Оценка субпопуляций лимфоцитов
реклама
Многопараметрический анализ в проточной цитометри и современные подходы к оценке фенотипа различных субпопуляций лимфоцитов. Хайдуков С.В., д.б.н. - Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, РАН, Москва. - ФГУ Федеральный Научно-Клинический Центр детской гематологии, онкологии и иммунологии, МЗиСР РФ, Москва. Семинар 5-7 октября 2011 г. Хайдуков С.В. Иммунный статус Анализ иммунного статуса пациентов определяют при помощи иммунофенотипирования. Иммунофенотипирование это характеристика клеток при помощи моноклональных антител или других зондов, позволяющая судить об их типе и функциональном состоянии по наличию того или иного набора клеточных маркеров. Хайдуков С.В. Моноклональные антитела CD = The Cluster of Differentiation Система классификации всех антител против антигенов лейкоцитов человека. Определяется на рабочих совещаниях (последнее HLDA IX, 11-13 марта 2010 г.). CD включает все клоны антител распознающих одни и те же антигены человека, но не их эпитопную специфичность (сейчас 363 CD). Хайдуков С.В. Анергические Т клетки. Эти клетки Т-клетки Цитотоксические T клетки генерируются после активации TCR в отсутствие ко-стимулирующих сигналов, это приводит к тому, что они не отвечают на последующие стимулирующие сигналы. Они являются функционально бездействующими клетками и не в состоянии пролиферировать или продуцировать IL-2. Эта генерация может быть важна для ухода от аутоиммунного ответа. CD8αα T клетки. Внутриэпителиальные лимфоциты обнаруженные в кишечнике. Они развиваются интра- или экстратимически. Экспрессируют αβ или γδTCR. γδTCR+ клетки продуцируют KGF, тогда как αβTCR+ клетки этого не делают. Для для генерации и/или гомеостаза им необходима β2 микроглобулин зависимая экспрессия MHC класс I. Они могут обладать регулирующий функцией за счет продукции IL-10 и TGF β. γδT клетки CD4+ αβ T клетки, CD8+ αβ T клетки Истощенные Т клетки. Генерируются в ответ на хроническое возбуждение TCR антигеном. Эти клетки экспрессируют ингибирующие рецепторы и обладают сниженной продукцией эффекторных цитокинов. Таким образом, они не в состоянии повыситься эффективный антивирусный иммунные ответы. Хайдуков С.В. NKT клетки TH1, TH2, TH9, TH17, TH22, TFH Центральные Т клетки памяти, Эффекторные T клетки памяти TR1, Натуральные Treg, Индуцированные Treg B-клетки Mature B-cells (Bm) Bm1 Bm2 Bm2’ Bm3 Bm4 Ранние Bm5 Bm5 памяти В настоящее время существует две системы классификации В-клеток, основанные на экспрессии поверхностных маркеров: 1. CD19, CD5, CD27, IgD 2. CD19, IgD, CD38, D27 Хайдуков С.В. B-клетки Хайдуков С.В. NK-клетки Распределение CD16 и CD56 при анализе CD3-CD19клеток периферической крови 1. CD56bright CD16-; 2. CD56bright CD16dim; 3. CD56dim CD16-; 4. CD56dim CD16+; 5. CD56-CD16+. Хайдуков С.В. CDC-панель FITC IgG CD45 CD3 CD3 CD3 CD3 Хайдуков С.В. PE IgG CD14 CD19 CD4 CD8 CD56 (+/-CD16) Контроль Гэйт T/B-клетки T-хелперы T-цитотоксические NK-клетки Наиболее часто используемая панель для определения иммунного статуса FITC IgG CD45 CD3 CD3 CD3 CD3 CD3 Хайдуков С.В. PE IgG CD14 CD19 CD4 CD8 CD56 (+/-CD16) HLA-DR Контроль Гэйт T/B-клетки T-хелперы T- цитотоксические NK-клетки актив. Т-кл. Трехцветная панель FITC PE PE-Cy5 Используется для: CD3 HLA-DR CD45 Мониторинг при хронических вирусных заболеваниях (HIV, CMV и т.д.) Мониторинг при трансплантации Первичный и вторичный иммунодефициты Аутоиммунные заболевания CD3 CD25 CD45 CD8 CD38 CD45 CD57 CD8 CD45 CD4 CD45RA CD45 CD4 CD45RO CD45 CD3 TcRαβ CD45 CD3 TcRγδ CD45 CD19 CD5 CD45 Хайдуков С.В. Необходимо для стандартизации анализа иммунофенотипа пациента. ¾ Стандартный забор, хранение и подготовка образца для анализа. ¾ Стандартный набор анализируемых маркеров (допускается расширение панели моноклональных антител для более полной характеристики исследуемого образца). ¾Стандартная настройка проточного цитометра и протоколов анализа. ¾Стандартный анализ с использованием контроля качества и контрольных сумм. Хайдуков С.В. Четырехцветная панель моноклональных антител для определения иммунного статуса FITC 1. IgG 2. CD19 3. CD16 4. CD8 5. CD4 7. CD45RA 8. TcR-αβ 9. CD4 PE ECD (или APC) PC5 (или PerCP) IgG IgG CD45 изотипический контроль CD5 CD27 CD45 В1, В2, В-клетки памяти CD56 CD3 CD45 T-NK-клетки и субпопуляции NK-клеток CD4 CD3 CD45 субпопуляции Т-клеток CD25 HLA-DR CD45 активированные Т хелперы CD45RO CD4 CD45 наивные и активированные Т хелперы, Т-клетки памяти TcR-γδ CD3 CD45 αβ- и γδ-Т-клетки CD25 CD127 CD45 регуляторные Т-клетки Опубликовано в: Хайдуков С.В., и др. Российский Иммунологический Журнал, 2007, 1(10), 3-4, С. 20–30. Хайдуков С.В., и др. Российский Иммунологический Журнал, 2008, 2(11), 1, С. 20–30. Хайдуков С.В., и др. Медицинская иммунология, 2008, 10(2-3), C. 113-121 Хайдуков С.В., и др. Мед. иммунол., 2009 Т. 11, № 2-3, стр. 227-238 Хайдуков С.В. В-2 (CD19+CD5-) CD19/CD5/CD27/CD45 Анализ В-клеток В-1 – аутореактивный клон (CD19+CD5+) В-клетки памяти (CD19+CD27+CD5-) Хайдуков С.В. CD19/CD5/CD27/CD45 Анализ В-клеток - В-клетки памяти Изменение количества В клеток памяти В-клетки памяти (CD19+CD27+CD5-) Повышение относительного уровня В-клеток памяти Множественный склероз Ревматоидный артрит Понижение относительного уровня В-клеток памяти Первичные иммунодефициты Синдром Шегрена Хронической грануломатоз Бактериальные инфекции дыхательного тракта Бактериальные инфекции желудочно-кишечного трактата Синдром Шегрена Норма ≥80% Ревматоидный артрит 60% Наивные Вклетки Хайдуков С.В. Заболевание В-клетки памяти Плотность экспрессии CD27 CD19/CD5/CD27/CD45 Анализ В-клеток – B-1 Пример: Аутоиммунный тиреоидит До терапии В процессе терапии В-1 клетки (CD19+CD5+) Хайдуков С.В. Норма Заболевания, при которых определение относительного уровня В-1 клеток является диагностически значимым. Заболевание 1.Системная красная волчанка (СКВ) 2.Синдром Шегрена 3.Ревматоидный артрит 4.Инсулин-зависимый диабет 5.Аутоиммунный тиреоидит 6.Миастения 7.Неспецифический язвенный колит 8.Аутоиммунные поражения при инфекционных заболеваниях (хламидиоз, синдром Рейтера, бруцеллез и др.) 9.Другие заболевания, имеющие в своей основе аутоиммунные механизмы Хайдуков С.В. Повышение относительного уровня В1 клеток ++++ ++++ +++ +++ ++++ +++ +++ +++ +? Анализ В-1 и В-клетки памяти при терапии Мабтерой Хайдуков С.В. Анализ NK-клеток NKT клетки CD16/CD56/CD3/CD45 Анализ по зоне CD45 NK-клетки 1 - CD16dim-to-negCD56bright - секретируют IFN-γ и другие цитокины, имеют меньшую цитолитическую активность. 2 - CD16brightCD56dim - слабо секретируют цитокины, но обладают высокой цитолитической активностью. Хайдуков С.В. Постоянно низкие активность и количество NK-клеток Патологическое состояние Ассоциированные симптомы и риски Приобретенный или врожденный иммунодефицит включая СПИД. Синдром Чедиака-Хигасси. Дефицит CD11/CD18 молекул семейства клеточной адгезии. Онкологические заболевания Онкологические заболевания связанные с наследственностью. Лейкемия. Х-связанный лимфопролиферативный синдром. Рак молочной железы (при диагнозе). Рак шеи и головы (до терапии). Терапия цитостатиками. Вирусная инфекция (цитомегаловирус, Эпштейна-Бар, герпес). Другие вирусные и бактериальные инфекции. Аутоиммунные заболевания. Высокий риск возникновения онкологии и достаточно частые инфекционные заболевания. Повышенный риск образования лимфом. Увеличенная восприимчивость к вирусным инфекциям. Распространение метастазов. Вероятность появления злокачественного образования выше нормального. Предшествует рецидиву. Повышенная чувствительность к вирусу ЭпштейнаБар. Неблагоприятный прогноз. Неблагоприятный прогноз. Более высокая вероятность рецидива. Более высокая частота, серьезность и продолжительность заболевания. Более высокая частота, серьезность, и продолжительность заболевания. Возможно более активное течение болезни, увеличенная частота инфекций. Психические расстройства Синдром дефицита NK-клеток. Синдром хронической усталости. Депрессия. Хронический стресс. Хайдуков С.В. Усталость, сниженная восприимчивость, лихорадка. Повышенная утомляемость, апатичность, увеличенная частота вирусных заболеваний. Более серьезные признаки. Неспособность справляться с ежедневными проблемами, усталость . По Whiteside et al., 1994 Постоянно высокие активность и количество NK-клеток Патологическое состояние Ассоциированные симптомы и риски Лимфопролиферация NK-клеток Хроническая пролиферация больших гранулярных лимфоцитов (LGLпролиферация LGL-лимфоцитоз, цитопения, спленомегалия Острая пролиферация больших гранулярных лимфоцитов (LGLпролиферация Встречается совместно с активной лейкемией/лимфомой Хайдуков С.В. По Whiteside et al., 1994 NKT-клетки при различных заболеваниях (A. Balato et al., 2009) Аутоиммунные патологии Множественный склероз Ревматоидный артрит Системная красная волчанка Воспалительные заболевания кишечника Трансплантация Кожа Роговица Клетки панкреатических островков Печень Сердце Атеросклероз Аорта Аллергия Аллергическая астма Аллергический конъюнктивит Инфекции Бактерии (например, M. tuberculosis) Паразитарные (например, leishmania) Дрожжи (например, C. neoformans) Вирусы (например, cytomegalovirus) Опухоли Солидные опухоли (например, рак легкого) Миелобластные опухоли (например, множественная миелома) Хайдуков С.В. CD8/CD4/CD3/CD45 Цитотоксические Т-клетки Анализ Т-клеток CD4+CD8+ Т-клетки (вышедшие из тимуса недифференцированные Т-клетки) Т-клетки хелперы Экспрессия CD8 на NK-клетках Хайдуков С.В. CD45RA/CD45RO/CD4/CD45 Анализ Т-клеток Т-клетки памяти. активированные Тклетки, Treg и T17 Наивные Т клетки Хайдуков С.В. Анализ Т-клеток Анализ только по CD45+ Хайдуков С.В. CD45RA/CD45RO/CD4/CD45 Анализ по CD4+ и CD45+ CD4/CD25/HLA-DR/CD45 Анализ активированных T хелперов и цитотоксических T-клеток Анализ по зоне B Активированные Регуляторные Тклетки Ранняя активация Хайдуков С.В. Поздняя активация Treg играют важную роль в иммуносупрессии и их изучают в таких областях как: • • • • Аутоиммунные заболевания, Трансплантационная иммунология, Противоопухолевый ответ Иммуногомеостаз Treg понижающие регуляторы ПОЛЬЗА • Регулируют Т клеточный гомеостаз • Предотвращают аутоиммунные заболевания • Предотвращают аллергии • Предотвращают гиперчувствительность • Толерантность после трансплантации • Предотвращают РТПХ С ДРУГОЙ СТОРОНЫ • Снижают противоопухолевый иммунитет • Снижают иммунитет к инфекциям Хайдуков С.В. CD4/CD25/CD127/CD45 Анализ регуляторных Т-клеток Идентификация Treg - CD3+CD4+CD25brightCD127neg Анализ по зоне CD3+CD4+ Анализ по зоне лимфоцитов Анализ по зоне CD3+CD4+ Регуляторные Т-клетки Хайдуков С.В. Анализ Т-клеток ? Хайдуков С.В. CD8/CD4/CD3/CD45 TcR-αβ/TcR-γδ/CD3/CD45 Анализ Т-клеток CD3highCD8dimTcR-γδ+ Т-клетки CD3+CD8brightTcR-αβ+ Т-клетки Хайдуков С.В. Изменения относительного количества γδ-T-клеток при различных заболеваниях и патологиях. Изменение относительного количества γδ-T-клеток Повышение относительного уровня γδ-T-клеток Понижение относительного уровня γδ-T-клеток Хайдуков С.В. Заболевание Вирусные инфекции: ВИЧ Цитомегаловирус Вирус Эпштейн-Бара Бактериальные инфекции: Туберкулез легких Mycobacterium Легионеллез Legionella Туляримия Francisella tularensis Сальмонеллез Salmonella Боррелиоз (болезнь Лайма) Borellia Атопический дерматит (у детей) Болезнь Крона Болезнь Бехчета Первичные иммунодефициты Атопический дерматит (у взрослых) Возрастное снижение относительного уровня γδ-T-клеток Инверсия соотношения T4/T8 - интерпретация Острая вирусная инфекция Хроническая вирусная инфекция Гематологические нарушения Первичные иммунодефициты Аутоиммунные заболевания Солидные опухоли Хайдуков С.В. Интервалы распределения фенотипов лимфоцитов условно здоровых доноров (n = 362) Тип клеток Лимфоциты (CD45bright) В-клетки (CD3-CD19+HLA-DR+) В-1 клетки (CD19+CD5+) В-2 клетки (CD19+CD5-) В клетки памяти (CD19+CD5-CD27+) NK (LGL) (CD3-CD16+CD56+) NK цитолитические (от общих NK-клеток) NK цитокин-продуцирующие (от общих NK-клеток) Т-клетки (CD3+CD19-) Т хелперы (CD3+CD4+) Т цитотоксические (CD3+CD8+) Т хелперы активированные/ памяти (CD4+CD45R0+) Т хелперы наивные (CD4+CD45RА+) αβ-Т клетки (CD3+αβ-ТсR+γδ-ТcR-) γδ-Т клетки (CD3+γδ-ТcR+αβ-ТсR- ) Т-NK клетки (CD16+CD56+CD3+) Т клетки актив. (HLA-DR+CD25+) Регуляторные Т-клетки (CD4+CD25brightCD127neg) Индекс соотношения (Тх/Тц) % ПК Абс.к-во кл/л 28 - 36 1,363-2,808 х 109 7 - 17 0,111-0,376 х 109 0,5 - 2,1 0,022-0,115 х 109 6,5 - 14,9 0,081-0,323 х 109 1,8 - 6,8 0,012-0,040 х 109 8 - 17 0,123-0,369 х 109 2,5 - 6,2 0,003 - 0,022 х 109 93,7 - 97,5 0,081-0,323 х 109 61 - 85 0,946-2,079 х 109 35 - 55 0,576-1,336 х 109 19 - 35 0,372-0,974 х 109 5 - 25 20 - 40 60,8 - 80,2 1,8 - 7,4 0,5 - 6 0,5 - 6 0,6 - 3,19 1,5 - 2,6 0,068-0,702 х 109 0,272-1,123 х 109 0,924-1,964 х 109 0,022-0,115 х 109 0,007-0,165 х 109 0,007-0,165 х 109 0,009-0,078 х 109 Опубликовано в: Хайдуков С.В., и др. Мед. иммунол., 2009, Т. 11, № 2-3, стр. 227-238 Хайдуков С.В. Анализ активированных NKклеток ααCD8+ NK-клетки Хайдуков С.В. Анализ активированных T- и NK-клеток CD16-CD56-CD8bright CD8/CD38/CD3/CD45 CD16+CD56+CD8dim CD16+CD56+CD8Активированные NK клетки Активированные цитотоксические Т клетки Покоящиеся CD8 позитивные Т клетки Хайдуков С.В. CD8/CD38/CD3/CD45 NK-клетки Анализ по зоне B Анализ по зоне D Хайдуков С.В. Анализ по зоне С А Б В Г Двухпараметрические гистограммы распределения лимфоцитов, полученные в результате многоцветного анализа периферической крови условно здорового пациента (А), пациента с острой вирусной инфекцией (Б) и пациентов с хроническим носительством ВИЧ (В, Г). Хайдуков С.В. СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ Хайдуков С.В.
