови, вызываемого метамизолом натрия, вносят Н1- и Н2гистаминовые, 5-НТ2 серотониновые и цис-лейкотриеновые рецепторы. Кроме того, в развитии феномена подавления СЛХЛ крови под воздействием метамизола натрия в определенной мере участвуют медиаторы базофилов. Оценка влияния блокаторов гистаминовых, серотониновых, лейкотриеновых, рецепторов и стабилизатора мембран базофилов и тучных клеток на феномен подавления СЛХЛ крови, вызываемый диклофенаком натрия, у пациентов с непереносимостью диклофенака натрия с различными клиническими проявлениями. Для того, чтобы оценить влияние блокаторов гистаминовых (клемастина, ранитидина), серотониновых (кетансерина), лейкотриеновых (зафирлукаста) рецепторов и стабилизатора мембран базофилов и тучных клеток (КГК) на феномен подавления СЛХЛ крови, вызываемый диклофенаком натрия, мы исследовали воздействие указанных препаратов в концентрациях, эквивалентных 1СТД, на СЛХЛ проб крови, инкубированных с диклофенаком натрия в концентрации 6мкМ, у больных с непереносимостью диклофенака с различными клиническими проявлениями: с реакциями на АСК со стороны органов дыхания (группа 1) (рис.21) и со стороны кожных покровов (группа 2) (рис.22). Из рисунков 21, 22 видно, что как клемастин, так и ранитидин частично уменьшали ингибирующее 172 Больные с непереносимостью диклофенака натрия 1 группы 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 Рис.21. Влияние клемастина, ранитидина, кетансерина, зафирлукаста и кромоглициевой кислоты на изменение СЛХЛ крови под воздействием диклофенака натрия у пациентов с непереносимостью диклофенака, имеющих реакции со стороны органов дыхания (группа 1). Примечание: *- р <0,05 относительно ИП больных с непереносимостью диклофенака натрия; # - р <0,05 относительно ИП здоровых доноров. 1. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с клемастином (1ЭСТД) и диклофенаком натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с клемастином. 2. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с ранитидином (1ЭСТД) и диклофенаком натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с ранитидином. 3. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с кетансерином (1ЭСТД) и диклофенаком натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с кетансерином. 4. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с зафирлукастом (1ЭСТД) и диклофенаком натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с зафирлукастом. 5. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с инталом (1ЭСТД) и диклофенаком натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с инталом. 6. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с диклофенаком натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с физиологическим раствором у пациентов с непереносимостью диклофенака 1 группы. 7. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с диклофенаком натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с физиологическим раствором у здоровых доноров. 173 Больные с непереносимостью диклофенака натрия 2 группы 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 Рис.22. Влияние клемастина, ранитидина, кетансерина, зафирлукаста и кромоглициевой кислоты на изменение СЛХЛ крови под воздействием диклофенака натрия у пациентов с непереносимостью диклофенака натрия, имеющих реакции со стороны кожных покровов (группа 2). Примечание: *- р <0,05 относительно ИП больных с непереносимостью диклофенака натрия. # - р <0,05 относительно ИП здоровых доноров. 1. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с клемастином (1ЭСТД) и диклофенаком натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с клемастином. 2. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с ранитидином (1ЭСТД) и диклофенаком натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с ранитидином. 3. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с кетансерином (1ЭСТД) и диклофенаком натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с кетансерином. 4. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с зафирлукастом (1ЭСТД) и диклофенаком натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с зафирлукастом. 5. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с КГК (1ЭСТД) и диклофенаком натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с КГК. 6. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с диклофенаком натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с физиологическим раствором у пациентов с непереносимостью диклофенака 2 группы. 7. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с диклофенаком натрия (6мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с физиологическим раствором у здоровых доноров. 174 воздействие диклофенака натрия на СЛХЛ крови больных с непереносимостью диклофенака с различными клиническими проявлениями. В то же время у пациентов с непереносимостью диклофенака натрия 1 группы прединкубация с ранитидином давала менее выраженный эффект по сравнению с эффектом клемастина в отношении этого явления. У пациентов с непереносимостью диклофенака натрия 2 группы, напротив, влияние ранитидина было выражено в большей степени по сравнению с таковым клемастина. Следует отметить, что эффект ранитидина и клемастина на угнетение СЛХЛ крови, вызываемое диклофенаком, был выражен слабо у пациентов 1 и 2 группы, соответственно. Прединкубация крови с кетансерином частично уменьшала ингибирующее воздействие диклофенака натрия на СЛХЛ крови больных с непереносимостью диклофенака с разными клиническими проявлениями, причем у пациентов 1 группы данный эффект был выражен слабее, чем у пациентов 2 группы. Зафирлукаст в равной мере вызывал частичную отмену ингибирования СЛХЛ крови под воздействием диклофенака натрия в обеих группах пациентов. КГК существенным образом отменяла ингибирующий эффект диклофенака натрия у пациентов 2 группы, в то время как у пациентов 1 группы КГК оказывала слабое влияние в отношении данного явления. В целом частичная отмена ингибирующего эффекта диклофенака натрия на СЛХЛ крови под воздействием ранитидина, кетансерина и КГК была выражена в большей степени у пациентов 2 группы по сравнению с 1 группой пациентов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что у больных с непереносимостью диклофенака натрия 1 группы гистаминовый механизм реализуется в большей степени, через гистаминовые рецепторы первого типа, 175 в то время как у пациентов 2 группы – в большей степени через гистаминовые рецепторы второго типа. Механизм серотонин-опосредованной активации тромбоцитов вносит вклад в развитие феномена специфического ингибирования СЛХЛ крови под воздействием диклофенака натрия у пациентов с непереносимостью этого препарата, причем участие указанного механизма в патогенезе данного феномена выражено в большей степени у пациентов 2 группы. Цис-лейкотриеновые рецепторы (цисЛТ1R) в равной степени участвуют в развитии вышеупомянутого феномена у всех пациентов с непереносимостью диклофенака натрия. Поскольку прединкубация крови с КГК в значительной степени снижала ингибирующий эффект, вызываемый диклофенаком натрия, у пациентов с непереносимостью диклофенака 2 группы, мы склонны полагать, что наблюдаемый феномен ингибирования СЛХЛ крови под воздействием диклофенака натрия у данных пациентов в определенной мере связан с высвобождением медиаторов из базофилов. У пациентов 1 группы, повидимому, медиаторы базофилов в меньшей степени опосредуют развитие феномена специфического ингибирования СЛХЛ крови. Таким образом, мы установили, что у пациентов с непереносимостью диклофенака натрия с реакциями со стороны кожных покровов существенный вклад в развитие феномена специфического ингибирования СЛХЛ крови, вызываемого диклофенаком, вносят Н2- гистаминовые и 5-НТ2 серотониновые рецепторы, в то время как вклад Н1- гистаминовых и цислейкотриеновых рецепторов выражен слабо. Кроме того, в развитии феномена подавления СЛХЛ крови под воздействием диклофенака натрия у данных пациентов принимают активное участие медиаторы базофилов. У пациентов с непереносимостью диклофенака натрия с реакциями со стороны органов дыхания существенный вклад в развитие феномена специфического ингибирования СЛХЛ крови, вызываемого диклофенаком, 176 вносят Н1- гистаминовые, при этом вклад остальных исследуемых рецепторов в реализацию подавления диклофенаком СЛХЛ крови выражен слабо. Участие механизма дегрануляции базофилов в патогенезе феномена подавления СЛХЛ крови, вызываемого диклофенаком, у данных пациентов также выражено незначительно. Оценка влияния блокаторов гистаминовых, серотониновых, лейкотриеновых рецепторов и стабилизатора мембран базофилов и тучных клеток на феномен подавления СЛХЛ крови, вызываемый тартразином, у пациентов с непереносимостью тартразина с различными клиническими проявлениями. Для того, чтобы оценить влияние блокаторов гистаминовых (клемастина, ранитидина), серотониновых (кетансерина), лейкотриеновых (зафирлукаста) рецепторов и стабилизатора мембран базофилов и тучных клеток (КГК) тартразином, на мы феномен подавления исследовали СЛХЛ воздействие крови, указанных вызываемый препаратов в концентрациях, эквивалентных 1СТД, на СЛХЛ проб крови, инкубированных с тартразином в концентрации 4мкМ, у больных с непереносимостью тартразина с различными клиническими проявлениями: с реакциями на тартразин со стороны органов дыхания (группа 1) (рис.23) и со стороны кожных покровов (группа 2) (рис. 24). Из рисунков 23, 24 видно, что клемастин, зафирлукаст ингибирующее действие и КГК в тартразина значительной на СЛХЛ степени крови отменяли больных с непереносимостью данного красителя обеих групп, в то время как действие ранитидина и кетансерина было выражено немного слабее. Следует отметить, что прединкубация проб крови пациентов 1 группы с кетансерином и ранитидином в меньшей степени отменяла ингибирующее действие тартразина на СЛХЛ крови, чем во 2-ой группе пациентов. 177 Больные с непереносимостью тартразина 1 группы 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 2 3 4 5 6 7 Рис.23. Влияние клемастина, ранитидина, зафирлукаста, кетансерина и кромоглициевой кислоты на изменение СЛХЛ крови под воздействием тартразина у пациентов с непереносимостью тартразина, имеющих реакции со стороны органов дыхания (группа 1). Примечание: *- р <0,05 относительно ИП больных с непереносимостью тартразина. # - р <0,05 относительно ИП здоровых доноров. 1. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с клемастином (1ЭСТД) и тартразином (4мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с клемастином. 2. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с ранитидином (1ЭСТД) и тартразином (4мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с ранитидином. 3. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с кетансерином (1ЭСТД) и тартразином (4мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с кетансерином. 4. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с зафирлукастом (1ЭСТД) и тартразином (4мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с зафирлукастом. 5. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с КГК (1ЭСТД) и тартразином (4мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с КГК. 6. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с тартразином (4мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с физиологическим раствором у пациентов с непереносимостью тартразина 1 группы. 7. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с тартразином (4мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с физиологическим раствором у здоровых доноров. 178 Больные с непереносимостью тартразина 2 группы 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 2 3 4 5 6 7 Рис.24. Влияние клемастина, ранитидина, зафирлукаста, кетансерина и кромоглициевой кислоты на изменение СЛХЛ крови под воздействием тартразина у пациентов с непереносимостью тартразина, имеющих реакции со стороны кожных покровов (группа 2). Примечание: *- р <0,05 относительно ИП больных с непереносимостью тартразина. # - р <0,05 относительно ИП здоровых доноров. 1. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с клемастином (1ЭСТД) и тартразином (4мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с клемастином. 2. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с ранитидином (1ЭСТД) и тартразином (4мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с ранитидином. 3. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с кетансерином (1ЭСТД) и тартразином (4мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с кетансерином. 4. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с зафирлукастом (1ЭСТД) и тартразином (4мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с зафирлукастом. 5. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с КГК (1ЭСТД) и тартразином (4мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с КГК. 6. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с тартразином (4мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с физиологическим раствором у пациентов с непереносимостью тартразина 2 группы. 7. Отношение СЛХЛ проб, инкубированных с тартразином (4мкМ), к СЛХЛ проб, инкубированных с физиологическим раствором у здоровых доноров. 179 Таким образом, у пациентов с непереносимостью тартразина в развитие феномена ингибирования тартразином СЛХЛ крови существенный вклад вносит гистаминовый механизм, причем последний реализуется в большей степени через Н1-гистаминовые рецепторы. Серотониновые 5-НТ2 рецепторы участвуют в развитии вышеупомянутого феномена у всех пациентов с непереносимостью тартразина, причем данные рецепторы экспрессируются в большей степени у пациентов с непереносимостью тартразина 2 группы. Цис-лейкотриеновые рецепторы (цисЛТ1R) в равной степени участвуют в развитии феномена ингибирования тартразином СЛХЛ крови у всех пациентов с непереносимостью тартразина. Поскольку стабилизатор мембран базофилов и тучных клеток КГК в значительной степени отменяла развитие феномена ингибирования тартразином СЛХЛ крови у всех пациентов с непереносимостью тартразина, можно предположить, что медиаторы базофилов участвуют в патогенезе наблюдаемого феномена. Таким образом, мы установили, что у пациентов с непереносимостью тартразина существенный вклад в развитие феномена ингибирования СЛХЛ крови, вызываемого тартразином, вносят Н1- и Н2- гистаминовые, 5-НТ2 серотониновые и цис-лейкотриеновые рецепторы. Кроме того, в развитие феномена подавления СЛХЛ крови под воздействием тартразина значительный вклад вносит механизм дегрануляции базофилов. Оценка влияния блокаторов гистаминовых, серотониновых, лейкотриеновых рецепторов и стабилизатора мембран базофилов и тучных клеток на феномен подавления СЛХЛ крови, вызываемый салицилатом, метамизолом, диклофенаком натрия и тартразином, у пациентов с непереносимостью данных препаратов. 180 Из полученных данных можно сделать следующее заключение об особенностях рецепторной реализации феномена специфического ингибирования СЛХЛ крови под воздействием НПВП и тартразина у пациентов с их непереносимостью, и возможно, также о рецепторной реализации механизмов непереносимости НПВП и тартразина: Н1-гистаминовые рецепторы вносят существенный вклад в реализацию подавления СЛХЛ крови у всех пациентов с непереносимостью АСК, метамизола натрия и тартразина, а также у пациентов с непереносимостью диклофенака 1 группы, причем указанные рецепторы экспрессируются в большей степени у пациентов с непереносимостью АСК 1 группы и у всех пациентов непереносимостью тартразина. У пациентов с непереносимостью диклофенака 2 группы Н1-гистаминовые рецепторы в меньшей степени опосредуют реализацию специфического подавления диклофенаком СЛХЛ крови. Н2-гистаминовые рецепторы вносят существенный вклад в реализацию подавления СЛХЛ крови у всех пациентов с непереносимостью АСК, метамизола натрия и тартразина, а также у пациентов с непереносимостью диклофенака натрия 2 группы. У пациентов с непереносимостью диклофенака 1 группы Н2-гистаминовые рецепторы вносят незначительный вклад в реализацию подавления СЛХЛ крови. При этом вклад Н2- гистаминовых рецепторов у пациентов с непереносимостью метамизола и диклофенака натрия 1 группы и у всех пациентов с непереносимостью тартразина выражен в меньшей степени по сравнению с вкладом Н1гистаминовых рецепторов. У пациентов с непереносимостью диклофенака натрия 2 группы, напротив, вклад Н2-гистаминовых рецепторов более выражен по сравнению с вкладом Н1-гистаминовых рецепторов. У пациентов с непереносимостью метамизола натрия 2 группы и у всех пациентов с непереносимостью АСК оба типа рецепторов принимают одинаковое участие в реализации гистаминового механизма. 181 Серотониновые 5-НТ2 рецепторы вносят существенный вклад в реализацию подавления СЛХЛ крови у всех пациентов с непереносимостью метамизола натрия и тартразина, а также у пациентов с непереносимостью АСК и диклофенака натрия 2 группы. У пациентов с непереносимостью диклофенака натрия 1 группы вклад указанных рецепторов выражен незначительно. У пациентов с непереносимостью АСК 1 группы серотониновые 5-НТ2 рецепторы не участвуют в патогенезе феномена специфического подавления салицилатом натрия СЛХЛ крови. Цис-лейкотриеновые рецепторы (цисЛТ1R) вносят существенный вклад в реализацию подавления СЛХЛ крови у всех пациентов с непереносимостью АСК, метамизола натрия и тартразина. У пациентов с непереносимостью диклофенака натрия вклад цис-лейкотриеновых рецепторов выражен слабее. Поскольку стабилизатор мембран базофилов и тучных клеток КГК в значительной степени отменяла развитие феномена ингибирования СЛХЛ крови у всех пациентов с непереносимостью АСК, метамизола натрия, тартразина, а также у пациентов с непереносимостью диклофенака натрия 2 группы, мы склонны полагать, что медиаторы базофилов в определенной мере участвуют в патогенезе наблюдаемого феномена у данных пациентов. У пациентов с непереносимостью диклофенака 1 группы КГК оказывала слабое влияние на эффект подавления диклофенаком СЛХЛ крови. Мы обобщили данные об участии различных рецепторов в феномене подавления СЛХЛ крови при различных формах непереносимости НПВП, тартразина (табл. 12). Таким образом, проведенные нами исследования показали разное участие Н1- и Н2- гистаминовых, 5-НТ2 серотониновых и цисЛТ1R рецепторов в развитии феномена ингибирования СЛХЛ крови под воздействием НПВП и тартразина в зависимости от клинических проявлений непереносимости и химической природы используемых псевдоаллергенов, что, вероятно, может свидетельствовать о разном вкладе гистаминовых, 182 Таблица 12 Эффекты блокаторов гистаминовых, серотониновых, лейкотриеновых рецепторов и стабилизатора мембран базофилов и тучных клеток на вызываемое НПВП и тартразином угнетение СЛХЛ крови у больных с непереносимостью данных псевдоаллергенов. Препарат, 1 ЭСТД Сильный эффект (ИП больных не имеет достоверных отличий от ИП здоровых доноров) 1. Пациенты с непереносимостью АСК 1 группы; 2. Пациенты с непереносимостью тартразина 1 и 2 групп. Пациенты с непереносимостью АСК 1 группы; Умеренный эффект (ИП больных достоверно ниже ИП здоровых доноров на 15-30%) Слабый эффект (ИП больных достоверно ниже ИП здоровых доноров на 35-45%) Пациенты с непереносимостью диклофенака 2 группы Отсутствие эффекта 1.Пациенты с непереносимостью АСК 2 группы; 2.Пациенты с непереносимостью метамизола 1и 2 групп; 3.Пациенты с непереносимостью тартразина 1 и 2 групп; 4.Пациенты с непереносимостью диклофенака 2 группы Пациенты непереносимостью диклофенака 1 группы с - Кетансерин - 1.Пациенты с непереносимостью АСК 2 группы; 2.Пациенты с непереносимостью метамизола 1и 2 групп; 3.Пациенты с непереносимостью тартразина 1 и 2 групп; 4.Пациенты с непереносимостью диклофенака 2 группы Пациенты непереносимостью диклофенака 1 группы с Пациенты непереносимостью АСК 1 группы; Зафирлукаст Пациенты с непереносимостью тартразина 1 и 2 групп; 1.Пациенты с непереносимостью АСК 1 и 2 групп; 2.Пациенты с непереносимостью метамизола 1 и 2 групп; Пациенты с непереносимостью диклофенака 1 и 2 групп - Кромоглициевая кислота 1. Пациенты с непереносимостью тартразина 1 и 2 групп; 2.Пациенты с непереносимостью диклофенака 2 группы 1.Пациенты с непереносимостью АСК 1 и 2 групп; 2.Пациенты с непереносимостью метамизола 1и 2 групп; Пациенты с непереносимостью диклофенака 1 группы. - Клемастин Ранитидин 1. Пациенты с непереносимостью АСК 2 группы; 2.Пациенты с непереносимостью метамизола 1 и 2 групп; 3.Пациенты с непереносимостью диклофенака 1 группы. - с 183 серотониновых и лейкотриеновых рецепторов в формирование непереносимости разных НПВП и тартразина у пациентов с различными клиническими проявлениями. Так, Н2-блокатор ранитидин значительно уменьшал угнетение СЛХЛ крови у пациентов с непереносимостью АСК 1 группы (ИП данных пациентов не имел достоверных отличий от ИП здоровых доноров). Вместе с тем у пациентов с непереносимостью диклофенака натрия 1 группы эффект ранитидина был выражен слабо (ИП данных пациентов был ниже ИП здоровых доноров на 42%). У всех пациентов с непереносимостью метамизола натрия, тартразина, а также у пациентов с непереносимостью АСК и диклофенака 2 группы эффект Н2блокатора был выражен умеренно (ИП данных пациентов был ниже ИП здоровых доноров на 15-30%). Поскольку стабилизатор мембран тучных клеток и базофилов КГК оказывала разный эффект на вызываемое НПВП и тартразином угнетение СЛХЛ крови у пациентов разных клинических групп, мы склонны полагать, что вклад механизма дегрануляции базофилов в развитие феномена ингибирования СЛХЛ и, возможно, в патогенез непереносимости НПВП и тартразина выражен в разной степени у пациентов с различными клиническими проявлениями непереносимости НПВП и тартразина. В частности, значительно уменьшая ингибирование СЛХЛ крови у всех пациентов с непереносимостью тартразина и пациентов с непереносимостью диклофенака 2 группы (ИП данных пациентов не имел достоверных отличий от ИП здоровых доноров), КГК оказывала слабое влияние на эффект ингибирования СЛХЛ крови у пациентов с непереносимостью диклофенака 1 группы (ИП данных пациентов был ниже ИП доноров на 44%). У всех пациентов с непереносимостью аспирина и анальгина влияние КГК было умеренным (ИП данных пациентов был ниже ИП здоровых доноров на 15-30%). 184 4.5. Определение концентрации цитокинов в плазме крови здоровых доноров и больных с непереносимостью НПВП, тартразина и оценка их роли в реализации феномена ингибирования стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой хемилюминесценции крови под влиянием НПВП, тартразина у пациентов с их непереносимостью. Выше мы показали, что в реализации феномена ингибирования СЛХЛ крови под влиянием НПВП и тартразина участвуют плазменные факторы (п.4.1.-4.3). Было установлено, что существенный вклад в вызываемое НПВП, тартразином угнетение СЛХЛ вносят медиаторы (п.4.4.). Вместе с тем, нас заинтересовал вопрос об участии цитокинов в реализации данного феномена. Для выяснения вклада цитокинового механизма в развитие феномена ингибирования СЛХЛ крови под влиянием НПВП, тартразина у пациентов с их непереносимостью, было проведено настоящее исследование. В первой серии опытов определяли концентрации цитокинов в плазме крови пациентов с непереносимостью НПВП, тартразина, проявляющейся реакциями со стороны органов дыхания (бронхоспазм/ринит),- группа1 и со стороны кожных покровов (крапивница/отек Квинке)- группа 2 (табл. 13). Как следует из таблицы, концентрации ИЛ-4, ИФН-γ в плазме периферической крови находятся в диапазоне нормальных значений у всех исследуемых лиц. Вместе с тем, концентрации ИФН-γ и ИЛ-4 у пациентов обеих групп достоверно выше, чем у здоровых доноров, принявших участие в нашем исследовании (р<0,05). Концентрация ИЛ-1β, ИЛ-8 и ФНО-α в плазме умеренно повышена у пациентов 1 группы. У пациентов 2 группы и здоровых доноров концентрации указанных провоспалительных цитокинов пределах нормальных значений. находятся в 185 Таблица 13 Уровень цитокинов в плазме крови пациентов с непереносимостью НПВП, тартразина и здоровых доноров Вид цитокина Здоровые доноры ИЛ-1β 1,0±0,04 (норма: 0-11) 0,5±0,05 (норма: 0-4) 8,1±1,2 (норма: 0-10) 2,6±0,2 (норма: 0-6) 2,2±0,1 (норма: 0-10) ИЛ-4 ИЛ-8 ФНО-α ИФН-γ Концентрация цитокинов, пг/мл Больные с непереносимостью НПВП и/или тартразина Пациенты с Пациенты с реакциями со реакциями со стороны органов стороны кожных дыхания (группа 1) покровов (группа 2) 12,1±0,7* 0,6±0,05 1,6±0,2* 2,5±0,3* 25,9±3,6* 9,8±1,2 8,9±1,1* 1,7±0,1 6,8±0,3* 4,3±0,2* Примечание: *- p<0,05 относительно здоровых доноров Концентрация цитокина находится в диапазоне нормальных значений Концентрация цитокина выше нормы Полученные результаты показывают, что уровни исследуемых цитокинов различны у пациентов с непереносимостью НПВП, тартразина разных клинических групп. У пациентов 2 группы концентрации всех исследуемых цитокинов находятся в пределах нормальных значений. У пациентов 1 группы выявлялось увеличение провоспалительных цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-8 и концентрации противовоспалительного концентрации ФНО-α, в то время как цитокина ИЛ-4 и провоспалительного цитокина ИФН-γ находились в диапазоне нормальных значений. Повышение концентрации провоспалительных цитокинов в плазме 186 крови пациентов 1 группы может быть связано с наличием хронического воспалительного процесса в слизистой оболочке бронхов. Умеренное повышение уровня провоспалительных цитокинов у данных пациентов, вероятно, связано с тем, что пациенты находились в периоде ремиссии хронического бронхита и астмы. У пациентов 2 группы и здоровых доноров в силу отсутствия воспалительного процесса в организме концентрации провоспалительных цитокинов находятся в пределах нормы. Обнаруженный нами относительно низкий уровень провоспалительного цитокина ИФН-γ в плазме крови пациентов с АТ может быть обусловлен следующими факторами: - отсутствием острых вирусных инфекций у исследуемых нами больных АТ; - наличием хронических вирусных инфекций, при которых снижение выработки интерферонов может быть обусловлено истощением функциональной активности лейкоцитов к синтезу данных цитокинов (истощением интерферон-синтетической активности лейкоцитов); - угнетением NO активности Т-хелперов 1 (Th1), продуцирующих ИФН-γ и другие цитокины [138]; - ингибирующим действием NO на продукцию ИФН-γ Th1-клетками [258; 278,]; - снижением образования лейкоцитами периферической крови пациентов с аспириновой астмой ПГЕ2 [178], усиливающего продукцию ИФН-γ и других цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ФНО-, ГМ-КСФ) [74]. Выявляемый низкий уровень противовоспалительного цитокина ИЛ-4 у всех пациентов с непереносимостью НПВП, тартразина и здоровых доноров указывает на отсутствие активации Т-хелперов 2 (Тh2) у большинства исследуемых лиц. Поскольку ИЛ-4- основной цитокин, который стимулирует переключение синтеза иммуноглобулинов на IgE изотип [77], усиленная продукция ИЛ-4 активированными Тh2, тучными клетками, базофилами и др. клетками наблюдается при аллергии. 187 Для того чтобы определить участие цитокиновых механизмов в реализации феномена ингибирования СЛХЛ крови под воздействием НПВП, тартразина, мы определяли концентрации различных цитокинов в пробах плазмы, полученных после прединкубации образцов крови с НПВП, тартразином, как описано в главе «Материалы и методы» п. 2.3.10, 2.3.11. (табл. 14,15). Таблица 14 Уровень цитокинов в плазме крови после прединкубации проб крови с салицилатом, метамизолом, диклофенаком натрия и тартразином у здоровых доноров. Тестируемые Концентрация цитокинов, пг/мл агенты ИЛ-1β ИЛ-4 ИЛ-8 ФНО-α ИФН-γ Физиологический 1,0±0,04 раствор (контроль) Салицилат натрия 0,9±0,07 0,5±0,05 8,1±1,2 2,6±0,2 2,2±0,1 0,5±0,07 9,3±0,8 2,7±0,3 2,3±0,2 Метамизол натрия Диклофенак натрия Тартразин 1,1±0,06 0,5±0,02 7,9±1,1 2,8±0,3 2,4±0,2 1,1±0,06 0,4±0,06 6,8±1,4 3,0±0,5 2,5±0,4 0,9±0,06 0,6±0,07 8,4±0,8 2,4±0,4 2,4±0,4 Как видно из данных таблицы 14, у здоровых доноров концентрации цитокинов в плазме крови после прединкубации образцов крови с салицилатом, метамизолом, диклофенаком натрия или тартразином не имели достоверных отличий от таковых в контрольных пробах, не содержащих НПВП или тартразин. Как видно из данных таблицы 15, прединкубация образцов крови больных 2 группы с салицилатом натрия приводила к достоверному повышению концентрации ИЛ-4 и ИФН-γ относительно контроля. Под влиянием метамизола натрия на кровь пациентов 2 группы увеличивалась 188 концентрация ИЛ-4 и ФНО-α. Прединкубация проб крови с тартразином сопровождалась достоверным увеличением уровней ИЛ-4, ФНО-α, ИФН-γ у данной группы больных. Диклофенак натрия не оказывал заметного влияния на уровень исследуемых цитокинов во 2 группе пациентов. У пациентов 1 группы прединкубация образцов крови с салицилатом, метамизолом натрия и тартразином сопровождалась тенденцией к увеличению концентрации ИЛ-8 и ФНО-α относительно контроля, однако повышение концентрации указанных цитокинов не было достоверным. Вместе с тем, под влиянием салицилата натрия наблюдалось достоверное увеличение концентрации ИФН-γ у данной группы пациентов. Диклофенак натрия не оказывал заметного влияния на уровень исследуемых цитокинов в 1 группе пациентов. Полученные данные показывают, что прединкубация образцов крови с НПВП, тартразином сопровождается тенденцией к увеличению уровня цитокинов в плазме крови обеих групп пациентов, особенно выраженной во второй группе пациентов. Последнее, вероятно, связано с большей чувствительностью клеток (базофилов и др.) к действию ирритантов (псевдоаллергенов) у пациентов 2 группы. Следует отметить, что салицилат натрия, метамизол, диклофенак натрия и тартразин по-разному влияют на уровень исследуемых цитокинов у пациентов с различными клиническими проявлениями, что может быть связано с тем, что имеются различия во влиянии данных препаратов различной химической природы на разные фракции лейкоцитов периферической крови. Диклофенак натрия не оказывал существенного влияния на выброс исследуемых цитокинов из клеток, что, вероятно, связано с меньшей чувствительностью клеток к его влиянию. По-видимому, некоторое увеличение концентрации исследуемых цитокинов 189 Уровень цитокинов в плазме крови после прединкубации проб крови с Таблица 15 салицилатом, метамизолом, диклофенаком натрия и тартразином у пациентов с их непереносимостью, имеющих реакции со стороны органов дыхания (группа 1) или со стороны кожных покровов (группа 2) Тестируемые агенты Концентрация цитокинов, пг/мл Пациенты с реакциями со стороны органов Пациенты с реакциями со стороны кожных дыхания (группа 1) покровов (группа 2) ИЛ-1β ИЛ-4 ИЛ-8 ФНО-α ИФН-γ ИЛ-1β ИЛ-4 ИЛ-8 ФНО-α ИФН-γ Физ. раствор 12,1±0,7 (контроль) 1,6±0,2 25,9±3,6 8,9± 1,1 6,8± 0,3 0,6±0,05 2,5±0,3 9,8±1,2 1,7±0,1 4,3±0,2 Салицилат натрия 14,3±2,4 1,4±0,1 26,4±2,3 11,7±1,4 8,6±0,6* 0,56±0,04 4,0±0,4* 11,6±2,2 1,6±0,1 5,5±0,5* Метамизол натрия 13,3±1,2 1,3±0,1 31,6±3,5 8,1±1,1 7,3±0,6 0,52±0,05 3,8±0,5* 8,5±0,7 2,4±0,3* 4,5±0,3 Диклофенак натрия 13,7±1,6 1,6±0,3 27,9±3,2 8,6±1,5 6,5±0,6 0,71±0,05 2,4±0,5 8,7±0,9 1,5±0,1 4,6±0,6 12,5±2,3 1,4±0,1 34,2±3,5 11,4±1,3 6,6±0,4 0,59±0,04 3,9±0,4* 8,8±0,7 2,2±0,2* 5,8±0,6* Тартразин Примечание: *- p<0,05 относительно контроля 190 под влиянием НПВП и тартразина в крови пациентов с их непереносимостью связано с дегрануляцией базофилов под воздействием указанных агентов, что сопровождается высвобождением из базофилов не только медиаторов, но и цитокинов. Известно, что базофилы продуцируют и выделяют ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-3, ИЛ-5, MIP-1α, ГМ-КСФ, ФНО, RANTES, ИФН-γ [79]. Активаторами синтеза и секреции цитокинов базофилами могут быть медиаторы воспаления, такие как компоненты комплемента С5а, С3а, С4а, главный основной протеин, ТАФ, хемокины (ИЛ-8, RANTES), монокины (ИЛ-1, ФНО), а также связывание антигеном поверхностных IgE. Кроме того, базофилы могут быть напрямую активированы посредством патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMP) [79]. У пациентов с АТ практически все вышеперечисленные активаторы могут стимулировать базофилы к синтезу цитокинов в силу наличия у них хронического бронхита, а у некоторых пациентов - атопии (при неинфекционно-аллергической и смешанной форме БА). У пациентов с крапивницей/отеком Квинке медиаторы воспаления, PAMP и провоспалительные цитокины могут выступать в качестве активаторов базофилов к синтезу цитокинов при наличии воспалительного процесса в организме. Не исключена также активация базофилов данных лиц при специфическом связывании каким-либо антигеном поверхностных IgE, что возможно для лиц с атопией. Однако мы не можем исключать, что помимо базофилов и другие лейкоциты могут высвобождать цитокины под влиянием НПВП in vitro. Имеются сообщения об увеличении хемотаксической активности ПМЛ больных с аспириновой астмой и с аспирин-чувствительной крапивницей после провокации аспирином, что может сопровождаться их дегрануляцией [128]. Известно, что провоспалительные цитокины оказывают праймирующее влияние к продукции фагоцитами АФК, что сопровождается увеличением ХЛ при воздействии вторичных стимулов [8; 31; 48; 66; 71; 99; 141; 146; 174; 191 269]. Противовоспалительные цитокины, напротив, оказывают ингибирующее влияние на ХЛ фагоцитов [48; 49; 58; 205; 215]. У пациентов с непереносимостью НПВП, тартразина обеих групп под влиянием салицилата, метамизола натрия и тартразина происходит незначительное увеличение уровня провоспалительных цитокинов, что может в некоторой степени предстимулировать фагоциты к увеличению выработки АФК при воздействии вторичных стимулов. Однако мы наблюдаем феномен ингибирования СЛХЛ крови под влиянием НПВП, тартразина у пациентов с их непереносимостью, что свидетельствует о том, что провоспалительные цитокины ИЛ-1β, ИЛ-8, ФНО-α и ИФН-γ не принимает участия в реализации указанного феномена у данных больных. Вместе с тем, у пациентов 2 группы под влиянием салицилата, метамизола натрия и тартразина происходит достоверное увеличение уровня противовоспалительного цитокина ИЛ-4, что может вносить вклад в развитие феномена ингибирования СЛХЛ крови, вызываемого НПВП, тартразином. Однако, учитывая низкую концентрацию ИЛ-4 в крови данных пациентов, вклад ИЛ-4 в реализацию указанного феномена незначительный. Таким образом, основной вклад в развитие феномена ингибирования СЛХЛ крови под влиянием НПВП, тартразина у пациентов с их непереносимостью вносят медиаторные механизмы. 192 Глава 5. Определение вклада индуцибельной NO- синтазы фагоцитов периферической крови стимулированной в развитие сульфатом феномена бария ингибирования люминол-зависимой хемилюминесценции крови под влиянием НПВП, тартразина у больных с астматической триадой. Многочисленными исследованиями устaновлено, что у больных БА в выдыхаемом воздухе выявляется значительное повышение содержания NO по сравнению с тaковым у здоровых людей [37; 95]. Известно, что повышение уровня NO в выдыхаемом воздухе зависит от нaличия воспалительных изменений в бронхах, которые влияют на aктивность iNOS [37; 60]. При обострении БА имеется параллельное увеличение количества выдыхаемого NO и aктивности iNOS [37]. Кроме того, Parikh A. et. al. [210]. В своих исследованиях определили более высокий уровень aктивности iNOS в эпителии носовых полипов у пaциентов с AТ по срaвнению с таковым у пaциентов с полипозом носа и БA без непереносимости aспиринa. Между тем, до настоящего времени не известно, существует ли зaвисимость между степенью подавления СЛХЛ крови под влиянием НПВП у больных с AТ и уровнем aктивности iNOS фагоцитов периферической крови. Для получения ответa на данный вопрос было проведено настоящее исследование. В первой серии опытов исследовaли влияние блокaторa iNOS LNNA нa СЛХЛ крови больных с AТ. Опытные пробы инкубировaли с рaствором LNNA в рaзличных концентрациях в смеси с сaлицилaтом или метaмизолом нaтрия, как описано предвaрительные в п. исследовaния 2.3.7. не Поскольку выявили проведенные достоверных нaми рaзличий покaзателей СЛХЛ крови под влиянием LNNA в смеси с НПВП у пациентов с AТ в фaзу обострения и в фaзу медикaментозной ремиссии хронического бронхитa, всех пациентов с AТ мы объединили в одну группу (табл.16). 193 Таблица 16 Влияние N -нитро-L-aргинина в смеси с сaлицилaтом или метaмизолом нaтрия на стимулировaнную сульфaтом бaрия люминол-зaвисимую ХЛ крови больных с aстматической триaдой, (М±m) Концентрации исследуемых препаратов N -нитро-L-aргинин (22,8мкМ) + сaлицилат нaтрия 3 мМ N -нитро-L-aргинин (11,4мкМ) + сaлицилат нaтрия 3 мМ N -нитро-L-aргинин (2,3мкМ) + сaлицилат нaтрия 3 мМ N -нитро-L-aргинин (0,46мкМ) + сaлицилат нaтрия 3 мМ N -нитро-L-aргинин (0,05мкМ) + сaлицилат нaтрия 3 мМ N -нитро-L-aргинин (0,02мкМ) + сaлицилат нaтрия 3 мМ Сaлицилaт нaтрия 3 мМ N -нитро-L-aргинин (22,8мкМ) + метaмизол нaтрия 6мкм N -нитро-L-aргинин (11,4мкМ) + метaмизол нaтрия 6мкм N -нитро-L-aргинин (2,3мкМ) + метaмизол нaтрия 6мкм N -нитро-L-aргинин (0,46мкМ) + метaмизол нaтрия 6мкм N -нитро-L-aргинин (0,05мкМ) + метaмизол нaтрия 6мкм N -нитро-L-aргинин (0,02мкМ) + метaмизол нaтрия 6мкм Метaмизол нaтрия 6мкМ Относительная светосумма СЛХЛ 1,16±0,10* 1,14±0,07* 1,02±0,06* 0,96±0,09* 0,90±0,04* 0,84±0,03* 0,66±0,05 1,11±0,13* 1,02±0,06* 0,94±0,09* 0,93±0,06* 0,85±0,05* 0,75±0,01* 0,63±0,03 Примечaние. *- р<0,05 относительно покaзателей СЛХЛ проб крови с сaлицилатом или метaмизолом нaтрия. Как видно из дaнных тaблицы 16, блокaтор iNOS LNNA в знaчительной степени снимает вызываемое НПВП угнетение СЛХЛ крови у пациентов с АТ, при этом нaибольший эффект наблюдaлся при высоких концентрaциях LNNA. Уменьшение ингибирующего действия НПВП на СЛХЛ крови под влиянием LNNA у больных с непереносимостью соответствующих препаратов может происходить в силу следующих причин: во-первых, снижением обрaзования NO, который подaвляет активность НАДФН- оксидазы ПМЛ, эффективно взаимодействует с О2-, в результaте чего снижaется продукция Н2О2 и ОН• [80]. Поэтому ингибировaние продукции NO может приводить к увеличению СЛХЛ крови несмотря нa снижение продукции пероксинитрита, способного окислять люминол и вносить вклад в развитие люминол-зависимой ХЛ фагоцитов [150]. Однако при воспалении на первый плaн выходят реaкции, связaнные с aктивацией фaгоцитов и 194 обрaзованием ими АФК (О2-, ОН•, Н2О2, ClO-), а зaтем – перекисей липидов, в то время как в норме за свечение клеток в знaчительной степени ответственны реaкции NO [97]; во-вторых, возможным учaстием iNOS в механизмaх угнетения СЛХЛ крови под влиянием НПВП у больных с АТ. Для выяснения вопросa учaстия iNOS фaгоцитов периферической крови в мехaнизмaх угнетения СЛХЛ крови под влиянием НПВП у больных с AТ во второй серии опытов определяли aктивность iNOS фaгоцитов крови у больных БA и доноров при воздействии на культуру лейкоцитов исследуемых НПВП. Об aктивности iNOS лейкоцитов косвенно судили по уровню конечных стaбильных продуктов NO (нитрaтов и нитритов) в пробaх. Учитывая, что в водной среде нитрит-ион крайне нестaбилен и быстро переходит в нитрaт-ион, для количественного определения уровней метaболитов NO предвaрительно обрaбaтывaли пробы с помощью кaдмиевых редукторов, в результате чего происходило превращение нитрaтов в нитриты (п.2.3.8, 2.3.9) (табл. 17). Таблица 17 Влияние салицилата, метамизола и диклофенака натрия на уровень стабильных конечных продуктов NO у пациентов с бронхиальной астмой и здоровых доноров, (М±m) Препарат Здоровые доноры Aтопическая AТ в фазу AТ в фазу БA в фазу ремиссии обострения ремиссии 106,77±11,74 130,15±10,41* 169,34±14,61* Контроль (без 79,81±6,38 НПВП) 64,65±5,82 84,34±7,59 104,12±13,55* 133,11±13,41* Салицилат (↓ на 19% отн. (↓ на 21% отн. (↓ на 20% отн. (↓ на 18% отн. натрия контроля) контроля) контроля) контроля) 60,67±6,07 82,21±9,04 101,51±8,12* 129,88± 11,69* Метамизол (↓ на 24% отн. (↓ на 23% отн. (↓ на 22% отн. (↓ на 20% отн. натрия контроля) контроля) контроля) контроля) 65,45±5,89 86,48±8,55 108,02±9,72* 136,36±10,91* Диклофенак (↓ на 18% отн. (↓ на 19% отн. (↓ на 17% отн. (↓ на 16% отн. натрия контроля) контроля) контроля) контроля) Примечание. *- р<0,05 относительно показателей проб здоровых доноров 195 Кaк видно из дaнных тaблицы 17, уровень нитритов в контрольных пробaх (без НПВП) рaзличен у всех исследуемых групп лиц. Сaмый низкий уровень нитритов был в группе здоровых доноров. В группе пaциентов с aтопической формой БA без ПРС и непереносимости НПВП в период ремиссии уровень нитритов не имел достоверных отличий от тaкового здоровых доноров. У всех пaциентов с AТ уровень нитритов был достоверно выше тaкового здоровых доноров. При этом при срaвнении уровня нитритов у пациентов с AТ и aтопической формой БA без полипоза носа и непереносимости НПВП, содержaние нитритов было достоверно выше в группе пaциентов с AТ в фaзу обострения хронического бронхита и БA. При срaвнении концентрации нитритов в группaх пaциентов с AТ в рaзные фaзы течения хронического бронхитa уровень последних был достоверно выше у пaциентов с AТ в фaзу обострения хронического бронхитa и БA по сравнению с группой пaциентов с AТ в фaзу ремиссии. Кроме того, инкубaция суспензии лейкоцитов с НПВП сопровождалась тенденцией к снижению уровня нитритов у всех исследуемых групп лиц. Следует отметить, что степень подaвления продукции NO фaгоцитами под влиянием НПВП существенно не рaзличалась у всех исследуемых групп лиц. Из этого следует, что уровень aктивности iNOS фагоцитов изменяется сходным образом под влиянием НПВП у здоровых доноров и у всех пaциентов с БA вне зaвисимости от фaзы течения зaболевания и наличия непереносимости НПВП. Учитывая, что активность iNOS фагоцитов несколько выше у пaциентов с обострением воспалительного процессa в бронхах по сравнению с таковыми в ремиссии, мы посчитaли целесообразным срaвнить показатели относительной светосуммы СЛХЛ крови у пaциентов с АТ в фaзу обострения хронического бронхитa и БА по срaвнению с пациентами в фазу ремиссии. Для наглядности приведены знaчения относительной интенсивности СЛХЛ здоровых доноров (табл. 18). 196 Таблица18. Зависимость относительной светосуммы СЛХЛ крови от фазы течения хронического бронхита у больных с астматической триадой, (М±m) Относительная светосумма СЛХЛ Фаза обострения Фаза ремиссии Здоровые НПВП хронического хронического доноры бронхита и астмы бронхита и астмы Салицилат натрия 0,69±0,05 0,67±0,05 1,09±0,09 Метамизол натрия 0,74±0,03 0,75±0,04 1,17±0,08 Диклофенак натрия 0,89±0,05 0,93±0,03 1,78±0,17 Из таблицы следует, что отсутствует зависимость относительной светосуммы СЛХЛ крови от фазы течения воспалительного процесса в бронхах и, следовательно, от уровня активности iNOS фагоцитов. Таким образом, мы склонны полагать, что ингибирование СЛХЛ крови под влиянием НПВП у больных с АТ, имеющих непереносимость соответствующих НПВП, не связано с повышением активности фагоцитов. iNOS 197 Глава 6. Определение стимулированной зависимости между сульфатом бария хемилюминесценции крови под влиянием степенью угнетения люминол-зависимой НПВП, тартразина и давностью существования непереносимости данных псевдоаллергенов. В предыдущем разделе было доказано, что отсутствует зaвисимость относительной светосуммы СЛХЛ от фазы течения воспалительного процессa в бронхaх и, следовательно, от уровня aктивности iNOS фагоцитов у больных АТ. Однако оставалась неизвестной зависимость между степенью угнетения СЛХЛ крови под влиянием НПВП, тaртрaзина и дaвностью возникновения непереносимости указанных псевдоаллергенов в рaзных клинических группах пaциентов. Для выяснения возможной временной зaвисимости было проведено настоящее исследование. Образцы крови инкубировaли с сaлицилатом, метaмизолом, диклофенaком нaтрия, тaртрaзином в концентрациях 3 мМ, 6 мкМ, 6мкМ, 4мкМ, соответственно (как описано в п. 2.3.7.), поскольку на укaзанных концентрaциях нaблюдались нaибольшие рaзличия показaтелей СЛХЛ крови у пациентов с непереносимостью дaнных псевдоаллергенов по срaвнению со здоровыми донорами. Затем регистрировали светосумму СЛХЛ крови и определяли относительную светосумму СЛХЛ, как описано в п. 2.3.5. (табл. 19, 20). Как следует из тaблицы 19, у пaциентов с бронхиaльными проявлениями непереносимости НПВП прослеживaется тенденция к уменьшению относительной светосуммы СЛХЛ крови под влиянием НПВП при увеличении дaвности существования непереносимости дaнных препaрaтов. Так, у пaциентов с непереносимостью АСК, проявляющейся реaкциями со стороны органов дыхания, с дaвностью возникновения зaболеваниия до 2-х лет, прединкубaция обрaзцов крови с сaлицилaтом нaтрия сопровождaлaсь умеренным ингибированием СЛХЛ крови, и ИП был равен 0,83±0,02, в то время как у пaциентов с длительно существующей непереносимостью АСК (более 10 лет) нaблюдaлось вырaженное ингибирование СЛХЛ крови, и ИП составлял 0,42±0,03. 198 Таблица 19. Зaвисимость относительной светосуммы СЛХЛ (ИП) от дaвности возникновения непереносимости НПВП, тартразина у пациентов с реaкциями на дaнные псевдоaллергены со стороны органов дыхания (бронхоспaзм, ринит), (М±m) Тестируемые агенты Относительная светосумма СЛХЛ, отн.ед. Больные с непереносимостью НПВП, тартразина (с реакциями со стороны органов дыхания) Продолжительность непереносимости НПВП, Доноры тартразина До 2-х лет 3-5 лет 6-10 лет Более 10 лет Салицилат 0,83±0,02* 0,72±0,03* 0,66±0,04* 0,42±0,03* 1,01±0,09 0,83±0,04* 0,76±0,02* 0,64±0,03* 0,44±0,04* 1,17±0,08 1,03±0,05* 0,93±0,04* 0,87±0,06* 0,78±0,04* 1,78±0,17 0,82±0,03* 0,75±0,04* 0,65±0,04* 0,42±0,02* 1,06±0,05 натрия Метамизол натрия Диклофенак натрия Тартразин Примечание. *- р<0,05 относительно аналогичной точки здоровых доноров 199 Таблица 20. Зaвисимость относительной светосуммы СЛХЛ (ИП) от дaвности возникновения непереносимости НПВП, тaртрaзина у пациентов с реакциями на данные псевдоaллергены со стороны кожных покровов (крaпивница/отек Квинке), (М±m) Тестируемые агенты Относительная светосумма СЛХЛ, отн.ед. Больные с непереносимостью НПВП, тартразина Доноры (с реакциями со стороны кожных покровов) Продолжительность непереносимости НПВП, тартразина До 2-х лет 3-5 лет 6-10 лет Более 10 лет Салицилат 0,52±0,06* 0,71±0,06* 0,81±0,05* 0,87±0,03* 1,01±0,09 0,63±0,06* 0,73±0,05* 0,79±0,05* 0,94±0,06* 1,17±0,08 0,84±0,07* 0,99±0,06* 1,23±0,07* 1,34±0,06* 1,78±0,17 0,45±0,04* 0,61±0,05* 0,69±0,04* 0,84±0,07* 1,06±0,05 натрия Метамизол натрия Диклофенак натрия Тартразин Примечание. *- р<0,05 относительно аналогичной точки здоровых доноров. У пaциентов с кожными проявлениями непереносимости НПВП (табл. 20), нaпротив, сaмые низкие показатели относительной светосуммы СЛХЛ при прединкубации обрaзцов крови с НПВП отмечaлись у пaциентов с дaвностью возникновения непереносимости данных препаратов до 2-х лет, сaмые высокие - у пaциентов с продолжительностью зaболевания более 10 лет. Так, у пaциентов с кожными проявлениями непереносимости АСК при дaвности возникновения заболевания до 2-х лет прединкубация обрaзцов крови с 200 сaлицилатом натрия сопровождалась выраженным ингибированием СЛХЛ крови, и ИП был рaвен 0,52±0,06, в то время как у пaциентов с длительно существующей непереносимостью АСК (более 10 лет) наблюдaлось умеренное ингибирование СЛХЛ крови, и ИП составлял 0,87±0,03. У пациентов непереносимостью с непереносимостью тaртрaзина НПВП отмечaлась в aнaлогичная сочетании с тенденция в изменении СЛХЛ крови под влиянием тaртрaзинa в зaвисимости от времени, прошедшего с момента возникновения непереносимости тaртрaзинa. (табл.19,20). Таким обрaзом, степень подaвления СЛХЛ крови под влиянием НПВП, тaртрaзина у пaциентов с их непереносимостью зaвисит от времени, прошедшего с момента возникновения данной непереносимости. У пaциентов с бронхиaльными проявлениями непереносимости НПВП, тартразина степень подaвления относительной светосуммы СЛХЛ крови возрастает при непереносимости. увеличении У длительности пациентов только существования с кожными укaзанной проявлениями непереносимости НПВП, тaртрaзина (крапивница/отек Квинке) степень подавления СЛХЛ крови снижается при увеличении дaвности возникновения непереносимости дaнных псевдоaллергенов. 201 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Еще в 1985 году Пыцким В.И. и соавт. [82] был описан феномен специфического угнетения аллергеном СЛХЛ лейкоцитов периферической крови сенсибилизированных людей и экспериментальных животных. В качестве аллергенов были использованы аллергены из домашней пыли, пыльцы растений, инсектные, чужеродный белок, пенициллин [68; 69]. Однако использованные аллергены были либо полноценными антигенами, либо гаптенами (пенициллин), образующими в организме комплексный антиген. Возникал вопрос - оказывают ли влияние на СЛХЛ крови псевдоаллергены, к числу которых относят НПВП, пищевые красители [34; 67]. Предварительно проведенные нами исследования показали также изменение СЛХЛ периферической крови под влиянием НПВП у больных с непереносимостью данных препаратов [18]. Так, добавление салицилата и метамизола натрия к пробам крови больных с непереносимостью АСК и/или метамизола натрия сопровождалось ингибированием СЛХЛ крови, в то время как у здоровых доноров показатели СЛХЛ крови под воздействием НПВП были достоверно выше по сравнению с таковыми данных больных. Между тем, до настоящего времени не известно, связаны ли выявленные различия СЛХЛ крови под воздействием НПВП у доноров и больных с непереносимостью НПВП исключительно с влиянием на ПМЛ крови биологически активных веществ (медиаторов, цитокинов) плазмы, или все же существуют какие-то особенности окислительного метаболизма ПМЛ у данной группы больных, проявляющиеся при воздействии на ПМЛ НПВП. Из литературы известно также, что непереносимость НПВП нередко сочетается с непереносимостью пищевых красителей, в частности тартразина [34; 67]. Напрашивается вопрос, будут ли возникать изменения СЛХЛ крови под влиянием пищевых красителей у пациентов с их непереносимостью, аналогичные изменениям СЛХЛ под влиянием НПВП, а 202 также каковы механизмы возможных изменений СЛХЛ, и существуют ли общие механизмы изменения СЛХЛ крови под влиянием пищевых красителей и НПВП? В связи с этим возникла необходимость изучить общие закономерности изменения продукции АФК ПМЛ периферической крови под влиянием НПВП, тартразина у больных с их непереносимостью разных клинических групп, а также механизмы этих изменений. Для решения данных вопросов в первой части нашей работы мы исследовали изменение СЛХЛ крови под влиянием НПВП у здоровых доноров и больных с непереносимостью НПВП разных клинических групп. В группу исследуемых НПВП вошли салицилаты (салицилат натрия), пиразолоны (метамизол натрия) и производные фенилуксусной кислоты (диклофенак натрия), поскольку указанные НПВП наиболее часто используются в клинической практике. Следует отметить, что ранее проведенные нами исследования показали, что степень подавления СЛХЛ крови под влиянием НПВП у больных с непереносимостью данных препаратов не зависела от формы клинического проявления непереносимости [18]. Поэтому при исследовании СЛХЛ крови под влиянием НПВП мы не стали делить группу пациентов с непереносимостью НПВП на отдельные клинические группы, объединив всех пациентов с различными формами клинических проявлений непереносимости НПВП в одну группу. Мы выяснили, что НПВП оказывают дозозависимое модифицирующее влияние на СЛХЛ цельной крови здоровых доноров и пациентов с непереносимостью данных препаратов. У здоровых доноров имеется зависимость светосуммы СЛХЛ крови от концентрации НПВП. Малые концентрации препаратов (концентрации, которые могут создаваться в крови in vivo при применении НПВП) стимулируют СЛХЛ крови, однако при увеличении концентрации наблюдается подавление СЛХЛ. Очевидно, это является выражением общебиологической закономерности, что вещество, действующее угнетающе 203 (повреждающее) в больших концентрациях, может оказывать стимулирующее влияние в малых концентрациях. Повышение СЛХЛ крови доноров при инкубации проб крови с малыми концентрациями НПВП, вероятно, обусловлено стимулирующим влиянием на выработку АФК фагоцитами кислоты продуктов липооксигеназного (эйкозатетраеновых метаболизма метаболитов, ЛТВ4), арахидоновой образующихся в лейкоцитах под влиянием НПВП [73; 163]. Можно также предположить, что эйкозатетраеновые метаболиты, являясь оксидантами, могут напрямую взаимодействовать с люминолом, усиливая ХЛ фагоцитов [7]. Кроме того, по данным литературы известно, что ПГ, в частности ПГЕ1, снижают генерацию АФК ПМЛ [238]. Поскольку НПВП угнетают циклооксигеназный путь метаболизма арахидоновой кислоты, что сопровождается снижением синтеза ПГ, можно предположить, что уменьшение ингибирующего действия ПГЕ1 на образование АФК должно повышать образование последних. Ингибирующее действие высоких концентраций НПВП на СЛХЛ крови доноров может быть обусловлено ингибированием активности фосфолипазы А2 [164], что сопровождается снижением синтеза эйкозатетраеновых метаболитов в антиокислительной лейкоцитах активности периферической НПВП, в крови; частности, усилением способности ингибировать процессы образования супероксиданионов в активированных фагоцитах [335]. Кроме того, при изучении регуляции оксидантных реакций в ПМЛ было выявлено, что НПВП вызывают скрытую переадаптацию (деактивацию) ПМЛ, ослабляющую чувствительность последних к вторичным стимулам [46]. Дозозависимое изменение СЛХЛ крови нами выявлено и у больных с непереносимостью НПВП. У пациентов с непереносимостью НПВП фаза стимуляции СЛХЛ крови отсутствовала, а угнетение СЛХЛ наступало при применении меньших концентраций препаратов, чем у здоровых доноров. Практически при всех используемых концентрациях НПВП СЛХЛ крови 204 больных с непереносимостью данных препаратов была достоверно (p<0,05) меньше, чем у здоровых доноров. В общем кривая изменений относительной светосуммы СЛХЛ больных была аналогична таковой здоровых доноров, но располагалась достоверно на более низком уровне. Было выявлено, что одним из механизмов ингибирования СЛХЛ крови больных под влиянием НПВП является снижение активности НАДФНоксидазы ПМЛ относительно таковой здоровых доноров. Следует отметить, что у пациентов с непереносимостью НПВП при отсутствии повышенной чувствительности к какому-либо НПВП показатели СЛХЛ крови при воздействии этого НПВП не имели достоверных отличий от аналогичных показателей здоровых доноров. Активность НАДФН-оксидазы ПМЛ у таких пациентов сходна с таковой у здоровых доноров. В следующей серии экспериментов мы исследовали влияние пищевого красителя тартразина, выступающего в роли псевдоаллергена, на СЛХЛ крови здоровых доноров и больных с непереносимостью НПВП в сочетании и без такового с непереносимостью тартразина с различными клиническими проявлениями непереносимости. Поскольку предварительно проведенные нами исследования показали, что степень подавления СЛХЛ крови под влиянием тартразина у больных с непереносимостью данного пищевого красителя не зависела от формы клинического проявления непереносимости, при исследовании СЛХЛ мы объединили всех пациентов с различными клиническими проявлениями непереносимости тартразина в одну группу. Обнаружено, что пищевой краситель тартразин, как и НПВП, модифицирует СЛХЛ крови здоровых доноров и больных с непереносимостью НПВП в сочетании или без такого с непереносимостью тартразина. Характер влияния тартразина на СЛХЛ крови больных с непереносимостью этого красителя и здоровых доноров является сходным с характером влияния НПВП на СЛХЛ крови больных с непереносимостью соответствующих препаратов и здоровых доноров, соответственно. У здоровых доноров при воздействии на 205 кровь тартразина выявлялось 2-е фазы в изменении интенсивности СЛХЛ крови: в первой фазе отсутствовали выраженные изменения СЛХЛ крови, вторая фаза характеризовалась дозозависимым угнетением СЛХЛ. У больных с непереносимостью тартразина наблюдалось выраженное подавление светосуммы СЛХЛ крови, уже начиная с минимальной концентрации красителя. При всех используемых концентрациях тартразина СЛХЛ крови больных с непереносимостью тартразина была достоверно ниже, чем у здоровых доноров. Установлено, что НАДФН-оксидаза ПМЛ не вносит вклад в реализацию ингибирования СЛХЛ крови под влиянием тартразина у всех групп исследуемых лиц. Полученные результаты свидетельствуют, что в развитие феномена ингибирования СЛХЛ крови под влиянием НПВП у пациентов с непереносимостью данных препаратов вносят вклад как НАДФН-оксидаза, так и МПО ПМЛ, в то время как подавление СЛХЛ крови под влиянием тартразина опосредуется главным образом угнетением активности МПО ПМЛ. Таким образом, нами выявлены статистически значимые различия показателей СЛХЛ крови у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью НПВП в сочетании и без такового с непереносимостью тартразина после прединкубации проб крови с данными псевдоаллергенами, что открыло возможность применения хемилюминесцентного теста для экспересс-диагностики Данный метод непереносимости указанных псевдоаллергенов. обладает рядом преимуществ перед уже существующими способами in vitro диагностики непереносимости НПВП, тартразина: вопервых, небольшой расход крови – до 100 мкл крови - на 1 пробу; во-вторых, повышение точности и объективности метода за счет полностью автоматизированного определения исследуемых параметров; в-третьих, возможность безопасного тестирования и выявления псевдоаллергенов (НПВП, тартразина и других пищевых добавок), прием которых может вызвать у пациента развитие негативных реакций; в-четвертых, возможность 206 индивидуального подбора НПВП, как препарата выбора, при необходимости применения НПВП; в-пятых, позволяет определять не только повышенную чувствительность к псевдоаллергенам (НПВП, тартразину), но и индивидуально подбирать препараты для лечения непереносимости данных псевдоаллергенов путем формирования дополнительных проб, в которые одновременно с тестируемым агентом (НПВП, тартразин) следует добавлять различные противоаллергические антисеротониновые, препараты антилейкотриеновые (антигистаминные, препараты, кромоглициевую кислоту) в концентрациях, эквивалентных средним терапевтическим дозам, и подбирать оптимальные препараты по возвращению показателей ИП СЛХЛ больных (ИП=Sхл опытной пробы (с псевдоаллергеном в смеси с противоаллергическим препаратом) / Sхл контрольной пробы (с противоаллергическим препаратом) к значениям ИП СЛХЛ здоровых доноров (ИП=Sхл опытной пробы (с псевдоаллергеном) / Sхл контрольной пробы); в-шестых, хемилюминесцентный тест прост в исполнении и весьма экономичнее современных in vitro тестов определения повышенной чувствительности к НПВП, тартразину. Данный тест был оформлен нами в виде патентной заявки «Способ диагностики in vitro повышенной чувствительности к псевдоаллергенам и подбора противоаллергической терапии» (дата поступления заявки: 22.04.2014; входящий номер: 025205; регистрационный номер: 2014116060), по которой 23.11.2015 г. вынесено положительное решение о выдаче патента на изобретение. Следует также отметить, что ранее проведенные совместно с Бондаревой Г.П. исследования (2005г.) выявили положительную корреляцию между результатами теста торможения естественной миграции лейкоцитов in vivo и хемилюминесцентного теста у пациентов с непереносимостью НПВП. Нас заинтересовал вопрос, связаны ли выявленные различия СЛХЛ крови под воздействием НПВП, тартразина у доноров и больных с их непереносимостью исключительно с влиянием на ПМЛ крови биологически 207 активных веществ (медиаторов, цитокинов) плазмы, или все же существуют какие-то особенности окислительного метаболизма ПМЛ у данной группы больных, проявляющиеся при воздействии на ПМЛ упомянутых псевдоаллергенов. Для выяснения данного вопроса мы прединкубировали образцы суспензии ПМЛ с НПВП, тартразином у пациентов с их непереносимостью и здоровых доноров. Выявлено, что суммарная продукция АФК выделенными ПМЛ, в том числе и продукция О2- , у больных с непереносимостью НПВП, тартразина не отличается от аналогичных показателей у доноров, что свидетельствует об отсутствии каких-либо особенностей в работе ферментов окислительного метаболизма, проявляющихся под воздействием используемых нами НПВП, тартразина у больных с непереносимостью данных препаратов по сравнению с донорами. Из этого можно сделать вывод, что различия в показателях СЛХЛ цельной крови больных с непереносимостью НПВП, тартразина по сравнению с донорами при прединкубации проб крови с данными псевдоаллергенами связаны с влиянием на ферменты окислительного метаболизма находящихся в плазме крови биологически активных веществ (медиаторов, цитокинов), содержание и соотношение которых различно у доноров и больных с непереносимостью НПВП, тартразина. Наше предположение хорошо соотносится с результатами экспериментальных и клинических исследований, доказывающих, что на фоне стимуляции аспирином in vitro увеличивается высвобождение сульфидолейкотриенов лимфоцитами периферической крови у пациентов с непереносимостью аспирина, по сравнению с толерантными к указанному препарату лицами [241]. Более того, при непереносимости ацетилсалициловой кислоты аспирин индуцирует синтез и высвобождение лимфоцитами периферической крови 15- гидроксиэйкозатетраеновой кислоты in vitro, стимулирует высвобождение гистамина из тромбоцитов, базофилов, тучных клеток [237]. Последнее подтверждается тем фактом, что у больных реакция на НПВП 208 нередко сопровождается увеличением гистамина в плазме крови и его выведения с мочой [67]. Наше предположение об участии биологически активных веществ в подавлении СЛХЛ цельной крови под влиянием НПВП у больных с непереносимостью данных препаратов подтверждают также ранее полученные Пыцким В.И. и соавт. [305] данные об участии гистаминового механизма в подавлении СЛХЛ крови больных с непереносимостью аспирина и/или анальгина при инкубации проб крови с салицилатом натрия или анальгином. воздействуя на По-видимому, ПМЛ, биологически способны окислительного метаболизма ПМЛ изменять активные активность вещества, ферментов и, следовательно, модифицировать СЛХЛ крови. В частности, при изучении влияния гистамина, используемого в различных концентрациях, на окислительный метаболизм ПМЛ было выявлено, что гистамин дозозависимо изменяет активность НАДФН- оксидазной и миелопероксидазной ферментных систем ПМЛ [17]. Установлено также дозозависимое модулирующее влияние серотонина на окислительный метаболизм фагоцитов [6]. Показано, что в концентрациях, превышающих физиологические, серотонин оказывает ингибирующее влияние на окислительный метаболизм фагоцитов [6], что объясняется его способностью индуцировать образование эндогенной цистионин-β- синтетазы, обеспечивающей торможение процессов генерации АФК [75]. Таким образом, показатели СЛХЛ и СЛЦХЛ выделенных ПМЛ под влиянием НПВП, тартразина не имели достоверных отличий (p>0,1) у доноров и больных с их непереносимостью, что свидетельствует об отсутствии каких-либо особенностей в работе ферментов окислительного метаболизма ПМЛ под воздействием указанных псевдоаллергенов у больных с их непереносимостью по сравнению с донорами. Для того, чтобы подтвердить, что именно плазменные факторы изменяют реакцию ПМЛ периферической крови на НПВП у больных с непереносимостью данных препаратов, мы исследовали влияние плазмы 209 больных с непереносимостью НПВП на окислительный метаболизм суспензии ПМЛ здоровых доноров. Показано, что плазма больных с непереносимостью АСК, проявляющейся реакциями со стороны органов дыхания (бронхоспазм/ринит), оказывает ингибирующее воздействие на СЛХЛ суспензии ПМЛ здоровых доноров. Причем, данный эффект был более выражен, если плазма была отобрана из проб крови больных с непереносимостью АСК, предварительно инкубированных с салицилатом натрия (3,0 мМ), по сравнению с влиянием плазмы, отобранной из проб крови больных, инкубированных с равным объемом физиологического раствора. Следовательно, плазма больных с бронхиальными проявлениями непереносимости НПВП содержит базальный уровень биологически активных веществ (медиаторов и цитокинов), оказывающих ингибирующее действие на суммарную продукцию АФК ПМЛ. Воздействие салицилата натрия на кровь больных с непереносимостью АСК сопровождается изменением соотношения биологически активных веществ в крови таким образом, что приводит к еще большему подавлению активности ферментов окислительного метаболизма ПМЛ и, следовательно, суммарной продукции АФК ПМЛ. В следующей серии экспериментов мы исследовали вклад биологически активных веществ (медиаторов, цитокинов) в реализацию феномена ингибирования СЛХЛ крови под влиянием НПВП, тартразина у больных с непереносимостью данных псевдоаллергенов. Для выяснения участия медиаторного механизма в развитии указанного феномена мы исследовали влияние блокаторов гистаминовых (клемастина, ранитидина), серотониновых (кетансерина), лейкотриеновых (зафирлукаста) рецепторов и стабилизатора мембран базофилов и тучных клеток (кромоглициевой кислоты) на вызываемое НПВП, тартразином угнетение СЛХЛ крови у больных с непереносимостью данных псевдоаллергенов с различными клиническими проявлениями непереносимости: с реакциями со 210 стороны органов дыхания (бронхоспазм, ринит)- группа 1 и с реакциями со стороны кожных покровов (крапивница/отек Квинке)- группа 2. Было сделано следующее заключение об особенностях рецепторной реализации феномена специфического ингибирования СЛХЛ крови под воздействием НПВП и тартразина у пациентов с их непереносимостью, и возможно, также о рецепторной реализации механизмов непереносимости НПВП и тартразина: Н1-гистаминовые реализацию рецепторы подавления вносят СЛХЛ крови существенный у всех вклад в пациентов с непереносимостью АСК, метамизола натрия и тартразина, а также у пациентов с непереносимостью диклофенака натрия 1 группы, причем указанные рецепторы экспрессируются в большей степени у пациентов с непереносимостью АСК 1 группы и у всех пациентов непереносимостью тартразина. У пациентов с непереносимостью диклофенака 2 группы Н1-гистаминовые рецепторы в меньшей степени опосредуют реализацию специфического подавления диклофенаком СЛХЛ крови. Н2-гистаминовые реализацию рецепторы подавления вносят СЛХЛ крови существенный у всех вклад в пациентов с непереносимостью АСК, метамизола натрия и тартразина, а также у пациентов с непереносимостью диклофенака натрия 2 группы. Следует отметить, что указанные рецепторы экспрессируются в большей степени у пациентов с непереносимостью АСК 1 группы. У пациентов с непереносимостью диклофенака натрия 1 группы Н2-гистаминовые рецепторы вносят незначительный вклад в реализацию подавления СЛХЛ крови. При этом вклад Н2-гистаминовых рецепторов у пациентов с непереносимостью метамизола натрия 1 группы, у пациентов с непереносимостью диклофенака натрия 1 группы и у всех пациентов с непереносимостью тартразина выражен в меньшей 211 степени по сравнению с вкладом Н1-гистаминовых рецепторов. У пациентов с непереносимостью метамизола натрия 2 группы и у всех пациентов с непереносимостью АСК оба типа рецепторов принимают одинаковое участие в реализации гистаминового механизма. Серотониновые 5-НТ2 рецепторы вносят существенный вклад в реализацию подавления СЛХЛ крови у всех непереносимостью метамизола натрия и тартразина, пациентов с а также у пациентов с непереносимостью АСК и диклофенака натрия 2 группы. У пациентов с непереносимостью диклофенака натрия 1 группы вклад указанных рецепторов выражен незначительно. У пациентов с непереносимостью АСК 1 группы серотониновые 5-НТ2 рецепторы не участвуют в патогенезе феномена подавления салицилатом натрия СЛХЛ крови. Цис-лейкотриеновые рецепторы (цисЛТ1R) вносят существенный вклад в реализацию подавления СЛХЛ крови у всех пациентов с непереносимостью АСК, метамизола натрия и тартразина. В большей степени указанные рецепторы экспрессируются у пациентов с непереносимостью тартразина. У пациентов с непереносимостью диклофенака натрия вклад цис-лейкотриеновых рецепторов выражен слабо. Поскольку стабилизатор мембран базофилов и тучных клеток КГК в значительной степени отменяла развитие феномена специфического ингибирования СЛХЛ крови у всех пациентов с непереносимостью АСК, метамизола натрия, тартразина, а также у пациентов с непереносимостью диклофенака натрия 2 группы, мы склонны полагать, что медиаторы базофилов в определенной мере участвуют в патогенезе наблюдаемого феномена у данных пациентов. Наиболее сильный эффект КГК наблюдался у пациентов с непереносимостью 212 тартразина 1 и 2 групп и у пациентов с непереносимостью диклофенака натрия 2 группы. У пациентов с непереносимостью диклофенака натрия 1 группы КГК оказывала слабое влияние на эффект подавления диклофенаком натрия СЛХЛ крови. Таким образом, проведенные нами исследования показали разное участие Н1- и Н2- гистаминовых, 5-НТ2 серотониновых и цисЛТ1R рецепторов в развитии феномена ингибирования СЛХЛ крови под воздействием НПВП и тартразина в зависимости от клинических проявлений непереносимости и химической природы псевдоаллергенов, что, вероятно, может свидетельствовать о разном вкладе гистаминовых, серотониновых и цислейкотриеновых рецепторов в формирование непереносимости различных псевдоаллергенов у пациентов с разными клиническими проявлениями. Взяв литературные данные о концентрациях исследуемых псевдоаллергенов, вызывающих 50% угнетение активности ЦОГ (ЕС50) [36], легко рассчитать, что обнаруженное нами разное участие Н1- и Н2- гистаминовых, 5-НТ2 серотониновых и цисЛТ1R рецепторов в развитии феномена ингибирования СЛХЛ крови под воздействием НПВП, тартразина у пациентов с их непереносимостью псевдоаллергенов, наблюдается угнетающих при использовании активность ЦОГ концентраций приблизительно в одинаковой степени: метамизол натрия (6 мкМ) угнетает активность ЦОГ на 69,0%, диклофенак натрия (6 мкМ)- на 70,6%, салицилат натрия (3 мМ)- на 75,6 %, тартразин (4 мкМ)- на 68,0%. Таким образом, обнаруженные нами различия в рецепторных механизмах у пациентов с разными клиническими проявлениями непереносимости псевдоаллергенов различной химической природы нельзя объяснить разной степенью ингибирования активности ЦОГ. Мы можем предположить возможные пути высвобождения медиаторов клеточного происхождения, модифицирующих СЛХЛ крови, под влиянием НПВП и тартразина у пациентов с их непереносимостью. 213 Пациенты с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты с реакциями со стороны органов дыхания (бронхоспазм/ринит): 1. Н1-опосредованный механизм активации и дегрануляции под воздействием тромбоцитов (существенно выражен). 2. Активация и дегрануляция тромбоцитов салицилата натрия [35;107]. 3. ЦисЛТ1R- опосредованный механизм дегрануляции базофилов (умеренно выражен) 4. Дегрануляция базофилов под влиянием салицилата натрия [34; 67] и других либераторов (умеренно выражен). Пациенты с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты с реакциями со стороны кожных покровов (крапивница/отек Квинке): 1. Н1-опосредованный механизм активации и дегрануляции под воздействием тромбоцитов (умеренно выражен) 2. Активация и дегрануляция тромбоцитов салицилата натрия [35; 107]. 3. 5-НТ2- серотонин-опосредованный механизм активации и дегрануляции тромбоцитов (умеренно выражен) 4. ЦисЛТ1R- опосредованный механизм дегрануляции базофилов (умеренно выражен) 5. Дегрануляция базофилов под влиянием салицилата натрия [34; 67] и других либераторов (умеренно выражена). Пациенты с непереносимостью метамизола натрия с реакциями со стороны органов дыхания (бронхоспазм/ринит) и кожных покровов (крапивница/отек Квинке): 1. Н1-опосредованный механизм тромбоцитов (умеренно выражен). активации и дегрануляции 214 2. Активация и дегрануляция тромбоцитов под воздействием метамизола натрия [35;107]. 3. ЦисЛТ1R- опосредованный механизм дегрануляции базофилов (умеренно выражен). 4. Дегрануляция базофилов под влиянием метамизола натрия [34; 67] и других либераторов (в частности, фактора тромбоцитов 4 и др.) (умеренно выражена). Пациенты с непереносимостью диклофенака натрия с реакциями со стороны органов дыхания (бронхоспазм/ринит): 1. Н1-опосредованный механизм активации и дегрануляции под воздействием тромбоцитов (умеренно выражен). 2. Активация и дегрануляция тромбоцитов диклофенака натрия [35;107]. 3. 5-НТ2- серотонин-опосредованный механизм активации и дегрануляции тромбоцитов (слабо выражен). 4. ЦисЛТ1R- опосредованный механизм дегрануляции базофилов (слабо выражен) 5. Дегрануляция базофилов под влиянием диклофенака [34; 67] и других либераторов (слабо выражена). Пациенты с непереносимостью диклофенака натрия с реакциями со стороны кожных покровов (крапивница/отек Квинке): 1. Н1-опосредованный механизм активации и дегрануляции тромбоцитов (слабо выражен). 2. Активация и дегрануляция тромбоцитов воздействием диклофенака [35,107]. 3. 5-НТ2- серотонин-опосредованный механизм активации и дегрануляции тромбоцитов (умеренно выражен). 4. ЦисЛТ1R- опосредованный механизм дегрануляции базофилов (слабо выражен). 215 5. Дегрануляция базофилов под влиянием диклофенака [34; 67] и других либераторов (существенно выражен). Пациенты с непереносимостью тартразина с реакциями со стороны органов дыхания (бронхоспазм/ринит) и кожных покровов (крапивница/отек Квинке): 1. Н1-опосредованный механизм активации и дегрануляции тромбоцитов (существенно выражен). 2. 5-НТ2- серотонин-опосредованный механизм активации и дегрануляции тромбоцитов (умеренно выражен). 3. ЦисЛТ1R- опосредованный механизм дегрануляции базофилов (существенно выражен). 4. Дегрануляция базофилов под влиянием тартразина [34; 67] и других либераторов (существенно выражен). Однако возможны и другие механизмы активации и дегрануляции базофилов и тромбоцитов у пациентов с непереносимостью НПВП, тартразина. В частности, базофилы при дегрануляции выделяют ТАФ, что может способствовать ТАФ-опосредованной агрегации тромбоцитов на эндотелиальных клетках и их дегрануляции с высвобождением серотонина, гистамина и других медиаторов [67]. Выделяемый базофилами и моноцитами ТАФ вызывает активацию тромбоцитов, высвобождение из них тромбоцитарного фактора 4, обладающего гистамин-высвобождающей активностью с выраженным дегранулирующим действием по отношению к базофилам [79]. Кроме того, активация и дегрануляция тромбоцитов может также происходить под влиянием нейтрофиллина, АФК, выделяемыми активированными ПМЛ [79]. Молекулы адгезии RANTES, выделяемые тромбоцитами, стимулируют высвобождение гистамина из базофилов [79]. По данным литературы, наиболее выраженное модифицирующее влияние на СЛХЛ крови оказывают гистамин и серотонин [6; 17; 55; 75; 189; 248; 268]. 216 Поскольку проведенные нами исследования показали разное участие Н1- и Н2- гистаминовых, 5-НТ2 серотониновых и цисЛТ1R рецепторов в развитии феномена ингибирования СЛХЛ крови под воздействием НПВП и тартразина в зависимости от клинических проявлений непереносимости и химической природы псевдоаллергенов, необходим индивидуальный подбор патогенетической терапии пациентам с непереносимостью указанных псевдоаллергенов различной химической природы клиническими проявлениями непереносимости. и с различными Разработанный нами объективный, быстрый, экономичный хемилюминесцентный тест in vitro диагностики повышенной чувствительности к псевдоаллергенам, в частности к НПВП, пищевому красителю тартразину позволяет определять не только повышенную чувствительность к данным псевдоаллергенам, но и подбирать оптимальные противоаллергические препараты для коррекции непереносимости НПВП и пищевых красителей. В следующей серии экспериментов мы исследовали вклад цитокинового механизма в вызываемое НПВП, тартразином угнетение СЛХЛ крови больных с непереносимостью данных псевдоаллергенов. В первой серии опытов определяли концентрации цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-8, ФНО-α, ИФН-γ и ИЛ-4 в плазме крови пациентов с непереносимостью НПВП, тартразина, проявляющейся реакциями со стороны органов дыхания (бронхоспазм/ринит), (крапивница/отек - группа1 Квинке)- группа и со 2. стороны Было кожных выявлено, что покровов уровни исследуемых цитокинов различны у пациентов с непереносимостью НПВП, тартразина разных клинических групп. Причем у пациентов 2 группы концентрации всех исследуемых цитокинов находились в пределах нормальных значений. У пациентов 1 группы выявлялось увеличение концентрации провоспалительных цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-8 и ФНО-α, в то время как концентрации противовоспалительного цитокина ИЛ-4 и 217 провоспалительного цитокина ИФН-γ находились в диапазоне нормальных значений. Повышение концентрации провоспалительных цитокинов в плазме крови пациентов 1 группы может быть связано с наличием хронического воспалительного процесса в слизистой оболочке бронхов. Умеренное повышение уровня провоспалительных цитокинов у данных пациентов, вероятно, связано с тем, что пациенты находились в периоде ремиссии хронического бронхита и астмы. У пациентов 2 группы и здоровых доноров в силу отсутствия воспалительного процесса в организме концентрации провоспалительных цитокинов находились в пределах нормы. Следует отметить, что ИЛ-1β- иммунорегуляторный цитокин, выделяемый при воспалительных реакциях, тканевых поражениях и инфекциях. Основным источником ИЛ-1β преимущественно являются активированные мононуклеарные фагоциты. Продукцию ИЛ-1β стимулируют бактериальные продукты, ФНО, сам ИЛ-1, а также контакт с CD4+Т-лимфоцитами. Это основной медиатор воспалительных реакций. Вместе с АГ ИЛ-1 запускает иммунные процессы, активирует Т-хелперы и выработку ими ИЛ-2, увеличивает на Т-клетках экспрессию рецептора для ИЛ-2, индуцирует активацию и адгезию ПМЛ, стимулирует образование других цитокинов (ИЛ2, ИЛ-3, ИЛ-6 и КСФ) активированными Т-лимфоцитами и другими клетками, активирует пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов. Системно ИЛ-1 действует синергически с ФНО-α и ИЛ-6. При значительном повышении концентрации ИЛ-1 в крови вызывает лихорадку, сонливость, снижение аппетита, увеличение продукции гепатоцитами белков острой фазы [62; 77]. ИЛ-8 синтезируется преимущественно активированными мононуклеарными фагоцитами. ИЛ-8 является хемокином, вызывающим направленную миграцию (хемотаксис) лейкоцитов в очаг воспаления [62; 77]. Воздействие 218 ИЛ-8 приводит также к экзоцитозу ферментов из нейтрофилов путем дегрануляции, а также продукцию АФК [98]. ФНО-α синтезируется преимущественно активированными мононуклеарными фагоцитами, а также лимфоцитами, эозинофилами, тучными клетками, базофилами [62; 77] и обладает провоспалительным эффектом. Местно ФНО-α вызывает экспрессию молекул адгезии на поверхности эндотелиальных клеток микрососудов, способствуя тем самым миграции лейкоцитов (нейтрофилов, мононуклеарных фагоцитов, эозинофилов) из крови в очаг воспаления. ФНО-α оказывает праймирующее действие на фагоциты к продукции последними АФК [48; 62; 77]. ФНО-α стимулирует рост NK, усиливает их цитотоксичность. При значительном повышении уровня ФНО-α в крови он, подобно гормону, оказывает системное стимулирует действие: вызывает продукцию лихорадку, цитокинов (ИЛ-1, регулирует ИЛ-6, стадии ИЛ-8, сна, ИФН-γ) мононуклеарными фагоцитами и другими клетками, увеличивает синтез сывороточных белков острой фазы гепатоцитами, активирует систему свертывания крови, подавляет деление стволовых клеток костного мозга, активирует липолиз. Введение ФНО может провоцировать астматический приступ [62; 77]. Обнаруженный нами относительно низкий уровень провоспалительного цитокина ИФН-γ в плазме крови пациентов с АТ может быть обусловлен следующими факторами: - отсутствием острых вирусных инфекций у исследуемых нами пациентов с АТ; - наличием хронических вирусных инфекций, при которых снижение выработки интерферонов может быть обусловлено истощением функциональной активности лейкоцитов к синтезу данных цитокинов (истощением интерферон-синтетической активности лейкоцитов); 219 - угнетением NO активности Т-хелперов 1 (Th1), продуцирующих ИФН-γ и другие цитокины [138]; - ингибирующим действием NO на продукцию ИФН-γ Th1-клетками [258; 278]; - снижением образования лейкоцитами периферической крови пациентов с аспириновой астмой ПГЕ2 [178], усиливающего продукцию ИФН-γ и других цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ФНО-, ГМ-КСФ) [74]. С другой стороны, в плазме крови здоровых людей и пациентов с крапивницей/отеком Квинке низкий уровень ИФН-γ связан с отсутствием выраженной антигенной противовоспалительного стимуляции. цитокина Выявляемый ИЛ-4 у всех низкий уровень пациентов с непереносимостью НПВП, тартразина и здоровых доноров указывает на отсутствие активации Т-хелперов 2 (Тh2) у большинства исследуемых лиц. Поскольку ИЛ-4- основной цитокин, который стимулирует переключение синтеза иммуноглобулинов на IgE изотип [77], усиленная продукция ИЛ-4 активированными Тh2, тучными клетками, базофилами и др. клетками наблюдается при аллергии. Для того, чтобы определить участие цитокиновых механизмов в реализации феномена ингибирования СЛХЛ крови под воздействием НПВП, тартразина, мы определяли концентрации различных цитокинов в пробах плазмы, полученных после прединкубации образцов крови с НПВП, тартразином. Было выявлено, что прединкубация образцов крови с НПВП, тартразином сопровождается тенденцией к увеличению уровня цитокинов в плазме крови обеих групп пациентов, особенно выраженной во второй группе пациентов. Последнее, вероятно, связано с большей чувствительностью клеток (базофилов и др.) к действию ирритантов (псевдоаллергенов) у пациентов 2 группы. Следует отметить, что салицилат, метамизол, диклофенак натрия и тартразин по-разному влияют на уровень исследуемых цитокинов у пациентов с различными клиническими проявлениями, что может быть 220 связано с тем, что имеются различия во влиянии данных псевдоаллергенов различной химической природы на разные субпопуляции лейкоцитов периферической крови. Диклофенак натрия не оказывал существенного влияния на выброс исследуемых цитокинов из клеток, что, вероятно, связано с меньшей чувствительностью клеток к его влиянию. Последнее перекликается с тем фактом, что непереносимость диклофенака встречается значительно реже, чем непереносимость аспирина и метамизола натрия [56]. По-видимому, некоторое увеличение концентрации исследуемых цитокинов под влиянием НПВП и тартразина в крови пациентов с их непереносимостью связано с дегрануляцией базофилов под воздействием указанных агентов, что сопровождается высвобождением из базофилов не только медиаторов, но и цитокинов. Известно, что базофилы продуцируют и выделяют ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-3, ИЛ-5, MIP-1α, ГМ-КСФ, ФНО, RANTES, ИФН-γ [79]. Активаторами синтеза и секреции цитокинов базофилами могут быть медиаторы воспаления, такие как компоненты комплемента С5а, С3а, С4а, главный основной протеин, ТАФ, хемокины (ИЛ-8, RANTES), монокины (ИЛ-1, ФНО), а также связывание антигеном поверхностных IgE. Кроме того, базофилы могут быть напрямую активированы посредством патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMP) [79]. У пациентов с АТ практически все вышеперечисленные активаторы могут стимулировать базофилы к синтезу цитокинов в силу наличия у них хронического бронхита, а у некоторых пациентов- атопии (при неинфекционно-аллергической и смешанной форме БА). У пациентов с крапивницей/отеком Квинке медиаторы воспаления, PAMP и провоспалительные цитокины могут выступать в качестве активаторов базофилов к синтезу цитокинов при наличии воспалительного процесса в организме. Также не исключена активация базофилов данных лиц при 221 специфическом связывании каким-либо антигеном поверхностных IgE, что возможно для лиц с атопией. Однако мы не можем исключать, что помимо базофилов и другие лейкоциты могут высвобождать цитокины под влиянием НПВП in vitro. Имеются сообщения об увеличении хемотаксической активности ПМЛ больных с аспириновой астмой и с аспирин-чувствительной крапивницей после провокации аспирином, что может сопровождаться их дегрануляцией [128]. Известно, что провоспалительные цитокины оказывают праймирующее влияние к продукции фагоцитами АФК, что сопровождается увеличением ХЛ при воздействии вторичных стимулов [8; 31; 48, 66; 71; 99; 141; 146; 174; 269]. Противовоспалительные цитокины, напротив, оказывают ингибирующее влияние на ХЛ фагоцитов [48; 49; 58; 205; 215]. У пациентов с непереносимостью НПВП, тартразина обеих групп под влиянием салицилата, метамизола натрия и тартразина на кровь происходит незначительное увеличение уровня провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-8, ФНО-α и ИФН-γ), что может в некоторой степени предстимулировать фагоциты к увеличению выработки АФК при воздействии вторичных стимулов. Однако мы наблюдаем феномен ингибирования СЛХЛ крови под влиянием НПВП, тартразина у пациентов с их непереносимостью, что свидетельствует о том, что исследуемые провоспалительные цитокины не принимают участия в реализации указанного феномена у данных больных. Вместе с тем, у пациентов 2 группы под влиянием салицилата, метамизола натрия и тартразина происходит достоверное увеличение уровня противовоспалительного цитокина ИЛ-4, что может вносить вклад в развитие феномена ингибирования СЛХЛ крови, вызываемого НПВП, тартразином. Однако учитывая низкую концентрацию ИЛ-4 в крови данных пациентов, вклад ИЛ-4 в реализацию указанного феномена незначительный. Таким образом, после изучения уровня цитокинов нами был сделан вывод, что основной вклад в развитие феномена ингибирования СЛХЛ 222 крови под влиянием НПВП, тартразина у пациентов с их непереносимостью вносят медиаторные механизмы. Как уже указывалось в главе «Обзор литературы», у всех больных с АТ выявлено разнообразие штаммов возбудителей острой и хронической инфекции дыхательных путей и доказано, что бактериальная, хламидийная, микоплазменная, вирусная и грибковая флора могут быть причиной обострения не только воспаления дыхательных путей, но и основных проявлений АТ - БА и ПРС [10]. У большинства больных с АТ чаще отмечаются обострения инфекционного процесса как местной, так и системной локализации, обострения очагов хронической инфекции и наличие признаков вторичного иммунодефицитного состояния [10]. При изучении показателей иммунограммы больных с АТ существенных изменений не выявлено. Однако описан дефицит секреторного IgA в назальном секрете, а также наличие высоких уровней специфических иммуноглобулинов к возбудителям хронической внутриклеточной инфекции [9]. Вместе с тем, по нашему мнению, частые инфекционные осложнения у пациентов с АТ могут свидетельствовать о нарушении функциональной активности ПМЛ, в частности способности последних к адекватному осуществлению реакций «дыхательного взрыва» при их взаимодействии с внешними факторами (например, микроорганизмами и др.). Известно, что «дыхательный взрыв» сопровождается вспышкой ХЛ. В связи с этим ХЛ в настоящее время широко используют для оценки функционального состояния ПМЛ [15]. Для оценки фагоцитарной активности ПМЛ в следующей серии опытов мы определяли суммарную продукцию АФК ПМЛ цельной крови и суспензии выделенных ПМЛ методом стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой хемилюминесценции у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью НПВП с разными клиническими проявлениями. 223 Было выявлено, что суммарная продукция АФК ПМЛ периферической крови различна у пациентов с непереносимостью НПВП разных клинических групп. Для пациентов с АТ характерно снижение суммарной продукции АФК выделенными ПМЛ на 17,5%, ПМЛ в составе цельной крови – на 33% по сравнению со здоровыми донорами (p<0,05), что может свидетельствовать о нарушении окислительного метаболизма и, следовательно, функциональной активности ПМЛ у данной группы пациентов. Более выраженное снижение суммарной продукции АФК ПМЛ цельной крови по сравнению с таковой выделенными ПМЛ у пациентов с АТ, вероятно, связано с супрессирующим влиянием на люминол-зависимую ХЛ ПМЛ биологически активных веществ (медиаторов), находящихся в цельной крови больных. У пациентов с хронической псевдоаллергической крапивницей, обостряющейся после приема НПВП, не обнаруживается существенных изменений суммарной продукции АФК ПМЛ по сравнению с группой здоровых доноров. В следующей серии опытов мы определяли также продукцию О2выделенными ПМЛ и ПМЛ в составе цельной крови методом стимулированной сульфатом бария люцигенин-зависимой ХЛ у больных с непереносимостью НПВП разных клинических групп и здоровых доноров. Было выявлено, что продукция О2- ПМЛ периферической крови различна у пациентов с непереносимостью НПВП разных клинических групп. Для пациентов с АТ характерно снижение продукции О2- выделенными ПМЛ на 27%, ПМЛ в составе цельной крови – на 23% по сравнению со здоровыми донорами (p<0,05), что косвенно свидетельствует об угнетении активности НАДФН-оксидазы ПМЛ у этих больных. У пациентов с хронической псевдоаллергической крапивницей/отеком Квинке, обостряющейся после приема НПВП, не обнаруживается существенных изменений суммарной не 224 обнаруживается существенных изменений продукции О2- ПМЛ по сравнению с группой здоровых доноров. Таким образом, несмотря на повышение уровня провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ФНО-α), обладающих выраженным праймирующим действием на окислительный метаболизм фагоцитов [48], а также повышение уровня ИЛ-8, индуцирующего продукцию АФК ПМЛ [98], суммарная продукция АФК, в том числе и продукция О2- снижена у пациентов с АТ. При изучении механизмов праймирующего действия комплекса провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ФНО-α, ИФН-γ) на окислительный метаболизм фагоцитов Никанкиной Л.В. и соавт. [48] было обнаружено: вопервых, увеличение активности НАДФН-оксидазы в процессе прайминга комплексом цитокинов, что свидетельствует о сборке фермента НАДФНоксидазы; во-вторых, увеличение внутриклеточного кальция более, чем в 4 раза в макрофагах, праймированных комплексом цитокинов. Мы склонны полагать, что снижение продукции АФК фагоцитами периферической крови у пациентов с АТ связано со снижением активности НАДФН-оксидазы фагоцитов, что может происходить в результате нарушения сборки данного фермента в процессе прайминга. Известно, что ИЛ-4 блокирует продукцию О2- и ПГЕ2 фагоцитами [77]. У пациентов с АТ в силу низкого уровня ИЛ-4 отсутствует ингибирующее действие ИЛ-4 на продукцию О2-. Вместе с тем, продукция О2- у пациентов с АТ снижена, что по-видимому, связано со снижением активности НАДФНоксидазы ПМЛ. Показано, что в организме фагоциты могут находиться в двух хорошо различимых состояниях: исходном и активированном, характерном для многих воспалительных заболеваний. Переход фагоцитов из одного состояния в другое протекает через промежуточную стадию, получившую название «прайминга». Суть данного эффекта заключается в том, что 225 воздействие праймирующего непосредственной агента активации, а на клетку вызывает не приводит развитие к ее повышенной функциональной готовности клетки, что влечет за собой усиление интенсивности ответа (повышенную продукцию АФК) на последующее добавление этого же или другого стимула [33]. На сегодняшний день описано много праймирующих стимулов для лейкоцитов, среди которых есть микроорганизмы и их отдельные компоненты [91]. Возможно, что от способности фагоцитов к праймингу зависит адекватный ответ последних на инфекционную нагрузку. Из полученных нами результатов видно, что у пациентов с АТ наблюдаются нарушения окислительного метаболизма в ПМЛ крови, проявляющиеся в снижении фагоцитарной активности и активности НАДФН-оксидазы ПМЛ, что может свидетельствовать о наличии дефектов в работе кислородозависимых ферментных систем ПМЛ крови у таких больных. Для подтверждения данных заключений исследовали способность ПМЛ крови к праймингу при воздействии комплексного антигенного препарата Staphylococcus aureus у больных с АТ и здоровых доноров. Выбор Staphylococcus aureus в качестве бактериального АГ был не случайным. В настоящее время широко обсуждается роль Staphylococcus aureus в этиологии и патогенезе полипозного риносинусита больных с бронхиальной астмой. Van Zele и соавт. [355] в своей работе показали, что наличие у пациента с полипозным риносинуситом непереносимости аспирина и БА повышает распространенность стафилококковой колонизации слизистой оболочки носовых путей до 87,5%, при этом IgE-антитела к стафилококковым энтеротоксинам обнаруживают в 80% случаев. Также установлено, что уровень колонизации золотистого стафилококка в среднем носовом ходе у пациентов с полипозом носа прямо пропорционален содержанию специфических IgE-антител к его энтеротоксинам [281]. 226 Было выявлено, что АГ Staphylococcus aureus оказывают праймирующее влияние на выработку АФК ПМЛ цельной крови и выделенными ПМЛ у здоровых доноров. Одним из механизмов такого влияния является увеличение активности НАДФН-оксидазы ПМЛ. У пациентов с АТ в стадии ремиссии, не сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами, наблюдается снижение праймирующего влияния АГ Staphylococcus aureus на выработку АФК ПМЛ цельной крови и выделенными ПМЛ по сравнению с донорами. Одним из механизмов подавления эффекта прайминга у данных пациентов является снижение активности НАДФН-оксидазы ПМЛ, что, вероятно, связано с нарушением сборки данного фермента в процессе прайминга. У пациентов с стафилококковыми специфическим АТ в стадии энтеротоксинами, аллергеном ремиссии, сенсибилизированных прединкубация (Staphylococcus проб aureus) крови со сопровождается значительным увеличением продукции АФК ПМЛ по сравнению со здоровыми донорами. Выраженная стимуляции продукции АФК ПМЛ крови под влиянием специфического бактериального аллергена не связана с повышением активности НАДФН-оксидазы ПМЛ, поскольку активность данного фермента у этих больных снижена по сравнению с таковой здоровых доноров. Увеличение светосуммы СЛХЛ крови под действием специфического аллергена (энтеротоксины Staphylococcus aureus) у больных с АТ в стадию ремиссии, сенсибилизированных АГ Staphylococcus aureus, в определяющей степени связано с активацией МПО ПМЛ. Эти результаты несколько отличаются от ранее полученных нами данных, когда у больных с поллинозом и атопической бронхиальной астмой в стадии ремиссии стимуляция СЛХЛ крови после предварительной инкубации проб крови со специфическим аллергеном была в значительной степени связана с увеличением активности НАДФН-оксидазы ПМЛ [20]. 227 Выраженные различия СЛХЛ крови больных с АТ, сенсибилизированных энтеротоксинами стафилококка, и здоровых доноров открывает возможность применения метода стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой ХЛ в качестве диагностического теста для определения специфической сенсибилизации организма к бактериальным аллергенам. Данный тест был оформлен нами в виде патентной заявки. Как уже указывалось в главе «Обзор литературы», у больных БА в выдыхаемом воздухе выявляется значительное повышение содержания NO по сравнению с таковым у здоровых людей [37; 95]. Известно, что повышение уровня NO в выдыхаемом воздухе зависит от наличия воспалительных изменений в бронхах, которые влияют на активность индуцибельной NO-синтазы (iNOS) [37;60]. При обострении БА имеется параллельное увеличение количества выдыхаемого NO и активности iNOS [37]. Кроме того, Parikh A. et. al. [210] в своих исследованиях определили более высокий уровень активности iNOS в эпителии носовых полипов у пациентов с АТ по сравнению с таковым у пациентов с полипозом носа и БА без непереносимости аспирина. Между тем, до настоящего времени неизвестно, существует ли зависимость между степенью подавления СЛХЛ крови под влиянием НПВП у больных с АТ и уровнем активности iNOS. Для получения ответа на данный вопрос определяли активность iNOS лейкоцитов периферической крови у больных с АТ, атопической формой БА без ПРС и непереносимости НПВП и здоровых доноров. Активность iNOS лейкоцитов косвенно оценивали по уровню стабильных конечных метаболитов NO (нитратов, нитритов) в пробах. Доказано, что активность iNOS фагоцитов повышена у больных с АТ по сравнению с другими группами лиц. В стадию обострения хронического бронхита и астмы активность iNOS выше, чем в стадию ремиссии. Повышение продукции NO фагоцитами больных с АТ можно объяснить следующим образом. Известно, что ИЛ-4 обеспечивает развитие Тh2 из 228 предшественников, ингибирует активацию макрофагов и блокирует многие эффекты, стимулированные ИФН-γ, такие как продукция ИЛ-1, NO и простагландинов [77]. Кроме того, оказалось, что ИЛ-4 способен угнетать базальный синтез NO моноцитами, способными синтезировать большое количество нитритов, но активирует синтез NO в культуре малопродуцирующих моноцитов [208; 209]. Эти данные указывают на то, что ИЛ-4 может быть как индуктором, так и ингибитором синтеза NO моноцитами, и его действие зависит от степени активации клеток мишеней. [93]. Также сообщается об активирующем действии ИЛ-4 на активность фермента аргиназы в фагоцитах [266], что сопровождается снижением продукции NO. Таким образом, выявленное нами увеличение образования NО фагоцитами пациентов с АТ в фазу ремиссии обусловлено индукцией синтеза NО провоспалительными цитокинами (ИЛ-1β, ФНО-α), синтез которых повышен у данных пациентов, а также бактериальными эндотоксинами. Низкий уровень ИЛ-4 также способствует увеличению выработки NО активированными фагоцитами у пациентов с АТ. У пациентов с АТ в фазу обострения, по данным Шагаровой С.Г. и соавт. [96], индукторами продукции NО активированными фагоцитами могут быть провоспалительные цитокины ИЛ-1β, ИФН-γ и ФНО-α, уровень которых резко увеличен в сыворотке периферической крови таких пациентов, а также бактериальными эндотоксинами. Концентрация ИЛ-4 в сыворотке крови этих пациентов также не имела достоверных отличий от таковой здоровых доноров. В следующей серии опытов мы инкубировали культуру лейкоцитов здоровых доноров и больных БА с НПВП разных химических групп. Было выявлено умеренное подавление продукции NO фагоцитами под влиянием НПВП у всех групп исследуемых лиц, однако степень подавления продукции NO под влиянием НПВП существенно не различалась у всех исследуемых групп лиц. Из этого следует, что уровень активности iNOS фагоцитов изменяется 229 сходным образом под влиянием НПВП у здоровых доноров и у всех пациентов с БА вне зависимости от фазы течения заболевания и наличия непереносимости НПВП. Ингибирующее действие НПВП на продукцию NO активированными фагоцитами, может быть связано с тем, что НПВП подавляют синтез мРНК iNOS [27;330], а также ингибируют образование провоспалительных цитокинов, стимулирующих активность iNOS [279; 339]. Также можно предположить, что одной из причин установленного ранее нами снижения суммарной продукции АФК, а также продукции О2- ПМЛ у пациентов с АТ является повышение активности iNOS ПМЛ, в результате чего образующийся в большом количестве NO угнетает активность НАДФН-оксидазы и образование Н2О2 и ОН• [80], что сопровождается подавлением люминол-зависимой ХЛ крови. Кроме того, под действием NO происходит снижение люцигенин-зависимой ХЛ в результате прямого связывания NO супероксидными радикалами, образуемыми в митохондриях [2]. Учитывая, что активность iNOS фагоцитов несколько выше у пациентов с обострением воспалительного процесса в бронхах по сравнению с таковыми в ремиссии, мы посчитали целесообразным сравнить показатели относительной светосуммы СЛХЛ крови у пациентов с АТ в фазу обострения хронического бронхита и БА по сравнению с пациентами в фазу ремиссии. Выявлено, что отсутствует зависимость относительной светосуммы СЛХЛ от фазы течения воспалительного процесса в бронхах и, следовательно, от уровня активности iNOS фагоцитов. Таким образом, мы склонны полагать, что ингибирование СЛХЛ крови под влиянием НПВП у больных с АТ, имеющих непереносимость соответствующих НПВП, не связано с повышением активности iNOS фагоцитов. Однако при обострении БА имеется пaрaллельное увеличение количествa выдыхаемого NO, aктивности iNOS, а также высокотоксичного пероксинитритa [37]. При воспaлении происходит избыточное нaкопление 230 NO в результaте aктивации iNOS. Это в свою очередь приводит к увеличению продуктов метaболизмa NO – сильнейших оксидaнтовпероксинитритного aниона, пероксинитритной кислоты, приводящих к ОН•, обрaзованию инициирующего процесс перекисного окисления клеточных мембран. У больных БА нaкопление токсичных свободных рaдикалов приводит к усугублению процессa воспaления дыхательных путей за счет увеличения сосудистой проницaемости, появления воспaлительного отекa [37]. Следует отметить, что благоприятные условия для усиления свободнорадикальных процессов и готовность к обострению воспаления создает также первичное угнетение антиоксидантной системы у больных с АТ, в частности, снижение активности внутриклеточных антиоксидантных металлоэнзимов (супероксиддисмутазы и каталазы), что особенно выражено в фазу обострения процесса [81]. Кроме того, высокие концентрaции NO в эпителиaльных или воспaлительных клеткaх, обрaзующиеся под воздействием цитокинов или эндотоксинов, могут подaвлять aктивность конститутивной NO-синтaзы (kNOS) и угнетaть aктивность рaстворимой гуaнилaтциклaзы, что приводит к уменьшению продукции циклического гуaнозинмонофосфaтa, увеличению содержaния внутриклеточного Ca2+ и в конечном счете к бронхоспaзму [37]. Таким образом, NO, произведенный в физиологических количествaх kNOS, нaпрaвлен нa поддержание определенного тканевого рaвновесия, в то время кaк NO, являющийся продуктом iNOS, усиливaет воспaлительные изменения в дыхательных путях при БА и, следовaтельно, повышает гиперреaктивность бронхов [137]. Поэтому, очевидно, что повышение aктивности iNOS эпителиальных клеток и фагоцитов связано с выраженностью клинических проявлений бронхиальной астмы. Значительное возрастание активности iNOS в фазу обострения хронического бронхита у больных с АТ способствует повышению гиперреактивности бронхов, что сопровождается увеличением 231 тяжести приступов экспираторного диспноэ на любые специфические и неспецифические раздражители, в том числе НПВП. В следующей серии опытов исследовали, как влияет давность возникновения непереносимости НПВП, тартразина на степень угнетения СЛХЛ крови под влиянием данных псевдоаллергенов у пациенов с их непереносимостью с различными клиническими проявлениями. Было выявлено, что степень подавления СЛХЛ крови под влиянием НПВП, тартразина у пациентов с их непереносимостью зависит от времени, прошедшего с момента возникновения указанной непереносимости. У пациентов с бронхиальными проявлениями непереносимости НПВП, тартразина степень подавления относительной светосуммы СЛХЛ крови возрастает при увеличении длительности существования указанной непереносимости. У пациентов только с кожными проявлениями непереносимости НПВП, тартразина (крапивница/отек Квинке) степень подавления СЛХЛ крови снижается при увеличении давности псевдоаллергенов. Мы возникновения можем непереносимости предположить следующее данных объяснение полученным результатам. Установлено, что ведущим патогенетическим звеном псевдоаллергической крапивницы, в том числе крапивницы в связи с повышенной чувствительностью к НПВП, тартразину, является нарушение функции гепатобилиарной системы в изолированном виде или в сочетании с заболеваниями желудочно-кишечного тракта [34; 67]. Вместе с тем, у пациентов с псевдоаллергической крапивницей нередко выявляется повышенная чувствительность базофилов, тучных клеток и ряда других клеток к различным ирритантам, в том числе НПВП, тартразину, что сопровождается высвобождением из них медиаторов [34; 67]. Кроме того, у пациентов с хронической крапивницей и непереносимостью НПВП также, как и у пацинетов с аспириновой астмой базальный уровень ЛТЕ4 повышен, при этом уровень последнего значительно увеличивается в ответ на прием 232 аспирина [213; 264]. Нарушение функции гепатобилиарной системы сопровождается нарушением инактивации медиаторов: снижением связывания гистамина белками плазмы крови у таких больных, а также уменьшением синтеза гепатоцитами ферментов, инактивирующих медиаторы, в частности, гистамин, другие биогенные амины. Сложение этих нарушений обычно приводит к развитию крапивницы при приеме НПВП, тартразина у таких больных. Мы склонны полагать, что снижение ингибирования СЛХЛ крови под влиянием НПВП, тартразина при увеличении давности существования их непереносимости у пациентов с псевдоаллергической крапивницей, возможно, связано с нормализацией функции гепатобилиарной системы с течением времени и, следовательно, увеличением мощности инактивирующих медиаторы механизмов. В частности, увеличением в плазме крови белков и гликопротеинов, связывающих медиаторы (в первую очередь гистамин), в результате чего снижается влияние последних на окислительный метаболизм ПМЛ. Для пациентов с бронхиальными проявлениями непереносимости НПВП, тартразина, мы можем предложить следующее объяснение эффекту возрастания ингибирования СЛХЛ крови под влиянием НПВП, тартразина при увеличении давности развития непереносимости НПВП, тартразина. У пациентов с аспириновой астмой в слизистой оболочке дыхательных путей обнаруживается большое количество тучных клеток [124; 180]. Дегрануляция тучных клеток обеспечивает повышение в сыворотке крови базальных уровней их медиаторов, в частности триптазы, стабильных метаболитов простагландина D2, гистамина [288]. Значительное увеличение количества тучных клеток связано с активной выработкой эпителиальными клетками назальных полипов фактора стволовых клеток (SCF), отвечающего за дифференцировку, хемотаксис, выживание и активацию тучных клеток [124]. Вместе с тем, у больных с аспириновой астмой также отмечается повышенная чувствительность тучных клеток, базофилов, тромбоцитов и 233 ряда других клеток к действию различных раздражителей, включая НПВП, тартразин [35; 70], что сопровождается дегрануляцией клеток с выбросом цитотоксических и провоспалительных медиаторов. Последнее сопровождается изменением хемилюминесценции крови. Кроме того, нами было установлено снижение фагоцитарной активности ПМЛ периферической крови данных больных, а также снижение способности ПМЛ к праймингу под воздействием бактериальных антигенов [67]. Доказано, что одним из механизмов упомянутых нарушений функциональной активности ПМЛ является подавление активности НАДФН-оксидазы ПМЛ [67]. Мы предполагаем, что подавление активности НАДФН-оксидазы ПМЛ может быть обусловлено наследственным дефектом работы данной ферментной системой. Однако нельзя исключать также угнетающее влияние глюкокортикостероидных гормонов (ГКС), применяемых для лечения аспириновой астмы, на ферменты окислительного метаболизма ПМЛ [16; 46]. Таким образом, у данных пациентов в опытных пробах крови повышен уровень медиаторов, как базальный, так и стимулированный (при воздействии НПВП, тартразина). Медиаторы угнетают активность ферментов окислительного метаболизма ПМЛ у данных больных, что в условиях нарастающего снижения активности НАДФН-оксидазы ПМЛ в результате частых обострений хронического бронхита и астмы (снижается функциональная активность ПМЛ), а также под влиянием регулярной терапии ГКС будет сопровождаться более выраженным подавлением светосуммы СЛХЛ крови под влиянием НПВП, тартразина по мере увеличения времени, прошедшего от начала заболевания. Однако мы не можем также исключать возможное изменение экспрессии рецепторов для медиаторов на ПМЛ у больных с АТ. Таким образом, в результате проведенного исследования нами были описаны новые механизмы ингибирования СЛХЛ крови под влиянием псевдоаллергенов (НПВП и пищевых красителей) у пациентов с их 234 непереносимостью. Доказано, что основной механизм реализации данного феномена- медиаторный, причем Н1- и Н2- гистаминовые, 5-НТ2 серотониновые и цисЛТ1R рецепторы вносят разный вклад в зависимости от химической природы псевдоаллергена и клинических проявлений непереносимости. Полученные в работе сведения позволили разработать in vitro тест для определения непереносимости псевдоаллергенов (НПВП, тартразина), а также подбора индивидуальной патогенетической терапии. 235 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, полученные результаты показали, что существуют особенности оксидантной активности фагоцитов периферической крови у больных с непереносимостью НПВП. Так, при изучении суммарной продукции АФК ПМЛ периферической крови, в том числе продукции О2ПМЛ, было выявлено что продукция АФК ПМЛ различна у пациентов с непереносимостью НПВП разных клинических групп. У пациентов с АТ наблюдалось снижение суммарной продукция АФК ПМЛ, в том числе продукции О2- ПМЛ, по сравнению со здоровыми донорами. Поскольку генерируемый ПМЛ О2- является продуктом активности НАДФН-оксидазы ПМЛ, активность последней мы косвенно оценивали по количеству образовавшегося О2-, регистрируемого методом СЛЦХЛ. Снижение продукции О2- ПМЛ позволило сделать заключение о снижении активности НАДФН-оксидазы ПМЛ у больных с АТ. У пациентов с хронической псевдоаллергической крапивницей/отеком Квинке, обостряющейся после приема НПВП, не обнаруживается существенных изменений продукции АФК ПМЛ по сравнению со здоровыми донорами. Выявленные нарушения оксидантной активности ПМЛ больных с АТ нацелило нас исследовать способность ПМЛ данных пациентов к праймингу. В качестве праймирующего агента был использован комплекс антигенов Staphylococcus aureus. Оказалось, что у пациентов с АТ в стадии ремиссии, не сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами, наблюдается снижение праймирующего влияния антигенов Staphylococcus aureus на суммарную выработку АФК ПМЛ цельной крови и выделенными ПМЛ, в том числе и продукцию О2- ПМЛ, по сравнению со здоровыми донорами, несмотря на повышение у этих пациентов уровня провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ФНО-α, ИЛ-8), которые обладают выраженным праймирующим действием на окислительный метаболизм фагоцитов. Мы 236 склонны полагать, что снижение продукции АФК фагоцитами периферической крови у пациентов с АТ при праймировании АГ Staphylococcus aureus связано со снижением активности НАДФН-оксидазы фагоцитов, что может происходить в результате нарушения сборки данного фермента в процессе прайминга, возможно, обусловленное наличием генетических дефектов в ПМЛ у данных больных. У пациентов с стафилококковыми специфическим АТ в стадии энтеротоксинами, аллергеном ремиссии, сенсибилизированных прединкубация aureus) (Staphylococcus проб крови со сопровождается значительным увеличением продукции АФК ПМЛ крови по сравнению со здоровыми донорами (p<0,05). Однако активность НАДФН-оксидазы ПМЛ у этих больных снижена по сравнению с таковой у здоровых доноров (p<0,05). Следующим этапом нашего исследования стало изучение влияния НПВП, являющихся псевдоаллергенами, на СЛХЛ крови пациентов с непереносимостью данных препаратов. Было выявлено, что НПВП оказывают дозозависимое модифицирующее влияние на СЛХЛ цельной крови здоровых доноров и препаратов. У здоровых пациентов с непереносимостью данных доноров малые концентрации препаратов стимулируют СЛХЛ крови, при увеличении концентрации препаратов развивается угнетение СЛХЛ. У пациентов с непереносимостью НПВП фаза стимуляции СЛХЛ крови отсутствует, а угнетение СЛХЛ наступает при применении меньших концентраций препаратов и выражено в большей степени, чем у здоровых доноров (p<0,05). Следует отметить, что у пациентов с непереносимостью НПВП при отсутствии повышенной чувствительности к какому-либо НПВП показатели СЛХЛ крови при воздействии этого НПВП не имеют достоверных отличий от аналогичных показателей здоровых доноров. Из литературы известно также, что непереносимость НПВП нередко сочетается с непереносимостью пищевых красителей, в частности 237 тартразина [34; 67]. Напрашивался вопрос, будут ли возникать изменения СЛХЛ крови под влиянием пищевых красителей у пациентов с их непереносимостью, аналогичные изменениям СЛХЛ под влиянием НПВП, а также каковы механизмы возможных изменений СЛХЛ, и существуют ли общие механизмы изменения СЛХЛ крови под влиянием пищевых красителей и НПВП? В связи с этим возникла необходимость изучить общие закономерности изменения продукции АФК ПМЛ периферической крови под влиянием тартразина, выступающего в роли псевдоаллергена, у больных с его непереносимостью разных клинических групп, а также механизмы этих изменений. Было выявлено, что пищевой краситель тартразин модифицирует СЛХЛ крови здоровых доноров и больных с непереносимостью НПВП в сочетании или без такого с непереносимостью тартразина. У здоровых доноров при воздействии на кровь тартразина выявляется две фазы в изменении СЛХЛ крови: в первой фазе отсутствуют выраженные изменения СЛХЛ, во второй фазе наблюдается дозозависимое угнетение СЛХЛ. У больных с непереносимостью тартразина выявлено выраженное подавление СЛХЛ крови, начиная с минимальной концентрации красителя. При всех используемых концентрациях тартразина СЛХЛ крови больных с непереносимостью тартразина ниже, чем у здоровых доноров (p<0,05). При изучении вклада НАДФН-оксидазы ПМЛ в развитие феномена ингибирования СЛХЛ крови под влиянием исследуемых псевдоаллергенов (НПВП, тартразина) ингибирования СЛХЛ было крови выявлено, под что влиянием одним НПВП из у механизмов больных с непереносимостью данных препаратов является снижение активности НАДФН-оксидазы ПМЛ относительно таковой здоровых доноров. Вместе с тем, НАДФН-оксидаза ПМЛ не вносит вклад в реализацию ингибирования СЛХЛ крови под влиянием тартразина у пациентов с непереносимостью НПВП в сочетании с непереносимостью тартразина, а наблюдаемое 238 угнетение СЛХЛ крови, по-видимому, связано с преимущественным ингибированием МПО ПМЛ. Таким образом, несмотря на определенное сходство во влиянии НПВП, тартразина на СЛХЛ крови больных с их непереносимостью, выявляются некоторые различия в активности ферментов окислительного метаболизма ПМЛ, в частности НАДФН-оксидазы, проявляющиеся под воздействием исследуемых псевдоаллергенов на СЛХЛ крови больных с их непереносимостью. Нас заинтересовал вопрос, связаны ли выявленные различия СЛХЛ крови под воздействием НПВП, тартразина у доноров и больных с их непереносимостью исключительно с влиянием на ПМЛ крови биологически активных веществ (медиаторов, цитокинов) плазмы, или все же существуют какие-то особенности окислительного метаболизма ПМЛ у данной группы больных, проявляющиеся при воздействии на ПМЛ упомянутых псевдоаллергенов. Для выяснения данного вопроса мы прединкубировали образцы суспензии ПМЛ с НПВП, тартразином у пациентов с их непереносимостью и здоровых доноров. Выявлено, что суммарная продукция АФК выделенными ПМЛ, в том числе и продукция О2- , у больных с непереносимостью НПВП, тартразина не отличается от аналогичных показателей у доноров, что свидетельствует об отсутствии каких-либо особенностей в работе ферментов окислительного метаболизма выделенных ПМЛ, проявляющихся под воздействием используемых нами НПВП, тартразина у больных с непереносимостью данных препаратов по сравнению с донорами. Из этого можно сделать вывод, что различия в показателях СЛХЛ цельной крови больных с непереносимостью НПВП, тартразина по сравнению с донорами при прединкубации проб крови с данными псевдоаллергенами связаны с влиянием на ферменты окислительного метаболизма находящихся в плазме крови биологически активных веществ (медиаторов, цитокинов), содержание 239 и соотношение которых различно у доноров и больных с непереносимостью НПВП, тартразина. Для того, чтобы подтвердить, что именно плазменные факторы изменяют реакцию ПМЛ периферической крови на НПВП у больных с непереносимостью данных препаратов, мы исследовали влияние плазмы больных с непереносимостью НПВП на окислительный метаболизм суспензии ПМЛ здоровых доноров. Показано, что плазма больных с непереносимостью АСК, проявляющейся реакциями со стороны органов дыхания (бронхоспазм/ринит), оказывает ингибирующее воздействие на СЛХЛ суспензии ПМЛ здоровых доноров. Причем, данный эффект был более выражен, если плазма была отобрана из проб крови больных с непереносимостью АСК, предварительно инкубированных с салицилатом натрия (3,0 мМ) по сравнению с влиянием плазмы, отобранной из проб крови больных, инкубированных с равным объемом физиологического раствора. Следовательно, непереносимости плазма НПВП больных с бронхиальными содержит базальный уровень проявлениями биологически активных веществ (медиаторов и цитокинов), оказывающих ингибирующее действие на суммарную продукцию АФК ПМЛ. Воздействие салицилата натрия на кровь больных с непереносимостью АСК сопровождается изменением соотношения биологически активных веществ в крови таким образом, что приводит к еще большему подавлению активности ферментов окислительного метаболизма ПМЛ и, следовательно, суммарной продукции АФК ПМЛ. Мы исследовали вклад биологически активных веществ (медиаторов, цитокинов) в реализацию феномена ингибирования СЛХЛ крови под влиянием НПВП, тартразина у больных с непереносимостью данных псевдоаллергенов. Для выяснения участия медиаторного механизма в развитии указанного феномена изучали влияние блокаторов гистаминовых (клемастина, ранитидина), серотониновых (кетансерина), лейкотриеновых 240 (зафирлукаста) рецепторов и стабилизатора мембран базофилов и тучных клеток (кромоглициевой кислоты) угнетение СЛХЛ псевдоаллергенов крови с у на вызываемое НПВП, тартразином больных различными с непереносимостью клиническими данных проявлениями непереносимости. Было выявлено, что феномен подавления СЛХЛ крови под влиянием псевдоаллергенов (НПВП, тартразина) у больных с их непереносимостью опосредуется участием медиаторов, что подтверждается ослаблением или предотвращением развития указанного феномена под воздействием клемастина, ранитидина, кетансерина, зафирлукаста и кромоглициевой кислоты (p<0,05). Вклад Н1- и Н2- гистаминовых, 5-НТ2 серотониновых и цисЛТ1R рецепторов в развитие феномена ингибирования СЛХЛ крови под воздействием НПВП и тартразина зависит от химической природы псевдоаллергенов и от клинических проявлений непереносимости. Поскольку проведенные нами исследования показали разное участие Н1- и Н2- гистаминовых, 5-НТ2 серотониновых и цисЛТ1R рецепторов в развитии феномена ингибирования СЛХЛ крови под воздействием НПВП и тартразина в зависимости от клинических проявлений непереносимости и химической природы псевдоаллергенов, необходим индивидуальный подбор патогенетической терапии пациентам с непереносимостью указанных псевдоаллергенов различной химической природы и с различными клиническими проявлениями непереносимости. Нами был разработан объективный, быстрый, экономичный хемилюминесцентный тест in vitro диагностики повышенной чувствительности к псевдоаллергенам, в частности к НПВП, пищевому красителю тартразину, который позволяет определять не только повышенную чувствительность к данным псевдоаллергенам, но и персонально подбирать оптимальные противоаллергические препараты для коррекции непереносимости НПВП и пищевых красителей. Данный тест был оформлен, как патентная заявка «Способ диагностики in vitro повышенной чувствительности к псевдоаллергенам и подбора противоаллергической 241 терапии» (дата поступления заявки: 22.04.2014; входящий номер: 025205; регистрационный номер: 2014116060), по которой 23.11.2015г. было вынесено положительное решение о выдаче патента на изобретение. Также исследовали вклад цитокинового механизма в вызываемое НПВП, тартразином угнетение СЛХЛ крови больных с непереносимостью данных псевдоаллергенов. Было выявлено, что у пациентов с непереносимостью НПВП, тартразина обеих групп под влиянием салицилата, метамизола натрия и тартразина на кровь происходит незначительное увеличение уровня провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-8, ФНО-α и ИФН-γ), что может в некоторой степени предстимулировать фагоциты к увеличению выработки АФК при воздействии вторичных стимулов. Однако мы наблюдали феномен ингибирования СЛХЛ крови под влиянием НПВП, тартразина у пациентов с их непереносимостью, что свидетельствует о том, что исследуемые провоспалительные цитокины указанного феномена не принимают участия в реализации у данных больных. Вместе с тем, у пациентов с хронической крапивницей/отеком Квинке, обостряющейся после приема НПВП, под влиянием салицилата, метамизола натрия и тартразина происходит достоверное увеличение уровня противовоспалительного цитокина ИЛ-4, оказывающего ингибирующее влияние на ХЛ фагоцитов, что может вносить вклад в развитие феномена ингибирования СЛХЛ крови, вызываемого НПВП, тартразином. Однако, учитывая низкую концентрацию ИЛ-4 в крови данных пациентов, вклад ИЛ-4 в реализацию указанного феномена незначительный. Таким образом, после изучения уровня цитокинов было сделано заключение, что основной вклад в развитие феномена ингибирования СЛХЛ крови под влиянием НПВП, тартразина у пациентов с их непереносимостью вносят медиаторные механизмы. Известно, что у больных БА в выдыхаемом воздухе выявляется значительное повышение содержания NO по сравнению с таковым у здоровых людей [37; 95], что связано с наличием воспалительных изменений 242 в бронхах, которые влияют на активность индуцибельной NO-синтазы (iNOS) [37; 60]. При обострении БА имеется параллельное увеличение количества выдыхаемого NO и активности iNOS [37]. Кроме того, Parikh A. et. al. [210] в своих исследованиях определили более высокий уровень активности iNOS в эпителии носовых полипов у пациентов с АТ по сравнению с таковым у пациентов с полипозом носа и БА без непереносимости аспирина. Между тем, до настоящего времени неизвестно, существует ли зависимость между степенью подавления СЛХЛ крови под влиянием НПВП у больных с АТ и уровнем активности iNOS фагоцитов. Для получения ответа на данный вопрос определяли активность iNOS лейкоцитов периферической крови у больных с АТ, атопической формой БА без ПРС и непереносимости НПВП и здоровых доноров. Активность iNOS лейкоцитов косвенно оценивали по уровню стабильных конечных метаболитов NO (нитратов, нитритов) в пробах. Доказано, что активность iNOS фагоцитов повышена у больных с АТ по сравнению с другими группами лиц. В стадию обострения хронического бронхита и астмы активность iNOS выше, чем в стадию ремиссии. Повышение продукции NO фагоцитами больных с АТ вероятно обусловлено индукцией продукции NО провоспалительными цитокинами (ИЛ-1β, ФНО-α), синтез которых повышен у данных пациентов, а также бактериальными эндотоксинами. Низкий уровень ИЛ-4 также способствует увеличению продукции NO фагоцитами, поскольку указанный противовоспалительный цитокин обладает активирующим действием на активность фермента аргиназы в фагоцитах [266], что сопровождается снижением продукции NO. В следующей серии опытов мы исследовали влияние НПВП на культуру лейкоцитов здоровых доноров и больных БА в сочетании и без такового с непереносимостью НПВП. Было выявлено умеренное подавление продукции NO фагоцитами под влиянием НПВП у всех групп исследуемых лиц, однако степень подавления продукции NO под влиянием НПВП существенно не 243 различалась у всех исследуемых групп лиц. Из этого следует, что уровень активности iNOS фагоцитов изменяется сходным образом под влиянием НПВП у здоровых доноров и у всех пациентов с БА вне зависимости от фазы течения заболевания и наличия непереносимости НПВП. Учитывая, что активность iNOS фагоцитов несколько выше у пациентов с обострением воспалительного процесса в бронхах по сравнению с таковыми в ремиссии, мы посчитали целесообразным сравнить показатели относительной светосуммы СЛХЛ крови у пациентов с АТ в фазу обострения хронического бронхита и астмы по сравнению с пациентами в фазу ремиссии. Выявлено, что отсутствует зависимость относительной светосуммы СЛХЛ от фазы течения воспалительного процесса в бронхах и, следовательно, от уровня активности iNOS фагоцитов. Таким образом, мы склонны полагать, что ингибирование СЛХЛ крови под влиянием НПВП у больных с АТ, имеющих непереносимость соответствующих НПВП, не связано с повышением активности iNOS фагоцитов. Мы также исследовали влияние давности возникновения непереносимости НПВП, тартразина на степень угнетения СЛХЛ крови под влиянием данных псевдоаллергенов у пациенов с их непереносимостью с различными клиническими проявлениями. Было выявлено, что степень подавления СЛХЛ крови под влиянием НПВП и тартразина у пациентов с их непереносимостью зависит от времени, прошедшего с момента возникновения непереносимости данных псевдоаллергенов. У пациентов с бронхиальными проявлениями непереносимости степень подавления СЛХЛ крови увеличении времени существования указанной пациентов только с проявлениями кожными возрастает непереносимости. при У непереносимости (крапивница/отек Квинке) степень подавления СЛХЛ крови уменьшается при увеличении тартразина. длительности существования непереносимости НПВП, 244 Таким образом, в нашей работе изучены особенности оксидантной активности фагоцитов периферической крови пациентов с непереносимостью НПВП. Выявлены нарушения механизмов «дыхательного взрыва», механизмов прайминга ПМЛ у пациентов с АТ, что, вероятно, связано с дефектами в работе НАДФН-оксидазной ферментной системы у данных пациентов. Установлены новые механизмы ингибирования СЛХЛ крови под влиянием псевдоаллергенов (НПВП и пищевых красителей) у пациентов с их непереносимостью. Доказано, что основной механизм реализации данного феномена- медиаторный, причем Н1- и Н2- гистаминовые, 5-НТ2 серотониновые и цисЛТ1R рецепторы вносят разный вклад в зависимости от химической природы псевдоаллергена и клинических проявлений непереносимости. Полученные в работе сведения позволили разработать in vitro тест для определения непереносимости псевдоаллергенов (НПВП, тартразина), а также подбора индивидуальной патогенетической терапии. Мы рекомендуем использовать метод стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой хемилюминесценции крови для диагностики in vitro повышенной чувствительности к псевдоаллергенам (НПВП, тартразину) и персонифицированного подбора патогенетической терапии. Содержательную часть работы рекомендуем использовать в учебном процессе при изучении дисциплин: патологическая физиология, клиническая патологическая физиология; общая патология; фармакология, клиническая фармакология. Перспективы дальнейшей разработки темы С практической точки зрения хочется надеяться, что настоящее исследование послужит отправной точкой для разработки стандартов персонифицированной патогенетической терапии пациентов с различными формами клинических проявлений непереносимости псевдоаллергенов (НПВП, пищевых красителей) после проведения необходимых клинических испытаний. Несомненно важным является расширение спектра исследуемых 245 псевдоаллергенов, на которые часто развиваются побочные реакции, с целью диагностики непереносимости и подбора патогенетической терапии с помощью предложенного нами безопасного хемилюминесцентного экспрессметода in vitro, что безусловно повысит эффективность диагностики и лечения пациентов с непереносимостью различных псевдоаллергенов. 246 ВЫВОДЫ 1. Суммарная продукция АФК ПМЛ различна у пациентов с непереносимостью НПВП разных клинических групп. У пациентов с астматической триадой снижена суммарная продукция АФК выделенными ПМЛ на 18%, ПМЛ в составе цельной крови – на 33% по сравнению со здоровыми донорами (p<0,05). У пациентов с хронической псевдоаллергической крапивницей/отеком Квинке, обостряющейся после приема НПВП, не обнаруживается существенных изменений суммарной продукции АФК ПМЛ по сравнению со здоровыми донорами. 2. Продукция О2- ПМЛ различна у пациентов с непереносимостью НПВП разных клинических групп. У пациентов с астматической триадой снижена продукция О2- выделенными ПМЛ на 27%, ПМЛ в составе цельной крови – на 23% по сравнению со здоровыми донорами (p<0,05). У пациентов с хронической псевдоаллергической крапивницей/отеком Квинке, обостряющейся после приема НПВП, не обнаруживается существенных изменений продукции О2- ПМЛ по сравнению со здоровыми донорами. 3. Антигены Staphylococcus aureus оказывают праймирующее влияние на выработку АФК ПМЛ цельной крови и выделенными ПМЛ у здоровых доноров, что связано с увеличением активности НАДФН-оксидазы ПМЛ. У пациентов с астматической триадой в стадии ремиссии, не сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами, наблюдается снижение праймирующего влияния антигенов Staphylococcus aureus на выработку АФК ПМЛ цельной крови и выделенными ПМЛ по сравнению с донорами (p<0,05), что связано со снижением активности НАДФН-оксидазы ПМЛ. У пациентов с астматической триадой в стадии ремиссии, сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами, прединкубация проб крови со специфическим аллергеном (Staphylococcus aureus) сопровождается значительным увеличением продукции АФК ПМЛ крови по 247 сравнению со здоровыми донорами (p<0,05). Активность НАДФН-оксидазы ПМЛ у этих больных снижена по сравнению с таковой здоровых доноров (p<0,05). 4. НПВП оказывают дозозависимое модифицирующее влияние на СЛХЛ цельной крови здоровых доноров и пациентов с непереносимостью данных препаратов. У здоровых доноров малые концентрации препаратов стимулируют СЛХЛ крови, при увеличении концентрации препаратов развивается угнетение СЛХЛ. У пациентов с непереносимостью НПВП фаза стимуляции СЛХЛ крови отсутствует, а угнетение СЛХЛ наступает при применении меньших концентраций препаратов и выражено в большей степени, чем у здоровых доноров (p<0,05). 5. Пищевой краситель тартразин модифицирует СЛХЛ крови здоровых доноров и больных с непереносимостью НПВП в сочетании или без такого с непереносимостью тартразина. У здоровых доноров при воздействии на кровь тартразина выявляется две фазы в изменении СЛХЛ крови: в первой фазе отсутствуют наблюдается выраженные дозозависимое изменения угнетение СЛХЛ, СЛХЛ. во второй У больных фазе с непереносимостью тартразина выявлено выраженное подавление СЛХЛ крови, начиная с минимальной концентрации красителя. При всех используемых концентрациях тартразина СЛХЛ крови больных с непереносимостью тартразина ниже, чем у здоровых доноров (p<0,05). 6. Одним из механизмов ингибирования стимулированной люминолзависимой хемилюминесценции крови под влиянием НПВП у больных с непереносимостью данных препаратов является снижение активности НАДФН-оксидазы ПМЛ относительно таковой здоровых доноров. Вместе с тем НАДФН-оксидаза ПМЛ не вносит вклад в реализацию ингибирования СЛХЛ крови под влиянием тартразина у пациентов с непереносимостью НПВП в сочетании с непереносимостью тартразина. 248 7. Показатели СЛХЛ и СЛЦХЛ выделенных ПМЛ, инкубированных с псевдоаллергенами (НПВП, тартразином), не имеют достоверных отличий (p>0,1) у доноров и больных с непереносимостью соответствующих псевдоаллергенов, что свидетельствует об отсутствии каких-либо особенностей в функционировании ферментов окислительного метаболизма ПМЛ под воздействием НПВП, тартразина у больных с непереносимостью данных псевдоаллергенов по сравнению с донорами. 8. Феномен подавления СЛХЛ крови под влиянием псевдоаллергенов (НПВП, тартразина) у больных с их непереносимостью опосредуется участием медиаторов, предотвращением развития что подтверждается указанного феномена ослаблением под или воздействием клемастина, ранитидина, кетансерина, зафирлукаста и кромоглициевой кислоты (p<0,05). Вклад Н1- и Н2- гистаминовых, 5-НТ2 серотониновых и цисЛТ1R рецепторов в развитие феномена ингибирования СЛХЛ крови под воздействием НПВП и тартразина зависит от химической природы псевдоаллергенов и от клинических проявлений непереносимости. 9. Провоспалительные цитокины ИЛ-1β, ИЛ-8, ФНО-α, ИФН-γ не вносят вклад в подавление СЛХЛ крови под влиянием НПВП, тартразина (р>0,01). Противовоспалительный цитокин ИЛ-4 вносит незначительный вклад в реализацию феномена ингибирования СЛХЛ крови под влиянием НПВП, тартразина у пациентов с кожными проявлениями непереносимости указанных псевдоаллергенов (p<0,05). 10. Активность индуцибельной NO-синтазы фагоцитов повышена у больных с астматической триадой по сравнению с таковой у здоровых доноров и больных с атопической бронхиальной астмой без полипоза носа и непереносимости НПВП (p<0,05). В стадию обострения хронического бронхита и астмы активность индуцибельной NO-синтазы выше, чем в стадию ремиссии (p<0,05). 249 11. Степень подавления СЛХЛ крови под влиянием НПВП у пациентов с астматической триадой не зависит от фазы течения воспалительного процесса в бронхах и от уровня активности индуцибельной NO-синтазы фагоцитов (p>0,1). 12. Степень подавления СЛХЛ крови под влиянием НПВП и тартразина у пациентов с их непереносимостью зависит от времени, прошедшего с момента возникновения непереносимости данных псевдоаллергенов. У пациентов с бронхиальными проявлениями непереносимости степень подавления СЛХЛ крови возрастает при увеличении времени существования указанной непереносимости. У пациентов только с кожными проявлениями непереносимости (крапивница/отек Квинке) степень подавления СЛХЛ крови уменьшается при увеличении длительности существования непереносимости НПВП, тартразина. 13. Обосновано применение хемилюминесцентного теста для диагностики in vitro повышенной чувствительности к псевдоаллергенам (НПВП, пищевым красителям) и персонифицированного подбора патогенетической терапии. 250 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Рекомендуем использовать метод стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой хемилюминесценции крови для диагностики in vitro повышенной чувствительности к псевдоаллергенам (НПВП, тартразину) и персонифицированного подбора патогенетической терапии. 2. Рекомендуем применять метод стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой хемилюминесценции крови для диагностики in vitro специфической сенсибилизации организма к бактериальным аллергенам. 3. Рекомендуем содержательную часть работы использовать в учебном процессе при изучении дисциплин: патологическая физиология, клиническая патологическая физиология; общая патология; фармакология, клиническая фармакология. 251 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АГ- антиген АСК-ацетилсалициловая кислота АТ- астматическая триада АФК - активные формы кислорода БА – бронхиальная астма БАЛ- бронхо-альвеолярный лаваж ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор ГЭБ – гемато - энцефалический барьер ДМСО - диметилсульфоксид ИЛ - интерлейкин ИФНγ- интерферон гамма КГК- кромоглициевая кислота 5-ЛОГ- 5-липоксигеназа ЛУК - ледяная уксусная кислота МПО - миелопероксидаза НПВП - нестероидные противовоспалительные препараты ПГ - простагландины ПМЛ - полиморфно-ядерные лейкоциты ПРС - полипозный риносинусит СЛХЛ - стимулированная сульфатом бария люминол-зависимая хемилюминесценция СЛЦХЛ - стимулированная сульфатом бария люцигенин-зависимая хемилюминесценция СОД – супероксиддисмутаза ТРФ-β- трансформирующий фактор роста β ТХА2- тромбоксан А2 T-хелперы -Th 252 ФГА-фитогемагглютинин ФМА – форболмиристатацетат ФМЛФ – формилметиониллейцилфенилаланин ФНО - фактор некроза опухоли ХЛ - хемилюминесценция Цис-ЛТ - цистеиниловые лейкотриены ЦОГ – циклооксигеназа ЭСТД- эквивалент средней терапевтической дозы 5-НЕТЕ- 5-гидроперокси-эйкозатетраеновая кислота iNOS- индуцибельная NO-синтаза NO- оксид азота 253 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Адо, А.Д. Клиническое значение теста торможения миграции лейкоцитов in vivo / А.Д. Адо, Г.П. Бондарева, В.Г. Читаева // Клиническая медицина.-1980.-№3.-С.37-41. 2. Активированная люцигенином хемилюминесценция тканей животных / Н.С. Матвеева, О.Б. Любицкий, А.Н. Осипов, Ю.А. Владимиров // Биофизика.-2007.-Т.52.-№6.-С.1120-1127. 3. Антиоксидантная активность фармацевтических препаратов, применяемых для лечения заболеваний глаз / Е.И. Ковалевский, Г.И. Клебанов, Ю.О. Теселкин, И.В. Бабенкова и др. // Вестн. офтальмологии.-1987.-V.103.-№ 4.-С.48-51. 4. Балаболкин, И.И. Аспириновая бронхиальная астма у детей / И.И. Балаболкин, Д.Ш. Мачарадзе //Аллергология.- 1999. - №4. - С.29-31. 5. Белоусов, Ю.Б. ОТС анальгетики-антипиретики для приема внутрь: механизм действия и профиль безопасности / Ю.Б. Белоусов, К.Г. Гуревич, С.В. Чаусова // Лечащий врач.-2015.-№1.-С. 79-82. 6. Бизунок, Н.А. Биогенные амины – эндогенные модуляторы клеточной генерации активных форм кислорода / Н.А. Бизунок //Белорусский медицинский журнал. - 2004. - № 4.-С. 34-36. 7. Бизунок, Н.А. Влияние противовоспалительных средств на фагоцитарную генерацию оксидантов / Н.А. Бизунок // Белорусский медицинский журнал.-2002.-№2.-С. 56-58. 8. Биленко, М.В. Способность низких доз ФНОα предактивировать и активировать макрофаги, повышая их способность к продукции активных форм кислорода и окислению липопротеинов низкой плотности: защитный эффект антиоксидантов / М.В. Биленко, А.В. Хильченко, Н.А. Шмитько // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2003.-№4.-С.410-413. 254 9. Бондарева, Г.П. Астматическая триада. Клинико-иммунологическая характеристика. Пути формирования. Терапевтические подходы : дис. …д-ра. мед. наук: 14.00.36 / Бондарева Галина Петровна. – М., 2009. – 231с. 10. Бондарева, Г.П. Аспириновая бронхиальная астма. Клинико- патогенетические аспекты / Г.П. Бондарева // Физиология и патология иммунной системы.- 2005.- Т.9.- №3.- С. 5-11. 11. Бондарева, Г.П. Роль золотистого стафилококка при полипозном синусите / Г.П. Бондарева, А.Б. Туровский, О.В. Семкина // Российский Аллергологический Журнал.-2013.-№6.-С.5-8. 12. Бондарева, Г.П. Этапы развития астматической триады / Г.П. Бондарева // Российский аллергологический журнал.-2007.-№3.-С.96-97. 13. Венгеровский А. И., Саратиков А. С. Механизмы гепатотоксичности парацетамола / А.И. Венгеровский, А.С. Саратиков // Фармакол. и токсикол. – 1991. -Т.54.- №1. - С.76-79. 14. Владимиров, активностей Ю.А. Оценка веществ и антиоксидантной биологических и антирадикальной объектов с помощью железоинициированной хемилюминесценции / Ю.А. Владимиров, М.П. Шерстнев, Т.К. Азимбаев // Биофизика.-1992.-V.37.- № 6.-С.1041-1047. 15. Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция / Ю.А. Владимиров, Е.В. Проскурина // Успехи биологической химии.- 2009- Т. 49.- С. 341–388. 16. Владимиров, Ю.А. Хемилюминесценция клеток животных / Ю.А. Владимиров, М.П. Шерстнев // Итоги науки и техники. Серия Биофизика / под. ред. М.Н. Мерзляка - М.: ВИНИТИ, 1989. – Т.24.-176 с. 17. Влияние гистамина на функциональные свойства нейтрофилов и интенсивность процесса пероксидного окисления нейтрофилов в крови доноров / А.Ю. Искусных, О.В. Башарина, В.Г. Артюхов, В.В. 255 Алабовский // Журнал «Вестник ВГУ», Серия: Химия. Биология. Фармация.-2008.-№1.-С.93-96. 18. Влияние ненаркотических анальгетиков на интенсивность люминолзависимой хемилюминесценции лейкоцитов периферической крови больных с непереносимостью этих лекарственных препаратов / С.В. Чаусова, Г.П. Бондарева, О.Ю. Филатов, В.И. Пыцкий // I-ая нац. конф. РААКИ «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии»: мат. конф.- М., 1997.-С.441. 19. Влияние парацетамола, его комбинаций с ацетилсалициловой и аскорбиновой кислотами на процессы перекисного окисления липидов в печени крыс / Л.А. Чайка, В.А.Поволоцкая, В.В. Либина и др. // Эксперим. и клин. фармакол.-1996.-Т.59.- №1.-С.43-46. 20. Влияние специфических аллергенов на изменение активности ферментов, ответственных за секрецию активных форм кислорода, лейкоцитов крови больных атопическими заболеваниями / М.Б. Ингема, О.Ю. Филатов, Ю.П. Сюсюкин и др. // YIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: мат. конгр. – М., 2001.-С.460. 21. Вознесенский, А.Г. Клиническая фармакология нестероидных противовоспалительных средств : учебное пособие / А.Г. Вознесенский.Волгоград: Мысль, 1999. - 191 с. 22. Голубев, Л.А. Антагонисты лейкотриеновых рецепторов в лечении бронхиальной астмы / Л.А. Голубев, С.Л. Бабак, Г.А. Григорянц // Южно-Российский медицинский журнал. – 2001. – №1-2. – С.85-88. 23. Гущин, И.С. Аллергическое воспаление / И.С. Гущин. - М.: Фармаруспринт, 1998.-251с. 24. Данилов, А.Б. Диклофенак в лечении болевых синдромов / А.Б. Данилов // Лечащий врач.-2009.-№5.-С. 58-63. 25. Диагностика аллергии хемилюминесценции на новокаин лейкоцитов и методами аллергической определения альтерации 256 лейкоцитов / Н.М. Кузнецова, О.Ю. Филатов, Е.В. Степанова, Е.А. Гюнтер // Всероссийский конгресс «Новые направления в медицине»: мат. конгр.- Ленинск-Кузнецкий, 2000.- С.77-78. 26. Днепровский, А.С. Теоретические основы органической химии / А.С. Днепровский, Т. И. Темникова -Л.: Химия, 1991. - 560 с. 27. Дубовиков, А.И. Нестероидные протвовоспалительные средства: некоторые практические аспекты примененения / А.И. Дубовиков // Неврология.-2009.-№1.-С.13-18. 28. Евсюкова, Е.В. Аспириновая бронхиальная астма / Е.В. Евсюкова // Новые Санкт-Петербургские врачебные ведомости. -2003.- №4.- С.11-17. 29. Зенкина, Л.В. Бронхиальная астма: концентрация IL-2, IL-4,IL-6, IFN-γ, TNF-α в сыворотке периферической крови и изменения в иммунном статусе при атопии и псевдоатопии / Л.В. Зенкина, С.В. Смирнова, С.Г. Кадричева // Вестник Клинической больницы №51.- 2008.- Т.3.- №2.С.42-48. 30. Зырьянов, С.К. Современные представления о безопасности лечения боли: нестероидные протвовоспалительные препараты / С.К. Зырьянов, Ю.Б.Белоусов // Лечебное дело.-2008.-№3.-С.14-16. 31. Изменение показателей оксидантного и цитокинового статуса больных хроническим вирусным гепатитом С и В при лечении препаратом рекомбинантного интерлейкина 1β человека / Конусова В.Г., Е.С. Романова, И.В. Чурилова и др. // Цитокины и воспаление.- 2003.-Т. 2.№1.-С.20-28. 32. Карпова, О.И. Амизон - новый отечественный ненаркотический анальгетик / О.И. Карпова // Пробл. медицины.-1998.-№ 3.-С.38-39. 33. Клебанов, Г.И. Клеточные механизмы прайминга и активация фагоцитов / Г.И. Клебанов, Ю.А. Владимиров // Успехи современной биологии.1999.-Т.119.-№5.-С.462-475. 257 34. Клиническая аллергология: Рук-во для практических врачей / Р.М. Хаитов, И.С. Гущин, Н.И. Ильина и др.; под общ. ред. Р.М. Хаитова.М.: МЕДпресс-информ, 2002.- 624 с. 35. Княжевская, Н.П. Аспириновая бронхиальная астма и антагонисты лейкотриенов / Н.П. Княжевская // Русский медицинский журнал.-2000.№12.-С.505-509. 36. Кукес, В.Г. Клиническая фармакология / В.Г. Кукес.-М.: «ГЭОТАРМедиа», 2006.-944с. 37. Лев, Н.С. Патогенетическая роль оксида азота при бронхиальной астме / Н.С. Лев // Российский вестник перинатологии и педиатрии.-2000.-№4.С.48-51. 38. Литвинова, Н.В. Нестероидные противовоспалительные средства: возможные механизмы антиоксидантного действия / Н.В. Литвинова, Т.H. Курапова // Біополімери і клітина.- 2004.- Т. 20.- № 6.- С.472-478. 39. Луценко, М.Т. Морфологические исследования клеток периферической крови у больных с бронхиальной астмой / М.Т. Луценко //Бюллетень.2000.-№7.-С.7-20. 40. Луценко, М.Т. Хемилюминесценция и гистохимия лейкоцитов периферической крови больных бронхиальной астмой / М.Т. Луценко, И.А. Плюснина // Бюллетень. – 2000. - №7. – С.49-55. 41. Мазуров, В.И. Клиническая ревматология / В.И. Мазуров. - СПб.: ООО "Издательство Фолиант", 2001. - 416 с. 42. Марков, Х.М. Окись азота и окись углерода - новый класс сигнальных молекул / Х.М. Марков // Успехи физиолог. наук.-1996.-Т. 27.-№4.-Р.3044. 43. Маслова, Л.В. Аспириновая бронхиальная астма / Л.В. Маслова // Медицинская панорама.- 2004. - №4. – С. 80-83. 258 44. Мачарадзе Д.Ш. Непереносимость аспирина у детей с бронхиальной астмой / Д.Ш. Мачарадзе, Р.И. Сепиашвили // Астма.- 2002. – Т.3.-№2. С.107-113. 45. Маянский, А.Н. Кондиционирование нейтрофила / А.Н. Маянский // Успехи соврем. биологии.- 1990.-Т.109.-С.90-105. 46. Маянский, А.Н. НАДФН - оксидаза нейтрофилов: активация и регуляция /А.Н. Маянский // Цитокины и воспаление - 2007.- №3.-С.10-12. 47. Механизмы цитокин-индуцированной активации фагоцитов / Л.В. Ковальчук, Л.В. Ганковская, Г.И. Клебанов. и др. // International J. Immunoreabilitation. -1997.-№11.-С.36. 48. Модуляция кислородного метаболизма фагоцитов рекомбинантными цитокинами и комплексом природных цитокинов / Л.В. Никанкина, Е.Н. Долгина, Л.В. Ганковская и др. // Журн. Микробиол. -1999.-№5.-С.106108. 49. Моисеева, Е.Г. Исследование действия интерлейкина-4 на функциональные свойства нейтрофилов / Е.Г. Моисеева // Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Медицина.-2006.№3.- С. 65-67. 50. Мокроносова, М.А. Триггерные факторы хронического рецидивирующего полипозного ринусинусита / М.А. Мокроносова // Российский аллергологический журнал.-2011.-№1.-С.25-31. 51. Насонова, В.А. Распространенность, структура и факторы риска развития гастропатий, индуцированных нестероидными противовоспалительными препаратами / В.А. Насонова, А.Е. Каратеев // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол. и колопроктол.- 2000.-Т.10.- № 4.С.34-39. 52. Насонова, В.А. Рациональная фармакотерапия ревматических заболеваний / В.А. Насонова, Е.Л. Насонов - М.: Литтерра, 2003.-529с. 259 53. Насонов, Е.Л. Современное учение о селективных ингибиторах ЦОГ-2: новые аспекты применения мелоксикама (мовалиса) / Е.Л. Насонов // Науч.-практ. ревматол.-2001.-№1.-С.58-62. 54. Насыров, X.M. Антиоксидантные свойства противовоспалительных средств / X.M. Насыров // Фармакология и токсикология.-1987.-№ 6.-С. 113-116. 55. Насыров, Х.М. Пероксидантный эффект медиаторов воспаления / Х.М. Насыров, Р.М. Кондратенко // Патол. физиол. эксп. тер.-1992.- №3.-С.1214. 56. Нестероидные противовоспалительные средства: анестезиологическая эффективность и основы безопасного применения (обзор литературы) / Р.И. Григорович, Е.А. Немахова, А.А. Лаврентьев, П.А. Попов // Вестник новых медицинских технологий.- 2010.- Т. XVII.- № 2.- С. 175179. 57. Новиков, П.Д. Выявление IgE- и IgG-антител к пищевому красителю тартразину в сыворотке крови больных / Новиков П.Д., Новикова Н.Д. // Иммунопатология, аллергология, инфектология.-2006.-№1.- С.36-41. 58. Определение антиоксидантной активности плазмы крови с помощью системы гемоглобин - пероксид водорода – люминол / Ю.О. Теселкин, И.В. Бабенкова, О.Б. Любицкий и др. // Вопросы мед. химии - 1998 – Т. 44 - №1 - С.70-76. 59. Осипов, А.Н. Активированные формы кислорода и их роль в организме / А.Н. Осипов, О.А. Азизова, Ю.А. Владимиров // Успехи биол. химии. – 1990. – Т.31. – С.180-208. 60. Паршина, С.С. Современные представления о биологических эффектах оксида азота и его роли в развитии кардиоваскулярной патологии / С.С. Паршина // Кардиоваскулярная терапия и профилактика.-2006.-Т.5(1).С.88-94. 260 61. Патогенетическая терапия аспириновой астмы: десенситизация аспирином и антагонисты лейкотриеновых рецепторов : методические рекомендации / Н.А. Дидковский, А.В. Караулов, И.В.Сидоренко и др. – М.: Медицина, 2001. - 11с. 62. Патофизиология : учебник для студентов учреждений высш. мед. проф. образования: в 3-х т. / А.И. Воложин, Г.В. Порядин, В.А. Войнов и др.; под ред. А.И. Воложина, Г.В. Порядина. - 3-е изд., стер.- М.:Издательский центр «Академия», 2013.-3т. 63. Петренко, Ю.М. Новое свойство аспирина и других салицилатов. Их способность к генерации радикалов за счет хелатирующе-окисляющего действия на катионы железа / Ю.М. Петренко, Ю.А. Владимиров //Эксперим. и клин. фармакол. - 1998. -V.61.- №1.-С.44-55. 64. Пинегин, Б.В. Нейтрофилы: структура и функции / Б.В. Пинегин, А.Н. Маянский // Иммунология. – 2007. - №6. – С.374-382. 65. Подплетняя, Е.А. Антиоксидатный механизм реализации фармакологических эффектов нестероидных протвовоспалительных средств / Е.А. Подплетняя, В.И. Мамчур // Журн. АМН України.- 2004.Т.10.-№1.-С.302-313. 66. Потапнев, М.П. Влияние цитокинов воспаления на фагоцитоз и бактерицидную активность нейтрофилов человека / М.П. Потапнев, Д.В. Печковский // Иммунология.-1992.-№3.-С.34-36. 67. Пыцкий, В.И. Аллергические заболевания / В.И. Пыцкий, Н.В. Адрианова, А.В. Артомасова.- 3-е изд., перераб. и доп.-М. : Триада-Х, 1999.-470с. 68. Пыцкий, В.И. Изменение люминол-зависимой хемилюминесценции лейкоцитов периферической крови кроликов при инкубации со специфическим аллергеном в процессе развития феномена Артюса / В.И. Пыцкий, О.Ю. Филатов // Патологическая физиология и экспериментальная терапия.-1992.-№5-6.-С.41-43. 261 69. Пыцкий, В.И. К стимулированной механизму специфического хемилюминесценции подавления полиморфно-ядерных лейкоцитов при аллергических процессах / В.И. Пыцкий, О.Ю. Филатов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-1994.- Т.117.№1.-С.299-301. 70. Пыцкий, В.И. Механизмы возникновения и развития бронхиальных астм и основные принципы их лечения: учебное пособие / В.И. Пыцкий.-М.: «Фармарус Принт Медиа», 2008.-56 с. 71. Ранозаживляющее и местное иммуностимулирующее действие рекомбинантного ИЛ-1 человека при применении у больных с длительно незаживающими ранами и трофическими язвами / Е.А. Варюшина, В.В. Москаленко, А.С. Симбирцев и др. // Цитокины и воспаление. – 2007. – T. 6. - № 2. – С. 54-62 . 72. Роль свободнорадикальных процессов в патогенезе бронхиальной астмы / С. Болевич, И.Г. Даниляк, А.Х. Коган и др. // Пульмонология.-1995.№1.- С.18-19, 22-24. 73. Сала, А. Лейкотриены: липидные биоэффекторы воспалительных реакций./ А.Сала, С. Зарини, М. Болла // Биохимия. – 1998. – Т. 63.-№ 1. – С. 101-110. 74. Серебренникова, С.Н. Роль цитокинов в воспалительном процессе / С.Н. Серебренникова, И.Ж. Семинский //Сибирский медицинский журнал.2008.-№6.-С.5-8. 75. Серотонин: биологические свойства и перспекивы клинического применения / В.Ю. Шур, М.А. Самотруева, М.В. Мажитова и др. // Фундаментальные исследования.-2014.-№7.-С.621-629. 76. Сидорик, Е.П. Биохемилюминесценция при опухолевом процессе / Е.П. Сидорик, Е.А. Баглей, М.И. Данко. –К.: Наук. думка, 1989.-220 с. 77. Система цитокинов, комплемента и современные методы иммунного анализа : учебно-методическое пособие / Л.В. Ковальчук, Л.В. 262 Ганковская, М.В. Хорева, Е.В. Соколова.-М.: Российский Государственный Медицинский Университет, 2001.- 158 с. 78. Снайдер, С.Х. Биологическая роль окиси азота / С.Х. Снайдер, Д.С. Бредт // В мире науки.- 1992.-№7.-С.15-24. 79. Современная концепция патогенеза бронхиальной астмы у детей / И.И. Балаболкин, И.Е., Смирнов, В.А. Булгакова и др. // Иммунопатология, аллергология, инфектология.-2006.-№1.-26-35. 80. Солодовникова, О.Н. «Кислородный взрыв» нейтрофильных лейкоцитов в патогенезе воспалительной реакции при гнойных инфекциях у детей / О.Н. Солодовникова, В.П. Молочный // Дальневосточный медицинский журнал.-2012.-№1.-С.118-122. 81. Состояние антиоксидантной системы у больных бронхиальной астмой разными формами / Б. Солонго, Т.П. Сизих, В.А. Чхенкели, Т.А. Растомпахова // Сиб. мед. журн. - 2004. - №2. -С.40-45. 82. Способ выявления сенсибилизации организма при аллергических заболеваниях / В.И. Пыцкий, Ю.П. Сюсюкин, О.Ю. Филатов, М.П. Шерстнев // Авторское свидетельство №1436643. Приоритет 13.12.85. Зарегистрир. 8.07.88. 83. Способ оценки противовоспалительной активности цитокинов: пат.2150113 Рос. Федерация: МПК 7 G01N33/52 / В.П. Еричев, Л.В. Ковальчук, Л.В. Ганковская и др.; заявитель и патентообладатель Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца - № 99101614/14; заявл. 28.01.1999; опубл. 27.05.2000, [Электронный ресурс] // Поиск патентов и изобретений, зарегистрированных в РФ и СССР. [Официальный сайт]. URL: http://www.freepatent.ru/patents/2150113.html (дата обращения 08.01.2015). 84. Способ получения бактериальных аллергенов: пат. 2183970 Рос. Федерация: МПК 7 А61К39/35, А61К39/02 / Федосеева В.Н., Камышева 263 В.А.; заявитель и патентообладатель ООО «Медалл» - № 2001102725; заявл. 31.01.2001; опубл. 27.06.2002, [Электронный ресурс] // Поиск патентов и изобретений, зарегистрированных [Официальный в РФ и СССР. сайт]. URL: http://www.findpatent.ru/patent/218/2183970.html (дата обращения 14.02.2014). 85. Стойко, Ю.М. Патогенетические аспекты применения нестероидных противовоспалительных препаратов в послеоперационном периоде / Ю.М. Стойко, В.Г. Гудымович // Медицинский совет. - 2009. - № 4. - С. 63-68. 86. Страчунский, Л.С. Нестероидные противовоспалительные средства : методическое пособие / Л.С. Страчунский, С.Н. Козлов.- Смоленск: Смоленская Государственная Медицинская Академия, 2008. - 54 с. 87. Структурная модификация мембран мононуклеарных клеток крови крыс в условиях экспериментального артрита и фармакотерапии нестероидными противовоспалительными средствами / Ю.И. Губский, Ф.П. Тринус, Т.А. Бухтиарова и др. // Журн. АМН України.-1999.-Т.5.№ 1.-С.110-120. 88. Стуров, Н.В. Клинико-фармакологическая характеристика НПВС для врача общей практики / Н.В. Стуров, В.И. Кузнецов // Журнал «Земский Врач» - 2011. - № 1. – С. 11-14. 89. Титова, Н.Д. Выявление аллергических реакций in vitro к пищевым красителям у детей с бронхиальной астмой и атопическим дерматитом / Н.Д. Титова // Педиатрия.-2011.-Т. 90.-№3.-С.38-43. 90. Титова, Н.Д. Аллергия на пищу и добавки / Н.Д. Титова // Неотложная помощь и профилактика аллергических заболеваний : сборник научных трудов.- Витебск: изд-во ВГМУ, 2008.- С.108-156. 91. Усанова, Е.А. Прайминг полиморфно-ядерных лейкоцитов крови доноров комплексами бактериальных антигенов Klebsiella pneumonia / 264 Е.А. Усанова, С.В. Чаусова, О.Ю. Филатов // II Всероссийская научнопрактическая конференция молодых ученых «Сибирские медикобиологические чтения»: мат. конф.- Барнаул, - 2012. - С. 80-81. 92. Филатов, О.Ю. Общие закономерности и диагностическое значение изменения образования активных форм кислорода лейкоцитами крови при аллергических и псевдоаллергических процессах: дис. …д-ра. мед. наук : 14.00.36 / Филатов Олег Юрьевич.-М., 1999. – 190 с. 93. Цитокины и оксид азота при бронхиальной астме / Ф.И. Петровский, Ю.А. Петровская, Л.М. Огородова и др. // Бюллетень сибирской медицины.-2002.-№1.- С.70-74. 94. Цурко, В.В. Взаимодействие нестероидных противовоспалительных препаратов с ингибиторами ангиотензинпревращающего фермента у больных ревматическими заболеваниями / В.В. Цурко, Д.В. Преображенский, О.А. Обухова // Терапевтический архив.-2003.-№5.С.64-70. 95. Цыпленкова, С.Э. Оксид азота в выдыхаемом воздухе: клиникофункциональные параллели при бронхиальной астме у детей / С.Э. Цыпленкова, Ю.Л. Мизерницкий // Аллергология.-2006.-№2.-С. 48-53. 96. Шагарова, С.Г. Содержание некоторых цитокинов в сыворотке крови и назальных смывах у больных бронхиальной астмой / С.Г. Шагарова, С.В. Смирнова // Цитокины и воспаление.-2010.-Том 9.-№4.-С.137-138. 97. Шерстнев, М.П. Роль нарушения барьерной и матричной функции липидного слоя биологических мембран в патологии / М.П. Шерстнев // Вопросы хемилюминесценции.-1990.-№1.-С. 19-20. 98. Шубич, М.Г. Медиаторные аспекты воспалительного процесса / М.Г. Шубич, М.Г. Авдеева // Архив патологии.-1997.-№2.-С.3-8. 99. Ярилин, А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии / А.А. Ярилин // Иммунология.-1997.-№6.-С.7-13. 265 100. Антиокислювальна та антирадикальна активність амізону, ацетилсаліцилової кислоти та ортофену / Ю.I. Губський, Г.Г. Горюшко, Т.М. Курапова и др. // Ліки.-1999.-№ 3-4.-С. 55—59. 101. Acetaminophen-derived activation of liver microsomal glutatione Strasferase of rats / M. Yonamine, Y. Aniya, T. Yokomakura, et al. // Jap. J. Pharmacol. - 1996. - V.72.-№ 2.-Р.175-181. 102. A controlled study of 9alpha,11beta-PGF2 (a prostaglandin D2 metabolite) in plasma and urine of patients with bronchial asthma and healthy controls after aspirin challenge / G. Bochenek, K. Nagraba, E. Nizankowska, et al. // J. Allergy Clin. Immunol.- 2003.- V.111.-Р.743-749. 103. Activation of nitric oxide release and oxidative metabolism by leukotrienes B4, C4, and D4 in human polymorphonuclear leukocytes / G. Larfars, F. Lantoine, M.-A. Devynck, et al. // Blood.- V. 93.- № 4.- Р. 1399-1405. 104. Activation of phospholipase D by interleukin-8 in human neutrophils / S. Sozzani, D .E. Agwu, M.D. Ellenburg, et al. // Blood.-1994.-V.84.-№11P.3895-3901. 105. Airway responsiveness to histamine and leukotriene E4 in subjects with aspirin-induced asthma / J.P. Arm, S.P. O’Hickey, B.W. Spur, T.H. Lee // Am. Rev. Respir Dis.- 1989.- V.140.-Р.148–153. 106. Allergen challenge of lung tissue from asthmatics elicits bronchial contraction that correlates with the release of leukotrienes C4, D4, and E4 / S.E. Dahlen, G. Hansson, P. Hedqvist, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.V.198380.-Р.1712-1716. 107. Ameison, I.C. PAF in Asthma / I.C. Ameison // Proceedings of a Symposium.-Toronto, 1986.-P.169-189. 108. Analyzing atopic and non-atopic asthma / J. Pekkanen, J. Lampi, J. Genuneit, et al. // Eur. J. Epidemiol.-2012.- V.27.-Р.281-286. 266 109. Anaphylactoid reactions due to nonsteroidal anti-inflammatory drugs: clinical and crossreactivity studies / J. Quiralte, C. Blanco, R. Castillo, et al. // Ann Allergy Asthma Immunol.- 1997.-V.78.-Р.293–296. 110. Angioedema and IgE antibodies to aspirin: a case report / M. Blanca, E. Perez, J.J. Garcia, et al. // Ann Allergy.- 1989.- V. 62.-Р.295–298. 111. Angioedema: Clinical and Etiological Aspects / K. Kulthanan, S. Jiamton, K. Boochangkool, K. Jongjarearnprasert // Clinical and Developmental Immunology.-2007:- URL: http://dx.doi.org/10.1155/2007/26438.html. 112. Antioxidant properties of aspirin: characterization of the ability of aspirin to inhibit silica-induced lipid peroxidation, DNA damage, NF-kappaB activation, and TNF-alpha production / X. Shi, М. Ding, Z. Dong, et al. // Моl. and Cell. Biochem.-1999.-V.199.- № 1-2.-P. 93-102. 113. Apparent hydroxylradical production by peroxynitrite: Implication for endotelial injury from nitric oxide and superoxide / J.S. Beckman, T.W. Beckman, J. Chen // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1990.- V.87.-Р.l620-1624. 114. A role for cysteinyl leukotrienes in airway remodeling in a mouse asthma model / W.R. Henderson, L.O. Tang, S.J. Chu, et al. // Am. J. Respir Crit. Care Med.- 2002.- V.165.-Р.108-116. 115. Ardekani, A.R. The inhibition of luminol-dependent chemiluminescence of lipoxygenase, myeloperoxidase, and human neutrophils by dipyridamole / A.R. Ardekani, D. English, K. Van Dyke // Microchem. J.-1986.- V.33.-№3.-309315. 116. Asero, R. Aspirin and paracetamol tolerance in patients with nimesulideinduced urticaria / R. Asero // Ann Allergy Asthma Immunol.-1998.- V.82.Р.237–238. 117. Asero, R. Chronic urticaria with multiple NSAID intolerance: is tramadol always a safe alternative analgesic? / R. Asero // J. Invest. Allergol. Clin. Immunol.- 2003.- V.13.-Р.55–58. 267 118. Asero, R. Clinical Management of Adult Patients with a History of Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drug–Induced Urticaria/Angioedema / R. Asero // Update Allergy, Asthma, and Clinical Immunology.-2007.-V.3.-№ 1Р. 24–30. 119. Asero, R. Leukotriene receptor antagonists may prevent NSAID-induced exacerbations in patients with chronic urticaria / R. Asero // Ann. Allergy Asthma Immunol.- 2000.- V.85.-Р.156–157. 120. Asero, R. Risk factors for acetaminophen and nimesulide intolerance in patients with NSAID-induced skin disorders / R. Asero // Ann Allergy Asthma Immunol.-1999.- V.82.-Р.554–558. 121. Asero, R. Tolerability of rofecoxib / R. Asero // Allergy.- 2001.- V.56.Р.916–917. 122. Association between serotonin transporter gene polymorphisms and childhood asthma / S. Farjadian, M. Moghtaderi, B. Fakhraei, et al. // Asthma.2013.- V.50.-№10.-1031-1035. 123. Association of HLA-DR11 with the anaphylactoid reaction caused by nonsteroidal anti-inflammatory drugs / J. Quiralte, F. Sanchez-Garcia, M.J. Torres, et al. // J. Allergy Clin. Immunol.- 1999.-V.103.-Р.685–689. 124. Association of stem cell factor expression in nasal polyp epithelial cells with aspirin sensitivity and asthma / M.L. Kowalski, A. Lewandowska-Polak, J. Wozniak, et al. // Allergy.- 2005.- V.60.- Р.631–637. 125. Association of urinary leukotriene E4 excretion during aspirin challenges with severity of respiratory responses / P.J. Daffern, D. Muilenburg, T.E. Hugli, et al. // J. Allergy Clin. Immunol.- 1999.- V.104.-№3.- Р.559-564. 126. Aspirin as a free radical scavenger: consequences for therapy of cerebrovascular ischemia / W. Kuhn, T. Muller, T. Bitner, M. Gerlach // Stroke. - 1995. -V.26.- № 10. -P.1959-1960. 268 127. Aspirin-Exacerbated Respiratory Disease Involves a Cysteinyl LeukotrieneDriven IL-33-Mediated Mast Cell Activation Pathway / T. Liu, Y. Kanaoka, N.A. Barrett, et al. // J. Immunol.- 2015.- V.195.- № 8.-P.3537-3545. 128. Aspirin- induced neutrophil chemotactic activity in patients with aspirinsensitive urticaria after desensitization to the drug / I. GrzelewskaRzymowska, M. Szmidt, J. Rozniecki, et al. // Invest. Allergol. Clin. Immunol. -1994. - V.5. - №1. – P.28-31. 129. Aspirin-intolerant asthma (AIA) assessment using the urinary biomarkers, leukotriene E4 (LTE4) and prostaglandin D2 (PGD2) metabolites / N. Higashi, M.Taniguchi, H. Mita, et al. // Allergol. Int.- 2012.- V.61.-Р.393-403. 130. Aspirin protects endothelial cells from oxidative stress—possible synergism with vitamin E / H.P. Podhaisky, A. Abate, T. Polte, et al. // FEBS Lett.1997.-V.417.-№3.-P. 349–351. 131. Aspirin sensitivity and severity of asthma: evidence for irreversible airway obstruction in patients with severe or difficult-to-treat asthma / K. Mascia, T. Haselkorn, Y.M. Deniz et al. // J. Allergy Clin. Immunol.- 2005.-V. 116.- Р. 970–975. 132. Aspirin-sensitive rhinosinusitis is associated with reduced E-prostanoid 2 receptor expression on nasal mucosal inflammatory cells / S. Ying, Q. Meng, G. Scadding, et al. // J. Allergy Clin. Immunol.- 2006.- V.117.-Р.312-318. 133. Aspirin-tolerant asthmatics generate more lipoxins than aspirin-intolerant asthmatics/M. Sanak, B.D. Levy, C.B. Clish, et al.//Eur. Respir. J.-2000.V.16.-Р.44-49. 134. Aspirin-triggered 15-HETE generation in peripheral blood leukocytes is a specific and sensitive Aspirin-Sensitive Patients Identification Test (ASPITest) / M.L. Кowalski, A. Ptasinska, M. Jedrzejczak, et al. // Allergy.-2005.- V.60.№9.-Р.1139-1145. 269 135. Basic biology and clinical application of specific cyclooxygenase-2 ingibitors / Crofford L.G., Lipsky PE, Brooks P., et al. // Arthritis Rheum.2000.-V.43.-№1.-Р.4-13. 136. Basophil histamine release by platelet-activating factor in aspirin-sensitive subjects with asthma / Y. Okuda, H. Hattori, T. Takashima, et al. // J. Allergy Clin. Immunol.- 1990.- V.86.- P.548–553. 137. Barnes, P.G. NO or no NO in asthma? / P.G. Barnes // Torax.- 1996.-V.51.Р.218-220. 138. Barnes, P.J. Nitric oxide and asthmatic inflammation / P.J. Barnes, F.Y. Liew // Immunol Today.-1995.-V.16.-P.128-130. 139. Biochemical pathogenesis of aspirin exacerbated respiratory disease / A. Narayanankutty, J.M. Reséndiz-Hernández, R. Falfán-Valencia, L.M. Teran // Clin. Biochem.- 2013.- V.46.-№7-8.-Р.566-578. 140. Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granul ocytes from human blood / A. Boyum // Scand. J. Clin. Invest. – 1968. – V.21. – P. 77-89. 141. Brar, D.W. Recombinant interferon-gamma preserves human granulocyte bactericidal and chemo-luminescence activities / D.W. Brar, E.C. Borden, R.A. Proctor // J.Infect.Dis. - 1993. - V.168.- №l.- Р.128-134. 142. Bronchial aspirin challenge causes specific eicosanoid response in aspirinsensitive asthmatics / A. Szczeklik, K. Sladek, R. Dworski, et al. // Am. J. Respir. Crit. Care Med.-1996.- V.154.-№6.-Р.1608-1614. 143. Bird, J. Inflammation Research / J. Bird // J. Pharmacol. Methods.-1985.V.14.- №4.-Р.305-312. 144. Cahill, K.N. Aspirin exacerbated respiratory disease: the search for a biomarker / K.N. Cahill, T.M. Laidlaw // Ann Allergy Asthma Immunol.2014.-V.113.- №5.- Р.500-501. 145. Characterization of a novel human mast cell line that responds to stem cell factor and expresses functional FcεRI / T.M. Laidlaw, J.W. Steinke, A.M. Tiñana, et al. // J. Allergy Clin Immunol.- 2011.-V.127.-№3.- Р.815-822. 270 146. Chemiluminescent and flow cytometric analysis of gamma interferon preincubation on neonatal and adult rat polymorphonuclear leukocytes / R.R. Wittler, M.M. Lieberman, D.D. Paine, et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol.1996.- V.3.-№5.-Р.527-532. 147. Ching, T.L. The effect of histamine on the oxidative burst of HL60 cells before and after exposure to reactive oxygen species / T.L. Ching, J.G. Koelemij, A. Bast // Inflammatory Research. - 1995.-V.44.- № 3. - P. 99-104. 148. Choi, J.H. An update on the pathogenesis of the upper airways in aspirinexacerbated respiratory disease / J.H. Choi, M.A. Kim, H.S. Park // Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol.- 2014.- V.14.-Р.1-6. 149. Clinical feature of asthmatic patients with increase urinary leucotriene E4 excretion (hyperleukotritnuria): Involvemtnt of chronic excretion hyperplastic rhinosinusitis with nasal polyposis / N. Higashi, M. Taniguchi, H. Mita, et al. // Allergy Clin. Immunol. -2004. - V.113. – P.277-283. 150. Contribution of chemiluminescence nitric / S. oxide Kudoh, K. synthase to Suzuki, M. human neutrophil Yamada, et al. // Luminescence.- 1999.- V.14.-№6.-P.335-339. 151. Correlation between the prostaglandin D(2)/E(2) ratio in nasal polyps and the recalcitrant pathophysiology of chronic rhinosinusitis associated with bronchial asthma / T. Yoshimura, M. Yoshikawa, N. Otori, et al. // Allergol Int.-2008.- V.57.-Р.429-436. 152. Corren, J. Asthma phenotypes and endotypes: an evolving paradigm for classification / J. Corren // Discov. Med.-2013. -V.15.-Р.243-249. 153. COX-3, a cyclooxygenase-1 variant inhibited by acetaminophen and other analgesic/antipyretic drugs: cloning, structure, and expression / N.V. Chandrasekharan, H. Dai, K.L. Roos, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.2002.-V.99.-№21.-Р.13926-13931. 271 154. Cutting edge: Leukotriene C4 activates mouse platelets in plasma exclusively through the type 2 cysteinyl leukotriene receptor / H.E. Cummings, T. Liu, C. Feng, et al. // J. Immunol.- 2013.- V.191.- №12.-Р.5807-5810. 155. Cyclooxygenase-2 mRNA is downexpressed in nasal polyps from aspirinsensitive asthmatics / C. Picado, J.C. Fernandez-Morata, M. Juan, et al. // Am. J. Resp. Crit. Care Med.-1999.- V.160.- Р.291-296. 156. CysLT1 receptor engagement induces activator protein-1- and NF- Bdependent IL-8 expression / C. Thompson, A. Cloutier, Y. Bossґe et al. // American Journal of Respiratory Cell andMolecular Biology.-2006.- V. 35.- № 6.-Р. 697–704. 157. Cysteinyl leukotrienes enhance tumour necrosis factor- -induced matrix metalloproteinase-9 in human monocytes/macrophages / T. Ichiyama, M. Kajimoto, M. Hasegawa, et al. // Clinical & ExperimentalAllergy.-2007.V.37.- № 4.-Р. 608–614. 158. Cysteinyl leukotrienes induce macrophage inflammatory protein-1 in human monocytes/macrophages / T. Ichiyama, M. Hasegawa, K. Hashimoto, et al. // International Archives of Allergy and Immunology.-2009.- V. 148.- № 2.Р.147–153. 159. Cysteinyl leukotrienes induce monocyte chemoattractant protein-1 in human monocyte/macrophages via mitogen-activated protein kinase and nuclearfactor- b pathways / K. Hashimoto, T. Ichiyama, M. Hasegawa, S., et al. // International Archives of Allergy andImmunology.-2009.- V.149.-№ 3.-Р. 275–282. 160. Cysteinyl leukotrienes induce vascular endothelial growth factor production in human monocytes and bronchial smooth muscle cells / S. Poulin, C. Thompson, M. Thivierge, et al. // Clinical & Experimental Allergy.-2011.- V. 41.-№2.-Р.204–217. 272 161. Cysteinyl leukotriene overproduction in aspirin-exacerbated respiratory disease is driven by platelet-adherent leukocytes / T.M. Laidlaw, M.S. Kidder, N. Bhattacharyya, et al. // Blood.-2012.- V.119.- Р.3790-3798. 162. Cysteinyl Leukotriene Receptor-1 Antagonists as Modulators of Innate Immune Cell Function / A. J. Theron, H. C. Steel, G. R. Tintinger, et al. // Hindawi Publishing Corporation Journal of Immunology Research.-2014.URL: http://hdl.handle.net/2263/45418.html. 163. Czech, W. Chemotactic 5-oxo-eicosatetraenoic acids induce oxygen radical production, Ca2+-mobilization, and actin reorganization in human eosinophils via a pertussis toxin-sensitive G-protein. / W. Czech, M. Barbisch, K. Tenscher // J. Invest. Dermatol.-1997.-V.108.- № 1.-P. 108-112. 164. Dai, H.-F. Role of nonsteroidal anti-inflammatory drugs in the prevention of post-ERCP pancreatitis: a meta-analysis / H.-F. Dai, X.-W. Wang, K. Zhao // Hepatobiliary Pacreat. Dis. Int. – 2009. – V.8.-№1.-Р.11-16. 165. Deficient prostaglandin E2 production by bronchial fibroblasts of asthmatic patients, with special reference to aspirin-induced asthma / M. Pierzchalska, Z. Szabo, M. Sanak, et al. // J. Allergy Clin. Immunol.- 2003.- V.111.-Р.1041– 1048. 166. Desensitization to acetylsalicylic acid (ASA) in ASA-sensitive patients with rhinosinusitis/asthma / D.D. Stevenson, W.W. Plskow, J.C. Curd., et al. // Pseudo-allergic reactions. Involvement of drugs and chemicals. Karger, Basel, 1982.-V.3.-P.133-156. 167. Diagnostic value of clinical parameters in the prediction of aspirinexacerbated respiratory disease in asthma / H.S. Chang, J.S. Park, A.S. Jang, et al. // Allergy Asthma Immunol. Res.- 2011.- V.3.-Р.256-264. 168. Differential effects of aspirin and misoprostol on15 hydroxyeicosatetraenoic acid generation by leukocytes from aspirin-sensitive asthmatic patients / M.L. Kowalski, A. Ptasinska, B. Bienkiewicz, et al. // Allergy Clin Immunol.-2003.V.112.- P.505–512. 273 169. Differential metabolism of arachidonic acid in nasal polyp epithelial cells cultured from aspirin-sensitive and as-pirin-tolerant patients / M.L. Kowalski, R. Pawliczak, J. Wozniak, et al. // Am. J. Resp. Crit. Care Med.- 2000.V.161.-Р.391–398. 170. Different rates of autoreactivity in patients with recurrent idiopathic angioedema associated or not with wheals / A. Tedeschi, R. Asero, M. Lorini, A.V. Marzano, M. Cugno // J. Investig Allergol. Clin. Immunol.-2012.-V. 22.№2.-Р.87-91. 171. Dinis, Т.С. Action of phenolicderivatives (acetaminophen, salicylate and 5aminosalicylate) as inhibitors of membrane lipid peroxitation and peroxylradical scavengers / Т.С. Dinis, V.М. Maderia, L.М. Almedia // Arch. Biochem. and Biophys.-1994.-V.315.- №1.-P. 161-169. 172. Dipalma, J.R. Tartrazine sensitivity / J.R. Dipalma // Am. Fam. Physician.1990.- V.42.-№5.-Р.1347–1350. 173. Direct evidence for a role of the mast cell in the nasal response to aspirin in aspirin-sensitive asthma / A.R. Fischer, M.A. Rosenberg, C.M. Lilly, et al. //J. Allergy Clin. Immunol.- 1994.- V.94.-Р.1046-1056. 174. Direct stimulation of the oxidative activity of isolated equine neutrophils by TNF-alpha and IL-1beta / H. Benbarek, G. Deby-Dupont, C. Deby, D. Serteyn // Vet. Immunol. Immunopathol.- 2008.- V.121.-№1-2.-Р.101-106. 175. Diverging signal transduction pathways activated by interleukin-8 and releated chemokines in human neutrophils: Interleukin-8, bat not NAP-2 of GROα, stimulates phospholipase D activity / G.P. L'Heureux, S. Bopurgoin, N. Jean, et al. // Blood- 1995.-V.85.-№2.-P.522-531. 176. Dowling E.J., Symons A.N., Jasani M.K. Free radical production at the site of an acute inflammatory reaction as measured by chemiluminescence // Int. J Tissue React.-1987.-V.9.-№5.-p.385-391. 274 177. Dugas, N. Role LTB4 in the interleukin- -4-induced human mononuclear phagocytic activation / N. Dugas, B. Dugas, О. Kolb // Immunology. - 1996. V.88.-№3. - P.1384-1388. 178. Dynamics of eicosanoids in peripheral blood cells during bronchial provocation in aspirin-intolerant asthmatics / D. Schafer, M. Schmid, U.C. Gode, et al. // Eur. Respir. J.- 1999.- V.13.-Р.638-646. 179. Effects of aspirin on ferritin expression and resistance to oxidative damage in endothelial cells / Z. He, Q. Liao, X. Xu, et al. // Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2001. - V.81.- № 9.- P.532–535. 180. Effect of endobronchial aspirin challenge on inflammatory cells in bronchial biopsy samples from aspirin-sensitive asthmatic subjects / S. Nasser, P.E. Christie, R. Pfister, et al. // Thorax.-1996.-V.51.- Р.64–70. 181. Effect of H1 and H2 agonists on the chemiluminescence of human blood mononuclear cells induced by phitohaemagglutinin / K. Meterey, M.I. Fekete, U. Bohm, A. Falus // Immunpharmacology.- 1985.- V.9.- №3.- Р.175-180. 182. Effect of non-steroidal anti-inflammatory drugs on lipid peroxidation by hydroxyl radical / Y. Tsujimoto, K. Saitoh, M. Kashima, et al. // General Pharmacol. - 1998. - №3. - Р. 405-408. 183. Eicosanoids in bronchoalveolar lavage fluid of aspirin-intolerant patients with asthma after aspirin challenge / K. Sladek, R. Dworski, J. Soja, et al. // Am. J. Respir Crit. Care Med.- 1994.- V.149.-Р.940-946. 184. Eicosanoids in exhaled air after non-specific challenge in patients with asthma / M. Kaszuba, J. Kaszuba, A. Sawina, et al. // Hypersensitivity.-2013.URL:http://dx.doi.org/10.7243/2052-594X-1-4.html. 185. Endotypes and phenotypes of chronic rhinosinusitis: a PRACTALL document of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology and the American Academy of Allergy, Asthma & Immunology / C.A. Akdis, C. Bachert, C. Cingi, et al. // J. Allergy Clin. Immunol.-2013.- V.131.- Р.14791490. 275 186. Enhanced expression of cyclooxygenase isoenzyme 2 (COX-2) in asthmatic airways and its cellular distribution in aspirin-sensitive asthma / A. Sousa, R. Pfister, P.E. Christie, et al. // Thorax.-1997.- V.52.-№11.-Р.940-945. 187. Enhanced expression of the leukotriene C(4) synthase due to overactive transcription of an allelic variant associated with aspirin-intolerant asthma / M. Sanak, M. Pierzchalska, S. Bazan-Socha, et al. // Am. J. Respir Cell Mol. Biol.- 2000.- V.23.-№3.-Р.290-296. 188. Enhancement of polymorphonuclear cell phagocytosis by lipid A- activated monocytes via cell-to-cell contact: A possible role for membrane-associated IL-6 and IL-8 / P. Decandia, M. Serrone, L. Pestillo, et al. // J.Zhejiang Forest.Sci.аnd Technol.-1993.-V.13.-№5.-P.49-58. 189. Eosinophils in allergy: role bin disease, degranulation, and cytokines / L.B. Martin, H. Kita, K.M. Leiterman, G.J. Gleich // Int. Acch. Allergy Immunol.1996.- V.109.-№3.-Р.207-215. 190. European position paper on rhinosinusitis and nasal polyps 2012: a summary for otorhinolaryngologists / W.J Fokkens., V.J. Lund, J. Mullol, et al. // Rhinology.-2012.- V.50.-Р.1-12. 191. Evidence for distinct cytokine expression in allergic versus nonallergik chronic sinusitis / D.L. Hamilos, D.Y. Leung, R. Wood, et al. // J. Allergy Clin Immunol.-1995.-V.96.-Р.537. 192. Exhaled eicosanoids following bronchial aspirin challenge in asthma patients with and without aspirin hypersensitivity: the pilot study / L. Mastalerz, M. Sanak, J. Kumik, et al. // Journal of Allergy.- 2012.- URL: http://dx.doi.org/10.1155/2012/696792. html. 193. Expression of arachidonate metabolism enzymes and receptors in nasal polyps of aspirin-hypersensitive asthmatics / A.M. Adamusiak, O. Stasikowska-Kanicka, A. Lewandowska-Polak, et al. // Int. Arch. Allergy Immunol.- 2012.- V.157.-№4.- Р.354-62. 276 194. Expression of the cysteinyl leukotriene receptors cysLT(1) and cysLT(2) in aspirin-sensitive and aspirintolerant chronic rhinosinusitis / C. Corrigan, K. Mallett, S. Ying, et al. // J. Allergy Clin. Immunol.- 2005.- V.115.-Р.316–322. 195. Expression of 5-lipoxygenase and cyclooxygenase pathway enzymes in nasal polyps of patients with aspirin-intolerant asthma / J. Adamjee, Y.J. Suh, H.S. Park, et al. // J. Pathol.- 2006.-V.209.-№3.-P.392-399. 196. Floctafenine: a valid alternative in patients with adverse reactions to nonsteroidal anti-inflammatory drugs / G. Papa, A. Romano, A. Del Bono, et al. // Ann. Allergy Asthma Immunol.- 1997.- V.78.-Р.74–78. 197. Freeman, B. Free radical chemistry of nitric oxide: Looking at the dark side / B. Freeman // Chest.-1994.- V.l05.-Р.79-84. 198. Genome-wide methylation profile of nasal polyps: relation to aspirin hypersensitivity in asthmatics / H.S. Cheong, S.M. Park, M.O. Kim, et al. // Allergy.- 2011.- V.66.-Р.637-644. 199. Grant, J.A. A report of a rare immediate reaction after ingestion of acetaminophen / J.A. Grant, J.M. Weiler. // Ann Allergy Asthma Immunol.2001.- V.87.-Р.227–229. 200. Granulocyte migration in vitro and in vivo in healthy children of parents with aspirin-sensitive asthma / R. Matusiewitz, K. Grzylowska, A. Grzylowska, et al. // Invest. Allergol. Clin. Immunol. -1993. - V.3. - №5. – P.259-264. 201. Grob, M. Anaphylaxis to celecoxib / M. Grob, W.J. Pichler, B. Wuthrich // Allergy.- 2002.- V.57.-Р.264–265. 202. Gyllenhammar, H. Mechanisms for luminal-augmented chemiluminescence from neutrophils induced by leukotriene B4 and N-formyl-methionyl-leucylphenylalanine / H. Gyllenhammar // Photochemistry and Photobiology.-1989.- V.49.-№2.-Р. 217–223. 277 203. Czerniawska-Mysik, G. Idiosyncrasy to pyrazolone drugs / G. CzerniawskaMysik, A. Szczeklik // Allergy.- 1981.- V.36.-Р.381–384. 204. Halliwell, В. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease / В. Halliwell, M.C. Guttrridge // Моl. and Cell. Biochem.-1984.-V.219.- № 1.P. 1-14. 205. Heck, D. Epidermal growth factor supresses nitric oxide and nitrogen peroxile production by keratinocytes / D. Heck, D. Laskin // J. Biol. Chem. 1992. - V. 267. - P. 21277-21280. 206. Heimburger, M.and J. E. Palmblad, “Effects of leukotriene C4 and D4, histamine and bradykinin on cytosolic calcium concentrations and adhesiveness of endothelial cells and neutrophils / M. Heimburger, J. E. Palmblad // Clinical & Experimental Immunology.-1996.- V.103.-№ 3.-Р. 454–460. 207. Heme oxygenase-1 induction may explain the antioxidant profile of aspirin / N. Grosser, A. Abate, S. Oberle, et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. - V.308.- № 4. - P.956–960. 208. Heterogeneous nitrite production by IL-4-stimulated human monocytes and peripheral blood mononuclear cells / N. Paul-Eugene, J.P. Kolb, C. Damais, et al. // Immunol. Lett.-1994.-V.42.-№1-2.- P.31-34. 209. Heterogeneous spontaneous and interleukin-4-induced nitric oxide production by human monocytes / G. Mautino, N. Paul-Eugene, P. Chanes, et al. // J. Leukoc. Biol. 1994.-V.56.-№1.-P.15-20. 210. High levels of nitric oxide synthase activity are associated with nasal polyp tissue from aspirin- sensitive asthmatics / A. Parikh, G.K. Scadding, P. Gray, et al. // Acta Otolaryngol.-2002.- V.122.-№3.-Р.302-305. 211. Histaminemia after aspirin challenge in aspirin-sensitive asthmatics / M. Szmidt, I. Grzelewska-Rzymowska, J. Rozniecki, et al. / Agents Actions.1981.- V.11.-№1-2.-Р.105-107. 278 212. Histamine, norepinephrine and serotonin content of nasal polyps / R.M. Bumsted, T. El-Ackad, J.M. Smith, M.J. Brody // Laryngoscope.-1979.- V.89.-Р.832-843. 213. Hypersensitivity to aspirin: common eicosanoid alterations in urticaria and asthma / L. Mastalerz, M. Setkowicz, M. Sanak, A. Szczeklik // J. Allergy Clin. Immunol.-2004.- V.113.-Р.771–775. 214. Hypersensitivity to nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) – classification, diagnosis and management: review of the EAACI/ENDA and GA2LEN/HANNA / Kowalski M.L., Makowska J.S., Blanca M., et al. // Allergy.- 2011.- V.66.- Р.818–829. 215. IL-10 does not affect oxidative burst and expression of selected surface antigen on human blood phagocytes in vitro / L. Gallová, L. Kubala, M. Cíz, A. Lojek // Physiol. Res.- 2004.- V.53.-№2.-Р.199-208. 216. Impaired EP2 Expression Causes Resistance to Prostaglandin E2 in Nasal Polyp Fibroblasts from Subjects with AERD Zhou, et al. // / K.N. Cahill, B.A. Raby, X. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.- 2015.- URL: http://dx.doi.org/10.1165/rcmb.2014-0486OC.html. 217. Improvement of aspirin intolerant asthma by montelukast, a leukotriene antagonist : a randomized, double-blind, placebo-controlled trial / S. Dahlen, K. Malmstron., E. Nizankowska, et al. // Am. J. Resp. Crit. Care med. -2002. – V.165. – P.9-14. 218. Increased amount of nitric oxide in exhaled air of asthmatics / К. Alving, E. Weitzberg, J.M. Lundberg // Eur. Resp. J.- 1993.-V.6.-Р.l368-1370. 219. Increased exhaled cysteinyl- leukotrienes and 8- isoprostane in aspirininduced asthma / A. Antczak, P. Montuschi, S. Kharintonov, et al. // Am. J. Resp. Crit. Care med. -2002. - V.166. – №3.- P.301-306. 220. Increased exhaled nitric oxide in active pulmonary tuberculosis due to inducible NO synthase upregulation in alveolar macrophages / C.H. Wang, C.Y. Lin, H.C. Lin, C.T. Yu // Eur. Resp. J.- 1998.- V.11.- Р.809-815. 279 221. Increased exhaled nitric oxide in clironic bronchitis: Comparison with asthma and COPD / F.M. Delen, J.M. Sippel, M.L. Osborne, et al. // Chest.2000.-V.117.-№3.- Р.695-701. 222. Increased formation of potent oxidant peroxynitrite in airways of asthmatic patients is associated with induction of nitric oxide synthase: effect of inhaled glucocorticoid / Saleh P., Ernst P., Lim S., Barnes P.J., Giad A. // FASEB J.1998.- V.9110.-Р.929-937. 223. Increased levels of cysteinyl-leukotrienes in saliva,induced sputum, urine and blood from patients withaspirin-intolerant asthma / F. Gaber, K. Daham, A. Higashi, et al. // Thorax.- 2008.- V.63.-Р.1076–1082. 224. Increased levels of free serotonin in plasma of symptomatic asthmatic patients / F. Lechin, B. van der Dijs, B. Orozco, et al. // Ann Allergy Asthma Immunol.- 1996.- V.77.-Р.245–253. 225. Inflammatory cell populations in bronchial biopsies from aspirin-sensitive asthmatic subjects / S.M. Nasser, R. Pfister, P.E. Christie, et al. // Am. J. Respir Crit. Care Med.- 1996.- V.153.-№1.-Р.90-96. 226. Ingibition of nasal polyp mast cell and eosinophil activation by desloratadin / M. L. Kowalski, A. Lewandodowska., J.Wozniak, et al. Allergy.-2005.-V.60.№80-85. 227. Inhaled leukotriene E(4), but not leukotriene D(4), increased airway inflammatory cells in subjects with atopic asthma / G.M. Gauvreau, K.N. Parameswaran, R.M. Watson, et al. // Am. J. Respir Crit. Care Med.- 2001.V.164.-Р.1495-1500. 228. Inhaled PGE2 prevents aspirin-induced bronchoconstriction and urinary LTE4 excretion in aspirin-sensitive asthma / P. Sestini, L. Armetti, G. Gambaro, et al. // Am. J. Respir Crit. Care Med.-1996.- V.153.-Р.572-575. 229. Interactive inhibitory effects of formoterol and montelukast on activated human neutrophils / C. M. Gravett, A. J. Theron, H. C. Steel, et al. // European Respiratory Journal.- V. 36.- №6.-Р. 1417–1424. 280 230. Intranasal challenge with aspirin induces cell influx and activation of eosinophils and mast cell in nasal secretions of aspirin-sensitive patients / M.L. Kowalski, J. Grzegorczyk, B. Wojciechowska, M. Poniatowska // Clin.Exp.Allergy.-1996.- V.26.-№7.-P.807-814. 231. In vitro effects of prostaglandin E1, prostaglandin E2, indomethacin, histamine, and tuftsin on chemiluminescence response of bovine polymorphonuclear leukocytes / T.R. Phillips, W.C. Yang, R.D. Schultz // Veterinary immunology and immunopathology.- 1987.- V.14.-№3.-Р. 233-244. 232. In vitro release of arachidonic acid metabolites, glutathione peroxidase and oxygen- free radicals from platelets of asthmatic patients with and without aspirin intolerance/ G. Celik, S. Bavek, Z. Misirligil, et al. // Thoraz. -1995.– V.50. - №5. – P.490-496. 233. Jenkins, C. Systematic review of prevalence of aspirin-induced asthma and its implication for clinical practice / C. Jenkins, J. Costello, L. Hodge // Br. Med .-2004. –V. 328.– P.43-44. 234. Johns, C.B. Elevated total serum IgE in nonatopic patients with aspirinexacerbated respiratory disease / C.B. Johns, T.M. Laidlaw // Am J Rhinol Allergy.-2014.-V.28.-№4.-Р.287-289. 235. Kharitonov, S.A. Elevated levels of exhaled nitric oxide in bronchiectasis / S.A. Kharitonov, A.U. Wells, B.J. Oconnor // Am. J. Resp. Crit. Care Med.1995.- V.51.-Р. l889-1893. 236. Kharitonov, S.A. Increased nitric oxide in exhaled air of asthmatic patients / S.A. Kharitonov, D. Yates, R.A. Robbins // Lancet.-1994.-V.343.-Р.l33-135. 237. Kim, M.S. Cytometry-Assisted Basophil Activation Test as a Safe Diagnostic Tool for Aspirin/NSAID Hypersenstivity / M.S. Kim, Y.J. Cho //Allergy Asthma Immunol Res.- 2012.- V.4.-№3.-Р.137-142. 238. Kitsis, E.A. The prostaglandin paradox: additive inhibition of neutrophil function by aspirin-like drugs and the prostaglandin El analog misoprostol / 281 E.A. Kitsis, G. Weissmann, S.B. Abramson // J.Rheumatol. - 1991. - V.18.№10. - P.1461-1465. 239. Kivity, S. Acetaminophen hypersensitivity / S. Kivity, I. Pawlik, J. Katz // Allergy.- 1999.- V.54.-Р.187–188. 240. Kovalchuk, L.V. A metod of evaluating anti-inflammatory activity of cytokines / L.V. Kovalchuk, L.V. Gankovskaya //J. Ocular Pharmacology.1996.-V.12.-№3.-Р.271. 241. Kowalski, M. L., Makowska J. S. Аспирин-зависимые заболевания органов дыхания. Современные подходы к диагностике и лечению / M. L. Kowalski, J. S. Makowska // Астма.-2006.-Т.7.-№1-2.-С.13-24. 242. Laidlaw, T.M. Cysteinyl leukotriene receptors, old and new; implications for asthma / T.M. Laidlaw, J.A. Boyce // Clin. Exp. Allergy.- 2012.- V.42.-№9.Р.1313-1320. 243. Laidlaw, T.M. How Patient Experiences Should Change Our Approach to Treating Patients with Aspirin-Exacerbated Respiratory Disease / T.M. Laidlaw // J. Allergy Clin. Immunol. Pract.-2015.- V.3.-№5.-Р.719-720. 244. Laidlaw, T.M. Pathogenesis of Aspirin-Exacerbated Respiratory Disease and Reactions / T.M. Laidlaw, J.A. Boyce // Immunol. Allergy. Clin. North. Am.2013.-V.33.-№2.-Р.195-210. 245. Laidlaw, T.M. Platelets in patients with aspirin-exacerbated respiratory disease / T.M. Laidlaw, J.A. Boyce // J. Allergy Clin. Immunol. - 2015.V.135.-№6.-Р.1406-1414. 246. Lane, S.J. Mast cell effector mechanisms / S.J. Lane, T.H. Lee // J. Allergy Clin Immunol.- 1996.- V.98.-67-71. 247. Lee, R.U. Aspirin-exacerbated respiratory disease: evaluation and management / R.U. Lee, D.D. Stevenson // Allergy Asthma Immunol. Res.2011.- V.1.-Р.3-10. 282 248. Leino, L. Histamine receptors on leucocytes are expressed differently in vitro and in vivo / L. Leino, E.M. Lilius // Int. Arch.Allergy Appl. Immunol.1990.- V.91.- №1.- Р. 30-35. 249. Lemanske, R.F. Inflammatory events in asthma: an expanding equation / R.F. Lemanske // J. Clin.Immunol.- 2000.-V.105.-№6.-P.633-636. 250. Leukotrienes are potent constrictors of human bronchi / S.E. Dahlen, P. Hedqvist, S. Hammarstrom, et al. // Nature.-1980.-V.288.-Р.484-486. 251. Leukotrienes C4 and D4 sensitize human neutrophils for hyperreactivity to chemoattractants / A. J. Theron, C. M. Gravett, H. C. Steel, et al. // Inflammation Research.- V.58.- № 5.-Р. 263–268. 252. Leukotriene D4 enhances tumor necrosis factor- -induced vascular endothelial growth factor productionin human monocytes/macrophages / Y. Haneda, S. Hasegawa, R. Hirano, et al. // Cytokine.-2011.- V.55.- №1.- Р. 24– 28. 253. Leukotriene D4 induces gene expression in human monocytes through cysteinylleukotriene type I receptor / G. Woszczek, L.-Y. Chen, S. Nagineni, et al. // Journal of Allergy & ClinicalImmunology.- 2008.-V.121.-№1.-Р. 215– 221. 254. Leukotrienes enhance the bactericidal activity of alveolar macrophages against Klebsiella pneumonia through the activation of NADPH oxidase C. H. C. Serezani, D. M. Aronoff, S. Jancar, et al. // Blood.- 2005.-V.106.- №3.-Р. 1067–1075. 255. Leukotrienes promote plasma leakage and leukocyte adhesion in postcapillary venules: in vivo effects with relevance to the acute inflammatory response / S.E. Dahlen, J. Bjork, P. Hedqvist, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.- 1981.- V.78.- Р.3887-3891. 256. Leukotriene-receptor expression on nasal mucosal inflammatory cells in aspirin-sensitive rhinosinusitis / A.R. Sousa, A. Parikh, G. Scadding, et al. // N. Engl. J. Med. 2002.- V.347.-Р.1493-1499. 283 257. Levy, M.B. Anaphylaxis to celecoxib / M.B. Levy, J.N. Fink // Ann. Allergy Asthma Immunol.- 2001.- V.87.-Р.72–73. 258. Lin, C.C. Pulmonary function changes and increased Th-2 cytokine expression and nuclear factor kB activation in the lung after sensitization and allergen challenge in brown Norway rats / C.C. Lin, C.Y. Lin, H.Y. Ma // Immunol. Lett.- 2000.- V.73.- P.57-64. 259. Lipopolysaccharide-dependent prostaglandin E(2) production is regulated by the glutathione-dependent prostaglandin E(2) synthase gene induced by the Toll-like receptor 4/MyD88/NF-IL6 pathway / S. Uematsu, M. Matsumoto, K. Takeda, et al. // J. Immunol. 2002.- V.168.-Р.5811-5816. 260. Long-term tolerability of nimesulide and acetaminophen in nonsteroidal anti-inflammatory drug-intolerant patients / D. Quaratino, A. Romano, G. Papa, et al. // Ann Allergy Asthma Immunol.- 1997.- V.79.-Р.47–50. 261. Machado-Carvalho, L. Prostaglandin E2 receptors in asthma and in chronic rhinosinusitis/nasal polyps with and without aspirin hypersensitivity / L. Machado-Carvalho, J. Roca-Ferrer, C. Picado // Respiratory Research.- 2014.V.15.-№1.-Р.100-109 262. Maclouf, J.A. Transcellular metabolism of neutrophil-derived leukotriene A4 by human platelets. A potential cellular source of leukotriene C4 / J.A. Maclouf, R.C. Murphy // J. Biol. Chem.-1988.-V.263.-P.174-181. 263. Mahdi, J.G. The historical analysis of aspirin discovery, its relation to the willow tree and antiproliferative and anticancer potential / J.G. Mahdi, A.J. Mahdi, I.D. Bowen // Cell proliferation.-2006.-V.39.-№2.-Р.147–55. 264. Mastalerz, L. Mechanism of chronic urticaria exacerbation by aspirin / L. Mastalerz, M. Setkowicz, A. Szczeklik // Curr Allergy Asthma Rep.- 2005.V.5.-Р.277–283. 265. Meloxicam in hypersensitivity to NSAIDs / E. Nettis, R. Di Paola, A. Ferrannini, et al. // Allergy.- 2001.- V.56.-Р.803–804. 284 266. Metabolism via Arginase or Nitric Oxide Synthase: Two Competing Arginine Pathways in Macrophages / M. Rath, I. Müller, P. Kropf, et al. // Front Immunol.-2014.- V.5.-P.532-542. 267. Metcalfe, D. D. Food allergy: adverse reactions to foods and food additives/ D. D. Metcalfe, H. A. Sampson, R. A. Simon.- 5th Edition.-Blackwell Publishing, 2014.- 624р. 268. Meterey, K. Action of histamine on PHA chemiluminescence response of blood mononuclear cells in autoimmune patients / K. Meterey, U. Bohm, A. Falus // Agents Action.- 1986.- V.18.- №1-2.-Р.254-257. 269. Modulation of granulocyte oxidative response by recombinant interferon alpha 2 and gamma / A. Kapp, H. Kirchner, H. Wokalek, E. Schöpf // Arch. Dermatol. Res.- 1986.- V.278.-№4.-Р.274-276. 270. Modulation of metabolic activity of phagocytes by antihistamines / A. Lojek, M. Ciž, M. Pekarova, et al. // Interdiscip. Toxicol.- 2011.- V.4.-№1.Р.15-19. 271. Moncada, S. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmacology / S. Moncada, R.U. Palmer, E.A. Higgs // Pharmacol. rev.- 1991.- V.43.-Р.109142. 272. Montelukast inhibits neutrophil pro-inflammatory activity by a cyclic AMPdependent mechanism / R. Anderson, A. J. Theron, C. M. Gravett, et al. // British Journal of Pharmacology.- V.156.-№ 1.-Р.105–115. 273. Mullol, J. Rhinosinusitis and nasal polyps in aspirin-exacerbated respiratory disease / J. Mullol, C. Picado // Immunol. Allergy Clin. North. Am.- 2013.V.33.-Р.163-176. 274. Multi-pronged inhibition of airway hyper-responsiveness and inflammation by lipoxin A(4) / B.D. Levy, G.T. De Sanctis, P.R. Devchand, et al. // Nat. Med. 2002.- V.8.-Р.1018-1023. 275. Nasal polyposis in aspirin-hypersensitive paitiens with asthma (aspirin triad) and aspirin-tolerant patients / M. L. Kowalski, B. Bienkiewicz, R. Pawliczak, 285 et al. // Allergy Clin. Immunol. Int.- J.World Allergy Org. Russ. Ed. – 2003. – V.6.–С.246-250. 276. Nathan, С. Role of nitric oxide synthesis in macrophage antimicrobial activity / С. Nathan, J.V. Hibbs // Curr. Opinion in Immunology.- 1991.-V.3.P.65- 70. 277. Nijkamp, F.P. Nitric Oxide and Bronchial Reactivity / F.P. Nijkamp, G. Folkerts // Clin. Exp. Allerg.- 1994.- V.269.-Р.905-914. 278. Nitric oxide increased interleukin-4 expression in T lymphocytes / R. H. Chang, M.H. Feng, W.H. Liu, et al. // Immunology.- 1997.-V.90.-№3.-P.364369. 279. Non-steroidal anti-inflammatory drugs selectively inhibit cytokine production by NK cells and gamma delta T cells / M.I. Inaoka, M. Kimishima, R. Takahashi, T. Shiohara // Exp Dermatol. -2006.- V.15.-№12.Р.981-990. 280. Okunishi, K. Leukotrienes and airwayinflammation / K. Okunishi, M. Peters-Golden // Biochimica et Biophysica Acta.-2011.- V. 1810.-№ 11.Р.1096–1102. 281. Organization of secondary lymphoid tissue and local IgE formation to Staphylococcus aureus enterotoxins in nazal polyp tissue / P. Gevaert, G. Holtappels, S.G. Johansson et al. // Allergy.-2005.-V.60.-P.71-79. 282. Overexpression of leukotriene C4 synthase in bronchial biopsies from patients with aspirin-intolerant asthma / A.S. Cowburn, K. Sladek, J. Soja, et al. // J. Clin Invest.-1998.-V.101.-№4.-P.834-846. 283. Ozaki, Y. Effects of histamine agonists and antagonists on luminoldependent chemiluminescence of granulocytes / Y. Ozaki, S. Kume, T. Ohashi // Agents Action.- 1984.- V.15.- №3-4.-Р.182-188. 284. Paracetamol (acetaminophen) hypersensitivity / B.J. De Paramo, S.Q. Gancedo, M. Cuevas, et al. // Ann. Allergy Asthma Immunol.- 2000.- V.85.Р.508–511. 286 285. Pekoe, G.M. Adaptation of the liquid scintillation counter to measure rapid burst chemiluminescence reactions / G.M. Pekoe // In: Cellular Chemiluminescence, Eds Van Dyke K., Boca Ration, CRC Press.- 1987.Р.167-182. 286. Perez, C. Pretreatment with montelukast blocks NSAID-induced urticaria and angioedema / C. Perez, M. Sanchez-Borges, E. Capriles // J. Allergy Clin. Immunol.- 2001.- V.108.-Р.1060–1061. 287. Phosphorylation by protein kinase a inhibits nuclear import of 5lipoxygenase / M. Luo, S.M. Jones, N. Flamand, et al. // J. Biol. Chem.2005.- V.280.-Р.40609-40616. 288. Plasma 9alpha,11beta-PGF2, a PGD2 metabolite, as a sensitive marker of mast cell activation by allergen in bronchial asthma / G. Bochenek, E. Nizankowska, A. Gielicz, et al. // Thorax.-2004.-V.59.-Р.459–464. 289. Platelet-activating factor in bronchoalveolar lavage fluid from asthmatic subjects / S.C. Stenton, E.N. Court, W.P. Kingston, et al. // Eur Respir J.1990.- V.3.-Р. 408-441. 290. Platelet-driven leukotriene C4-mediated airway inflammation in mice is aspirin-sensitive and depends on T prostanoid receptors / T. Liu, D. Garofalo, C. Feng, et al. // J. Immunol. 2015.- V.94.-№11.-Р. 5061-5068. 291. Polymorphonuclear leukocyte-platelet interaction: role of P-selectin in thromboxane B2 and leukotriene C4 cooperative synthesis / N. Maugeri, V. Evangelista, A. Celardo, et al. // Thromb. Haemost.-1994.-V.72.-Р.450-456. 292. Possible involvement of mast-cell activation in aspirin provocation of aspirin-induced asthma / H. Mita, S. Endoh, M. Kudoh, et al. // Allergy. 2001.- V. 56.-№11.-Р.1061-1067. 293. Prasad, K. Hydroxyl radical - scavening property of indomethacin / K. Prasad, V.A. Laxdal // Моl. and Cell. Biochem.-1994.—V.136.-№ 2.-P. 139144. 287 294. Prevalence of asthma with aspirin hypersensitivity in the adult population of Poland / L. Kasper, K. Sladek, M. Duplaga, et al. // Allergy. -2003. –V.58. – №10.-P.1064-1066. 295. Production of serotonin by tryptophan hydroxylase 1 and release via platelets contribute to allergic airway inflammation / T. Dürk, D. Duerschmied, T. Müller, et al. // Am. J. Respir. Crit. Care. Med.- 2013.V.187.-№5.-Р.476-485. 296. Prostaglandin D2: a dominant mediator of aspirin-exacerbated respiratory disease / K.N. Cahill, J.C. Bensko, J.A. Boyce, T.M. Laidlaw // J. Allergy Clin. Immunol.- 2015.- V.135.-№1.-Р.245-252. 297. Prostaglandin D2-induced bronchoconstriction is mediated only in part by the thromboxane prostanoid receptor / S.L. Johnston, N.J. Freezer, W. Ritter, et al. // Eur. Respir J.- 1995.- V.8.-Р.411-415. 298. Prostaglandin D2 selectively induces chemotaxis in T helper type 2 cells, eosinophils, and basophils via seven-transmembrane receptor CRTH2 / H. Hirai, K. Tanaka, O. Yoshie, et al. // J. Exp. Med.- 2001.-V.193.-№2.-Р.255261. 299. Prostaglandin E2 deficiency causes a phenotype of aspirin sensitivity that depends on platelets and cysteinyl leukotrienes / T. Liu, T.M. Laidlaw, H.R. Katz, J.A. Boyce / Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.-2013.- V.110.-№42.Р.16987-16992. 300. Prostaglandin E2 deficiency uncovers a dominant role for thromboxane A2 in house dust mite-induced allergic pulmonary inflammation / T. Liu, T.M. Laidlaw, C. Feng, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.-2012.- V.109.-№31.Р.12692- 12697. 301. Prostaglandin E2 inhibits eosinophil trafficking through E-prostanoid 2 receptors / E.M. Sturm, P. Schratl, R. Schuligoi, et al. // J. Immunol. 2008.V.181.- №10.-Р.7273-7283. 288 302. Prostaglandin E2 resistance in granulocytes from patients with aspirinexacerbated respiratory disease / T.M. Laidlaw, A.J. Cutler, M.S. Kidder, et al. // J. Allergy Clin. Immunol.- 2014.- V.133.-№6.-Р.1692-1701. 303. Protective effects of inhaled PGE2 on allergen-induced airway responses and airway inflammation / Gauvreau GM, Watson RM, O’Byrne PM // Am. J. Respir Crit. Care Med.-1999.- V.159.-Р.31-36. 304. Pytsky, V.I. In vitro diagnosis of pseudoallergic reaction to salicylate sodium and metamizole sodium(analgin) / V.I. Pytsky, O.Ju. Filatov, S.V. Chausova // XYI Intern. Congr. Allergol. аnd Clin. Immunol.: proceedings of the Сongr.- Cancum, Mexico, 1997.- P. 46. 305. Pytsky, V.I. Role of histamine in inhibition of stimulated luminol-depended chemiluminescence of blood leucosytes induced by salicylate sodium or metamizole sodium(analgin) in aspirin or/and analgin sensitive patients / V.I. Pytsky, O.Ju. Filatov, S.V. Chausova // Eur.J. of Clin. Che.& Clin.Biochem.1997.- V.35.-№9.-Р.94. 306. Redente, E.F. Lung tumor growth is stimulated in IFN-γ -/- mice and inhibited in IL-4-Rα -/- mice / E.F. Redente, L.D. Dwyer-Nield, B.S. Barrett, et al. // Anticancer Research. - 2009.-V. 29.-№12.-P.5095-5101. 307. Release of leukotrienes, prostaglandins, and histamine into nasal secretions of aspirin-sensitive asthmatics during reaction to aspirin / N.R. Ferreri, W.C. Howland, D.D. Stevenson, H.L. Spiegelberg // Am. Rev. Respir Dis.- 1988.V.137.-№4.-Р.847-854. 308. Reduced expression of COXs and production of prostaglandin E(2) in patients with nasal polyps with or without aspirin-intolerant asthma / J. RocaFerrer, F.J. Garcia-Garcia, J. Pereda, et al. // J. Allergy Clin. Immunol.-2011.V.128.-Р.66-72. 309. Reduced expression of the prostaglandin E2 receptor E-prostanoid 2 on bronchial mucosal leukocytes in patients with aspirin-sensitive asthma / C.J. 289 Corrigan, R.L. Napoli, Q. Meng, et al. // J. Allergy Clin. Immunol.- 2012.- V. 129.-Р.1636-1646. 310. Regulation of Serotonin-Induced Trafficking and Migration of Eosinophils / B.N. Kang, S.G. Ha, N.S. Bahaie, et al. // PLoS One.-2013.-V.8.-№1.- Р.54840. 311. Release of cysteinyl leucotrienes with aspirin stimulation and the effect of prostaglandin E2 on release from peripheral blood leucocytes in aspirin- induced asthmatic patients / G. Celik, S. Bavek, Z. Misirligil , et al. // Clin. Exp. Allergy. -2001. - V.31. – P.1615-1622. 312. Rembish, S.J. Further evidence that lucigenin-derived chemiluminescence monitors mitochondrial superoxide generation in rat alveolar macrophages / S.J. Rembish, M.A. Trush // Free Radic. Biol. Med.-1994.-V.17.-Р. 117–126. 313. Ricciotti, E. Prostaglandins and inflammation / E. Ricciotti, G.A. FitzGerald // Arterioscler Thromb. Vasc. Biol.-2011.- V.31.-Р.986-1000. 314. Rhinosinusitis and Aspirin-Exacerbated Respiratory Disease / M.L. Garcia Cruz, M.А. Jimenez-Chobillon, L.M. Teran // Journal of Allergy.-2012.-URL: http://dx.doi.org/10.1155/2012/273752.html. 315. Role of staphylococcal superantigen-specific IgE antibodies in aspirinintolerant asthma /J.Y. Lee, H.M.Kim, Y.M.Ye, et al. //Allergy Asthma Proc.2006.-V.27.-№5.-Р.341-346. 316. Safety of rofecoxib in subjects with a history of adverse cutaneous reactions to aspirin and/or nonsteroidal anti-inflammatory drugs / M.L. Pacor, G. Di Lorenzo, D. Biasi, et al. // Clin. Exp. Allergy.- 2002.- V.32.-Р.397–400. 317. Safety risks for patients with aspirin-exacerbated respiratory disease after acute exposure to selective nonsteroidal anti-inflammatory drugs and COX-2 inhibitors: Meta-analysis of controlled clinical trials / D.R. Morales, B.J. Lipworth, B. Guthrie, et al. // J. Allergy Clin. Immunol.- 2014.- V.134.- №1.Р.40-45. 290 318. Sanchez-Borges, M. Atopy is a risk factor for nonsteroidal antiinflammatory drug sensitivity / M. Sanchez-Borges, A. Capriles-Hulett // Ann Allergy Asthma Immunol.- 2000.- V.84.- Р.101–106. 319. Sánchez-Borges, M. NSAID-induced urticaria and angioedema: a reappraisal of its clinical management / M. Sánchez-Borges, A. CaprilesHulett, F. Caballero-Fonseca // Am J Clin Dermatol.-2002.- V.3.-№9.-Р.599607. 320. Sastre, B. Role of PGE2 in asthma and nonasthmatic eosinophilic bronchitis / B. Sastre, V. del Pozo // Mediators Inflamm.-2012.-URL: http://dx.doi.org/10.1155/2012/645383.html. 321. Selective severe anaphylactic reaction due to ketorolac tromethamine without nonsteroidal antiinflammatorydrug intolerance / E. Scala, M. Giani, L. Pirrotta, et al. // J. Allergy Clin. Immunol.- 2001.- V.107.-Р.557. 322. Selectivity of recombinant human leukotriene D(4), leukotriene B(4), and lipoxin A(4) receptors with aspirin-triggered 15-epi-LXA(4) and regulation of vascular and inflammatory responses / K. Gronert, T. Martinsson-Niskanen, S. Ravasi, et al. // Am. J. Pathol.- 2001.- V.158.-Р.3-9. 323. Settipane, G.A. Aspirin and allergic diseases / G.A. Settipane // Am. J. Med.- 1983.- V.74.-Р.102–110. 324. Simchowitz, L. Chemotactic factor-induced generation of superoxid radicals by human neutrophils: effect of metabolic inhibitors and antiinflammatory drugs / L. Simchowitz, J. Mehta, I. Spilberg // Arthritis and Reum.-1979.V.22.-№7.-P. 755-763. 325. Skin responses to intradermal histamine and leukotrienes C4, D4, and E4 in patients with chronic idiopathic urticaria and in normal subjects / D.L. Maxwell, B.A. Atkinson, B.W. Spur, et al. // J. Allergy Clin. Immunol.1990.- V.86.-Р.759–765. 326. Sneader, W. The discovery of aspirin: a reappraisal / W. Sneader // BMJ.2000.- V.321.-Р.1591–1594. 291 327. Specific immunoglobulin E for staphylococcal enterotoxins in nasal polyps from patients with aspirin-intolerant asthma / Y.J. Suh, S.H. Yoon, A.P. Sampson, et al. // Clin. Exp. Allergy.- 2004.- V.34.-№8.-Р.1270-1275. 328. Star, R.A. Southwestern Internal Medicine Conference Nitric Oxide / R.A. Star // Am. J. Med. Sci.- 1993.- V.306.-№ 5.-Р.348-358. 329. Stimulation with thromboxane A2 (TXA2) receptor agonist enhances ICAM-1, VCAM-1 or ELAM-1 expression by human vascular endothelial cells / T. Ishizuka, M. Kawakami, T. Hidaka, et al. // Clin. Exp. Immunol.1998.- V.112.-Р.464-470. 330. Stratman, N.C. Ibuprofen: effect on inducible nitric oxide synthase / N.C. Stratman, D.B. Carter, V.H. Sethy // Brain Res. Mol. Brain. Res.- 1997.V.50.-№1-2.-Р.107-12. 331. Szczeklik, A. Aspirin-induced asthma: advances in pathogenesis and management / A. Szczeklik, D. Stevenson // Allergy Clin. Immunol. Int. 1999. –V.104. №5– P.292-293. 332. Szczeklik, A. Aspirin-induced asthma as a viral disease / A. Szczeklik // Clin. Allergy.-1988.-V.18.-Р.15–20. 333. Szczeklik, A. Relationship of inhibition of prostaglandins biosynthesis by analgesics to asthma attacks in as-pirins-sensitive patients / A. Szczeklik, R.J. Gryglewski, G. Czerniawska-Mysik // Br. Med. J.- 1975.- V.1.- Р.67–69. 334. Szczeklik, A. Natural history of aspirin-induced asthma / A. Szczeklik, E. Nizankowska, M. Duplaga // AIANE Investigators. European Network on Aspirin-Induced Asthma. Eur Respir J.- 2000.- V.16.- Р.432-436. 335. Takayma, F. Effect of diclofenak, a non-steroidal anti-inflamatory drug, on lipid peroxidation caused by ischemia- reperfusion in rat liver / F. Takayma, T. Egashira, Y. Yamanaka // Jap. J. Pharmac. - 1994. - V.64.- №2. - Р.71-78. 336. Targeted eicosanoid lipidomics of exhaled breath condensate provide a distinct pattern in the aspirin-intolerant asthma phenotype / M. Sanak, A. 292 Gielicz, G. Bochenek, M. Kaszuba, et al.// J. Allergy Clin. Immunol.- 2011.V. 127.-Р.1141-1147. 337. Targeted gene disruption reveals the role of the cysteinyl leukotriene 2 receptor in increased vascular permeability and in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice / T.C. Beller, A. Maekawa, D.S. Friend, et al. // J. Biol. Chem.-2004.- V.279.-Р.46129-46134. 338. The effect of indication on hypersensitivity reactions associated with zomepirac sodium and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs / B.L. Strom, J.L. Carson, M. Lee Morse, et al. // Arthritis Rheum.- 1987.- V.30.Р.1142–1148. 339. The effect of non-steroidal anti-inflammatory agents on behavioural changes and cytokine production following systemic Inflammation : Implications for a role of COX-1 / J.L. Teeling, C. Cunningham, T.A. Newman, V.H. Perry // Brain Behav Immun.-2010.- V.24.-№3.-Р.409-419. 340. The classification of cyclooxygenase inhibitors / L.P. Lipsky, S.B. Abramson, L. Crofford, et al. // J. Rheumatol.-1998.-V.25.-Р.2298-2303. 341. The mechanism of LTE4-induced histamine hyperresponsiveness in guineapig tracheal and human bronchial smooth muscle, in vitro / C.A. Jacques, B.W. Spur, M. Johnson, et al. // Br. J. Pharmacol.-1991.- V.104.-№4.-Р.859866. 342. The Presence of Specific IgE to Salicyloyl and O-Methylsalicyloyl in Aspirin-Sensitive Patients / D. Zhu, W.M. Becker, K.H. Schulz, et al. // Asian Pacific Journal of Allergy and Immunology.- 1992.- V.10.-Р.25-32. 343. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent/ C.E. Gerber, M. Zipfel, D. Niethammer, et al. // Eur.J. Clin. Biochem. 1996.V.34.-№11. - P. 901-908. 344. Thromboxane A2 accounts for broncho-constriction but not for platelet sequestration and microvascular albumin exchanges induced by fMLP in the 293 guinea pig lung / M.F. Bureau, F. De Clerck, J. Lefort, et al. // J. Pharmacol. Exp. Ther.-1992.- V.260.-Р.832. 345. Thomson, L. Kinetics of cytochrome c (2+) oxidation by peroxynitrite: Implication for superoxide measurements in nitric oxide-producing biological systems / L. Thomson, M. Trujillo, R.Telleri // Arch Biochem Biophys.1995.- V.319.-Р.491-497. 346. Tolerability of nimesulide in aspirin-sensitive patients / L. Andri, G. Senna, C. Betteli, et al. // Ann Allergy.- 1994.- V.72.-Р.29–32. 347. Tolerability of rofecoxib in patients with cutaneous adverse reactions to nonsteroidal anti-inflammatory drugs / E. Nettis, R. Di Paola, A. Ferrannini, A. Tursi // Ann. Allergy Asthma Immunol.- 2002.- V.88.-Р.331–334. 348. Tolerability to new COX-2 inhibitors in NSAIDsensitive patients with cutaneous reactions / M. Sanchez-Borges, A. Capriles-Hulett, F. CaballeroFonseca, C.R. Perez // Ann Allergy Asthma Immunol.- 2001.- V. 87.-Р.201– 204. 349. Tolerance of daily low-dose aspirin does not preclude aspirin-exacerbated respiratory disease / K. Lee-Sarwar, C. Johns, T.M. Laidlaw, K.N. Cahill // J. Allergy Clin. Immunol. Pract.- 2015.- V.3.-№3.-Р.449-451. 350. Tomita, T. Staphylococcal delta tolin-induced generation of chemiluminescence by human polymorphonuclear leukocytes / T. Tomita, K. Momi, S. Kanegasaki // Toxicon.-1984.- V.22.-№6.-Р.957-965. 351. Turrens, J.F. Ubisemiquinone is the electron donor for superoxide formation by complex III of heart mitochondria / J.F. Turrens, A. Alexandre, A.L. Lehninger // Arch. Biochem. Biophys.-1985.- V.237.-Р.408-414. 352. Ueno, A. Possible involvement of thromboxane in bronchoconstrictive and hypertensive effects of LTC4 and LTD4 in guinea pigs / A. Ueno, K. Tanaka, M. Katori // Prostaglandins.-1982.- V.23.-Р.865-880. 294 353. Urinary leukotriene E4 concentrations increase after aspirin challenge in aspirin-sensitive asthmatic subjects / P.E. Christie, P. Tagari, A.W. FordHutchinson, et al. // Am. Rev. Respir Dis.- 1991.- V.143.- Р.1025-1029. 354. Validation of lucigenin (bis-N-methylacridinium) as a chemilumigenic probe for detecting superoxide anion radical production by enzymatic and cellular systems / Y. Li, H. Zhu, P. Kuppusamy, et al. // J. Biol. Chem.-1998.- V.273.Р.2015–2023. 355. Van Zele, T. Staphylococcus aureus colonization and IgE antibody formation to enterotoxins in increased in nazal poliposis / T. Van Zele, P. Gevaert, J.B. Watelet // J. Allergy Clin. Immunol.- 2004.-V.114.-P.981-983. 356. Variable prostaglandin E2 resistance in fibroblasts from patients with usual interstitial pneumonia / S.K. Huang, S.H. Wettlaufer, C.M. Hogaboam, et al. // Am. J. Respir. Crit. Care Med.- 2008.- V.177.-Р.66-74. 357. Variation of urinary level of leukotriene E4 in aspirin-sensitive subjects // G. Kanny, B. Chenuel, J. Sainte-Laudy, et al. // Allergy Clin. Immunol. Int-.– 2002.- V.14.- №5. –С.201-208. 358. Velazquez, J.R. Aspirin-Intolerant Asthma: A Comprehensive Review of Biomarkers and Pathophysiology / J.R. Velazquez, L.M. Teran // Clinical Reviews in Allergy & Immunology.-2013.- V. 45.-№1.-Р.75-86. 359. Weidemann, М. Prostaglandinand tromboxane synthesis in a pure macrophage populationand inhibition, by E-type prostaglandins of chemiluminescence/ М. Weidemann, В. A. Peskar, К. Wrogemann / FEBS Lett-1978.-V.89.- №1.-P. 136-140. 360. Wilson, B.G. Adverse reactions to food additives / B.G. Wilson, S.L. Bahna // Ann. Allergy Asthma Immunol.-2005.-V.95.-№ 6.-Р.499-507. 361. Yang, В. Signal transduction pathways in modulation of ciliary beat frequency by methacholine / В. Yang, R.J. Schlosser, T.V. McCaffrey // Ann. Otol. Rhinol. Laryngol.- 1997.- V.l06.-Р.230-236. 295 ПРИЛОЖЕНИЕ. «Характеристика пациентов, включенных в исследования». Глава 3. «Оценка оксидантной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов у больных с непереносимостью НПВП разных клинических групп». Раздел 3.1. «Определение суммарной продукции АФК ПМЛ у здоровых доноров и больных с непереносимостью НПВП разных клинических групп»; раздел 3.2. «Определение продукции супероксидного анион радикала ПМЛ у здоровых доноров и больных с непереносимостью НПВП разных клинических групп». Объектом исследования были пациентов: 21 пациент с АТ 37 и пациентов из общей выборки 16 пациентов с хронической псевдоаллергической крапивницей/отеком Квинке, обостряющейся после приема НПВП. Все пациенты находились в фазе ремиссии основного заболевания. Группа практически здоровых лиц состояла из 24 человек. Показанием к включению пациентов в исследование было: приступы экспираторного диспноэ, ринит, крапивница, отек Квинке при приеме НПВП в любой лекарственной форме (инъекции, таблетки, драже). Противопоказаними к включению пациентов в исследование являлись: проявления острой или обострение хронической инфекции, прием системных глюкокортикостероидов, антибиотиков - за 2 недели и менее до исследования. Для каждого пациента одновременно регистрировали светосумму СЛХЛ и СЛЦХЛ ПМЛ крови. Раздел 3.3. «Определение продукции АФК ПМЛ у здоровых доноров и больных с непереносимостью НПВП, проявляющейся реакциями со стороны органов дыхания (бронхоспазм, ринит), после предстимуляции комплексом антигенов Staphylococcus aureus». Объектом исследования были 29 пациентов из общей выборки пациентов (24 женщины и 5 мужчин) с АТ со смешанной (неинфекционно- и инфекционно-зависимой) и инфекционно-зависимой формами бронхиальной 296 астмы в фазе ремиссии хронического бронхита и астмы в возрасте от 19 до 70 лет. У 17 пациентов с АТ в сыворотке крови определялись специфические IgE к различным стафилококковым энтеротоксинам (SEA, SEB, TSST). Показанием к включению пациентов в исследование было: наличие у пациентов полного клинического синдрома АТ (БА в сочетании с ПРС и непереносимостью НПВП). Противопоказаними к включению пациентов в исследование являлись: проявления острой или обострение хронической инфекции, прием системных глюкокортикостероидов, антибиотиков - за 2 недели и менее до исследования. Контрольная группа практически здоровых людей состояла из 27 человек (15 женщин и 11 мужчин) в том же возрастном диапазоне, не сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами. Раздел 3.4. «Исследование воздействия НПВП на стимулированную сульфатом бария люминол-зависимую хемилюминесценцию периферической крови у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью данных препаратов»; Раздел 3.5. «Исследование воздействия НПВП на стимулированную сульфатом бария люцигенин-зависимую хемилюминесценцию периферической крови у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью данных препаратов». Объектом исследования были 75 больных из общей выборки пациентов (49 женщин и 26 мужчин) с непереносимостью АСК и/или метамизола натрия и/или диклофенака натрия в возрасте от 19 до 70 лет. Из этих больных у 51 непереносимость указанных НПВП проявлялась в виде поражения органов дыхания (аспириновая астма, ринит), у 24 - в виде крапивницы, отека Квинке. Группа пациентов с непереносимостью диклофенака натрия включала 18 человек, с непереносимостью АСК- 35 человек, с непереносимостью метамизола натрия- 29 человек, у которых непереносимость данных препаратов подтверждалась данными анамнеза и проявлялась симптоматикой 297 со стороны кожных покровов и системы органов дыхания. Группа пациентов с непереносимостью НПВП, но не имеющих повышенной чувствительности к диклофенаку натрия, состояла из 21 человека; с непереносимостью НПВП, но не имеющих повышенной чувствительности к АСК- из 26 человек; с непереносимостью НПВП, но не имеющих повышенной чувствительности к метамизолу натрия- из 22 человек. В крови всех обследованных пациентов IgE к исследуемым НПВП не были выявлены. Критерии включения пациентов в исследование: приступы экспираторного диспноэ, ринит, крапивница, отек Квинке при приеме НПВП (АСК и/или метамизола натрия и/или диклофенака натрия) в любой лекарственной форме. Критерии исключения: прием антигистаминных, антисеротониновых, антилейкотриеновых препаратов, КГК, НПВП за 2 недели и менее до исследования. Контрольная группа здоровых доноров, не контактировавших с НПВП и противоаллергическими препаратами в ближайшие 2 недели до опыта, состояла из 45 человек. Для каждого пациента одновременно регистрировали светосумму СЛХЛ и СЛЦХЛ ПМЛ крови. Раздел 3.6. «Исследование воздействия пищевого красителя тартразина на стимулированную сульфатом бария люминол-зависимую хемилюминесценцию периферической крови у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью НПВП в сочетании с непереносимостью тартразина»; Раздел 3.7. «Исследование воздействия пищевого красителя тартразина на стимулированную сульфатом бария люцигенин-зависимую хемилюминесценцию периферической крови у здоровых доноров и пациентов с непереносимостью НПВП в сочетании с непереносимостью тартразина». Объектом исследования были 20 человек с непереносимостью НПВП в возрасте от 19 до 60 лет. Из этих больных у 9 пациентов непереносимость НПВП сочеталась с непереносимостью тартразина. Непереносимость тартразина подтверждалась данными анамнеза и проявлялась клинически в 298 виде бронхоспазма/ринита (5 человек) и/или крапивницы/отека Квинке (4 человека). В крови всех обследованных пациентов IgE к тартразину не были выявлены. Показания к включению пациентов в исследование: приступы экспираторного диспноэ, ринит, крапивница, отек Квинке при приеме НПВП и употреблении продуктовых изделий, напитков, лекарственных препаратов, окрашенных тартразином в желтый цвет. Противопоказания к включению пациентов в исследование: прием антигистаминных, антисеротониновых, антилейкотриеновых препаратов, КГК, НПВП, а также окрашенных тартразином продуктовых изделий, напитков, лекарственных препаратов за 2 недели и менее до исследования. Контрольная группа здоровых доноров, не контактировавших с НПВП, противоаллергическими препаратами, а также с пищевыми изделиями и лекарственными формами, содержащими тартразин, в ближайшие 2 недели до эксперимента, состояла из 14 человек. У здоровых доноров отсутствовала непереносимость НПВП и тартразина. Для каждого человека одновременно регистрировали светосумму СЛХЛ и СЛЦХЛ ПМЛ крови. Глава 4. «Определение роли плазменных факторов в развитии феномена ингибирования стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой хемилюминесценции крови под влиянием НПВП, тартразина у здоровых доноров и больных с их непереносимостью». Раздел 4.1. «Определение светосумм люминол- и люцигенин-зависимой хемилюминесценции суспензии ПМЛ после прединкубации с исследуемыми НПВП у здоровых доноров и больных с их непереносимостью». Объектом исследования были 35 больных (24 женщины и 11 мужчин) с непереносимостью АСК и/или метамизола натрия и/или диклофенака натрия в возрасте от 19 до 70 лет. Из этих больных у 21 непереносимость указанных 299 НПВП проявлялась в виде поражения органов дыхания (аспириновая астма, ринит), у 14 - в виде крапивницы, отека Квинке. Показания к включению пациентов в исследование: приступы экспираторного диспноэ, крапивница, отек Квинке на прием АСК и/или метамизола натрия и/или диклофенака натрия в любой лекарственной форме (инъекции, таблетки, драже). Противопоказания к включению пациентов в исследование: прием антигистаминных антисеротониновых, антилейкотриеновых препаратов, КГК, НПВП, системных глюкокортикостероидов в ближайшие 2 недели до исследования. Контрольная группа практически здоровых людей состояла из 32 человек (22 женщины и 10 мужчин) в том же возрастном диапазоне, не принимавших НПВП и противоаллергические препараты в ближайшие 2 недели до эксперимента. Для каждого человека одновременно регистрировали светосумму СЛХЛ и СЛЦХЛ ПМЛ крови. Раздел 4.2. «Определение светосумм люминол- и люцигенин-зависимой хемилюминесценции суспензии ПМЛ после прединкубации красителем тартразином у здоровых доноров и с пищевым больных с его непереносимостью». Объектом исследования были 17 человек с астматической триадой в возрасте от 19 до 60 лет. У 8 пациентов повышенная чувствительность к НПВП сочеталась с непереносимостью тартразина. Непереносимость тартразина подтверждалась данными анамнеза и проявлялась клинически в виде бронхоспазма/ринита и/или крапивницы/отека Квинке. Группа больных, не имеющих непереносимости тартразина, но имеющих непереносимость НПВП, состояла из 9 человек. В крови всех обследованных пациентов специфических IgE к тартразину не было выявлено. Показания к включению пациентов в исследование: приступы экспираторного диспноэ, ринит, крапивница, отек Квинке при приеме НПВП 300 и употреблении продуктовых изделий, напитков, окрашенных тартразином в желтый цвет. Противопоказания к включению пациентов в исследование: прием антигистаминных препаратов, КГК, антисеротониновых, антилейкотриеновых системных глюкокортикостероидов, НПВП, а также окрашенных тартразином продуктовых изделий, напитков, лекарственных препаратов в ближайшие 2 недели до исследования. Группа здоровых доноров, не контактировавших с НПВП, а также с пищевыми изделиями и лекарственными формами, содержащими тартразин, в ближайшие 2 недели до эксперимента, состояла из 10 человек. У здоровых доноров отсутствовала непереносимость НПВП и тартразина. Для каждого человека одновременно регистрировали светосумму СЛХЛ и СЛЦХЛ суспензии ПМЛ. Раздел 4.3. «Определение светосуммы люминол-зависимой хемилюминесценции суспензии ПМЛ здоровых доноров, инкубированных с плазмой крови больных с непереносимостью НПВП». Объектом исследования были 5 человек с АТ в возрасте от 29 до 54 лет. Все пациенты по данным анамнеза имели непереносимость АСК. Повышенная чувствительность к АСК подтверждалась данными анамнеза и проявлялась клинически в виде бронхоспазма/ринита и/или крапивницы/отека Квинке. В крови всех обследованных пациентов уровень общего IgE был нормальным, специфических IgE к АСК не было выявлено. Показания к включению пациентов в исследование: приступы экспираторного диспноэ, ринит, крапивница, отек Квинке при приеме АСК. Противопоказания к включению пациентов в исследование: наличие острых или обострение антигистаминных, хронических инфекций, антисеротониновых, прием антибиотиков, антилейкотриеновых, глюкокортикостероидных препаратов, КГК, НПВП за 2 недели и менее до исследования. 301 Группа здоровых доноров, противоаллергическими не препаратами контактировавших с в недели ближайшие 2 НПВП, до эксперимента, состояла из 10 человек. У здоровых доноров отсутствовала непереносимость НПВП. Уровень общего IgE был нормальным. Раздел 4.4. «Определение роли медиаторов (гистамина, серотонина, цистеиниловых лейкотриенов) в реализации феномена ингибирования стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой хемилюминесценции крови под влиянием НПВП, тартразина у здоровых доноров и пациентов с их непереносимостью». Объектом исследования были 58 человек с непереносимостью НПВП в возрасте от 22 до 67 лет (36 женщин, 22 мужчины), из них у 29 человек повышенная чувствительность к НПВП проявлялась клинически в виде бронхоспазма/ринита, у 29 человек- в виде крапивницы/отека Квинке. У 8 человек из выборки непереносимость НПВП сочеталась с непереносимостью тартразина, из них у 4 человек непереносимость тартразина проявлялась клинически в виде бронхоспазма/ринита, у 4- в виде крапивницы/отека Квинке. Показания к включению пациентов в исследование: приступы экспираторного диспноэ, ринит, крапивница, отек Квинке при приеме НПВП, употреблении продуктов, напитков, лекарственных форм, окрашенных тартразином. Противопоказания к включению пациентов в исследование: прием антигистаминных, препаратов, КГК, антисеротониновых, антилейкотриеновых НПВП, пищевых изделий и лекарственных средств, окрашенных тартразином, за 2 недели и менее до исследования. 302 Раздел 4.5. «Определение концентрации цитокинов в плазме крови здоровых доноров и больных с непереносимостью НПВП, тартразина и оценка их роли в реализации феномена ингибирования стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой хемилюминесценции крови под влиянием НПВП, тартразина у пациентов с их непереносимостью». Обследовано 30 больных с непереносимостью НПВП, тартразина в возрасте от 29 до 60 лет. Из них 18 пациентов – с АТ в стадии ремиссии хронического бронхита и астмы, 12 пациентов с крапивницей/отеком Квинке. Из 18 пациентов с АТ 8 пациентов имели смешанную форму БА (неинфекционно-аллергическую + пациентов форму – инфекционную инфекционно-аллергическую), БА. Из 12 пациентов 10 с крапивницей/отеком Квинке 5 пациентов имели атопические заболевания. Из 30 пациентов с непереносимостью НПВП 6 имели непереносимость тартразина, из них у 3 непереносимость тартразина проявлялась реакциями со стороны органов дыхания, у 3- со стороны кожных покровов. Всех пациентов с непереносимостью НПВП, тартразина разделили на 2 группы: 1 группу составляли пациенты с АТ, 2 группу- пациенты с крапивницей/отеком Квинке. Критерии включения пациентов в исследование: приступы экспираторного диспноэ, ринит, крапивница, отек Квинке при приеме НПВП (АСК и/или метамизола натрия и/или диклофенака натрия) в любой лекарственной форме (инъекции, таблетки, драже), а также при употреблении пищевых продуктов, напитков, лекарственных препаратов, окрашенных тартразином. Критерии исключения: прием системных глюкокортикостероидов, НПВП за 2 недели и менее до исследования, наличие острой или обострение хронической инфекции. Контрольную группу составили 8 здоровых доноров без воспалительных и атопических заболеваний, сопоставимых по полу и возрасту. 303 Глава 5. «Определение вклада индуцибельной NO- синтазы фагоцитов периферической крови в развитие феномена ингибирования стимулированной сульфатом влиянием бария НПВП, люминол-зависимой тартразина у хемилюминесценции здоровых доноров и крови под больных с астматической триадой». В данной главе представлены результаты трех серий опытов. Для определения влияния N -нитро-L-аргинина в смеси с НПВП на СЛХЛ крови больных с АТ (первая серия опытов) объектом исследования были 14 больных (7 женщин и 5 мужчин) с АТ со смешанной (неинфекционно- и инфекционно-зависимой) и инфекционно-зависимой формами БА в возрасте от 19 до 70 лет. Из этих больных 8 человек находились в стадии обострения хронического бронхита и БА, 6 человек - в стадии медикаментозной ремиссии. Критерии включения пациентов в исследование: приступы экспираторного диспноэ при приеме АСК и/или метамизола натрия в любой лекарственной форме (инъекции, таблетки, драже). Критерии исключения пациентов из исследования: прием противоаллергических препаратов, НПВП за 2 недели и менее до исследования. Контрольная группа практически здоровых людей состояла из 10 человек (6 женщин и 4 мужчин) в том же возрастном диапазоне, не принимавших НПВП и противоаллергические препараты в ближайшие 2 недели до эксперимента. Для определения активности iNOS лейкоцитов периферической крови у больных с БА и здоровых доноров при воздействии на культуру лейкоцитов исследуемых НПВП (вторая серия опытов) объектом исследования были 18 больных (11 женщин и 7 мужчин) с БА смешанной (неинфекционно- и инфекционно-зависимой) и инфекционно-зависимой формами в возрасте от 19 до 68 лет. Из этих больных 13 человек имели АТ, при этом 7 пациентов находились в стадии медикаментозной ремиссии хронического бронхита и астмы, 6 пациентов - в стадии обострения хронического бронхита и БА. 5 304 пациентов имели атопическую форму БА в стадии ремиссии без полипоза носа и непереносимости НПВП. Критерии включения и исключения пациентов аналогичны вышеописанным. Контрольная группа практически здоровых людей состояла из 5 человек (3 женщин и 2 мужчин) в том же возрастном диапазоне, не имеющих воспалительных процессов в организме и не принимавших НПВП в ближайшие 2 недели до эксперимента. Для определения зависимости относительной светосуммы СЛХЛ крови от фазы течения хронического бронхита у больных с АТ (третья серия опытов) объектом исследования были 65 человек с АТ со смешанной (неинфекционно- и инфекционно-зависимой) и инфекционно-зависимой формами БА. Из них 37 человек находились в фазе обострения хронического бронхита и БА, 28 человек в фазе ремиссии. У 21 больного по данным анамнеза была непереносимость аспирина, у 26-непереносимость анальгина, у 18-непереносимость диклофенака исключения пациентов аналогичны Глава 6. «Определение натрия. Критерии включения и вышеописанным. зависимости между степенью угнетения стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой хемилюминесценции крови под влиянием нестероидных противовоспалительных препаратов, тартразина и временем, прошедшим с момента возникновения непереносимости данных псевдоаллергенов». Исследование проведено с участием 58 человек с непереносимостью НПВП в возрасте от 20 до 62 лет (38 женщин, 15 мужчин), из них 33 человека страдали аспириновой астмой, и повышенная чувствительность к НПВП у данных бронхоспазма/ринита; пациентов 20 проявлялась человек клинически страдали в виде хронической псевдоаллергической крапивницей/отеком Квинке, обостряющейся после приема НПВП. У всех пациентов с непереносимостью НПВП в анамнезе отмечалась непереносимость 2 или более НПВП разных химических групп. У 305 6 пациентов непереносимость НПВП сочеталась с непереносимостью тартразина, из них у 3 пациентов непереносимость тартразина проявлялась реакциями со стороны органов дыхания (брохоспазм), у 3- только со стороны кожных покровов (крапивница/отек Квинке). Показания к включению пациентов в исследование: приступы экспираторного диспноэ, ринит, крапивница, отек Квинке при приеме НПВП, а также при употреблении пищевых продуктов, напитков, лекарственных препаратов, окрашенных тартразином. Противопоказания к включению пациентов в исследование: прием антигистаминных, антисеротониновых, антилейкотриеновых препаратов, КГК, НПВП, продуктов и напитков, окрашенных тартразином за 2 недели и менее до исследования. Контрольная группа здоровых доноров состояла из 45 человек, не принимавших противоаллергические препараты, НПВП, а также продукты и напитки, окрашенные тартразином, в ближайшие 2 недели до эксперимента.
