2.2.2. Проточная цитометрия. Для выявления

2.2.2. Проточная цитометрия.
Для выявления поверхностных и внутриклеточных антигенов был
использован
метод
специфические
прямой
иммунофлюоресценции,
моноклональные
определенными
антитела
при
котором
конъюгированы
флюорохромами: флюоресцеинизотиоцианат
с
(FITC),
фикоэритрин (PE), перидинин-хлорофилл протеин (PerCP). Выявление
флюоресценции каждого из этих флюорохромов и усиление светового
сигнала
на
фотоумножителях
проточного
цитометра
позволяло
одновременно получать информацию о физических параметрах клетки
(размер и гранулярность) и о наличии/отсутствии нескольких антигенов.
Для лизирования эритроцитов был использован лизирующий
раствор (FACS Lysing solution (BD)), разведенный 1:10 (объем/объем)
дистиллированной водой, длительность инкубации с которым в темноте
при комнатной температуре не превышала 10-12 минут.
При необходимости разведения суспензий клеток был использован
буфер (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl) для проточных цитометров
FacsFlow (BD).
Для фиксации был использован фиксирующий раствор (CellFIX
(BD)), разведенный 1:10 (объем/объем) дистиллированной водой.
Для получения возможности выявлять внутриклеточные антигены
был
использован
пермеабилизирующий
раствор
(Permeab
(BD)),
разведенный 1/10 (объем/объем) дистиллированной водой, длительность
инкубации с которым в темноте при комнатной температуре не
превышала 30 минут.
Нарушение
целостности
мембраны
мертвых
клеток
было
определено по позитивности окрашивания с 7-AAD (рис. 3). 7-AAD
(PharMingen, BD) был внесен из расчета 20 мкл на 1х106 клеток/мл, время
инкубации составило 30 минут. Учет результатов был осуществлен по
третьему
каналу
флюоресценции
(FL3);
положительные
события
отражали
относительное
содержание
нежизнеспособных
клеток
в
анализируемом образце.
SSC
7-AAD
CD45
7-AAD
FSC
Рис.
3.
Выявление
нежизнеспособных
клеток
по
позитивности
окрашивания с 7AAD. В данном случае мертвые 7AAD-позитивные
клетки (стрелка) составили менее 1% (0,64) от всех анализируемых
событий.
Клоны-производители антител были тщательно отобраны по их
реактивности и отсутствию фонового (неспецифического) окрашивания.
Для анализа субпопуляций лимфоцитов были использованы
коммерческие наборы моноклональных антител:
• SimultestPlus
(BD),
включающий
положительный
контроль
CD45(D1)/CD14(MфP9), специфические МАТ CD3(SK7)/CD19(4G7),
CD4(SK3)/8(SK1),
CD3(SK3)/CD16(B73.1)+CD56(MY31),
CD3(SK7)/HLADR(L243)
и
соответствующие
изотипические
контроли;
• CD3(UCHT1)/CD19(HD37)/CD45(T29-33),
CD8(DK25)/CD4(MT310)/CD3(UCHT1),
CD3(UCHT1)/CD16(DJ130c)/CD45(T29-33)
и
соответствующие
изотипические контроли (DAKO).
Для
анализа
моноклональные
лейкозных
мышиные
бластов
античеловеческие,
были
использованы
конъюгированные
с
различными флюорохромами антитела следующих специфичностей: CD2,
CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD13, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20,
CD22, CD23, CD25, CD33, CD34, CD38, CD45, CD56, CD61, CD64,
CD117, HLA-DR, гликофорин А, миелопероксидаза, каппа-цепь, ламбдацепь, µ-цепь, Tdt (табл. 22).
Таблица 22
Специфичность антител для выявления клеток методом проточной
цитометрии
Выявляемый антиген
Используемый клон1
Производитель
1
2
3
CD2
MT910
DAKO, BD
CD3
SK7
BD
CD4
MT310
DAKO
CD5
L17F12, DK23
DAKO, BD
CD7
M-T701
BD
CD8
DK25
BD
CD10
W8E7
BD
CD13
TUK1
BD, Caltag
CD14
TUK4
CD15
BD
CD19
Leu-12, SJ25-C1
BD, Immunotech
CD20
L27
BD
CD22
S-HCL-1
BD
CD23
BD
CD25
BD
CD33
WM54
DAKO
CD34
HPCA-2
BD
CD38
BD
CD45
2D1
BD
CD56
Leu-19
BD
CD61
RUUPL7F12
BD
CD65
VIM2
An Der Grub
CD117
95C3
BD, Immunotech
2
3
JC159
DAKO
G20-127
BD
1
GPhA
IgM
Kappa
BD
HLADR
L243
BD
Lambda
F0435
BD
Tdt
HT-6
DAKO
1
Если клон не указан, то использованы аффинно очищенные антитела.
В каждом случае были использованы также отрицательные
изотипические контроли, соответствующие применяемым специфическим
(целевым) антителам.