KOMBITEST™ CD3 FITC / CD8 PE / CD45 PerCP / CD4 APC

KOMBITEST™ CD3 FITC / CD8 PE / CD45 PerCP / CD4 APC
Кат№: ED7025
1. Спецификация
Содержимое
Использование
Специфичность
Клон
Изотип
Флуорохром
λ возбуждения
Максимум
эмиссии
CD3
MEM-57
IgG2a
FITC
488 нм
50 тестов, 1 мл
20 мкл на тест
CD8
CD45
MEM-31 MEM-28
IgG2a
IgG1
PE
PerCP
488 нм
488 нм
525 нм
575 нм
670 нм
CD4
MEM-241
IgG1
APC
633 нм
660 нм
2. Назначение
KOMBITEST ™ CD3 FITC / CD8 PE / CD45 PerCP /
CD4 APC предназначен для оценки относительного
количества субпопуляций (т-хелперов CD3+CD4+ и Тсупрессоров/цитотоксических CD3+CD8+) зрелых Тлимфоцитов человека в цельной лизированной крови.
С помощью данного реагента можно определять
соотношение количества CD4+/CD8+.
3. Принцип анализа
Этот тест основан на специфическом связывании
моноклональных
антител
с
антигенными
детерминантами,
экспрессирующимися
на
поверхности лимфоцитов. Моноклональные антитела
конъюгированы с различными флуорохромами,
которые испускают свет под действием луча лазера.
Испускаемый свет от каждой клетки собирается и
анализируется
управляющим
компьютером
проточного цитофлуориметра.
Разница в
интенсивности флуоресценции позволяет различить
подклассы по профилю экспрессируемых антигенов.
Специфическая окраска клеток крови осуществляется
в результате инкубации образца крови с реагентом и
последующим лизисом красных клеток крови. После
этого оставшиеся неповрежденные лимфоциты
анализируют на проточном цитофлуориметре.
4. Специфичность
Моноклональные антитела МЕМ-57 взаимодействуют
с гамма-ипсилон и дельта-ипсилон димерами
комплекса CD3. Моноклональные антитела МЕМ-57
были отнесены к CD3 на Собрании рабочей группы по
дифференцировочным
антигенам
лимфоцитов
человека (HLDA4 WS Code: T 96).
Антитела МЕМ-241 распознают корецептор CD4.
Моноклональные антитела МЕМ-241 были отнесены к
CD4
на
Собрании
рабочей
группы
по
дифференцировочным
антигенам
лимфоцитов
человека (HLDA8 (HCDM) WS Code: M241).
Антитела МЕМ-31 распознают конформационнозависимый эпитоп CD8. Моноклональные антитела
МЕМ-31 были отнесены к CD8 на Собрании рабочей
группы
по
дифференцировочным
антигенам
лимфоцитов человека (HLDA3 WS Code: T 575).
Антитела МЕМ-28 распознают все альтернативные
формы
фосфотирозин-фосфатазы
CD45.
Моноклональные антитела МЕМ-28 были отнесены к
CD45
на
Собрании рабочей
группы по
дифференцировочным
антигенам
лимфоцитов
человека (HLDA3 WS Code:NL 833a).
5. Предоставляемые реагенты
Реагент содержит готовую смесь мышиных
моноклональных антител к антигену человека CD3
(клон МЕМ-57), конъюгированные с FITC, к антигену
человека CD8 (клон МЕМ-31), конъюгированные с РЕ,
к антигену человека CD45 (клон МЕМ-28),
конъюгированные с PerCP, к антигену человека CD4
(клон МЕМ-241), конъюгированные с APC. Меченные
антитела находятся в фосфатно-солевом буфере с
добавлением 15 мМ азида натрия и 0,2%
высокоочищенного
бычьего
сывороточного
альбумина в качестве стабилизаторов. Содержимого
1 флакона достаточно для выполнения 50 тестов.
6. Условия хранения
В защищенном от света месте 2 -8
замораживать.
1/4
0С.
Перевод версии ED7025_EN_CZ_SK_090729
Не
7. Предостережения
Используйте реагент только по назначению
Не используйте реагенты с истекшим сроком
годности.
Не оставляйте реагенты на свету.
Не замораживайте реагенты.
Избегайте контаминации реагентов.
Любое несоответствие предлагаемому протоколу
окраски может привести к неправильному результату.
Антитела содержат азид натрия (NaN3), который в
чистом виде является очень токсичным. Однако,
концентрация, использующаяся в реагенте (15 mM) не
является токсичной. При сливе реагента в
канализацию разбавляйте его большим количеством
воды.
Образцы
крови
являются
потенциально
инфицированным материалом и с ними следует
обращаться должным образом. Избегайте контакта
образца с кожей, глазами и слизистыми.
9. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в
0,3-0,5 мл ФСБ.
10. Проанализируйте пробу на проточном цитометре
или храните при 2-8 0С в темном месте 24 часа.
10. Анализ данных
Проанализируйте образец, окрашенный
KOMBITEST™ CD3 FITC / CD8 PE /CD45 PerCP / CD4
APC, на проточном цитофлуориметре. Компенсируйте
флуоресцентные сигналы во время или после сбора
данных. После этого постройте график боковое
светорассеяние против флуоресценции CD45-PerCP.
Выделите регион лимфоцитов CD45+ как показано на
рисунке 1.
Постройте график CD8-PE против флуоресценции
CD3-FITC для CD45+ лимфоцитов, как показано на
рисунке 2. Выделите популяции для вычисления
количества Т-цитотоксических клеток (CD3+CD8+,
правый верхний квадрант).
Постройте график CD4-APC против флуоресценции
CD3-FITC для CD45+ лимфоцитов, как показано на
рисунке 3. Выделите популяции для вычисления
количества Т-хелперов (CD3+CD4+, правый верхний
квадрант).
6. Необходимые материалы
Пробирки 5 мл, 12 х 75 мм
Фосфатно-солевой буфер (ФСБ)
Автоматические пипетки
Вортекс
Лизирующий раствор
Центрифуга
Проточный
цитофлуориметр,
оснащенный
лазерами с длиной волны 488 нм и 633-638 нм.
Рекомендуемые реагенты для выполнения настройки
протокола:
CD3 FITC (1F-202-T025), CD3 PE (1P-202-T025), CD3
PerCP (PC-202-T025), CD3 (1A-202-T025).







11. Ожидаемые значения
Результаты, получаемые в разных лабораториях,
могут отличаться. Каждой лаборатории
рекомендуется устанавливать свой интервал
нормальных значений. Результаты, полученные в
лаборатории производителя, представлены ниже:
9. Процедура окраски
1. Произведите забор периферической крови в
стерильную пробирку с антикоагулянтом (гепарин,
ЭДТА).
2. Добавьте 20 мкл реагента KOMBITEST™ CD3
FITC / CD8 PE /CD45 PerCP / CD4 APC в чистую
пробирку.
3. Добавьте 100 мкл крови в пробирку.
Перемешайте.
4. Инкубируйте 20-30 мин при комнатной
температуре в темноте.
5. Выполните лизис красных клеток. Рекомендуется
использовать коммерческие лизирующие
растворы, содержащие лизирующий и
фиксирующие агенты. Следуйте инструкции
производителя.
6. Центрифугируйте пробирку 5 минут при 300 g.
7. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в
3-4 мл ФСБ.
8. Центрифугируйте пробирку 5 минут при 300 g.
Параметр
n
CD3+CD4+ лимфоциты
CD3+CD8+ лимфоциты
50
50
Mean
(%)
47.8
23.3
SD
8.9
6.8
CV (%)
18.6
29.2
12. Ограничения метода
Неправильная установка и наладка проточного
цитофлуориметра могут искажать получаемый
результат.
Неправильные настройки, включая напряжение на
каналах флуоресценции и компенсацию сигналов, а
также положение регионов могут искажать
получаемый результат.
В патологических образцах крови могут
обнаруживаться результаты, отклоняющиеся от
нормы.
Эритроциты в патологических образцах крови могут
быть резистентны к лизису.
При высоком лейкоцитозе рекомендуется развести
образец крови ФСБ до концентрации примерно 5*106
лейкоцитов/мл.
Образцы крови следует окрасить и проанализировать
в течение 24 часов после забора крови.
2/4
Перевод версии ED7025_EN_CZ_SK_090729
Пример данных
Литература
van den Berg HA et al. (2007) Coreceptor CD8-driven
modulation of T cell antigen receptor specificity. J Theor
Biol. 249: 395-408
Pang DJ et al. (2007) CD8 Raft localization is induced by
its assembly into CD8alpha beta heterodimers, not
CD8alpha alpha homodimers. J Biol Chem. 282: 1388494
Alarcon B et al. (2006) T-cell antigen-receptor
stoichiometry: pre-clustering for sensitivity. EMBO Rep. 7:
490-5
Devine L et al. (2006) Mapping the binding site on CD8
beta for MHC class I reveals mutants with enhanced
binding. J Immunol. 177: 3930-8
Kuhns MS et al. (2006) Deconstructing the form and
function of the TCR/CD3 complex. Immunity 24:133-9
Yi H et al. (2006) The phenotypic characterization of
naturally occurring regulatory CD4+CD25+ T cells. Cell
Mol Immunol. 3: 189-195
differentiation molecules. J Immunol Methods. 319: 1-5
Huang Y and Wange RL (2004) T cell receptor signaling:
beyond complex complexes. J Biol Chem. 279: 2882728830
Nakamura Y et al. (2004) Intrathyroidal CD4+ T
lymphocytes express high levels of Fas and CD4+CD8+
macrophages/dendritic cells express Fas ligand in
autoimmune thyroid disease. Thyroid 14: 819-824
Brdickova N. et al. (2003) LIME: a new membrane
Raftassociated adaptor protein involved in CD4 and CD8
coreceptor signaling. J Exp Med. 198:1453-62
Clapham PR and McKnight A (2002) Cell surface
receptors, virus entry and tropism of primate lentiviruses.
J Gen Virol. 83:1809-29
Foti M et al. (2002) p56Lck anchors CD4 to distinct
microdomains on microvilli. Proc Natl Acad Sci U S A. 99:
2008- 13
Nam K-H et al. (2000) Peripheral blood extrathymic
CD4+CD8+ T cells with high cytotoxic activity are from
the same lineage as CD4+CD8- T cells in cynomolgus
monkeys. Int Immunol. 12:1095-1103
Millan J et al. (1999) CD4 segregates into specific
detergentresistantT-cell membrane microdomains. Tissue
Antigens. 53:33-40
Hilgert I. et al. (1993) Therapeutic in vivo use of the A1CD3 monoclonal antibody. Transplantation 55: 435
Guttinger M et al. (1992) CD45 phosphotyrosine
phosphatase and p56lck protein tyrosine kinase: a
functional complex crucial in T cell signal transduction. Int
Immunol. 4: 1325-30
Stover DR et al. (1991) Protein-tyrosine-phosphatase
CD45 is phosphorylated transiently on tyrosine upon
Рисунок 1. Выделение популяции CD45+ лимфоцитов.
Рисунок 2. Анализ CD45+ лимфоцитов. Оценка Тцитотоксических CD3+CD8+ лимфоцитов в правом
верхнем квадранте.
Рисунок 3. Анализ CD45+ лимфоцитов. Оценка Тхелперов CD3+CD4+ лимфоцитов в правом верхнем
квадранте.
3/4
Перевод версии ED7025_EN_CZ_SK_090729
activation of Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA 88:
7704-7707
Taetle R et al. (1991) Regulation of CD45 expression in
human leukemia cells. Leukemia 5: 309-314
Stover DR et al. (1991) Protein-tyrosine-phosphatase
CD45 is phosphorylated transiently on tyrosine upon
activation of JurkatT cells. Proc Natl Acad Sci USA 88:
7704-7707
Taetle R et al. (1991) Regulation of CD45 expression in
human leukemia cells. Leukemia 5: 309-314
Nakano A et al. (1990) Expression of leukocyte common
antigen (cd45) on various human leukemia/lymphoma cell
lines. Acta Pathol Jpn. 40: 107-15
Yamada A et al. (1990) Effect of activation of protein
kinase C on CD45 isoform expression and CD45 protein
tyrosine phosphatase activity in T cells. Eur J Immunol.
20: 1655-60
Bazil V et al. (1989) Sialic acid-dependent epitopes of
CD45 molecules of restricted cellular expression.
Immunogenetics 29: 202-5
Horejsi V et al. (1988): Monoclonal antibodies against
human leucocyte antigens. II. Antibodies against CD45
(T200), CD3 (T3), CD43, CD10 (CALLA), transferrin
receptor (T9), a novel broadly expressed 18-kDa antigen
(MEM-43) and a novel antigen of restricted expression
(MEM-74). Folia Biol (Praha). 34: 23-34
Horejsi V. et al. (1986) Monoclonal antibodies against
human leucocyte antigens. I. Antibodies against beta-2microglobulin, immunoglobulin kappa light chains, HLADR-like antigens, T8 antigen, T1 antigen, a monocyte
antigen, and a pan-leucocyte antigen. Folia Biol. (Praha)
32, 12
Leukocyte Typing IV., Knapp W. et al. (Eds.), Oxford
University Press (1989); p. 293.
Leukocyte Typing III., McMichael M.J. et al. (Eds.),
Oxford University Press (1987); p.611.
Производитель
EXBIO Praha, a.s.
Nad Safinou II 366
252 42 Vestec, Czech Republic
Tel: +420 261 090 666
Fax: +420 261 090 660
E-mail: [email protected]
http://www.exbio.cz
4/4
Перевод версии ED7025_EN_CZ_SK_090729